Что такое рсв 1 расшифровка: Расчет по страховым взносам (РСВ) — Контур.Экстерн — СКБ Контур

Содержание

Формирование РСВ-1 в 1С 8.3 Бухгалтерия

Рассмотрим, как компьютерная программа 1С Бухгалтерия 8.3 помогает бухгалтеру делать ежеквартальные отчеты в ПФР.

Если в систему 1С своевременно и корректно вводились необходимые документы, то формирование «пенсионной» отчетности не представляет трудностей, так как выполняется автоматически. Чтобы все данные попали на нужные места в отчетах, в 1С должны быть занесены следующие операции.

Прежде всего, ежемесячное начисление взносов на ОПС и ОМС. Оно производится программой одновременно с начислением зарплаты сотрудникам документом 1С «Начисление зарплаты». Тариф взносов предварительно устанавливается в настройках учета зарплаты (см. пункт «Справочники и настройки» в разделе «Зарплата и кадры»).
Уплата взносов тоже должна попасть в отчет в ПФР. Ее следует отражать в 1С банковской выпиской «Списание с расчетного счета» с видом операции «Уплата налога» (налог «Страховые взносы в ПФР» или «в ФФОМС», вид «Взносы»).

Формирование отчетности РСВ-1

Когда документы по начислению и уплате взносов успешно занесены в программу, можно начинать формирование отчетности в Пенсионный фонд. В 1С для этой цели служит рабочее место:

Зарплата и кадры/ Страховые взносы/ Квартальная отчетность в ПФР

Чтобы создать новый комплект пачек отчетности, достаточно установить текущий период и нажать «Создать комплект» (период на этой кнопке будет указан автоматически).

Если в программе 1С 8.3 есть ранее созданные и сохраненные комплекты за другие периоды, то они отображаются в списке. Причем создание нового комплекта форм возможно, только если более ранние комплекты имеют состояние «Отправлено» или «Не будет передаваться». Для изменения состояния служит ссылка «Установить состояние».

Получите 267 видеоуроков по 1С бесплатно:

По нажатию кнопки «Создать комплект» программа создает и автоматически заполняет форму РСВ-1. В открывшемся окне отображены общие сведения об облагаемой базе и начисленных взносах за требуемый период. Статус формы — «В работе».

Если в верхней части нажать ссылку «Разделы 1-5», то откроется непосредственно отчет РСВ-1 «Расчет по начисленным и уплаченным взносам». Слева расположена панель разделов. По нажатию на раздел он открывается в правой части.

В раздел 1 попадают суммы взносов в ПФР и ФФОМС, которые в течение периода были начислены и уплачены, а также задолженность (если таковая есть).

В разделе 2 отражен расчет взносов на основании облагаемой базы и применяемого тарифа. Если в течение периода в программе вводились документы «Больничный лист», по которым начислялись пособия, то сумма пособий автоматически отразится в разделе 2 в строках 201 и 211 «Суммы, не подлежащие обложению страховыми взносами».

Как в 1С 8.3 изменить данные в отчетности РСВ-1

Если мы вернемся в форму работы с РСВ-1 и выделим здесь строку «Пачка разделов 6 РСВ-1», то увидим, что внизу появился список сотрудников с суммами заработка и начисленных взносов. Это те данные, которые попадают в «Индивидуальные сведения» (раздел 6).

Двойным щелчком по строке с сотрудником открывается форма редактирования раздела 6 РСВ-1 для данного сотрудника. В случае необходимости все сведения здесь можно отредактировать вручную: изменить суммы, добавить новые строки.

На вкладке «Раздел 6.8 (стаж)» этой же формы отражены сведения о стаже работника. Если на него вводился больничный лист, то период болезни автоматически отображается здесь с кодом ВРНЕТРУД. Этот раздел также доступен для ручного редактирования. Например, если работнику по договоренности с руководством предоставлялся отпуск «без содержания», следует добавить сюда строки и указать требуемый период отпуска, выбрав в разделе «Исчисляемый стаж» нужный код.

При необходимости заполняются и такие данные, как периоды работы в особых условиях или по льготной позиции. В случае работы в условиях «вредности» заполняется раздел 6.7.

Еще одна возможность, позволяющая редактировать стаж сотрудников, ссылка «Стаж» в форме работы с РСВ-1:

По нажатию этой ссылки открывается форма редактирования стажа в виде списка сотрудников. Эта форма содержит в том числе и графы для сведений о назначении досрочной пенсии. Изменения, внесенные в стаж, следует сохранить с помощью соответствующей кнопки.

Как выгрузить РСВ-1 и другая отчетность в пенсионный фонд

Готовый отчет РСВ-1 можно распечатать на бумаге или выгрузить его из 1С в виде файла в формате ПФР. Существует возможность проверить правильность заполнения отчета как с помощью встроенной в 1С проверки, так и сторонними программами.

Рабочее место «Квартальная отчетность в ПФР» позволяет также создавать корректирующую форму РСВ-1 и загружать комплекты форм в программу из файлов отчетности.

Начиная с версии 3.0.43 и выше программа «1С:Бухгалтерия 8.3» формирует и ежемесячный отчет СЗВ-М (он доступен в подразделе «Справочники и настройки» раздела программы «Зарплата и кадры»).

К сожалению, мы физически не можем проконсультировать бесплатно всех желающих, но наша команда будет рада оказать услуги по внедрению и обслуживанию 1С. Более подробно о наших услугах можно узнать на странице Услуги 1С или просто позвоните по телефону +7 (499) 350 29 00. Мы работаем в Москве и области.

ПФР Код территориальные условия 2016 и расшифровка: РКС, МКС и прочие — formy-i-blanki.ru

Код	Полное наименование	Акт законодательства	Срок действия кода
РКС	Район Крайнего Севера	Подпункт 2, 6, 13 пункта 1 и пункт 2 статьи 28 «Сохранение права на досрочное назначение трудовой пенсии отдельным категориям граждан» Федерального закона от 17.12.2001 № 173-ФЗ «О трудовых пенсиях в Российской Федерации»	с 01.01.2014 по 31.12.2014
РКС	Район Крайнего Севера	Пункты 2, 6 и 7 части 1 и часть 2 статьи 32 «Сохранение права на досрочное назначение страховой пенсии отдельным категориям граждан» Федерального закона от 28.12.2013 № 400-ФЗ «О страховых пенсиях»	с 01.01.2015
МКС	Местность, приравненная к районам Крайнего Севера	Подпункт 2, 6, 13 пункта 1 и пункт 2 статьи 28 «Сохранение права на досрочное назначение трудовой пенсии отдельным категориям граждан» Федерального закона от 17.12.2001 № 173-ФЗ «О трудовых пенсиях в Российской Федерации»	с 01.01.2014 по 31.12.2014
МКС	Местность, приравненная к районам Крайнего Севера	Пункты 2, 6 и 7 части 1 и часть 2 статьи 32 «Сохранение права на досрочное назначение страховой пенсии отдельным категориям граждан» Федерального закона от 28.12.2013 № 400-ФЗ «О страховых пенсиях»	с 01.01.2015
РКСМ	Район Крайнего Севера	Пункт 7 статьи 14, пункт 6 статьи 15 Федерального закона от 17.12.2001 № 173-ФЗ «О трудовых пенсиях в Российской Федерации»	с 01.01.2014 по 31.12.2014
РКСМ	Район Крайнего Севера	Части 4 и 7 статьи 17 «Повышение фиксированной выплаты к страховой пенсии» Федерального закона от 28.12.2013 № 400-ФЗ «О страховых пенсиях»	с 01.01.2015
МКСР	Местность, приравненная к районам Крайнего Севера	Пункт 11 статьи 14, пункт 8 статьи 15 Федерального закона от 17.12.2001 № 173-ФЗ «О трудовых пенсиях в Российской Федерации»	с 01.01.2014 по 31.12.2014
МКСР	Местность, приравненная к районам Крайнего Севера	Части 5 и 7 статьи 17 «Повышение фиксированной выплаты к страховой пенсии» Федерального закона от 28.12.2013 № 400-ФЗ «О страховых пенсиях»	с 01.01.2015
		Пункты 2, 6 и 7 части 1 и часть 2 статьи 32 «Сохранение права на досрочное назначение страховой пенсии отдельным категориям граждан» Федерального закона от 28.12.2013 № 400-ФЗ «О страховых пенсиях»
		Части 4 и 7 статьи 17 «Повышение фиксированной выплаты к страховой пенсии» Федерального закона от 28.12.2013 № 400-ФЗ «О страховых пенсиях»
		Части 5 и 7 статьи 17 «Повышение фиксированной выплаты к страховой пенсии» Федерального закона от 28.12.2013 № 400-ФЗ «О страховых пенсиях»
Ч31	Работа в зоне отчуждения	Статья 31 «Пенсионное обеспечение граждан, занятых на эксплуатации Чернобыльской АЭС и на работах в зоне отчуждения» Закона Российской Федерации от 15.05.1991 № 1244-1 «О социальной защите граждан, подвергшихся воздействию радиации вследствие катастрофы на Чернобыльской АЭС» (Ведомости СНД и ВС РСФСР, 1991, № 21, ст. 699; Собрание законодательства Российской Федерации, 1995, № 48, ст. 4561; 2006, № 30, ст. 3288)	с 01.01.2014
Ч33	Работа на территории зоны проживания с правом на отселение	Статья 33 «Пенсионное обеспечение граждан, постоянно проживающих на территории зоны проживания с правом на отселение» Закона Российской Федерации от 15.05.1991 № 1244-1 «О социальной защите граждан, подвергшихся воздействию радиации вследствие катастрофы на Чернобыльской АЭС»	с 01.01.2014
Ч34	Работа на территории зоны проживания с льготным социально–экономическим статусом	Статья 34 «Пенсионное обеспечение граждан, постоянно проживающих на территории зоны проживания с льготным социально–экономическим статусом» Закона Российской Федерации от 15.05.1991 № 1244-1 «О социальной защите граждан, подвергшихся воздействию радиации вследствие катастрофы на Чернобыльской АЭС»	с 01.01.2014
Ч35	Работа в зоне отселения до переселения в другие районы	Статья 35 «Пенсионное обеспечение граждан, постоянно проживающих в зоне отселения до их переселения в другие районы» Закона Российской Федерации от 15.05.1991 № 1244-1 «О социальной защите граждан, подвергшихся воздействию радиации вследствие катастрофы на Чернобыльской АЭС»	с 01.01.2014
Ч36	Работа в зоне отселения (по фактической продолжительности)	Статья 36 «Пенсионное обеспечение граждан, занятых на работах в зоне отселения (не проживающих в этой зоне)» Закона Российской Федерации от 15.05.1991 № 1244-1 «О социальной защите граждан, подвергшихся воздействию радиации вследствие катастрофы на Чернобыльской АЭС»	с 01.01.2014
СЕЛО	Работа в сельском хозяйстве	Часть 14 статьи 17 «Повышение фиксированной выплаты к страховой пенсии» Федерального закона от 28.12.2013 № 400-ФЗ «О страховых пенсиях»	с 01.01.2016

Корректировка РСВ 1 | Современный предприниматель

Необходимость в подаче корректирующего отчета, как правило, возникает, если ошибки обнаружились уже после представления расчета РСВ-1, и это привело к занижению суммы взносов к уплате. Положения о внесении изменений в расчет содержит статья 17 закона от 24.07.2009 № 212-ФЗ и Порядок заполнения расчета РСВ-1 (утв. Постановлением Правления ПФР от 16.01.2014 № 2п). О том, как сделать корректировку РСВ-1, всегда ли нужно сдавать «уточненку» и какие нюансы учесть при сдаче корректирующих и отменяющих сведений персучета — расскажем в нашей статье.

Корректировка РСВ-1: когда подавать

Исправляя ошибки в расчете РСВ-1, можно использовать один из двух способов:

заполнить и сдать уточненный расчет за период, в котором допущена ошибка,

не сдавая «уточненку», учесть прошлые ошибки в текущем отчете РСВ-1.

В какие сроки нужно подавать «уточненку»? ПФР в своем письме от 25.06.2014 № НП-30-26/7951 рекомендовал сдавать уточненные расчеты не позднее 1 числа третьего месяца, следующего за отчетным периодом. Например, уточненный РСВ-1 после 3 квартала можно сдать не позже 1 декабря. Тем, кто не успел исправиться в этот срок, корректировку РСВ-1 нужно делать в текущем отчете, в нашем примере – в годовом. Хотя, если следовать п. 5.1 Порядка заполнения расчета РСВ-1, сдать «уточненку» можно до наступления срока сдачи расчета за следующий расчетный период, то есть до 1 дня следующего квартала. В нашем случае этот срок продлился бы до 1 января.

Когда ошибка обнаружена до наступления следующего отчетного периода:

если это привело к занижению взносов к уплате, то следует сдать уточненный расчет РСВ-1, в котором должен присутствовать исправленный раздел 6 с персонифицированными сведениями. При заполнении «уточненки» все разделы заполняются полностью заново, но уже с верными показателями.
если занижения взносов не произошло, то сделать корректировку нужно в расчете РСВ-1 за текущий отчетный период, а «уточненку» при этом подавать не надо.

Как заполнить уточненный расчет РСВ-1

Допустим, в сданном отчете РСВ-1 за 9 месяцев 2016 года была обнаружена ошибка – занижение начисленных взносов по одному сотруднику. Прежде, чем закончится 2016 год, нужно подать уточненный расчет, в котором:

в подразделе 6.3 укажем тип корректировки в РСВ-1 «исходная», проставив в ячейке знак «Х», при этом отчетный период и год заполнять не надо;
в подразделе 6.4 исправим суммы выплат и базу для начисления;
в подразделе 6.5 укажем правильную сумму начислений;
в подраздел 6.6 переносятся данные из первичного расчета, если они там присутствовали;
в подразделе 6.7, если нужно, исправляются выплаты, на которые начисляются взносы по доптарифам;
в подразделе 6.8 при необходимости исправляются данные о стаже работника.

Если ошибки допущены по нескольким работникам, то исправленные разделы 6 заполняются по каждому из них. Остальные сведения по сотрудникам, где ошибок не выявлено, тоже нужно заново внести в уточненный расчет. При этом может измениться количество пачек со сведениями персучета, что следует указать в разделе 2.5.1.

На титульном листе пишем порядковый номер уточнения — «001», «002» и т.д. Еще следует указать код причины уточнения в РСВ-1, расшифровка которых дана в пп. 5.1 п.5 Порядка заполнения расчета:

код 1 – уточнение в части уплаты пенсионных взносов;
код 2 – изменение начисленных пенсионных взносов;
код 3 –уточнение в части взносов на ОМС.

Как заполнить корректирующую РСВ-1, если срок сдачи за следующий расчетный период уже наступил

Если ошибка в РСВ-1 за 9 месяцев 2016 года будет обнаружена, например, в январе 2017 года, то исправленные сведения раздела 6 включаются в расчет РСВ-1 за 2016 год:

в подразделе 6.3 код корректировки в РСВ-1 обозначим как «корректирующая», при этом укажем отчетный период и год, за который вносится исправление;
подразделы 6.4 – 6.7 корректируются по аналогии с уточненным расчетом;
в подразделе 6.8 обязательно надо заполнить сведения о периоде работы, т.к. эти сведения заменят ранее указанные в первичном отчете.

В текущий расчет РСВ-1, таким образом, будут включены «исходные» сведения за отчетный период по всем сотрудникам, а также «корректирующие» разделы 6, заполненные только по тем работникам, по которым исправляются данные прошлого периода.

«Отменяющая» корректировка РСВ-1 раздел 6

Корректировка «отменяющая» указывается в подразделе 6.3, если представленные ранее сведения персучета необходимо полностью убрать, то есть отменить. Например, ошибочно работнику, уже уволенному, была начислена зарплата и взносы.

По таким сотрудникам заполняются только подразделы 6.1 – 6.3, а в подразделе 6.4 нужно указать лишь код категории застрахованного лица. Остальные подразделы раздела 6 останутся незаполненными.

Обратите внимание, что сдавать корректирующий РСВ-1 нужно также, как и первичный расчет: при численности застрахованных лиц от 25 человек и более — только электронно, если численность меньше, то можно сдать расчет электронно, или на бумаге.

Обновление сайтов и типовых конфигураций 23.11–30.11.2020

Бухгалтерия предприятия, редакция 3.0, обновление 3.0.85.25 от 27.11.2020

Выбор режима налогообложения на 2021 год

Добавлена возможность выбора оптимального режима налогообложения на 2021 год с учетом прогрессивной шкалы по УСН.

Формат электронного УКД

Добавлена возможность использования формата электронного УКД, утвержденного Приказом ФНС России от 12.10.2020 № ЕД-7-26/[email protected]

Этот формат действует с 27 ноября 2020. До 1 октября 2021 можно также применять формат, утвержденный Приказом ФНС России от 13.04.2016 №MМВ-7-15/[email protected]

Страховые взносы ИП за себя на 2021–2023 годы

Установлены размеры фиксированных страховых взносов на 2021–2023 годы, которые ИП платит за себя.

Изменения видов деятельности по ПСН

С 2021 года изменен перечень видов деятельности, по которым можно получить патент.

КБК по патентам с 2021 года

Добавлен КБК для оплаты патента с 2021 года по Приказу Минфина России от 12.10.2020 № 236н.

Расшифровка расходов до первичного документа в декларации по налогу на прибыль

Добавлена детализация в расшифровку расходов в декларации по налогу на прибыль. Можно расшифровать расходы по строкам Приложения №2 к Листу 02 декларации.

Учет расходов на спецодежду и спецоснастку

С 2021 года изменен порядок списания на расходы стоимости спецодежды и спецоснастки. Новыми правилами учета не предусмотрены способы списания стоимости в течение срока полезного использования или пропорционально объему продукции (работ или услуг).

Стоимость спецодежды и спецоснастки, признанных запасами, подлежит единовременному списанию на расходы при передаче в эксплуатацию.

Инвентаризация спецодежды с 2021 года

Добавлена возможность инвентаризации спецодежды и инструментов, переданных в эксплуатацию. Инвентаризационные описи заполняются по остаткам на забалансовых счетах МЦ.02 «Спецодежда в эксплуатации» и МЦ.04 «Инвентарь и хозяйственные принадлежности в эксплуатации» для указанного работника.

КБК по земельному налогу с 2021 года

Добавлен КБК для уплаты земельного налога с 2021 года по Приказу Минфина России от 12.10.2020 № 236н.

Расшифровка застрахованных лиц в РСВ

Добавлена возможность расшифровки застрахованных лиц в Расчете по страховым взносам. Расшифровать можно показатели строки 010 Подразделов 1.1 и 1.2 Приложения 1 к Разделу 1.

Расчет выгоды от применения пониженных тарифов страховых взносов

Добавлена возможность расчета выгоды от применения пониженных тарифов страховых взносов. Отчет можно использовать для проверки соблюдения условий льготных тарифов. Например, для сравнения размера выгоды с объемом капитальных вложений участником свободной экономической зоны на территориях Республики Крым и города федерального значения Севастополя.

Регламентированная отчетность

В декларацию о плате за негативное воздействие на окружающую среду внесены изменения в соответствии с постановлением Правительства Российской Федерации от 24.01.2020 № 39.

Зарплата и Управление Персоналом, редакция 3, обновление 3.1.15.137 от 24.11.2020

Добавлена возможность формирования реестров сведений о работниках медицинских и социальных учреждений, которые получают стимулирующие выплаты в связи c COVID-19 в соответствии с Постановлениями Правительства РФ от 30.10.2020 г. № 1762 и от 18.11.2020 г. № 1859.

Появилась возможность автоматического заполнения кода основания исчисляемого страхового стажа ВИРУС в формах СЗВ-СТАЖ и СЗВ-КОРР.

Добавлен отчет «Анализ экономии от пониженного тарифа страховых взносов» для удобства соблюдения условий Федерального закона от 13.07.2020 № 204-ФЗ.

Форма статистики 1-Т за 2020 год теперь заполняется автоматически.

В РСВ добавлена расшифровка к показателям строки 010 разделов 1.1 и 1.2 Приложения 1 и той же строки Приложения 2.

Зарплата и кадры государственного учреждения, редакция 3, обновление 3.1.15.137 от 24.11.2020

Добавлен отчет «Ведомость дополнительных доходов физических лиц, облагаемых НДФЛ, страховыми взносами» (ф. 0504094) согласно приказу Минфина России от 15.06.2020 № 103н.

Форма статистики 1-Т за 2020 год теперь заполняется автоматически.

В РСВ добавлена расшифровка к показателям строки 010 разделов 1.1 и 1.2 Приложения 1 и той же строки Приложения 2.

Обновленные статьи

В разделе Отправка и получение отчетности обновлена статья «Формирование и отправка реестра больничных листов в ФСС».

В разделе Использование криптопровайдеров обновлена статья «Выгрузка контейнера КриптоПро CSP из реестра».

О компании | АО «АТС»

История

Федеральным законом от 4 ноября 2007 года № 250-ФЗ «О внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации в связи с осуществлением мер по реформированию Единой энергетической системы России» были внесены изменения и дополнения в статью 33 Федерального закона от 26 марта 2003 года № 35-ФЗ «Об электроэнергетике», касающиеся особенностей правового статуса коммерческой инфраструктуры оптового рынка.С 01 апреля 2008 года деятельность по организации торговли на оптовом рынке, связанную с заключением и организацией исполнения сделок по обращению электрической энергии, мощности и иных объектов торговли, обращение которых допускается на оптовом рынке, должен осуществлять коммерческий оператор оптового рынка

13 декабря 2007 года состоялась государственная регистрация Открытого акционерного общества «Администратор торговой системы оптового рынка электроэнергии». В соответствии с решением Наблюдательного совета НП «АТС» от 30 ноября 2007 года на ОАО «АТС» возложено исполнение с 01 апреля 2008 года функции коммерческого оператора оптового рынка.

В настоящее время АО «АТС» — 100 % дочерняя компания Некоммерческого партнерства «Совет рынка».АО «АТС» проводит торги и обеспечивает расчёты между производителями и покупателями электроэнергии. Компания АО «АТС» непрерывно растёт и развивается. На сегодняшний день она является ведущим в России организатором торговли на оптовом рынке электрической энергии и мощности.

Цели

АО «АТС» создано в целях осуществления деятельности по организации торговли на оптовом рынке электрической энергии и мощности, связанной с заключением и организацией исполнения сделок по обращению электрической энергии, мощности и иных объектов торговли, обращение которых допускается на оптовом рынке.

АО «АТС» — динамичная, клиентоориентированная компания, которая считает своей главной задачей обеспечение надежного и прозрачного функционирования российского оптового рынка электроэнергии и мощности.

Виды деятельности

Оказание услуги по организации оптовой торговли электрической энергией, мощностью и иными допущенными к обращению на оптовом рынке товарами и услугами.
Осуществление регистрации двусторонних договоров купли-продажи электрической энергии и мощности.
Организация системы измерений и сбора информации о фактическом производстве электрической энергии и мощности и об их потреблении на оптовом рынке.
Взаимодействие с организациями технологической инфраструктуры в целях прогнозирования объема производства и потребления электрической энергии, поддержания установленных техническими регламентами параметров качества электрической энергии, устойчивости и надежности энергоснабжения.
Разработка, внедрение и сопровождение программных и информационных систем, обеспечивающих осуществление * Обществом видов деятельности, указанных в настоящем пункте.
Оказание информационных и консультационных услуг.
Осуществление любой иной деятельности, не запрещенной законодательством Российской Федерации и соответствующей целям деятельности Общества.

Отчет по расчету страховым взносам в 1C – подготовка к сдаче отчетности

Подготовка и сдача отчетности — одна из основных задач, стоящих перед каждой организацией. По окончании года бухгалтеры обязаны предоставить в ПФР, ФСС и ФНС отчеты по налогам и взносам.

В этой статье мы рассмотрим, как подготовиться к сдаче отчета по страховым взносам (РСВ) в программе «1С:Зарплата и кадры государственного учреждения 8» ред. 3.1, какие ошибки могут возникнуть и как их исправить.

Подготовка к отчету

На этапе подготовки нужно отметить, что в организации желательно указывать все ее реквизиты и регистрационные данные налогового органа. Для того чтобы проверить наличие реквизитов и при необходимости заполнить их, перейдите на главной панели в блок «Настройка» и найдите пункт «Организации» (рис.1-3).

Рис. 1. Блок «Настройка» в программе «1С:Зарплата и кадры государственного учреждения 8»

Рис. 2. Реквизиты организации в «1С:Зарплата и кадры государственного учреждения 8»

Рис. 3. Регистрационные данные налогового органа в «1С:Зарплата и кадры государственного учреждения 8»

Проверка при подготовке к формированию отчета

Тридцатого числа месяца, следующего за отчетным, наступает последний день отчетного срока по РСВ, если иные сроки не предусмотрены законодательством.

При создании отчета в «1С:Зарплата и кадры государственного учреждения 8» все разделы и приложения заполняются автоматически, однако, прежде чем их заполнять, желательно проконтролировать точность ведения учета в программе.

Важно иметь в виду, что каждое начисление должно содержать указанный ему вид дохода в соответствии с главой 34 Налогового кодекса РФ. По умолчанию многие начисления уже прописаны в программе. Но бывают ситуации, когда стандартных начислений недостаточно, и пользователь добавляет свои. В этом случае рекомендуем проверить, какие виды дохода были проставлены. Для этого перейдите на вкладку «Настройка», пункт плана видов расчета «Начисления». Чтобы проверить, какой вид дохода задан для вашего начисления, перейдите на вкладку «Налоги, взносы, бухучет». Далее в строке для выбора значения «Вид дохода» проставьте соответствующее значение (рис. 4).

Рис. 4. Виды доходов в «1С:Зарплата и кадры государственного учреждения 8»

После проведения документов-начислений (отпусков, начислений зарплаты, командировок) в регистрах будет записан установленный вид дохода.

Для того чтобы посмотреть базу для исчисления страховых взносов, можно воспользоваться отчетом «Анализ взносов в фонды». Он находится на вкладке «Налоги и взносы», в пункте «Отчеты по налогам и взносам». Этот отчет детально расшифровывает базу для исчисления страховых взносов по видам расчетов, что позволит увидеть как облагаемую, так и необлагаемую базу. Также отчет позволит просмотреть суммы с превышения, если был достигнут установленный в программе предел.

Если после отчета «Анализ взносов в фонды» вы заметили, что какие-либо суммы указаны неправильно или что-то не входит в базу для исчисления страховых взносов, то можно воспользоваться отчетом «Проверка расчетов взносов». Этот отчет позволит сформировать такую же таблицу, как в отчете «Анализ взносов в фонды», но уже с расшифровкой по сотрудникам.

Главной особенностью отчета «Проверка расчетов взносов» является то, что вы увидите облагаемую базу по каждому сотруднику, а также автоматически рассчитанную сумму страховых взносов, взятую с облагаемой базы. Это позволит сравнить суммы плановых страховых взносов с облагаемой базы и сумму фактически начисленных страховых взносов. И если фактические суммы не совпадают с плановыми, то программа выделит их красным цветом, что свидетельствует о том, что вы не учли какую-либо сумму страховых взносов (рис.5). В таком случае необходимо доначислить взносы. А если вы видите отрицательные значения, значит необходимо перекинуть доход на месяц с положительной облагаемой базой.

Рис. 5. Отчет «Проверка расчетов взносов» в «1С:Зарплата и кадры государственного учреждения 8»

Также следует учесть, что при заполнении выплаты, которые не являются объектом обложения или были выплачены незастрахованным, отражать в форме не нужно. Например, сохраняемый средний заработок на период трудоустройства.

Если выплата является объектом начисления, но не облагается страховыми взносами, ее следует отражать в форме. Например, материальная помощь в связи с рождением детей, государственные пособия, компенсационные выплаты, установленные законодательством. Кроме того, если в организацию были приняты новые сотрудники, а вы внесли по ним не все данные, их необходимо заполнить. Иначе отчетность могут не принять. Вы можете это сделать в карточке сотрудника на вкладке «Кадры», пункт «Сотрудники». Нужный документ, удостоверяющий личность, находится на вкладке «Личные данные» (рис.6).

Рис. 6. Карточка сотрудника в «1С:Зарплата и кадры государственного учреждения 8»

Отчет по расчету страховых взносов заполняется на вкладке «Отчетность, справки», пункт «1С-Отчетность».

Если вы подключите сервис «1С-Отчетность», то сможете не только отправлять отчеты напрямую из «1С», но и вести переписку с ПФР, ФНС, Росстатом, получать уведомления из ФНС и многое другое. Если же сервис не подключен, вы сможете только создавать отчеты и выгружать их для отправки через других операторов.

Отчетность по представленной форме собрана из разделов, часть которых не заполняется отдельными группами плательщиков.

Для формирования отчета нажмите кнопку «Создать» (рис.7) и выберите необходимый отчет.

Рис.7. Создание отчета в «1С:Зарплата и кадры государственного учреждения 8»

Далее выберите, по какой организации заполняется отчет и за какой период (рис.8), и нажмите кнопку «Создать».

Рис. 8. Выбор организации в «1С:Зарплата и кадры государственного учреждения 8»

Затем на форме нажмите кнопку «Заполнить». Титульный лист представляет собой информацию из справочника «Организации», также в нем указывается код расчетного периода и дата подписания отчета (рис.9).

Рис. 9. Титульный лист в «1С:Зарплата и кадры государственного учреждения 8»

В первом разделе отображаются сводные данные по суммам страховых взносов, подлежащие уплате за расчетный период, в том числе за последние три месяца, а также суммы превышенных расходов над исчисленными взносами (рис.10).

Рис. 10. Первый раздел в «1С:Зарплата и кадры государственного учреждения 8»

Если есть необходимость, то по кнопке «Расшифровать» вы можете посмотреть, как формируются суммы по сотрудникам (рис.11,12).

Рис. 11. Панель управления отчетом в «1С:Зарплата и кадры государственного учреждения 8»

Рис. 12. Расшифровка по сотрудникам в «1С:Зарплата и кадры государственного учреждения 8»

Второй раздел заполняется в том случае, если вы являетесь главой крестьянского хозяйства. Он включает сводные данные по суммам страховых взносов, подлежащих уплате в бюджет (рис.13). В других случаях раздел заполнять не нужно.

Рис. 13. Второй раздел в «1С:Зарплата и кадры государственного учреждения 8»

В третьем разделе автоматически заполняются данные персонифицированного учета по каждому застрахованному сотруднику за квартал отчетного периода, а также сведения о полученных доходах и исчисленных страховых взносах (рис.14).

Рис. 14. Третий раздел в «1С:Зарплата и кадры государственного учреждения 8»

Перед отправкой отчета необходимо проверить контрольные соотношения (рис.15).

Рис. 15. Проверка контрольных соотношений в «1С:Зарплата и кадры государственного учреждения 8»

Если все соотношения выполнены, можете смело отправлять отчет. Тем не менее при проверке могут возникнуть ошибки. Причин может быть большое количество. Например, если у вас отсутствует отчет за прошлые периоды текущего года. Или же имеются отрицательные страховые взносы по сотруднику за отчетный период.

В первом случае необходимо проверить, что отчеты за прошлые периоды заполнены в программе. При возникновении ситуации, когда происходят перерасчеты за прошлые периоды, следует отправить корректировку, после чего приступать к заполнению текущего периода.

Во втором случае требуется определить, по каким сотрудникам имеются отрицательные начисления, и распределить доход прошлого периода для покрытия отрицательных сумм.

Что делать, если вы отправили отчет, а в расчетах оказались ошибки?

В этом случае необходимо отправить пояснения или исправленный расчет, согласно пункту 3 статьи 88 Налогового кодекса РФ. Если вы отправили уточненный расчет и в нем была уменьшена сумма взносов к уплате, тогда ФНС может потребовать обосновать уменьшение суммы взносов. Например, первичными документами или регистрами налогового учета.

Вывод

В нашей статье мы подробно рассмотрели, как подготовиться к сдаче отчета по страховым взносам в программе «1С:Зарплата и кадры государственного учреждения 8» ред. 3.1. Понимание того, как правильно проверить заполняемость отчетности, найти ошибки и исправить их, позволит вам сэкономить не только бюджет организации, но также свое время и нервы.

Если у вас все еще остались вопросы по заполнению отчетности или требуется помощь квалифицированного специалиста, вы всегда можете обратиться в нашу компанию.

Стенограммы ∙ Президент ∙ События ∙ Президент России

Рубрикация материалов

17 мая, понедельник

Встреча с председателем правления компании «НОВАТЭК» Леонидом Михельсоном

17 мая 2021 года, 13:402021-05-17 Отдел редакции официального сайта Президента России Москва, Кремль

14 мая, пятница

Совещание с постоянными членами Совета Безопасности

14 мая 2021 года, 14:202021-05-14 Отдел редакции официального сайта Президента России Московская область, Ново-Огарёво

13 мая, четверг

Совещание с членами Правительства

13 мая 2021 года, 15:502021-05-13 Отдел редакции официального сайта Президента России Московская область, Ново-Огарёво

12 мая, среда

Рабочая встреча с губернатором Омской области Александром Бурковым

12 мая 2021 года, 14:302021-05-12 Отдел редакции официального сайта Президента России Москва, Кремль

11 мая, вторник

Рабочая встреча с губернатором Красноярского края Александром Уссом

11 мая 2021 года, 13:302021-05-11 Отдел редакции официального сайта Президента России Москва, Кремль

10 мая, понедельник

Гала-матч Ночной хоккейной лиги

10 мая 2021 года, 20:102021-05-11 Отдел редакции официального сайта Президента России Сочи

Комментарий о ходе вакцинации в Российской Федерации

10 мая 2021 года, 15:152021-05-11 Отдел редакции официального сайта Президента России

Встреча с президентом Международной федерации хоккея на льду Рене Фазелем

10 мая 2021 года, 15:052021-05-11 Отдел редакции официального сайта Президента России Сочи

9 мая, воскресенье

Парад Победы на Красной площади

9 мая 2021 года, 11:052021-05-09 Отдел редакции официального сайта Президента России Москва, Красная площадь

8 мая, суббота

Встреча с Президентом Таджикистана Эмомали Рахмоном

8 мая 2021 года, 18:102021-05-08 Отдел редакции официального сайта Президента России Москва, Кремль

6 мая, четверг

Рабочая встреча с Заместителем Председателя Правительства Татьяной Голиковой

6 мая 2021 года, 15:102021-05-06 Отдел редакции официального сайта Президента России Сочи

4 мая, вторник

Видеообращение по случаю старта финального этапа Х Всероссийского фестиваля Ночной хоккейной лиги в Сочи

4 мая 2021 года, 16:002021-05-04 Отдел редакции официального сайта Президента России

30 апреля, пятница

Совещание с постоянными членами Совета Безопасности

30 апреля 2021 года, 13:402021-04-30 Отдел редакции официального сайта Президента России Москва, Кремль

29 апреля, четверг

Встреча с представителями деловых кругов Франции

29 апреля 2021 года, 14:202021-04-29 Отдел редакции официального сайта Президента России Московская область, Ново-Огарёво

27 апреля, вторник

Встреча с членами Совета законодателей

27 апреля 2021 года, 14:152021-04-29 Отдел редакции официального сайта Президента России Санкт-Петербург

26 апреля, понедельник

Встреча с Председателем Центризбиркома Эллой Памфиловой

26 апреля 2021 года, 13:102021-04-26 Отдел редакции официального сайта Президента России Москва, Кремль

23 апреля, пятница

Встреча с Татьяной Голиковой и Анной Поповой

23 апреля 2021 года, 13:002021-04-23 Отдел редакции официального сайта Президента России Москва, Кремль

22 апреля, четверг

Встреча с Президентом Белоруссии Александром Лукашенко

22 апреля 2021 года, 18:202021-04-22 Отдел редакции официального сайта Президента России Москва, Кремль

Саммит по вопросам климата

22 апреля 2021 года, 16:102021-04-22 Отдел редакции официального сайта Президента России Москва, Кремль

21 апреля, среда

Послание Президента Федеральному Собранию

21 апреля 2021 года, 13:202021-05-03 Отдел редакции официального сайта Президента России Москва Показать предыдущие материалы

Респираторно-синцитиальный вирус человека виропорин SH: путь распознавания вируса, используемый хозяином для передачи сигнала об активации инфламмасом

Ключевые сообщения

Какой ключевой вопрос?

Какова чистая прибыль?

Мы считаем, что находки в этой рукописи в высшей степени новы. Наши данные показывают, что после инфицирования RSV небольшой гидрофобный белок RSV накапливается в структурах липидного рафта, образуя ионные каналы, которые запускают транслокацию NLRP3 из цитоплазмы в Golgi.

Зачем читать дальше?

Мы можем заключить, что эти внутриклеточные рафтовые структуры имеют решающее значение для восприятия клеточного стресса, вызванного дисбалансом ионных концентраций, и могут быть общим путем распознавания вируса, который может использоваться инфицированной клеткой-хозяином для передачи сигнала об активации инфламмасом NLR.

Введение

Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) остается ведущей причиной серьезных вирусных бронхиолитов и пневмоний у младенцев и детей раннего возраста во всем мире.Бремя болезней является значительным: 70% всех младенцев инфицированы RSV в течение первого года жизни1. Это наиболее частая причина госпитализации младенцев и острой дыхательной недостаточности в педиатрических отделениях интенсивной терапии. Сорок процентов детей, выписанных из больницы, имеют рецидивирующие, повторяющиеся респираторные симптомы и одышку в течение как минимум 10 лет2. Инфекция также важна для пожилых людей и лиц с ослабленным иммунитетом. Патология вируса связана с врожденным иммунитетом и перекосом иммунных ответов в сторону фенотипа Th3.3, 4

Один цитокин, связанный с инфекцией RSV, — это IL-1β. Хотя было показано, что этот цитокин секретируется RSV-инфицированными клетками дыхательных путей 5, остается вопрос о механизме активации инфламмасом. В настоящее время выясняется, что инфламмасомы представляют собой мультибелковые комплексы, которые действуют как платформа для активации каспазы 1, которая, в свою очередь, расщепляет про-ИЛ1β и про-ИЛ18, что приводит к их секреции.6

Поскольку было показано, что инфламмасомы запускаются разными лигандами, было высказано предположение, что для полной активации необходимы два или потенциально более сигналов.Первый, или прайминговый сигнал, может запускаться транскрипционно активным PRR или цитокиновым рецептором, это приводит к транскрипционной активации генов, кодирующих про-IL1β и про-IL18.7 Второй сигнал запускается в ответ на различные стрессовые сигналы, связанные с поврежденный 6

Возникает вопрос, каким образом IL-1β запускается в ответ на инфекцию RSV, и какой этап «примирования» приводит к секреции IL-1β. Недавнее исследование, проведенное Segovia et al 8, показало, что RSV запускает активацию NLRP3 через производство активных форм кислорода (ROS).Хотя это исследование дало некоторые ключи к разгадке, оно не показало, какая часть вируса вызывает это воспаление, и механизм активации NLRP3 остается неизвестным.

В текущем исследовании мы попытались пролить больше света на механизмы активации инфламмасом, вызванной RSV. Наши исследования показали, что малогидрофобный (SH) виропорин RSV, который индуцирует проницаемость мембраны для ионов или малых молекул9, необходим для запуска инфламмасомы NLRP3 при инфекциях RSV.

В нашем исследовании фармакологическая обработка RSV-инфицированных клеток лекарствами, которые ингибируют вирусные ионные каналы и разрушители липидного рафта, блокировала активацию инфламмасом, показывая, что структура липидного рафта во внутриклеточных компартментах играет важную роль в активации инфламмасом. Наше исследование демонстрирует, что при инфицировании RSV, виропорин RSV SH накапливается в структурах липидного рафта, возможно, образуя ионные каналы, которые запускают транслокацию NLRP3 из цитоплазмы в Golgi.

Методы

Вирусы

Штамм А2 респираторно-синцитиального вируса человека, штамм MacIntyre вируса простого герпеса 1 человека, вирус энцефаломиокардита (адаптированная культура ткани), вирус везикулярного стоматита Орсе были первоначально приобретены в Американской коллекции культур тканей. Вирусы размножали и титровали в клетках африканских зеленых мартышек. Мутантный вирус rgRSV-GF (ΔSH RSV) был предоставлен докторами Марком Пиплзом и Питером Коллинзом.10 В предыдущих исследованиях было показано, что мутантный ΔSH RSV эффективно растет и реплицируется в культуре клеток (Bukreyev et al , J Virol ). 1997).Мы также выполнили кривые роста этого мутанта, и мы видим, что он обладает репликацией и способностью к росту, аналогичной дикому типу. Эти вирусы хранили при -80 ° C.

Ячейки

Первичные эпителиальные клетки легких человека были получены от взрослого мужчины (TCS cell works, UK). Их пассировали и поддерживали в среде эпителиальных клеток, предоставленной TCS.

Химикаты / реактивы

Все продукты тонкой химии были получены от Sigma (Великобритания). TLR2, mAb, специфичные к TLR4, были получены от Hycult (Дания).Специфические антитела к TLR3, TLR9, TLR7 и TLR8 были приобретены в Santa Cruz Biotechnology (Калифорния, США). Специфические антитела к RIG-I были приобретены в Abcam (Кембридж, Великобритания). Кроличьи поликлональные антитела p10 к каспазе 1, кроличьи поликлональные антитела к NLRP3 и козьи поликлональные антитела, связанные с апоптозным пятнышком (ASC), были приобретены в Santa Cruz Biotechnology (Калифорния, США). Антитело к IL1β (NBP1-42767) было получено от Novus (США). Поликлональный кролик по отношению к IL1β был приобретен abcam (США).Поликлональные антитела (AbSH), специфичные к белку SH RSV11, были любезным подарком профессора Бяо Хэ.

РНК-интерференция

Интерференция РНК

была использована для того, чтобы заставить замолчать гены RIG-I, TLR7, TLR3, TLR4, TLR8 и TLR2. Различные клоны psiRNA были созданы с использованием вектора psiRNA-h7SK от Invitrogen; наиболее эффективным против последовательности: для RIG-I, GGAAGAGGTGCAGTATATT, для TLR7 GGGTATCAGCGTCTAATATCA, для TLR8 GACCAACTTCGATACCTAAA, для NLRP3 GGAAGTGGACTGCGAGAAGTT, для TLR3, GAGTTAGATATGCGCTTTAAT, для TLR4 GCCAGGAGAACTACGTGTGAA для TLR2 GTCAATTCAGAACGTAAGTCA.

Эпителиальные клетки легких человека (1 × 10 ⁵) высевали в шестилуночные планшеты и трансфицировали 0,5 мкг псиРНК либо для RIG-I, либо для TLR3, TLR7, TLR4, TLR8 или скремблированной миРНК в качестве контроля с использованием липофектамина 2000. (Invitrogen). Через 48 часов уровень молчания определяли вестерн-блоттингом.

Конфокальная микроскопия

Эпителиальные клетки легких человека на предметных стеклах микрокамер (Lab-tek, Gibco) инкубировали с множественностью инфицирования RSV (MOI 5), а затем дважды промывали в PBS / 0.02% бычий сывороточный альбумин (BSA) перед фиксацией 4% формальдегидом в течение 15 мин. Клетки фиксировали, чтобы предотвратить возможную реорганизацию белков в ходе эксперимента. Клетки пермеабилизировали с использованием PBS / 0,02% BSA / 0,02% сапонина и метили антителами к NLRP3, ASC, непосредственно метили подходящим флуорофором. Гольджи окрашивали mAb GM130, а затем — мышиноспецифическим Ig Alexa 488-Fab. Клетки получали на конфокальном микроскопе Carl Zeiss, Inc LSM510 META (с флуоресцентным микроскопом Axiovert 200) с использованием 1.4 NA 63 × объектив Zeiss. Изображения анализировали с использованием программного обеспечения для анализа изображений LSM 2.5 (Carl Zeiss, Inc).

Оптимизация концентраций препарата к инфламмасоме

Эпителиальные клетки легких человека высевали на шестилуночные планшеты. На следующий день клетки инфицировали RSV с MOI 5 в среде, содержащей соответствующую концентрацию каждого лекарства, в течение 60 мин (5-N-этил-N-изопроамилорид 25 мкМ, бензамил 50 мкМ, верапамил 50 мкМ, нистатин 25 мкМ, амантадин или римантадин 6,5 мкМ, гексаметиленамилорид (ГМА), 50 мкМ).

Супернатант, содержащий вирус, удаляли и клетки промывали. Добавляли свежую среду, содержащую лекарства, и клетки инкубировали в течение 12 часов. (Жизнеспособность клеток определяли с использованием 0,2% трипанового синего при исследовании клеток под микроскопом).

Бесклеточный супернатант собирали через 12 часов после инфицирования и анализировали на IL-1β с помощью цитометрического набора гранул (CBA). В некоторых случаях супернатанты и клеточные экстракты собирали для вестерн-блоттинга.

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET)

FRET — это неинвазивный метод визуализации, используемый для определения молекулярной близости.FRET может происходить на расстоянии 1–10 нм и эффективно увеличивает разрешение световой микроскопии до молекулярного уровня. Он включает безызлучательный перенос энергии от возбужденного состояния донорной молекулы к соответствующему акцептору. Скорость передачи энергии обратно пропорциональна шестой степени расстояния между донором и акцептором. Эффективность передачи энергии (E) определяется относительно r и R ₀, характеристическое расстояние Форстера равенством 1

FRET будет измеряться с точки зрения уменьшения флуоресценции донора после полного фотообесцвечивания акцепторного флуорофора.Повышенная флуоресценция донора после полного разрушения акцептора указывает на ассоциацию между двумя интересующими молекулами.

Результаты

Инфекция RSV активирует воспаление NLRP3

Чтобы определить, обнаруживается ли RSV инфламмасомой, мы исследовали активацию инфламмасомы, измеряя секрецию IL1β первичными RSV-инфицированными эпителиальными клетками легких. РНК-вирусы, такие как вирус везикулярного стоматита (VSV) и вирус энцефаломиокардита (ECMV), а также ДНК-вирус вируса простого герпеса (HSV1) также сравнивали с RSV.

Данные показали, что инфекция RSV привела к секреции IL1β в течение 6 часов (рисунок 1A). Секреция IL1β не наблюдалась при инфекциях другими вирусами. Чтобы проверить, была ли секреция IL1β NLRP3-специфичной, экспрессия NLRP3 была подавлена psiRNA, что привело к снижению секреции IL1β (рисунок 1B), тем самым подтверждая, что RSV обнаруживается инфламмасомой NLRP3. Секрецию IL-6 измеряли в качестве контроля для эффекта psiRNA, поскольку он не зависит от активации инфламмасом, но является известным маркером активации NF-kB.Все протестированные вирусы запускали секрецию IL-6, но только RSV был обнаружен инфламмасомой в этих незапраймированных клетках.

Рисунок 1

Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) инфекция активирует воспаление NLRP3. Эпителиальные клетки легких инфицировали 5 множественностью инфекции (moi) RSV или ECMV, или вирусом везикулярного стоматита (VSV), или вирусами HSV1. Супернатант собирали через 12 часов после инфицирования и анализировали на IL1β и IL6 с использованием системы набора гранул CBA на FACSCalibur (Becton Dickinson) (A).Экспрессия NLRP3 подавлялась псиРНК, и клетки снова инфицировали 5 мкл вирусов RSV или ECMV, или VSV, или HSV1. Супернатант собирали через 12 часов после инфицирования и анализировали на IL1β и IL6 с использованием системы CBA (B). Экстракты клеток из инфицированных эпителиальных клеток легких анализировали на присутствие про-IL1β с помощью вестерн-блоттинга, и также изображены контроли нагрузки для β-актина. (С). Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов.

RSV вызывает секрецию про-IL1β

Секреция

IL1β требует двух сигналов: транскрипции про-IL1β (сигнал 1) и обработки каспазой 1 (сигнал 2).Чтобы проверить, обеспечивает ли инфекция RSV транскрипционный сигнал, мы инфицировали клетки RSV и исследовали ответ про-IL1β с помощью вестерн-блоттинга. Инфекция RSV вызвала реакцию про-IL1β, в то время как инфекция другими вирусами не вызывала (рисунок 1C).

Передача сигналов TLR необходима для активации инфламмасом

RSV

обнаруживается различными PRR, такими как TLR4,12 TLR7,13 TLR3 и RIG-I.14 Чтобы определить, играют ли они также роль в активации инфламмасом, мы индивидуально отключили RIG-I, TLR3, TLR4, TLR7 или TLR8. в инфицированных RSV клетках, а также в TLR2 (рисунок 2).Только отключение TLR4 приводило к снижению экспрессии про-IL1β и IL1β. Секреция IFNβ не снижалась при подавлении любой из этих молекул, что показывает, что снижение IL1β было специфическим. Таким образом, TLR4, по-видимому, необходим для сигнала 1, транскрипции про-ILβ, что приводит к последующему высвобождению зрелого IL1β при инфицировании RSV.

Рисунок 2

TLR4 обеспечивает первый или запускающий сигнал активации. Эпителиальные клетки легких инфицировали респираторно-синцитиальным вирусом с 5 множественностью инфицирования (moi) и исследовали присутствие про-IL1β с помощью вестерн-блоттинга, а также секрецию IL1β и IFNβ с использованием системы CBA.Экспрессия RIG-I подавлялась psiRNA, и клетки снова инфицировали и исследовали на про-IL1β, а также секрецию IL1β и IFNβ (A). Экспрессия TLR3 подавлялась psiRNA, и клетки снова инфицировались и тестировались на про-IL1β, а также секрецию IL1β и IFNβ (B). Экспрессия TLR7 подавлялась psiRNA, и клетки снова инфицировались и тестировались на про-IL1β, а также секрецию IL1β и IFNβ (C). Экспрессия TLR4 подавлялась psiRNA, и клетки снова инфицировались и тестировались на про-IL1β, а также секрецию IL1β и IFNβ (D).Экспрессия TLR8 подавлялась псиРНК, и клетки снова инфицировались и тестировались на про-IL1β, а также секрецию IL1β и IFNβ (E). Экспрессия TLR2 подавлялась псиРНК, и клетки снова инфицировались и тестировались на про-IL1β, а также секрецию IL1β и IFNβ (F). Данные представляют собой среднее значение трех независимых экспериментов.

Однако некоторое количество IL1β все еще продуцируется, что позволяет нам полагать, что в дополнение к установленным сенсорам TLR еще может существовать дополнительный механизм для запуска продукции IL1β.

SH-опосредованный механизм активации инфламмасом

Чтобы выяснить, как инфекция RSV запускает сигнал 2, мы изучили вирусные белки RSV, которые увеличивают проницаемость мембран, поскольку было показано, что ионный канал гриппа M2 индуцирует активацию инфламмасом, модулируя внутриклеточную концентрацию K ⁺.15

Малый гидрофобный белок RSV был классифицирован как виропорин. Он изменяет проницаемость мембраны, проявляя свойства катион-селективного ионного канала.16,17 SH не важен для вирусной репликации in vitro (Bukreyev et al 1997). Однако делеция гена SH приводит к ослаблению на моделях мышей и шимпанзе, предполагая, что это важно для инфекционности in vivo (Bukreyev et al 1997; Whitehead et al 1999).

Для проверки роли SH в активации инфламмасом использовали мутантный RSV с делецией SH rgRSV-GF (ΔSHRSV) 10. В предыдущих исследованиях было показано, что мутант ΔSHRSV эффективно растет и реплицируется в культуре клеток.18 Инфекция rgRSV-GF не смогла вызвать активацию каспазы и высвобождение IL1β (фигура 3A). Однако клетки, инфицированные rgRSV-GF, высвобождали IL6, невоспалительный цитокин, IFNβ и про-IL1β. Инфекция RSV индуцировала продукцию каспазы 1, а инфекция rgRSV-GF — нет. Вместе эти результаты показывают, что SH играет важную роль в запуске сигнала 2, ведущего к продукции каспазы 1 и активации инфламмасом (рис. 3)

Рисунок 3

Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) и ΔSHRSV-опосредованный механизм активации инфламмасом.Эпителиальные клетки легких были инфицированы RSV или ΔSHRSV. Клеточный супернатант собирали и тестировали на секрецию IL1β (A), IL6 (B) и IFNβ (C). Экстракты клеток из инфицированных эпителиальных клеток легких анализировали на присутствие про-IL1β (D) и каспазы p10 (E) с помощью вестерн-блоттинга. Представленные данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов.

Для исследования механизма SH-индуцированной активации инфламмасом 10 мы инфицировали клетки RSV или rgRSV-GF и использовали препараты, которые блокируют ионный канал нескольких других виропоринов, таких как амантадин и римантадин, которые блокируют канал M2 гриппа, и HMA, которая блокирует канал Vpu ВИЧ, а также канал p7 вируса гепатита C, чтобы получить более полное представление о свойствах канала белка SH (рис. 4)

Рисунок 4

Влияние ингибиторов ионных каналов на активацию инфламмасом.Эпителиальные клетки легких инфицировали респираторно-синцитиальным вирусом и культивировали в присутствии или в отсутствие гексаметиленамилорида, амантадина, римантадина или EIPA, или бензамила или верапамила в течение 12 часов. Супернатанты собирали и тестировали на секрецию IL1β и IL6 с использованием системы массива шариков CBA (BectonDickinson). Флуоресценцию детектировали с помощью FACSCalibur (BectonDickinson). Представленные данные являются средним значением трех независимых экспериментов.

HMA успешно подавляет секрецию IL1β при инфицировании RSV.Однако при применении амантадина или римантадина подавления не наблюдалось. Наблюдая за эффектом HMA, мы затем исследовали действие других ингибиторов ионных каналов: EIPA и Benzamil, которые также блокируют ионные каналы Na ⁺ / H ⁺, и Verapamil, который блокирует каналы Ca ⁺. Верапамил не влиял на секрецию IL1β, тогда как HMA, EIPA и Benzamil снижали секрецию IL1β при инфекции RSV. Эти результаты предполагают, что SH-дисплеи селективны в отношении одновалентных катионов (Na ⁺ и K ⁺), как и белок p7 вируса гепатита С (HCV) (рисунок 4).

SH взаимодействий

Чтобы выяснить внутриклеточный механизм, с помощью которого SH активирует инфламмасому NLRP3, мы исследовали перенос SH в клетку. Предыдущие исследования показали, что сборка RSV и накопление SH происходит в структурах липидных рафтов на поверхности клетки и в доменах липидных рафтов в сети Гольджи.19

Клетки легких инфицировали фиксированным RSV и пропитывали 0,2% сапонином. Для мечения SH использовали ранее описанное антитело против SH. Белок SH локализован в эндоплазматическом ретикулуме и мембранах комплекса Гольджи.В то время как NLRP3 был распределен в цитоплазме и после инфицирования RSV, большая часть NLRP3, а также ASC была обнаружена в Golgi (рисунок 5).

Рис. 5

Локализация малых гидрофобных (SH), NLRP3 и ASC в Гольджи. Эпителиальные клетки легких стимулировали респираторно-синцитиальным вирусом (RSV) в течение 6 часов, а затем окрашивали mAb GM130, а затем — мышиным специфическим Ig Alexa 488-Fab для мечения системы Гольджи. Антитело против SH использовали для мечения белка SH RSV, за которым следовал мышиный специфический Ig Alexa 546-Fab.Ядро метили с помощью ядерного красителя Topro-3 (A). Стимулированные клетки (B, C) или клетки, стимулированные RSV в течение 6 часов (D, E), окрашивали на NLRP3 с использованием кроличьего анти-NLRP3 Fab, конъюгированного с Alexa 546, или козьего анти-ASC Fab, конъюгированного с Alexa 546. Ядро метили ядерным красителем Topro-3. Желтые области указывают на расположение рецепторов. Клетки получали с помощью конфокального микроскопа Zeiss 510. Прутки 10 мкм. Представленные данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение четырех независимых экспериментов.

Чтобы проанализировать роль мембран липидных рафтов в комплексе Гольджи в SH-индуцированной активации инфламмасом, клетки метили субъединицей холерного токсина B, конъюгированной с TRITC (CTX-TRITC). CTX связывается с маркером липидных рафтов GM1, и инкубация при более высоких температурах (от 25 ° C до 37 ° C) позволяет CTX интернализоваться и транспортироваться к Golgi.20 Мы использовали этот метод для маркировки липидных рафтов, обогащенных GM1, в Golgi. отсек. SH метили антителом SH, конъюгированным с Cy5, и использовали FRET, чтобы определить, находится ли белок SH в липидных рафтах.Мы обнаружили четкие сигналы FRET в инфицированных клетках, выявив ассоциации между SH и липидными рафтами, а также между NLRP3 и липидными рафтами (рис. 6А). Когда клетки обрабатывали нистатином, который разрушает кавеолы и липидные рафты, сигнал теряется. Этот результат согласуется с перераспределением NLRP3 и ASC, которое следовало за обработкой нистатином инфицированных клеток, показывая, что разрушение липидного рафа ингибирует активацию инфламмасом, поскольку перераспределение NLRP3 и ASC будет ингибировать их взаимодействия и образование инфламмасомы (фигура 7).Более того, продукция IL1β в инфицированных RSV клетках резко снижалась после лечения нистатином (фигура 6B).

Рис. 6

Взаимодействие липидных рафтов с малыми гидрофобными (SH) и NLRP3. Перенос энергии флуоресценции резонансный перенос энергии флуоресценции — это неинвазивный метод визуализации, используемый для определения молекулярных ассоциаций. Эпителиальные клетки легких стимулировали респираторно-синцитиальным вирусом (RSV) и культивировали в присутствии или в отсутствие 25 мкМ нистатина. Липидные рафты были обнаружены с использованием холерного токсина-TRITC для метки GM1.SH, NLRP3 или ASC были помечены специфическими антителами, конъюгированными с Cy5. Взаимодействия MHC-класса I с GM1 использовали в качестве отрицательного контроля, тогда как взаимодействия Golgi с GM1 использовали в качестве положительного контроля. MHC-class-I был обнаружен с использованием антитела W6 / 32, конъюгированного с Cy5. Гольджи окрашивали mAb GM130, конъюгированными с Cy5 (A). Клетки получали с помощью конфокального микроскопа Zeiss 510. Супернатанты также собирали из эпителиальных клеток легких, стимулированных RSV, и культивировали в присутствии или в отсутствие 25 мкМ нистатина или 10 мкМ брефельдина A и тестировали на секрецию IL1β с использованием системы массива шариков CBA (BectonDickinson) (B).Представленные данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение четырех независимых экспериментов.

Фиг.7.

NLRP3, перераспределение ASC при лечении нистатином. Эпителиальные клетки легких стимулировали респираторно-синцитиальным вирусом и затем либо оставляли без обработки (A), либо культивировали с 25 мкМ нистатином (B) или 10 мкМ брефельдином A (C). Гольджи окрашивали mAb GM130, а затем Ig, специфичным для мыши с Alexa 488-Fab. Клетки окрашивали на NLRP3, используя кроличий анти-NLRP3 Fab, конъюгированный с Alexa 546, и козий анти-ASC Fab, конъюгированный с Alexa 647.Клетки получали с помощью конфокального микроскопа Zeiss 510. Прутки 10 мкм. Представленные данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение четырех независимых экспериментов.

Чтобы проверить важность колокализации Гольджи в активации инфламмасом, мы использовали брефельдин A (BFA). Метаболит грибов BFA, как известно, вызывает быструю и обратимую разборку стека Гольджи на канальцы и везикулы, что приводит к перераспределению резидентных ферментов Гольджи и накоплению белков в эндоплазматическом ретикулуме (ER) обратимым образом.21, 22

Обработка BFA разобрала Golgi и привела к перераспределению NLRP3 и ASC (фигура 7C), что блокировало активацию инфламмасом с помощью RSV, поскольку не было продукции IL1β в супернатанте клеток, обработанных BFA (фигура 6B).

Обсуждение

В этом исследовании мы обнаружили, что RSV способен запускать активацию NLRP3. Это согласуется с недавним исследованием Segovia et al. Наши данные ясно демонстрируют, что RSV способен запускать активацию инфламмасомы NLRP3 самостоятельно, без необходимости праймирования клеток другим PAMP, поскольку ранее было доказано, что это необходимо для других вирусов, таких как вирус энцефаломиокардита и VSV.23 RSV, по-видимому, способен сам по себе обеспечивать как сигнал 1, так и сигнал 2 для активации инфламмасом. Остается вопрос: как срабатывают сигналы 1 и 2?

Чтобы ответить на этот вопрос, мы сначала исследовали, как запускается сигнал 1. Существует много потенциальных PRR, которые могут запускать сигнал 1 в случае RSV, например TLR4,12 TLR7,13 TLR3 и RIG-I.14. Чтобы выяснить, запускает ли один или несколько из этих PRR сигнал 1, мы сбили их экспрессия без обнаружения снижения секреции IL1β.Снижение транскрипции секреции IL1β наблюдалось только тогда, когда TLR4 был нокдаун, что позволяет предположить, что TLR4 является единственным ответственным за запуск сигнала 1 RSV-индуцированной активации инфламмасом.

Мы также сбили TLR2; однако он не влиял на секрецию IL1β. Эти данные противоречат данным Segovia et al , которые сообщили, что TLR2 запускает эти ответы. Различия, наблюдаемые в двух исследованиях, могут быть связаны с использованием разных типов клеток. Исследование Segovia et al в основном проводилось на нокаутных клетках мышей.Наше исследование было выполнено на эпителиальных клетках легких человека. Эти клетки являются основной мишенью человеческого RSV in vivo. В модели мыши RSV может быть обнаружен с помощью различных PRR.

Как только мы продемонстрировали, что сигнал 1 запускается TLR4, мы приступили к исследованию того, как запускается сигнал 2. Было предложено три модели. Одна модель подтверждает, что внеклеточный АТФ запускает отток K ⁺ 24 и индуцирует рекрутирование NLRP3, другая — высвобождение лизосомного содержимого, вызванное разрушением лизосом25, 26 и активацией NLRP3 из-за продукции ROS.27

Мы исследовали вирусные белки RSV, которые могут увеличивать проницаемость мембран, поскольку было показано, что ионный канал M2 гриппа индуцирует активацию инфламмасом, модулируя внутриклеточную концентрацию K ⁺.15 Белок RSV SH был классифицирован как виропорин. Во время инфицирования клеток вирусом проницаемость мембран изменяется за счет использования виропоринов, которые облегчают проникновение вируса. Основная активность виропоринов заключается в создании пор на биологических мембранах, позволяющих проходить ионам и небольшим молекулам; это полезно как при входе, так и при выходе вируса.

Чтобы определить, вносит ли белок SH RSV вклад в активацию NLRP3, мы использовали мутанты RSV, лишенные виропорина SH. В предыдущих исследованиях было показано, что эти мутанты растут и эффективно реплицируются в культуре клеток.18 Наши результаты демонстрируют, что мутанты RSV, лишенные виропорина SH, не могут запускать активацию инфламмасом, что позволяет предположить, что сигнал 2 запускается из белка SH, возможно, посредством образование поры или канала на плазматической мембране. Белок SH RSV присоединяется к растущему списку вирусных белков, которые, как было показано, образуют ионные каналы в липидных бислоях, включая пикорнавирус 2B, 28, 29 ВИЧ-1 Vpu30, 31 и HCV p7, которые проницаемы как для ионов Na +, так и для ионов K +, и отображают относительно низкая ионная селективность 32, а также виропорин гриппа M2, который проявляет протонную проводимость и, как было показано, активирует инфламмасому NLRP3.15

Было показано, что использование лекарств, блокирующих вирусные ионные каналы, способно ингибировать секрецию IL1β, вызванную инфекцией RSV, предполагая, что SH функционирует аналогично p7 HCV, который является селективным в отношении одновалентных катионов (Na + и K +).

Ранее было показано, что SH связывается с липидными рафтами на поверхности клетки, но после интернализации он накапливается в комплексе Гольджи внутри мембранных структур, обогащенных маркером липидных рафтов GM1.19 Наши исследования FRET подтвердили, что SH действительно локализован. внутриклеточно в липидных рафтах в мембранах Гольджи.Интересно, что NALP3, как было показано, накапливается в аппарате Гольджи и связывается с маркером липидного рафта GM1 при инфицировании RSV.

Липидные рафты — это специализированные мембранные микродомены, которые обеспечивают благоприятную среду для внутримолекулярных перекрестных помех, но также способствуют ускорению передачи сигнала. Несколько новых исследований обнаружили накопление ионных каналов и их модуляторов в липидных рафтах, 33, 34, что согласуется с нашими выводами. Липидные рафты находятся не только на плазматической мембране, но, как было показано, также накапливаются в сети Гольджи.Их функция там, как полагают, заключается в сортировке секреторных грузов, 35 и в случае RSV, они могут использовать это преимущество для своего механизма выхода.

Наши данные показывают, что при заражении RSV белок SH направляется в Гольджи, где он должен функционировать как ионный канал. Кроме того, существует транспорт NLRP3 из цитоплазмы в Гольджи, где он локализуется в структурах липидных рафтов. Эти внутриклеточные рафтовые структуры, по-видимому, имеют решающее значение для накопления ионных каналов и их модуляторов.Ощущение клеточного стресса, вызванного дисбалансом концентраций ионов во внутриклеточных везикулах, может быть общим путем распознавания вируса, который может использоваться инфицированной клеткой-хозяином для передачи сигнала об активации инфламмасом NLR.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом, предоставленным Исследовательской сетью для детей и молодежи (NISCHR, Уэльс). Авторы хотели бы поблагодарить докторов Mark Peeples и Peter Collins за вирусы rgRSV и rgRSV-GF, а также критическое прочтение рукописи и доктора Biao He за антисыворотку к белку SH.

Антитела

и местный цитокиновый ответ на инфекцию респираторно-синцитиального вируса у пожилых людей, проживающих в сообществе

РЕЗЮМЕ

Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) все чаще признается как вызывающий тяжелую заболеваемость и смертность у пожилых людей, но исследований по RSV- индуцированный иммунный ответ в этой популяции. Информация об иммунологических процессах, происходящих во время инфицирования RSV в конкретных группах риска, важна для рационального и целенаправленного дизайна новых вакцин и терапевтических средств.Здесь мы оценили реакцию антител и местных цитокинов на инфекцию RSV у пожилых людей, проживающих в сообществе (возраст ≥60 лет). В течение трех зим у участников исследования были взяты образцы сыворотки крови и мазка из носоглотки во время острой респираторной инфекции и выздоровления. Иммуноферментные анализы RSV IgG (ELISA) и анализы нейтрализации вирусов проводили на образцах сыворотки от RSV-инфицированных индивидуумов ( n = 41) и контролей ( n = 563 и n = 197, соответственно).Концентрации назального RSV IgA и цитокинов определяли с помощью мультиплексных иммуноанализов в подгруппе участников. Модель in vitro дифференцированных первичных эпителиальных клеток бронхов использовали для оценки индуцированных RSV цитокиновых ответов с течением времени. Статистически значимое увеличение титров нейтрализации сыворотки и концентраций IgG наблюдалось у участников, инфицированных RSV, по сравнению с контрольной группой. Во время острой инфекции RSV статистически значимая местная повышающая регуляция бета-интерферона (IFN-β), IFN-λ1, IFN-γ, интерлейкина 1β (IL-1β), фактора некроза опухоли альфа (TNF-α), IL-6, IL -10, CXCL8 и CXCL10.IFN-β, IFN-λ1, CXCL8 и CXCL10 также были активированы в эпителиальной модели после инфицирования RSV. В заключение, это исследование позволяет по-новому взглянуть на базовый иммунный ответ на инфекцию RSV в важной и малоизученной группе риска, обеспечивая выводы для будущих исследований, которые необходимы для профилактики и лечения тяжелого заболевания RSV у пожилых людей.

ВАЖНОСТЬ Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) может вызывать тяжелую заболеваемость и смертность в определенных группах риска, особенно среди младенцев и пожилых людей.В настоящее время нет (профилактического) лечения, за исключением частично эффективных, но очень дорогих моноклональных антител. Таким образом, RSV остается серьезной проблемой для общественного здравоохранения. Чтобы обеспечить целенаправленную разработку новых вакцин и терапевтических средств, очень важно понять иммунологические механизмы, лежащие в основе (защиты от) тяжелого заболевания в группах особого риска. Поскольку большинство исследований, связанных с RSV, сосредоточено на младенцах, имеются очень ограниченные данные о реакции на RSV у пожилых людей.Таким образом, в этом исследовании у пожилых людей, проживающих в сообществах, оценивали индуцированные RSV ответы антител и локальную секрецию цитокинов. Эти данные предоставляют новую информацию, которая будет способствовать продолжающимся усилиям по разработке безопасных и эффективных стратегий профилактики и лечения RSV в малоизученной группе риска.

ВВЕДЕНИЕ

Респираторно-синцитиальный вирус (RSV), который в первую очередь известен тем, что вызывает тяжелые заболевания у младенцев, вызывает тяжелую заболеваемость и смертность у пожилых людей (1–3).В глобальном масштабе острые респираторные инфекции, вызванные RSV, у пожилых людей, по оценкам, привели к 336 000 госпитализаций в 2015 году, что, по оценкам, стало причиной 14 000 смертей в стационаре и, вероятно, еще больше — за пределами больницы (3). За исключением частично эффективных и очень дорогих моноклональных антител (паливизумаб), которые используются только у младенцев с высоким риском (4), в настоящее время нет вакцин или специальных противовирусных препаратов, доступных для профилактики и лечения RSV-заболевания. Разработка безопасных и эффективных стратегий в значительной степени зависит от глубокого понимания иммунологических механизмов, лежащих в основе (защиты от) тяжелого заболевания.Однако эти механизмы и связанные с ними корреляты защиты могут не совпадать в разных группах риска. Например, в отличие от младенцев, пожилые люди уже перенесли несколько инфекций RSV на протяжении жизни и часто страдают от ослабления иммунитета. Несмотря на то, что существует огромное количество литературы об иммунном ответе человека на инфекцию RSV (обзор см. В ссылке 5), большинство исследований сосредоточено на детской популяции, и лишь в некоторых из них представлены данные об иммунном ответе у пожилых людей (6 –10).

Хотя большинство стратегий вакцинации против RSV, которые разрабатываются в настоящее время, нацелены на индукцию вирус-специфических антител, степень их вклада в защиту и их точные защитные механизмы остаются неопределенными (для обзора см. Ссылку 11). Частицы RSV содержат два основных поверхностных гликопротеина: белок прикрепления (G) и белок слияния (F). В частности, антитела, нацеленные на префузионную форму белка F (пре-F), по-видимому, опосредуют нейтрализацию (12), хотя G-специфические антитела также могут вносить свой вклад (13).Однако нейтрализующая способность RSV-специфического сывороточного иммуноглобулина G (IgG), по-видимому, плохо коррелирует с защитой in vivo (8, 14). Более высокие титры могут указывать на лучшие шансы на защиту, но защитный порог, вероятно, не существует (8, 14). Концентрация RSV-специфического IgA в слизистой оболочке носа, по-видимому, немного лучше коррелирует с защитой, чем уровень сывороточного IgG, но этот ответ недолговечен, и, опять же, установленный защитный порог отсутствует (8, 14, 15).Примечательно, что большинство исследований, изучающих реакцию антител на RSV, были сосредоточены на младенцах и лицах пожилого возраста.

RSV в первую очередь поражает эпителий верхних и нижних дыхательных путей. В то время как у большинства людей при заражении возникают лишь легкие симптомы, у младенцев и пожилых людей может развиться тяжелое, опасное для жизни заболевание, такое как бронхиолит и пневмония. Механизмы, лежащие в основе тяжелого RSV-заболевания, изучены не полностью, но нарушение регуляции иммунного ответа, например, из-за незрелого или ослабляющего иммунного ответа, по-видимому, является важным компонентом (обзор см. В ссылке 16).Примечательно, что продукция цитокинов в слизистой оболочке дыхательных путей, вероятно, имеет решающее значение для модуляции последующего иммунного ответа (для обзора см. Ссылку 17). Опять же, в то время как многие исследования предоставляют данные об экспрессии цитокинов слизистой оболочки у младенцев, данных, специфичных для пожилого взрослого населения, мало (9).

В этом исследовании антитела и местные цитокиновые ответы были оценены у инфицированных RSV пожилых людей (≥60 лет) во время острой инфекции и выздоровления. В сыворотке определяли титры RSV-специфической нейтрализации и концентрации IgG, а также концентрации антиген-специфических IgA и цитокинов в образцах из носа.Кроме того, был проведен эксперимент по инфицированию RSV с течением времени в первично дифференцированных эпителиальных клетках бронхов для идентификации цитокинов, которые, вероятно, происходят из эпителия. Вместе эти данные позволяют по-новому взглянуть на иммунный ответ на RSV у пожилых людей, что может способствовать целенаправленной разработке профилактических и терапевтических стратегий для RSV в этой малоизученной группе риска.

РЕЗУЛЬТАТЫ

РСВ-специфические титры нейтрализации сыворотки и концентрации IgG увеличиваются при инфицировании у пожилых людей.Способность к нейтрализации сыворотки и концентрация IgG — два наиболее часто оцениваемых параметра при изучении иммунного ответа на RSV. По этой причине мы сравнили эти две иммунологические характеристики между случаями с подтвержденной инфекцией RSV, во время острой инфекции и выздоровления через 8 недель, и контрольной группой без подтвержденной инфекции RSV при любой выборке во время исследования. Для схематического обзора различных групп, которые были проанализированы, см. Рис. 1A. Следует отметить, что в этом исследовании в контрольную группу без РСВ входили как люди без респираторных инфекций, так и люди с респираторными инфекциями, отличными от РСВ.Мы обнаружили, что средние титры нейтрализации сыворотки были выше во время фазы восстановления у RSV-инфицированных пациентов, чем во время острой инфекции или в контрольной группе без RSV-инфекции (рис. 2A), и что эти различия были статистически значимыми ( P < 0,001). Кроме того, средние титры нейтрализации были незначительно ниже у RSV-инфицированных пациентов во время острой инфекции, чем в контрольной группе без RSV-инфекции ( P = 0,06). Мы нашли сопоставимые результаты для RSV-специфических сывороточных концентраций IgG (рис.2B; Фиг. S1A), за исключением того, что в этом случае средняя концентрация IgG во время острой инфекции RSV была примерно такой же, если не немного выше, чем в контроле без инфекции RSV. Примечательно, что титры нейтрализации, специфичные для RSV, измеренные во время отбора проб в острой фазе, вероятно, уже увеличились по сравнению с уровнями до воздействия, поскольку можно наблюдать тенденцию к увеличению средних титров, коррелирующих с интервалом между началом лихорадки и взятием проб ( P = 0,06) (рис. 2С). Интересно, что мы наблюдали только слабую корреляцию между титрами нейтрализации сыворотки и концентрациями RSV-специфических IgG в контроле без инфекции RSV ( r = 0.3890, P < 0,001) (рис. 2D), что соответствует предыдущей литературе (8).

Рис. 1

Схематический обзор экспериментального плана исследования. (A) Полный набор данных включает лиц, инфицированных RSV ( n = 41), у которых были взяты образцы во время острой инфекции (<72 ч после начала лихорадки) и выздоровления (через 8 недель). Кроме того, были включены контрольные группы без инфекции RSV ( n = 563), некоторые из которых не были инфицированы, а некоторые имели респираторные инфекции, отличные от RSV.Собирали сыворотку и мазки из носоглотки и использовали их для различных анализов. (B) В течение сезона 2014–2015 гг. У участников с симптомами была проведена дополнительная выборка для раннего выздоровления через 2 недели после выборки для острой фазы. Это привело к подгруппе RSV-инфицированных людей ( n = 16), у которых образцы были взяты в трех временных точках: острая фаза, раннее выздоровление (+2 недели) и выздоровление (+8 недель). (C) Чтобы проанализировать местные IgA и цитокиновые ответы на RSV-инфекцию, мы отобрали 10 симптоматических участников с MLPA-подтвержденной RSV-инфекцией и без каких-либо других обнаруживаемых вирусных инфекций во время острой фазы.Все отобранные участники были отрицательными на какие-либо респираторные вирусные инфекции во время фазы выздоровления. В качестве здорового контроля мы отобрали 10 человек того же возраста и пола без симптомов, у которых во время отбора проб не было ни одной респираторной вирусной инфекции. ELISA, иммуноферментный анализ; IgA / IgG, иммуноглобулин A / G; М / Ж, мужчина / женщина; МИА — мультиплексный иммуноферментный анализ; MLPA, мультиплексная амплификация зонда, зависящая от лигирования; PRNT, тест нейтрализации уменьшения зубного налета; RSV, респираторно-синцитиальный вирус.

Рис. 2.

Серологический анализ RSV-инфицированных участников и контрольной группы. (A) Титры нейтрализации вируса определяли с помощью PRNT для контролей без RSV ( n = 197; белые кружки) и RSV-инфицированных лиц во время острой инфекции и выздоровления ( n = 40; черные кружки). (B) RSV-A-специфические сывороточные концентрации IgG определялись с помощью ELISA для контролей без RSV ( n = 563; белые кружки) и RSV-инфицированных лиц во время острой инфекции и выздоровления ( n = 41; черные кружки).PRNT и логарифмически трансформированные данные ELISA анализировали с использованием обычного одностороннего ANOVA с тестом множественного сравнения Тьюки. (C) Образцы участников были взяты <72 ч после начала лихорадки, в пределах от 0 до 3 дней. На графике показаны титры нейтрализации сыворотки в острой фазе в соответствии с интервалом между началом лихорадки и взятием пробы. Данные PRNT были проанализированы с использованием обычного одностороннего дисперсионного анализа. (D) Корреляция между данными PRNT и ELISA для контролей без RSV ( n = 196). Данные оценивали по корреляции Пирсона.(E) Титры нейтрализации вируса определяли с помощью PRNT для людей, инфицированных RSV ( n = 15) во время острой инфекции, раннего выздоровления (+2 недели) и выздоровления (+8 недель). (F) RSV-A-специфические сывороточные концентрации IgG определялись с помощью ELISA для RSV-инфицированных лиц ( n = 16) во время острой инфекции, раннего выздоровления (+2 недели) и выздоровления (+8 недель). Данные на панелях E и F были проанализированы с использованием теста Фридмана с тестом множественного сравнения Данна. (G и H) Концентрации F-специфического (G) и нуклеопротеинового (N) -специфического (H) назального IgA перед слиянием RSV определяли с помощью мультиплексного иммуноанализа в подгруппе участников.Все точки данных представляют отдельных участников, а линии указывают средние геометрические и 95% доверительные интервалы. * , P < 0,05; * * , P < 0,01; ** * , P < 0,001; нс, не имеет значения. ЕД / мл, условные единицы на миллилитр; ELISA, иммуноферментный анализ; IgA / IgG, иммуноглобулин A / G; PRNT, тест нейтрализации уменьшения зубного налета.

FIG S1

Дополнительные серологические анализы RSV-инфицированных участников и контрольной группы.(A) RSV-B-специфические сывороточные концентрации IgG определялись с помощью ELISA для контролей без RSV ( n = 562; белые кружки) и RSV-инфицированных лиц во время острой инфекции и выздоровления ( n = 41; черные кружки). Лог-преобразованные данные ELISA анализировали с использованием обычного одностороннего ANOVA с тестом множественного сравнения Тьюки. (B) RSV-B-специфические сывороточные концентрации IgG определялись с помощью ELISA для RSV-инфицированных лиц ( n = 16) во время острой инфекции, раннего выздоровления (+2 недели) и выздоровления (+8 недель).Данные были проанализированы с использованием теста Фридмана с тестом множественного сравнения Данна. (C — E) Концентрации RSV-специфического назального IgA определяли с помощью мультиплексного иммуноанализа для постфузионных F, G _A и G _B в подгруппе участников. Все точки данных представляют отдельных участников, а линии указывают средние геометрические и 95% доверительные интервалы. * *, P < 0,01; ** *, P < 0,001; нс, не имеет значения. ЕД / мл, условные единицы на миллилитр; ELISA, иммуноферментный анализ; IgA / IgG, иммуноглобулин A / G.Скачать FIG S1, файл TIF, 1,5 МБ. Авторские права © 2020 Yu et al.
Этот контент распространяется в соответствии с условиями международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0.

Для одной из когорт данного исследования (2014–2015 гг.) Было включено дополнительное время отбора проб через 2 недели после первоначального отбора образцов на острую инфекцию (рис. 1B). Данные, полученные от 16 RSV-инфицированных пациентов в этой когорте, показывают, что средние титры нейтрализации сыворотки и концентрации RSV-специфических IgG являются значительными ( P < 0.01) увеличивалось в этот момент раннего выздоровления по сравнению с таковыми во время острой инфекции (рис. 2E и F; рис. S1B). Более того, хотя это и не является статистически значимым, похоже, что как средний титр нейтрализации, так и концентрации IgG начали снижаться через 8 недель после острой инфекции по сравнению с уровнями, наблюдаемыми через 2 недели.

Принимая во внимание, что концентрации назального RSV-специфического IgA, как было показано, обеспечивают лучший показатель защиты, чем сывороточные антитела (8, 14), мы затем определили антиген-специфические назальные концентрации IgA с использованием мультиплексного иммуноанализа в подмножестве 10 RSV. -инфицированные пациенты как во время острой инфекции, так и в период выздоровления, а также 10 здоровых неинфицированных контрольных пациентов (рис.1С). В качестве антигенов мы включили как префузионные, так и пост-фузионные конформации белка F (пре-F и пост-F, соответственно), нуклеопротеина (N) и белков G как из штаммов группы A, так и из штаммов B (G _A и G _B). Несмотря на небольшое количество образцов и большую вариабельность, мы наблюдали явную тенденцию к увеличению средних назальных концентраций IgA для всех антигенов в случаях инфицирования RSV во время выздоровления по сравнению со здоровым контролем (рис. 2G и H; рис. S1C-E). Большая вариабельность концентрации IgA, наблюдаемая в группе с острой инфекцией, может свидетельствовать о том, что эта группа состояла из комбинации людей, некоторые из которых имели, а некоторые (еще) не ответили на инфекцию.

Титры нейтрализации сыворотки в острой фазе показывают слабую отрицательную корреляцию с продолжительностью кашля, которая не достигает статистической значимости. В течение периода исследования регистрировались даты начала и окончания симптомов заболевания, о которых сообщали сами пациенты. В качестве критерия отбора проб у всех подтвержденных RSV-инфицированных участников наблюдалась лихорадка, которая длилась в среднем 4,5 дня (95% доверительный интервал [ДИ] от 2,5 до 6,5) (рис. 3A). После инфицирования RSV подавляющее большинство участников также испытали кашель и ринит, продолжавшийся в среднем 16 лет.4 (95% ДИ, от 12,4 до 20,4) и 13,7 (95% ДИ, от 10,3 до 17,2) дня, соответственно (рис. 3A). Мы не наблюдали явной разницы в продолжительности симптомов между инфекциями RSV A и B (рис. 3A). Мы предположили, что титры нейтрализации сыворотки в острой фазе могут коррелировать с продолжительностью симптомов, но мы не смогли подтвердить или опровергнуть эту возможность с доступными данными (рис. 3B и C).
Рис. 3.
Анализ симптомов заболевания RSV по отношению к титрам нейтрализации сыворотки в острой фазе. (A) Были зарегистрированы даты начала и окончания симптомов болезни, о которых сообщали сами пациенты.Все точки данных представляют отдельных участников, а линии указывают средние значения и 95% доверительные интервалы. (B и C) Графики, показывающие корреляцию между титрами нейтрализации сыворотки в острой фазе (PRNT60) и продолжительностью кашля (B; n = 37) и ринита (C; n = 36) для участников, инфицированных RSV. Для некоторых участников была записана только дата начала кашля и ринита, и они были исключены из анализа ( n = 3 и n = 4, соответственно).Данные оценивали по корреляции Спирмена. PRNT, тест нейтрализации уменьшения зубного налета.

Инфекция RSV вызывает повышенную регуляцию различных цитокинов в слизистой оболочке носа у пожилых людей. Продукция цитокинов слизистой оболочки играет важную роль в модуляции (защитного или патогенного) иммунного ответа на RSV (17). Однако имеется мало данных о местном цитокиновом ответе, в частности, у пожилого взрослого населения (9). По этой причине мы оценили концентрации 13 цитокинов, которые, как известно, обычно участвуют в противовирусном ответе, в образцах из носа от подгруппы участников (рис.1С). Чтобы ограничить наши результаты именно ответом, опосредованным RSV, мы выбрали 10 людей, инфицированных RSV, у которых не было обнаружено дополнительных респираторных вирусов. Кроме того, эти люди дали отрицательный результат на все респираторные вирусы, включая RSV, во время отбора проб для восстановления. В качестве здорового контроля мы включили 10 образцов от участников соответствующего возраста и пола без симптомов инфекции, которые, кроме того, дали отрицательный результат на все респираторные вирусы, включенные в диагностическую панель.

Мы обнаружили статистически значимое увеличение назальных концентраций бета-интерферона (IFN-β), IFN-λ1, IFN-γ, интерлейкина 1β (IL-1β), фактора некроза опухоли альфа (TNF-α), IL-6, IL-10, CXCL8 и CXCL10 у лиц, инфицированных RSV, во время острой инфекции по сравнению со здоровым контролем (рис.4 и таблица 1). Кроме того, мы наблюдали статистически значимое снижение концентраций большинства этих цитокинов во время последующего наблюдения (выздоровления) у лиц, ранее инфицированных RSV, по сравнению с острой инфекцией, за исключением IFN-β. Мы не обнаружили статистически значимых различий между группами в назальной концентрации IFN-λ2 / 3 (рис. 4C и таблица 1), и мы не смогли обнаружить IFN-α2, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF). , и IL-12p70 в любой из групп (рис.S2A). Примечательно, что отсутствие обнаружения этих цитокинов не обязательно означает их отсутствие in vivo , поскольку это также может быть объяснено специфическими для цитокинов проблемами с обработкой, хранением или анализом образцов.
Рис. 4.
Повышенная регуляция назальных цитокинов у пожилых людей, инфицированных RSV. Мультиплексный иммуноанализ использовали для определения назальной концентрации IFN-β (A), IFN-λ1 (B), IFN-λ2 / 3 (C), IFN-γ (D), IL-1β (E), TNF- α (F), IL-6 (G), IL-10 (H), CXCL8 (I) и CXCL10 (J). Образцы мазков из носоглотки были собраны у участников исследования в течение 72 часов с момента появления лихорадки (острый RSV; n = 10) и контрольной группы без респираторной вирусной инфекции (здоровые; n = 10).Образцы были взяты у людей, инфицированных RSV, во время выздоровления, через 8 недель (выздоровление; n = 10). Точки данных представляют отдельных участников, а линии указывают средние геометрические концентрации и 95% доверительные интервалы. Измерения ниже предела обнаружения были установлены в 0,5 раза ниже нижнего предела обнаружения. Непарные образцы от здоровых и остро инфицированных RSV лиц сравнивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Парные выборки от людей во время острой RSV-инфекции и выздоровления сравнивали с использованием непараметрического критерия Уилкоксона с соответствующими парными знаками. * , P < 0,05; * * , P < 0,01; ** * , P < 0,001; нс, не имеет значения. Пунктирными линиями обозначен нижний предел обнаружения. IFN, интерферон; ИЛ, интерлейкин; RSV, респираторно-синцитиальный вирус; TNF, фактор некроза опухоли.
ТАБЛИЦА 1
Концентрации цитокинов в носу у RSV-инфицированных лиц (острый RSV) и неинфицированных контрольных (здоровых и выздоравливающих) ^a ^, ^b

FIG S2
Цитокины, оставшиеся ниже предела обнаружения или не изменились при инфицировании RSV.(A) Мультиплексный иммуноферментный анализ использовали для определения концентрации IFN-α2, GM-CSF и IL-12p70 в образцах из носа. Образцы мазков из носоглотки были собраны у участников исследования в течение 72 часов с момента появления лихорадки (острый RSV; n = 10) и контрольной группы без респираторной вирусной инфекции (здоровые; n = 10). Образцы были взяты у людей, инфицированных RSV, снова во время выздоровления, через 8 недель (выздоровление; n = 10). Точки данных представляют отдельных участников, а линии указывают средние геометрические концентрации и 95% доверительные интервалы.Измерения ниже предела обнаружения были установлены в 0,5 раза ниже нижнего предела обнаружения. Пунктирная линия указывает нижний предел обнаружения. (B) Мультиплексный иммуноанализ использовали для определения концентраций IFN-α2, IFN-γ, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-10, GM-CSF и IL-12p70 в базолатеральной среде и апикальной образцы отмывки ложных или RSV-инфицированных культур HAE. Образцы собирали через 12-336 ч после инфицирования из имитаций и RSV-инфицированных культур HAE, полученных от трех отдельных доноров. Значения представляют собой средние геометрические концентрации и стандартные отклонения.Измерения ниже предела обнаружения были установлены в 0,5 раза ниже нижнего предела обнаружения. Пунктирными линиями обозначен нижний предел обнаружения. Скачать FIG S2, файл TIF, 2,5 МБ. Авторские права © 2020 Yu et al.
Этот контент распространяется в соответствии с условиями международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0.

RSV инфицирует реснитчатые клетки в культурах первично дифференцированных HAE. Для дальнейшего выяснения цитокинового ответа слизистой оболочки на RSV-инфекцию мы использовали культуры первичного эпителия дыхательных путей человека (HAE) in vitro на поверхности раздела воздух-жидкость на поверхности раздела , чтобы выделить специфический цитокин врожденного эпителия. отклик.Мы инокулировали культуры HAE двумя штаммами RSV-A (RSV-A2 и RSV-X) и одним штаммом RSV-B (WA / 18537/62) и собирали образцы в различные моменты времени (от 12 до 336 часов). Схематическое изображение экспериментальной установки см. На рис. 5А. Сначала мы подтвердили успешное инфицирование культур HAE, выполнив анализ вирусного титрования во времени апикальных промывных образцов (рис. 5B). Три штамма демонстрировали сходные кривые роста, достигая пиковых титров через 48-72 часа после инфицирования (hpi). Инфекция RSV-B привела к самым низким пиковым титрам, отражающим либо более низкую эффективность репликации, либо ограниченное высвобождение вирусных частиц из слоя эпителиальных клеток.В конечном итоге репликация вируса достигла стабильной фазы с продолжением продуцирования инфекционных вирусных частиц по крайней мере до 14 дней после инфицирования (336 hpi). Помимо титрования, мы провели иммунофлуоресцентную микроскопию для оценки распространения инфекции в культурах HAE для RSV-A2 и RSV-X. Для этого эпителий окрашивали на наличие инфекции RSV (белок G; зеленый), реснитчатых клеток (β-тубулин; красный) и бокаловидных клеток, продуцирующих слизь (муцин 5B; фиолетовый). Мы наблюдали постепенное увеличение количества инфицированных клеток от 12 до 48 hpi для обоих штаммов вируса (рис.5С; Рис. S3A). Как описано ранее, инфекция RSV ограничивалась реснитчатыми клетками (18, 19). В соответствии с наблюдаемым постоянством продуцирования инфекционного вируса, инфицированные клетки все еще можно было обнаружить при 336 hpi (фиг. 5D; фиг. S3B). В то время как инфекция RSV, по-видимому, не сильно влияла на структурную целостность эпителия до 48 hpi, мы наблюдали образование синцития и явное уменьшение ресничек на 336 hpi.
Рис. 5.
Инфекция RSV первичных культур эпителия дыхательных путей человека (НАЕ) на границе раздела воздух-жидкость.(А) Схематическое изображение экспериментальной установки. (B) Титрование (TCID ₅₀) образцов апикальной промывки, собранных через 12-336 ч после инфицирования RSV-инфицированными культурами HAE, полученными от трех отдельных доноров в ходе двух независимых экспериментов. Линии указывают средние геометрические титры со стандартными отклонениями. (C и D) Культуры HAE инфицировали RSV-A2 или RSV-X или ложно инфицировали, как указано, и инкубировали в течение 12, 24 и 48 часов (C) и 336 часов (D). Бокаловидные клетки, RSV-инфицированные клетки и реснитчатые клетки были впоследствии визуализированы путем окрашивания на муцин 5B (MUC5B; фиолетовый), белок G RSV (зеленый) и β-тубулин (β-TUB; красный), соответственно.Ядра окрашены DAPI (синий). Изображения взяты от одного репрезентативного донора. Прутки, 20 мкм.

FIG S3
Иммунофлуоресцентное окрашивание RSV-инфицированных культур HAE. (A) Параллельно с инфекциями RSV, результаты которых показаны на фиг. 4, культуры HAE были ложно инфицированы и инкубированы в течение 12, 24 и 48 часов. (B) Культуры HAE инфицировали RSV-A2 или RSV-X или ложно инфицировали, как указано, и инкубировали в течение 336 часов. Бокаловидные клетки, RSV-инфицированные клетки и реснитчатые клетки были впоследствии визуализированы путем окрашивания на муцин 5B (MUC5B; фиолетовый), белок G RSV (зеленый) и β-тубулин (β-TUB; красный), соответственно.Ядра окрашены DAPI (синий). Изображения на панели A получены от донора, представленного на фиг. 4; изображения на панели B получены от двух дополнительных доноров. Прутки, 20 мкм. Скачать FIG S3, файл JPG, 2,2 МБ. Авторские права © 2020 Yu et al.
Этот контент распространяется в соответствии с условиями международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0.

RSV индуцирует экспрессию ограниченного числа цитокинов в дифференцированных эпителиальных культурах дыхательных путей. Наконец, мы использовали как базолатеральную среду, так и образцы апикальной промывки RSV-инфицированных HAE культур в разное время после инфицирования для оценки концентраций панели цитокинов, используемых для назального введения. образцы.Мы обнаружили заметную повышающую регуляцию IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2 / 3, CXCL8 и CXCL10 в образцах базолатеральной среды после инфицирования RSV по сравнению с имитацией инфекции, начиная с 24-48 hpi (рис. 6). Эти концентрации достигли плато около 96 hpi и оставались стабильными до 336 hpi. За исключением CXCL8, мы наблюдали аналогичный RSV-опосредованный ответ в образцах апикальной смывки, хотя отличие от ложной инфекции, как правило, было менее выраженным, чем наблюдаемое для образцов базолатеральной среды.Следует отметить, что в отличие от других цитокинов, которые были измерены, базальные уровни CXCL8 были очень высокими, и увеличение по сравнению с ложно-инфицированными культурами наблюдалось только в образцах базолатеральной среды, а не в образцах апикальной промывки (рис. 6G и H). Хотя в целом три штамма вируса показали сходный образец индукции цитокинов, ответ, индуцированный RSV-X, постоянно немного опережал по времени ответ, индуцированный RSV-A2 и RSV-B. Этот более ранний ответ, по-видимому, коррелирует с несколько более эффективной репликацией и / или распространением RSV-X, чем RSV-A2 и RSV-B, в первые дни заражения (рис.5B и C). После инфицирования RSV концентрации IFN-α2, IFN-γ, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-10, GM-CSF и IL-12p70 в базолатеральной среде и апикальных смывах были ниже предела. обнаружения или существенно не отличались от таковых в ложно инфицированных культурах (рис. S2B).
Рис. 6.
Повышающая регуляция цитокинов в базолатеральной среде и апикальных смывах культур HAE, инфицированных RSV. Мультиплексный иммуноанализ использовали для определения концентрации IFN-β (A и B), IFN-λ1 (C и D), IFN-λ2 / 3 (E и F), CXCL8 (G и H) и CXCL10 (I и J).Образцы базолатеральной среды и апикальной смывки собирали через 12–336 ч после инфицирования из имитаций и RSV-инфицированных культур HAE, полученных от трех отдельных доноров, в двух независимых экспериментах. Значения представляют собой средние геометрические концентрации и стандартные отклонения. Измерения ниже предела обнаружения были установлены в 0,5 раза ниже нижнего предела обнаружения. Пунктирными линиями обозначен нижний предел обнаружения. HAE — эпителиальный слой дыхательных путей человека; IFN, интерферон; RSV, респираторно-синцитиальный вирус.

ОБСУЖДЕНИЕ

Поскольку большинство исследований иммунного ответа на RSV-инфекцию у людей сосредоточено на младенцах, имеется лишь ограниченная информация об иммунном ответе, защитном или патогенном, на RSV у пожилых людей.В настоящем исследовании мы показываем, что инфекция RSV у пожилых людей, проживающих в сообществе (возраст ≥60 лет), вызывает повышение сывороточных титров нейтрализации RSV и концентрации RSV-специфических IgG. Кроме того, мы обнаружили, что инфекция RSV в этой популяции приводит к усилению активности в слизистой оболочке носа IFN-β, IFN-λ1, IFN-γ, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-10, CXCL8 и CXCL10. Наконец, в модели in vitro дифференцированных первичных эпителиальных клеток бронхов человека мы наблюдали опосредованную RSV повышающую регуляцию IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2 / 3, CXCL8 и CXCL10.

Предыдущие исследования показали, что титры нейтрализации RSV сыворотки до контакта и концентрации RSV-специфических IgG не очень хорошо коррелируют с защитой от инфекции (8, 14). Хотя очевидно восприимчивые люди, как правило, демонстрируют несколько более низкие титры и концентрации, чем те, кто не заразился, вероятно, не существует порогового уровня, выше которого они гарантированно защищены от инфекции. Из-за отсутствия исходных образцов для RSV-инфицированных участников нашего исследования мы не смогли подтвердить, что у восприимчивых людей были более низкие титры до воздействия, чем у тех, кто предположительно был защищен, т.е.е. контроли без инфекции RSV. Однако, учитывая, что мы наблюдали увеличение титров нейтрализации сыворотки в зависимости от интервала между началом лихорадки и взятием образцов, и учитывая существующие данные от пожилых людей, показывающие, что титры нейтрализации сывороточного RSV начинают увеличиваться в течение 1-3 дней от начала заболевания (9 ), вполне вероятно, что в нашем исследовании титры нейтрализации RSV до контакта с RSV-инфицированными участниками были на самом деле немного ниже, чем в контрольной группе. Таким образом, кажется, что (нейтрализующие) антитела действительно способствуют, по крайней мере частично, защите от RSV-инфекции у пожилых людей, но будущая работа также должна учитывать роль клеточного иммунитета как дополнительного средства защиты.

Важным фактором, усложняющим оценку исследований, подобных представленному здесь, является тот факт, что из-за своего наблюдательного характера контрольная группа, вероятно, состоит из лиц с переменным воздействием RSV. По этой причине вполне вероятно, что некоторые из контрольных субъектов не заразились RSV не из-за своего иммунного статуса, а просто потому, что они не подвергались воздействию вируса. Использование экспериментальных и контролируемых моделей инфицирования человека позволило бы обойти эту проблему, но по этическим соображениям такие исследования нельзя проводить с пожилыми людьми, которые обычно подвергаются повышенному риску серьезных осложнений.Другой вариант — сосредоточить исследования на пожилых людях, часто контактирующих с маленькими детьми, поскольку воздействие RSV в этой группе, вероятно, будет более распространенным. Титры и концентрации нейтрализующих RSV-специфических антител, по-видимому, начали снижаться через 8 недель после острой инфекции. Для будущих исследований было бы интересно провести более длительное наблюдение, чтобы дополнительно охарактеризовать динамику и продолжительность ответа антител, специфичных к RSV, у пожилых людей.

Как показано в этом и других исследованиях, все взрослые имеют сывороточные антитела, специфичные к RSV, которые обладают различной способностью к нейтрализации вирусов (8, 14).Когда эти вирус-специфические антитела не способны полностью предотвратить инфекцию, как это часто бывает, они все еще могут смягчить развитие тяжелого заболевания, например, за счет привлечения и активации (врожденных) иммунных клеток посредством Fc-опосредованные взаимодействия (обзоры см. В ссылках 11 и 20). Недавно мы показали, что у младенцев способность RSV-специфических антител активировать естественные клетки-киллеры может способствовать защите от тяжелых заболеваний (21).Напротив, эти антитела потенциально также способствуют развитию тяжелого заболевания в процессе, называемом антителозависимым усилением (ADE) инфекции и / или воспаления. Дальнейшие исследования у пожилых людей, включая пациентов с различной степенью тяжести заболевания RSV и исходные образцы, необходимы для выяснения механизмов, с помощью которых RSV-специфические антитела предотвращают, смягчают и / или способствуют возникновению тяжелой патологии RSV в этой конкретной популяции. Мы обнаружили слабую корреляцию между сывороточной концентрацией IgG и титрами нейтрализации, что также было описано другими (8).Такие наблюдения подчеркивают важность включения функциональных анализов (например, нейтрализации и Fc-опосредованной функциональности) в исследования ответа антител на RSV. В то время как концентрация, конечно, является важным фактором, функциональность антитела также сильно зависит от состава изотипа и подкласса, специфичности антигена и эпитопа и гликозилирования Fc. Характеристика ответа антител в самом широком смысле с помощью комплексного системного серологического подхода, вероятно, обеспечит важное понимание роли RSV-специфических антител в защите от RSV-инфекции и заболевания (22).

В дополнение к ответу антител мы оценили концентрации цитокинов слизистой оболочки в носовых образцах пожилых людей и обнаружили, что некоторые из них были активированы явно RSV-зависимым образом. В то время как ассоциация между концентрацией IL-6 в носу и тяжестью заболевания RSV у взрослого населения была ранее описана (9), насколько нам известно, повышение уровня IFN-β, IFN-λ1, IFN-γ, IL-1β, TNF-α , IL-10, CXCL8 и CXCL10 при инфицировании RSV у пожилого взрослого населения ранее конкретно не демонстрировалось.Примечательно, что ранее было показано, что большинство этих цитокинов играют (полезную и / или вредную) роль в опосредованном RSV заболевании у детей (обзор см. В ссылке 5). В этой молодой популяции была описана защитная роль IFN-γ (23-25), в то время как различная связь с тяжестью заболевания была обнаружена для IL-6 (26-28) и IL-10 (28, 29), и вредная роль была предложена для IL-1β (26, 27), TNF-α (26), CXCL8 (26, 27) и IFN-λ (30). Необходимы дальнейшие исследования для оценки роли этих цитокинов в патогенезе RSV у пожилых людей, например, путем сравнения пациентов с различной степенью тяжести заболевания.

В этом исследовании мы обнаружили, что уровни IFN-β, IFN-λ1, CXCL8 и CXCL10 повышены как in vivo , так и in vitro , подчеркивая потенциал модели культуры HAE в повторении in vivo воспалительная реакция. Поскольку эпителиальная модель имеет менее сложный клеточный состав, чем слизистая оболочка носа, мы обнаружили повышенную регуляцию меньшего количества цитокинов в модели in vitro , чем в модели in vivo . Например, мы не обнаружили IL-1β in vitro , тогда как это был один из цитокинов с наиболее выраженной активацией in vivo .Действительно, было показано, что опосредованная RSV экспрессия этого цитокина у мышей требует присутствия нейтрофилов и макрофагов (31).

Наши результаты in vitro в значительной степени повторяют то, что ранее было обнаружено в сопоставимых дифференцированных эпителиальных моделях, которые в основном были получены от детей: повышенная регуляция CXCL8, CXCL10 и IFN-λ1 (32–35), в то время как IL-1β и TNF- α не выражены (34). Примечательно, что предыдущие исследования, посвященные ответу на инфекцию RSV в недифференцированных эпителиальных клетках, действительно сообщали о повышении регуляции IL-1β, TNF-α и IFN-γ (36–38), подчеркивая некоторые различия между этими моделями.В то время как несколько исследований ранее описывали индуцированную RSV активацию IL-6 в дифференцированных эпителиальных клетках (32–34), мы не наблюдали заметных изменений в секреции IL-6 в нашей модели in vitro . Кроме того, мы наблюдали явную индукцию секреции IFN-β и IFN-λ2 / 3, чего не было в более ранних исследованиях (33, 34). Использование различных штаммов RSV (39) и методов культивирования и / или анализа может объяснить эти расхождения. Поразительно, что в отличие от наших результатов in vitro , мы не наблюдали RSV-зависимую активацию IFN-λ2 / 3 in vivo .Возможное объяснение этой разницы заключается в том, что наша модель in vitro и получена из клеток бронхов, тогда как in vivo мы исследовали слизистую оболочку носа. Действительно, в предыдущих исследованиях сообщалось о различиях в уровнях экспрессии цитокинов между эпителиальными клетками бронхов и носа (33). Было бы особенно интересно провести одноклеточное секвенирование носовых щеток от людей, инфицированных RSV, чтобы расшифровать точное клеточное происхождение различных цитокинов in vivo и выяснить, как различные эпителиальные модели in vitro и сравниваются с in vivo. vivo ситуация.Кроме того, модели in vitro совместно с дифференцированных эпителиальных и иммунных клеток дыхательных путей, вероятно, дадут новое понимание их взаимодействия и результирующих профилей экспрессии цитокинов.

В заключение, наше исследование позволяет по-новому взглянуть на иммунный ответ на инфекцию RSV у пожилых людей. Дальнейшая работа с пожилыми людьми должна быть направлена на выяснение вклада функций антител (опосредованных Fc) в защиту, а также с учетом роли клеточного иммунитета.Исследования, сравнивающие пациентов с РСВ с различной степенью тяжести заболевания, необходимы для установления роли цитокинов, функциональности антител и клеточного иммунитета в (защите от) прогрессирования до тяжелого заболевания. Взятые вместе, такие исследования обеспечат основу для рациональной разработки целевых стратегий профилактики и лечения RSV-инфекции в малоизученной популяции с высоким риском.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования. Клинические образцы были получены в рамках проспективного наблюдательного когортного исследования, проведенного в Нидерландах зимой 2011-2012, 2012-2013 и 2014-2015 годов для оценки распространенности гриппоподобных заболеваний. болезнь (ГПЗ) у пожилых людей, проживающих в сообществе (40).Участники в возрасте ≥60 лет были набраны через их терапевтов или через службу записи актов гражданского состояния. Критерии исключения не использовались. Письменное информированное согласие было получено от всех участников. Вся деятельность, связанная с исследованием, проводилась в соответствии с надлежащей клинической практикой, которая включает положения Хельсинкской декларации. Исследование было одобрено признанным этическим комитетом METC Noord-Holland (http://www.trialregister.nl; NL3234 и NL4666).

Участников попросили сообщить о возникновении ГПЗ в соответствии с критериями Голландского Пел, определяемых лихорадкой (≥37.8 ° C) по крайней мере с одним другим симптомом из следующих: головная боль, миалгия, боль в горле, кашель, ринит или боль в груди (41). В течение 72 часов после начала лихорадки, то есть во время острой фазы, медсестра-исследователь собрала образцы во время посещения на дому. Второй отбор образцов был проведен через 8 недель (± 1 неделя) во время фазы восстановления. В когорте 2014-2015 гг. Дополнительная выборка была проведена через 2 недели после острой фазы. Регистрировались даты начала и окончания симптомов заболевания, о которых сообщают сами пациенты. В качестве контрольной группы здоровых людей в течение всего сезона брали образцы от субъектов без симптомов инфекции, участвовавших в одном когортном исследовании.Характеристики участников для всех групп и подмножеств можно найти в Таблице S1. Статистически значимых различий по возрасту и полу между группами не было.

ТАБЛИЦА S1
Характеристики участников. a. В контрольную группу «без RSV» входили как люди без инфекции, так и люди с респираторными инфекциями, отличными от RSV. б) Возраст 2 человек не регистрировался, и они были исключены из анализа характеристик; единственному участнику было 59 лет. c. Пол 16 человек не регистрировался, и они были исключены из анализа характеристик.г — непараметрический критерий Манна-Уитни. д, точный тест Фишера. е. В образцах, взятых у этих людей, респираторных вирусов обнаружено не было. g. Никаких респираторных вирусов, кроме RSV, не было обнаружено в образцах от этих людей во время острой фазы, и респираторные вирусы, включая RSV, не были обнаружены у этих людей во время выздоровления. Скачать Table S1, PDF-файл, 0,1 МБ. Авторские права © 2020 Yu et al.
Этот контент распространяется на условиях Creative Commons Attribution 4.0 Международная лицензия.

Отбор проб и диагностика. Образцы сыворотки отбирали в пробирки для сбора сыворотки с активатором сгустка и гелевым сепаратором, разделяли на аликвоты в течение 8 часов и хранили при -80 ° C. Образцы из носоглотки получали с помощью стерильного тампона с ворсистым нейлоновым наконечником и хранили в 1 мл модифицированной жидкой транспортной среды Amies (Eswab; Копан, Брешиа, Италия). Образцы мазков транспортировали при комнатной температуре в лабораторию, где образцы встряхивали, разделяли на аликвоты и хранили при -80 ° C в течение 8 часов после отбора.Диагностика проводилась на всех мазках из носоглотки с помощью метода мультиплексной лигирования-зависимой амплификации зонда (MLPA) для широкой панели респираторных вирусных патогенов, включая вирусы гриппа A и B, RSV A и B, метапневмовирус человека, носорог / энтеровирус, аденовирус, парагрипп. вирусы с 1 по 4, бокавирус и коронавирус NL63 / OC43 / 229E / HKU1 (RespiFinder Smart 22; PathoFinder, Маастрихт, Нидерланды).

Клеточные линии и вирусы. Клетки Vero (ATCC CCL-81) культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM; Gibco).Клетки HEp2 (ATCC CCL-23) культивировали в минимальной необходимой среде (MEM; Gibco). Все среды были дополнены 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сывороткой (HyClone, Fisher Scientific) и 1% пенициллина, стрептомицина и глутамина (Gibco).

RSV-A2 человека (ATCC VR-1540) размножали на клетках HEp2. RSV-98-25147-X (здесь X; GenBank FJ948820), RSV-X-GFP7 (42) и RSV-B / WA / 18537/62 (здесь B) размножались на клетках Vero. Исходные вирусы, используемые для экспериментов по заражению, очищали осаждением полиэтиленгликолем (А2) или ультрацентрифугированием между слоями 10% и 50% сахарозы (X и B).Титры вирусов определяли с помощью анализа 50% инфекционной дозы культуры ткани (TCID ₅₀) на клетках Vero в соответствии с методом Спирмена и Карбера (43) и пересчитывали в БОЕ на миллилитр путем умножения на 0,69.

Серологические анализы. Концентрации IgG в сыворотке, специфичных к RSV, определяли с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). Планшеты Immulon покрывали RSV-A2 (инактивированным 2% Triton X-100) или очищенным RSV-B. После блокирования 2% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в фосфатно-солевом буфере (PBS) планшеты инкубировали с сывороткой, разведенной 1: 1500 в PBS, содержащем 0.1% Tween 80. После промывки планшеты инкубировали с поликлональными кроличьими антителами против человеческого IgG (Dako), конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP), и активность HRP оценивали с использованием одного раствора TMB (3,3 ‘, 5,5-тетраметилбензидин) (Life Technologies) на планшет-ридере для ELISA. Для этого анализа мы включили образцы острой фазы и выздоровления от всех участников, инфицированных RSV ( n = 41), выборку образцов (либо острых случаев, либо здоровых людей из контрольной группы) от участников без подтвержденного RSV при любой выборке во время исследования ( n = 563), а также дополнительные двухнедельные образцы от RSV-инфицированных участников в когорте 2014-2015 гг. ( n = 16).

Титры нейтрализации вируса определяли с помощью теста нейтрализации уменьшения бляшек (PRNT) с использованием RSV-X-GFP7, как описано ранее (42). Образцы, включенные в этот анализ, были по существу такими же, как и для ELISA, за исключением того, что данные PRNT не регистрировались и не измерялись для одного человека, инфицированного RSV, и меньшее количество участников без RSV было включено в качестве контроля ( n = 197).

Концентрации RSV-специфического IgA определяли в образцах из носа с помощью мультиплексного иммуноанализа, по существу, как описано ранее (44).Флуоресцентные шарики (Bio-Rad Laboratories) покрывали белком RSV pre-F, post-F, N, G _A или G _B, и связанный IgA детектировали с использованием козьего F (ab ‘) 2 против человека. IgA, конъюгированный с фикоэритрином (PE) (Southern Biotech). Для этого мы отобрали 10 участников с симптомами, у которых была подтверждена MLPA-инфекция RSV, и не было других обнаруживаемых вирусных инфекций во время острой фазы. Все отобранные участники были отрицательными на вирусные инфекции во время фазы выздоровления. В качестве здоровой контрольной группы мы выбрали 10 человек того же возраста и пола без симптомов, у которых во время отбора проб не было вирусной инфекции.

HAE культур на границе раздела воздух-жидкость. Первичные эпителиальные клетки дыхательных путей человека были получены от пациентов, перенесших лобэктомию легкого в Медицинском центре Амстердамского университета (A-UMC). Перед взятием образцов у всех пациентов было получено подписанное информированное согласие. Исследование проводилось в соответствии с правилами ЕС и было одобрено Советом по институциональной проверке A-UMC (2015_122 # A2301550). Здоровые эпителиальные клетки из иссеченной ткани выделяли и культивировали в соответствии с протоколом Fulcher и Randell (45).Для этого исследования использовали клетки от трех разных доноров (1 мужчина и 2 женщины; возраст 56, 57 и 71 год).

Первичные эпителиальные клетки дыхательных путей человека первоначально размножали в среде PneumaCult-ExPlus (номер 05040; Stemcell) в колбах T75, покрытых коллагеном типа I (VitroCol, 5007-20ML; Advanced Biomatrix). Когда достигалось 80-90% слияния, клетки трипсинизировали до одноклеточных суспензий и переносили в среду PneumaCult-ExPlus во вставки Transwell с размером пор 0,4 мкм (номер 3470; Corning), покрытые коллагеном типа IV (C7521-10MG; Сигма).По достижении слияния апикальную среду удаляли, а базолатеральную среду заменяли средой PneumaCult-ALI (номер 05001; Stemcell) для инициации дифференцировки на границе раздела воздух-жидкость.

Инфекция. После 6 недель дифференцировки 1 × 10 ⁵ БОЕ RSV-A2, -X или -B в общем объеме 200 мкл сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS) добавляли к апикальной стороне Вставки HAE, в то время как только HBSS использовался для имитации инфекции. После 2 ч инкубации при 37 ° C инокулят удаляли и апикальную сторону дважды промывали HBSS.В различные моменты времени отбирали образцы с апикальной стороны эпителия, промывая 200 мкл HBSS в течение 20 мин при 37 ° C. Образцы базолатеральной среды отбирали путем сбора 200 мкл среды и пополнения. Апикальные и базолатеральные образцы быстро замораживали и хранили при -80 ° C до дальнейшего анализа. Для иммунофлуоресцентного окрашивания клетки фиксировали в 4% -ном формальдегиде в течение 20 мин при комнатной температуре. Вставки промывали и хранили в PBS Дульбекко при 4 ° C.

Иммунофлуоресцентное окрашивание. Фиксированные культуры HAE были проницаемы в 0.1% Triton X-100 в течение 1 часа с последующей блокировкой в течение 30 минут в 1% BSA в PBS. Кроличьи антитела против MUC5B (sc-20119; Santa Cruz) и мышиные антитела против RSV-G (клон 021 / 19G) (46) инкубировали в течение 2 часов, а затем инкубировали в течение 1 часа с ослиными антителами против кроличьих IgG – Cy5 (711 -175-152; Jackson) и ослиного антимышиного IgG-A488 (A21202; Life Technologies) и заключительная инкубация в течение 1 ч с анти-β-тубулином-Cy3 (C4585; Sigma). Вставки заключали в VectaShield с 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI; H-1500; Vector Laboratories).Снимки были получены с помощью конфокального микроскопа Leica SP8. Макси-проекция выполнялась на плоскости z-стека.

Анализ цитокинов. Концентрации цитокинов в образцах из носа отобранных индивидуумов (подмножество, используемое для локальных измерений IgA [Рис. 1C]), образцы апикальной смывки HAE и образцы базолатеральной среды HAE определялись с использованием панели ответа на человеческий антивирус LEGENDplex (номер 740390; BioLegend) в соответствии с инструкциями производителя. Этот анализ содержал следующие мишени: IL-1β, IL-6, IL-8 / CXCL8, IL-10, IL-12-p70, IFN-α2, IFN-β, IFN-γ, IFN-λ1 / IL-29. , IFN-λ2,3 / IL-28A, B, CXCL10 / IP-10, GM-CSF и TNF-α.

Статистика. Все данные, полученные из клинических образцов, представлены в виде отдельных точек данных с геометрическим средним и 95% доверительным интервалом. PRNT и логарифмически трансформированные данные ELISA анализировали с использованием обычного одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с тестом множественного сравнения Тьюки. Корреляцию между данными PRNT и ELISA оценивали по корреляции Пирсона. Корреляцию между PRNT и продолжительностью симптомов оценивали по корреляции Спирмена. Данные, полученные для подгруппы участников с двухнедельной выборкой, были проанализированы с использованием теста Фридмана с тестом множественного сравнения Данна.Что касается данных по цитокинам, непарные образцы от здоровых и остро инфицированных RSV людей сравнивались с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни, а парные образцы от людей во время острой RSV-инфекции и выздоровления сравнивались с использованием непараметрического критерия согласованных пар Уилкоксона со знаком рангового ранга. Значение P <0,05 считалось статистически значимым. Статистический анализ проводился с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 8.2.1. Все данные, полученные на культурах HAE, представлены в виде средних геометрических концентраций со стандартными отклонениями.

БЛАГОДАРНОСТИ

Эта работа была поддержана Министерством здравоохранения, социального обеспечения и спорта Нидерландов (VWS) и Седьмым рамочным проектом Европейского Союза PREPARE (602525).

Мы благодарим всех участников за их время и приверженность к исследованию. Мы благодарим исследовательский персонал больницы Спаарне и сотрудников лаборатории Региональной лаборатории Кеннемерланд и Центра по контролю за инфекционными заболеваниями при Национальном институте общественного здравоохранения и окружающей среды.Мы благодарим Теуна Гичелаара и Герко ден Хартога за полезные обсуждения. Для мультиплексного иммуноанализа RSV pre-F любезно предоставил Ксандер де Хаан (Утрехтский университет), а RSV post-F и N любезно предоставил Mark Esser (AstraZeneca).

Мы заявляем об отсутствии конфликта интересов.

СНОСКИ

Получено 23 июня 2020 г.

Принято 13 августа 2020 г.

Copyright © 2020 Yu et al.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.

Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.

Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.

Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.

Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Сент-Джуд подписывает соглашение о коммерциализации вакцины против RSV

г.Детская исследовательская больница Джуда и Институт сыворотки Индии подписали лицензионное соглашение о завершении разработки и коммерциализации вакцины Святого Джуда против респираторно-синцитиального вируса (RSV), вируса, вызывающего серьезные инфекции нижних дыхательных путей. Младенцы подвергаются особенно высокому риску заражения, и в настоящее время нет одобренных вакцин.

Соглашение дает Институту сыворотки Индии право на разработку и проведение клинических испытаний запатентованной вакцины Святого Иуды, известной как SeVRSV.

«RSV остается серьезной угрозой для младенцев во всем мире в течение первого года жизни и для всех, включая детей, больных раком, чей иммунный ответ ослаблен болезнью или возрастом», — сказал Джеймс Р. Даунинг, доктор медицины, президент Сент-Джуда. и главный исполнительный директор. «Мы рады, что сотрудники и руководство Serum осознали жизненно важный потенциал этой вакцины. Мы надеемся на тесное сотрудничество с ними, чтобы сделать эту вакцину доступной во всем мире».

RSV является наиболее частой причиной инфекций нижних дыхательных путей у младенцев.Исследователи подсчитали, что во всем мире за один год до 34 миллионов детей в возрасте до 5 лет могут страдать от острой инфекции нижних дыхательных путей, вызванной RSV. Примерно 10 процентам этих детей может потребоваться госпитализация.

В вакцине Сент-Джуд используется вирус парагриппа мышей типа 1, который модифицирован так, чтобы нести ген RSV и запускать иммунный ответ человека. Для иммунной системы вирус парагриппа мышей типа 1 похож на вирус парагриппа человека типа 1, который является наиболее частой причиной крупа у детей.Исследователи из Сент-Джуда воспользовались этим сходством вакцины SeVRSV, чтобы подготовить иммунный ответ человека и защитить от серьезных заболеваний как RSV, так и круп.

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) подсчитала, что вакцина SeVRSV является одной из десятков потенциальных вакцин против RSV, разрабатываемых во всем мире. Доклинические испытания показали, что SeVRSV безопасен и эффективен. SeVRSV предназначен для введения младенцам через нос.

Сывороточный институт Индии Pvt.Ltd. является крупнейшим в мире производителем вакцин по количеству произведенных и проданных в мире доз более 1,3 миллиарда доз. Они поставляют вакцины против дифтерии, столбняка, коклюша, Hib, БЦЖ, r-гепатита B, полиомиелита, кори, эпидемического паротита и краснухи. По оценкам, 65 процентов детей в мире получают по крайней мере одну вакцину, произведенную компанией. Вакцины, производимые Институтом сыворотки Индии, аккредитованы ВОЗ и используются в национальных программах иммунизации примерно в 140 странах по всему миру, спасая миллионы жизней во всем мире.

Matching-jsac-R1.dvi

% PDF-1.4 % 1 0 obj > эндобдж 2 0 obj > эндобдж 3 0 obj > эндобдж 4 0 объект > поток 2012-07-15T15: 18: 36-07: 002013-06-06T12: 32: 23-07: 00dvips (k) 5.94b Copyright 2004 Radical Eye SoftwareAFPL Ghostscript 8.51application / pdf
Matching-jsac-R1.dvi
конечный поток эндобдж 5 0 obj > >> эндобдж 6 0 obj > >> эндобдж 7 0 объект > >> эндобдж 8 0 объект > >> эндобдж 9 0 объект > >> эндобдж 10 0 obj > >> эндобдж 11 0 объект > >> эндобдж 12 0 объект > >> эндобдж 13 0 объект > >> эндобдж 14 0 объект > >> эндобдж 15 0 объект > >> эндобдж 16 0 объект > >> эндобдж 17 0 объект > >> эндобдж 18 0 объект > поток x] [sqN) ox3NXeg6TɗжdYˑ / 2AH * kl = ڳ s ٙ A ǿ_ͳ =?> y {+ (jn2WφPPcgt8ln% _ ^ ʕ ^ a # l7 ڃ #%: wNmoo7CgFo7t (w (.x #: ᩓ`: Տ F (; eoDF! -, 4nNԋ | bs $ GPFM ~ UJO8hB! U? ޥ ‘Oҽ = Ҳ9HCE4BII5jr7 & te.N1 «/ Q9P ~ B_W # y $ # h ~ Fc) ~ 31v6Nyqhp,

% PDF-1.3 % 1 0 obj > поток конечный поток эндобдж 2 0 obj > эндобдж 6 0 obj > эндобдж 7 0 объект > эндобдж 8 0 объект > эндобдж 9 0 объект > эндобдж 10 0 obj > эндобдж 11 0 объект > эндобдж 12 0 объект > эндобдж 13 0 объект > эндобдж 14 0 объект > эндобдж 15 0 объект > эндобдж 16 0 объект > эндобдж 17 0 объект > эндобдж 18 0 объект > эндобдж 19 0 объект > эндобдж 20 0 объект > эндобдж 21 0 объект > эндобдж 22 0 объект > эндобдж 23 0 объект > эндобдж 24 0 объект > эндобдж 25 0 объект > эндобдж 26 0 объект > эндобдж 27 0 объект > эндобдж 28 0 объект > эндобдж 29 0 объект > эндобдж 30 0 объект > эндобдж 31 0 объект > эндобдж 32 0 объект > эндобдж 33 0 объект > эндобдж 34 0 объект > эндобдж 35 0 объект > эндобдж 36 0 объект > эндобдж 37 0 объект > эндобдж 5 0 obj > / ProcSet [/ PDF / Text] / ColorSpace> / Font> / Свойства >>> эндобдж 4 0 объект > поток hZr8} W * ĕcNLB3v $ ѫK2 =

Завершение начальных функций ключа дешифрования · da9f328316 — webif

@ -1,10 +1,10 @@

Пакет: webif

Приоритет: необязательно

Раздел: web

Версия: 1.4.3-2

Версия: 1.4.3-3

Архитектура: mipsel

Сопровождающий: [email protected]

Зависит от: tcpfix, webif-channelicons (> = 1.1.26), lighttpd (> = 1.4.39-1), jim (> = 0.77), jim-oo (> = 0.77), jim-sqlite3 (> = 0.77), jim-cgi (> = 0.7-1), jim-binary (> = 0.76), service-control (> = 2.3), busybox (> = 1.20.2-1), lsof (> = 4.87), epg (> = 1.2.8), hmt (> = 2.0 .10), ssmtp, cron-daemon (> = 1.18.3-3), at (> = 3.1.18), anacron, trm (> = 1.1), openssl-command, nicesplice, id3v2, file, rsvsync (> = 1.1.11), webif-диаграммы (> = 1.2-1), полосы (> = 1.4.1), tmenu (> = 1.21-2), ffmpeg (> = 2.8), id3v2, multienv (> = 1.6) , tcpping (> = 1.1), e2fsprogs, wireless-tools (> = 29-1), dbupdate, recmon (> = 2.0,7), hwctl, самородок (> = 0,98), sqlite3 (> = 3,15,1), jim-xconv

Зависит от: tcpfix, webif-channelicons (> = 1.1.26), lighttpd (> = 1.4.39-1), jim (> = 0.77), jim-oo (> = 0.77), jim-sqlite3 (> = 0,77), jim-cgi (> = 0,7-1), jim-binary (> = 0,76), управление службами (> = 2,3), busybox (> = 1.20.2-1), lsof (> = 4,87), epg (> = 1.2.8), hmt (> = 2.0.10), ssmtp, cron-daemon (> = 1.18.3-3), at (> = 3.1.18), anacron, trm (> = 1.1), openssl-command, nicesplice, id3v2, file, rsvsync (> = 1.1.11), webif-charts (> = 1.2-1), stripts (> = 1.4.2), tmenu (> = 1.21-2) , ffmpeg (> = 2.8), id3v2, multienv (> = 1.6), tcpping (> = 1.1), e2fsprogs, wireless-tools (> = 29-1), dbupdate, recmon (> = 2. Разное permalink Страница навигация Журнал учета трудовых книжек: Журнал учета трудовых книжек — скачать образец заполнения Плюсы пива: Пить ли пиво? Плюсы и минусы хмельного напитка Добавить комментарий Отменить ответ Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены * Комментарий * Имя * Email * Сайт Найти: Рубрики Бизнес Вложения Готовый Документ Документы Идеи Разное С нуля Советы Советы по продвижению Франшиза Браузерная игра OrbitalWars, является многопользовательской онлайн-игрой, одновременно в нее могут играть неограниченное кол-во человек. Тематика игры относится к разряду космических баталий за сферу влияния в космосе. В игре существует три корпорации, которые разместили свои базы на планетах, Марс, Венера и Земля. Каждая из воинственных корпораций подчинила себе определенное звездное пространство, которое является сферой патрулирования и защиты от налетов вражеских космических кораблей. Внутри корпораций существует деление на кланы, некоторые кланы воюют как с врагами корпорации, так и внутри ее со своими соплеменниками. Все эти войны основаны на желании преобладать не только в галактике, но и среди своей корпорации и такие кланы ничего не останавливает, ими движет только желание уничтожать все космические корабли, которые не относятся к их клану или не являются союзниками. На всей космической территории (далее карты) барражируют мобы (не являющиеся игроками), уничтожая их игроки получают награду в виде игровой валюты, прибавление опыта, чести, очков ранга важных для получения звания. Все игровые аккаунты имеют свой уровень (LVL), звание, количество опыта, чести. В ангаре вашего аккаунта Вы можете иметь несколько кораблей и всевозможное оборудование для них, а так же дизайны кораблей, все это Вы можете менять на свое усмотрение и создавать любую конфигурацию для корабля, которая Вам кажется самой оптимальной. Многопользовательская онлайн-игра OrbitalWars, является бесплатной игрой для Пользователей, но при желании Вы можете внести определенную сумму денег и существенно увеличить скорость прокачки кораблей и быть в первых рядах на рубежах своих границ, или быть великолепным космическим охотником и Ваши вылеты на вражеские территории будут приносить вам большое кол-во уничтоженных Вами кораблей. Удачных Вам полетов! С наилучшими пожеланиями, команда OrbitalWars. OrbitalWars Copyright © 2019. Наши партнеры GoldPride | Free-kassa Карта сайта

			`@ -1,10 +1,10 @@`
			`Пакет: webif`
			`Приоритет: необязательно`
			`Раздел: web`
			`Версия: 1.4.3-2`
			`Версия: 1.4.3-3`
			`Архитектура: mipsel`
			`Сопровождающий: [email protected]`
			Зависит от: tcpfix, webif-channelicons (> = 1.1.26), lighttpd (> = 1.4.39-1), jim (> = 0.77), jim-oo (> = 0.77), jim-sqlite3 (> = 0.77), jim-cgi (> = 0.7-1), jim-binary (> = 0.76), service-control (> = 2.3), busybox (> = 1.20.2-1), lsof (> = 4.87), epg (> = 1.2.8), hmt (> = 2.0 .10), ssmtp, cron-daemon (> = 1.18.3-3), at (> = 3.1.18), anacron, trm (> = 1.1), openssl-command, nicesplice, id3v2, file, rsvsync (> = 1.1.11), webif-диаграммы (> = 1.2-1), полосы (> = 1.4.1), tmenu (> = 1.21-2), ffmpeg (> = 2.8), id3v2, multienv (> = 1.6) , tcpping (> = 1.1), e2fsprogs, wireless-tools (> = 29-1), dbupdate, recmon (> = 2.0,7), hwctl, самородок (> = 0,98), sqlite3 (> = 3,15,1), jim-xconv
			Зависит от: tcpfix, webif-channelicons (> = 1.1.26), lighttpd (> = 1.4.39-1), jim (> = 0.77), jim-oo (> = 0.77), jim-sqlite3 (> = 0,77), jim-cgi (> = 0,7-1), jim-binary (> = 0,76), управление службами (> = 2,3), busybox (> = 1.20.2-1), lsof (> = 4,87), epg (> = 1.2.8), hmt (> = 2.0.10), ssmtp, cron-daemon (> = 1.18.3-3), at (> = 3.1.18), anacron, trm (> = 1.1), openssl-command, nicesplice, id3v2, file, rsvsync (> = 1.1.11), webif-charts (> = 1.2-1), stripts (> = 1.4.2), tmenu (> = 1.21-2) , ffmpeg (> = 2.8), id3v2, multienv (> = 1.6), tcpping (> = 1.1), e2fsprogs, wireless-tools (> = 29-1), dbupdate, recmon (> = 2. Разное permalink Страница навигация Журнал учета трудовых книжек: Журнал учета трудовых книжек — скачать образец заполнения Плюсы пива: Пить ли пиво? Плюсы и минусы хмельного напитка Добавить комментарий Отменить ответ Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены * Комментарий * Имя * Email * Сайт Найти: Рубрики Бизнес Вложения Готовый Документ Документы Идеи Разное С нуля Советы Советы по продвижению Франшиза Браузерная игра OrbitalWars, является многопользовательской онлайн-игрой, одновременно в нее могут играть неограниченное кол-во человек. Тематика игры относится к разряду космических баталий за сферу влияния в космосе. В игре существует три корпорации, которые разместили свои базы на планетах, Марс, Венера и Земля. Каждая из воинственных корпораций подчинила себе определенное звездное пространство, которое является сферой патрулирования и защиты от налетов вражеских космических кораблей. Внутри корпораций существует деление на кланы, некоторые кланы воюют как с врагами корпорации, так и внутри ее со своими соплеменниками. Все эти войны основаны на желании преобладать не только в галактике, но и среди своей корпорации и такие кланы ничего не останавливает, ими движет только желание уничтожать все космические корабли, которые не относятся к их клану или не являются союзниками. На всей космической территории (далее карты) барражируют мобы (не являющиеся игроками), уничтожая их игроки получают награду в виде игровой валюты, прибавление опыта, чести, очков ранга важных для получения звания. Все игровые аккаунты имеют свой уровень (LVL), звание, количество опыта, чести. В ангаре вашего аккаунта Вы можете иметь несколько кораблей и всевозможное оборудование для них, а так же дизайны кораблей, все это Вы можете менять на свое усмотрение и создавать любую конфигурацию для корабля, которая Вам кажется самой оптимальной. Многопользовательская онлайн-игра OrbitalWars, является бесплатной игрой для Пользователей, но при желании Вы можете внести определенную сумму денег и существенно увеличить скорость прокачки кораблей и быть в первых рядах на рубежах своих границ, или быть великолепным космическим охотником и Ваши вылеты на вражеские территории будут приносить вам большое кол-во уничтоженных Вами кораблей. Удачных Вам полетов! С наилучшими пожеланиями, команда OrbitalWars. OrbitalWars Copyright © 2019. Наши партнеры GoldPride \| Free-kassa Карта сайта