Ифнс по инн: Федеральная налоговая служба

Содержание

Инспекция ФНС

Руководитель: Тимофеев Сергей Анатольевич

Адрес: 142803, Московская область, г. Ступино, ул. Фрунзе, д. 3, корп. 3

Телефоны: контакт-центр 8-800-222-22-22   приемная +7 (496) 647-05-01

Факс: 7 (496) 642-51-12 Телефон доверия: +7 (496) 647-08-96

Email:  [email protected]

Cайт ФНС России:www.nalog.ru/rn50

Способ проезда

На электропоезде из Москвы: с Павелецкого вокзала до станции «Ступино» или на автобусе из Москвы: от автостанции «Красногвардейская» (метро «Красногвардейская») автобусом «Москва — Ступино» до автостанции «Ступино», в г. Ступино автобусные остановки «Черемушки», «Бульвар Победы» и «Новый рынок»

Инспекция на карте и сайте

График работы инспекции:


Понедельник-четверг
с 9.00 до 18.00

Пятница
с 9.00 до 16.45

Перерыв на обед
с 13.00 до 13.45

График приема налогоплательщиков физических лиц для приема и выдачи документов и консультирования

(окна №№ 1-8 в операционном зале ИФНС России по г. Ступино)

Понедельник, среда с 9.00 до 18.00
Вторник, четверг с 9.00 до 20.00
Пятница с 9.00 до 16.45
График приема налогоплательщиков в субботу смотрите на официальном сайте ФНС России https://www.nalog.ru/rn50/ifns/imns_50_45/#t2
Без обеденного перерыва

Онлайн запись на прием в инспекцию


 

Заплатил налоги сам — подумай о тех, с кем планируешь отдых

В разгар отпусков гражданам, не исполнившим налоговые обязательства по полученным в прошлом году уведомлениям, стоит позаботиться о погашении задолженности перед государством. Тем, кто вовремя не исполнил требования налоговых органов, надо быть морально готовыми к возможным изменениям летних планов на отдых — при наличии налоговой задолженности судебный пристав вправе ограничить выезд должника за пределы Российской Федерации. Напомнить об уплате налогов стоит и тому, с кем планируется отдых.  (Подробнее…)

Летний отпуск особо приятен, когда долг по налогам уплачен!

В связи с наступлением отпускного периода ИФНС России по г. Ступино Московской области призывает налогоплательщиков, имеющих задолженность по налогам, срочно ее уплатить. Налоговые органы уже начали процедуру принудительного взыскания задолженности по имущественным налогам. (Подробнее…)

 


Телефоны отделов инспекции:

Контрольный отдел — 8 (496) 647-07-41; 647-07-38; 647-36-62

Отдел аналитической работы и расчетов с бюджетом — 8 (496) 647-07-35; 647-07-37

Отдел информационных технологий — 8 (496) 647-05-03

Отдел камеральных проверок № 1 — 8 (496) 647-08-97; 647-07-28; 647-07-46

Отдел камеральных проверок № 2 — 8 (496) 647-07-43; 647-07-44; 647-37-47

Отдел камеральных проверок № 3 — 8 (496) 647-07-33; 647-04-99

Отдел обеспечения процедур банкротства — 8 (496) 647-07-29

Отдел общего обеспечения — 8 (496) 647-07-32; 647-07-36

Отдел предпроверочного анализа и истребования документов — 8 (496) 647-09-01; 647-07-39

Отдел работы с налогоплательщиками — 8 (496) 647-07-34; 647-00-07; 647-08-08

Отдел регистрации и учета налогоплательщиков — 8 (496) 649-02-09

Отдел урегулирования задолженности — 8 (496) 647-07-40; 647-07-45

Отдел финансового обеспечения — 8 (496) 647-07-48; 647-07-25

Правовой отдел — 8 (496) 647-07-39

Реквизиты

Получатель платежа:   Управление федерального казначейства по Московской области (ИФНС России по г. Ступино Московской области)

ИНН — 5045005336     КПП — 504501001

Банк получателя платежа:    ГУ БАНКА РОССИИ ПО ЦФО//УФК по Московской области, г. Москве

БИК—   004525987

Единый казначейский счёт:     40102810845370000004

Номер счета получателя средств:    

03100643000000014800

ОКТМО:    46776000

 

 

 

Инспекция ФНС России № 49

Контакты

г. Москва, ул. 3-Рощинская, влд.3, стр.2;

Юридический адрес:

г. Москва, ул. 3-Рощинская, влд.3, стр.2;

Телефон:

единый телефонный номер по России
8-800-222-22-22
контакт-центр:
+7 (495) 276-22-22
для справок:
+7 (495) 400-35-91
+7 (495) 400-35-82
+7 (495) 400-35-68

Факс:

+7 (495) 400-35-98

Начальник:

Романюк Ольга Викторовна

Время работы:

 
Время работы инспекции

Перерыв

Время работы операционного
зала(без перерыва)
пн 9.00-18.00 13.00-13.45
9.00-18.00
вт 9.00-18.00 13.00-13.45 9.00-20.00
ср 9.00-18.00 13.00-13.45 9.00-18.00
чт 9.00-18.00 13.00-13.45 9.00-20.00
пт 9.00-16.45 13.00-13.45 9.00-16.45
Во вторую и четвертую субботу календарного месяца с 10.00 до 15.00.

Способ проезда

От станции метро Тульская (первый вагон из центра), далее пешком мимо «Ингосстраха», пересечь Малую Тульскую улицу, далее во дворы жилых домов по диагонали в сторону Нижнего Михайловского проезда, д.16.

 

Реквизиты

Код ИФНС 7749
Наименование Межрайонная инспекция Федеральной налоговой службы № 49 по г. Москве
ИНН 7725109336
КПП 772501001
Адрес ,115191,Москва г,,,,Рощинская 3-я ул,влд.3,стр.2,,

Получатель Управление Федерального казначейства по г. Москве
Наименование банка ГУ Банка России по ЦФО 
БИК банка 044525000
Номер счета 40101810045250010041
Номер корреспондентского счета или субсчет банка,
в котором открыт счет УФК России по г. Москве — нет

Особое внимание просим уделить при заполнении полей 61 (ИНН получателя) и 103 (КПП получателя)

 

Дополнительная информация: Личный прием граждан руководством инспекции осуществляется по адресу:
г. Москва, ул. 3-я Рощинская, д.3, стр.2.

 

График личного приема граждан руководством инспекции

 

Должность Ф.И.О. (полностью) Дни приема Время приема Телефон для записи
Начальник инспекции Романюк Ольга Викторовна вторник с 9.00-13.00  
  четверг 14.00-17.00  
Заместитель начальника инспекции Мозжухин Владимир Михайлович понедельник-четверг с 9.30-12.30, 14.30-17.30  
  пятница с 9.30-12.30, 14.30-16.00        8-495-400-36-29
Заместитель начальника инспекции Корнеев Николай Борисович понедельник, среда с 11.00-13.00  
Заместитель начальника инспекции Гаджиев Мансур Салихович пятница с 11.00-13.00  

 

Реквизиты 46 налоговой инспекции

Будьте предельно внимательны при заполнении реквизитов и кодов КБК для оплаты в 46 ИФНС города Москва. Если Вы случайно допустите малейшую ошибку в номере расчётного счёта или коде КБК, Вы не только потеряете Ваши средства, которые будет проблематично вернуть, но и создадите себе массу проблем, потеряв много времени на возврат. При неправильном заполнении  других реквизитов по ИФНС 46, Вам придётся переделывать платёжное поручение или полностью переписывать квитанцию на оплату.

Код ИФНС 7746
Наименование Межрайонная инспекция Федеральной налоговой службы № 46 по г. Москве
ИНН 7733506810
КПП 773301001
Адрес 125373, г. Москва, Походный проезд, домовладение 3, стр.2

Реквизиты банка получателя

ГУ Банка России по ЦФО (с 06.02.2017)
Счет: 40101810045250010041
БИК: 044525000

ИНН / КПП получателя платежа – 7733506810 / 773301001

Получатель – УФК по г. Москве (Межрайонная ИФНС России № 46 по г. Москве)
Код ОКТМО – 45373000

Коды КБК для уплаты государственной пошлины

За государственную регистрацию юридического лица
или индивидуального предпринимателя

КБК – 182 108 07010 01 1000 110

государственная пошлина за государственную регистрацию юридического лица, физических лиц в качестве индивидуальных предпринимателей, изменений, вносимых в учредительные документов юридического лица, за государственную регистрацию ликвидации юридического лица и другие юридически значимые действия

КБК – 182 108 07030 01 1000 110

государственная пошлина за право использования наименований «Россия», «Российская Федерация» и образованных на их основе слов и словосочетаний в наименованиях юридических лиц.

КБК – 182 113 01020 01 6000 130

плата за предоставление сведений и документов, содержащихся в Едином государственном реестре юридических лиц и Едином государственном реестре индивидуальных предпринимателей.

КБК – 182 113 01190 01 6000 130

плата за предоставление информации из реестра дисквалифицированных лиц.

КБК – 182 116 03030 01 6000 140

денежные взыскания (штрафы) за административные правонарушения в области налогов и сборов, предусмотренные Кодексом Российской Федерации об административных правонарушениях.

Информация о 46 налоговой инспекции

узнать больше

Внимание с 1 января 2014 года изменился код ОКАТО, теперь вместо него необходимо указывать новый код ОКТМО.
Если Вам необходимо узнать новые коды ОКТМО которые используются вместо кодов ОКАТО, воспользуйтесь удобным сервисом:

Определение кода ОКТМО по адресу


Если Вы заметили на сайте опечатку или неточность, выделите её
и нажмите на клавиатуре: Ctrl + Enter или нажмите сюда.

Налоговое законодательство — Официальный сайт Администрации Санкт‑Петербурга

Уважаемые налогоплательщики физические лица и индивидуальные предприниматели!

Информация о налоговых льготах для жителей Санкт‑Петербурга

УФНС России по Санкт‑Петербургу сообщает о реорганизации Межрайонной инспекции ФНС России №28 по Санкт‑Петербургу путем присоединения к Межрайонной инспекции ФНС России №23 по Санкт‑Петербургу (далее — МИ ФНС №23).
С 1 января 2021 года при заполнении платежных документов на перечисление налогов и сборов в бюджетную систему РФ, при представлении деклараций и иных документов следует указывать реквизиты МИ ФНС России №23. Адрес инспекции остается прежним, информация о телефонах инспекции будет размещена в рубрике «Контакты» сайта ФНС России.
Реквизиты для уплаты налогов в МИ ФНС России №23

Получатель платежа

Управление Федерального казначейства по
г. Санкт‑Петербургу (Межрайонная ИФНС России №23 по Санкт‑Петербургу)

ИНН получателя

7810000001

КПП получателя

781001001

Банк получателя

Северо Западное ГУ Банка России г. Санкт‑Петербург

(с 01.01.2021 СЕВЕРО-ЗАПАДНОЕ ГУ БАНКА РОССИИ//УФК по г. Санкт‑Петербургу г. Санкт‑Петербург)

БИК

044030001     01.01.2021 БИК 014030106)

Счет №

40 10 18 102000000 1000 1
с 01.01.2021 40102810945370000005

Код ИФНС

7810



Памятка  Управления ФНС РФ «На какую систему налогообложения перейти»

Ошибки при работе на портале ФНС nalog.ru — Удостоверяющий центр СКБ Контур

При проверке условий подключения и защищённого соединения с сервером Личного кабинета возникла ошибка «Не удалось обратиться к серверу с использованием защищенного соединения. Возможно, не установлено доверие между клиентом и сервером…»

Если вы работаете на сайте ФНС с одного ПК с несколькими учётными записями (сертификатами), при каждой смене учётной записи необходимо чистить SSL (Сервис — Свойства браузера — Содержание — Очистить SSL).

1. Пройдите диагностику и выполните рекомендуемые действия.

2. Если электронная подпись установлена на носитель Рутокен ЭЦП 2.0, воспользуйтесь инструкцией и установите Рутокен.Коннект (см. Поддерживаемые браузеры).

3. Перейдите напрямую в нужный ЛК, минуя проверки, заменив в адресной строке протокол http на https. Для Личного кабинета ЮЛ вместо http://lkul.nalog.ru/ нужно перейти на https://lkul.nalog.ru/, для Личного кабинета ИП — https://lkipgost.nalog.ru/lk. Если получится войти — используйте этот способ всегда.

4. Проверьте работу в браузерах:

— Спутник
Примечание: после запуска скачанного установочного файла перейдите в раздел «Настройки» и уберите галку с пункта «Установить КриптоПро CSP для поддержки защищенных каналов на основе ГОСТ шифрования и цифровой подписи».

— Яндекс.Браузер
После установки браузера зайдите в его настройки и включите поддержку ГОСТ-шифрования («Настройки» — «Системные» — «Сеть»):

5. Проверьте, что в антивирусе не включено https-сканирование (часто встречается в антивирусах Avast и ESET).

6. Запустите программу КриптоПро CSP с правами администратора. Перейдите на вкладку «Настройки TLS» и снимите галочку «Не использовать устаревшие cipher suite-ы». После изменения данной настройки нужно обязательно перезагрузить компьютер.

7. После перезагрузки компьютера поставьте галочку «Не использовать устаревшие cipher suite-ы» в настройках КриптоПро CSP на вкладке «Настройки TLS», не соглашайтесь с предложением о перезагрузке.

8. Установите корневые сертификаты 2016, 2017 и 2018 годов с сайта https://www.gnivc.ru/certification_center/kssos/ в хранилище «Промежуточные центры сертификации».

9. Если на компьютере установлены другие СКЗИ (VipNet CSP, Континент-АП, Агава и др.), удалите их или перейдите на другое рабочее место. Корректная работа с несколькими криптопровайдерами на одном ПК не гарантируется.

 

При работе в ЛК физического лица появляется окно (не окно КриптоПро) с требованием ввести пароль, но при этом пароля на контейнере нет или стандартный пин-код от токена не подходит.

1. Войдите в Личный кабинет Физического лица.

2. Откройте страницу «Главная» — «Профиль» — «Получить электронную подпись».

3. Если на открывшейся странице выбрана ЭП — удалите подпись и зарегистрируйте КЭП заново.

 

При регистрации Юридического лица появляется ошибка «У Вас отсутствуют полномочия действовать от лица организации без доверенности».

Для юридических лиц в сервисе «Личный кабинет налогоплательщика» первичную регистрацию можно выполнить с КЭП, выданным на руководителя, указанного в ЕГРЮЛ как лицо, имеющее право действовать без доверенности, либо на лицо, имеющее действующую доверенность с полными полномочиями (доверенность с полными полномочиями должна быть передана и зарегистрирована в налоговой. Процесс входа описан на сайте ФНС, раздел «Регистрация лицом, имеющим действующую доверенность с полными полномочиями»).

Для управляющей компании КЭП должен содержать ФИО руководителя управляющей компании и реквизиты (ИНН, ОГРН) той организации, управление которой осуществляется. Также перед первым входом по сертификату дочерней организации требуется зарегистрировать в ФНС доверенность на руководителя УК.

Контакты nalog.ru

По вопросам работы на портале и ошибкам, не связанным с настройкой рабочего места и электронной подписью, обратитесь в службу поддержки портала ФНС:
— Телефон: 8 (800) 222-22-22
— Форма обращения в техподдержку ФНС

Список ФНС Москвы: адреса, телефоны, реквизиты для оплаты счетов

Номер ФНС Фактический адрес отделения ИФНС Телефон ИНН/КПП
ИФНС № 1 (ЦАО) 105064, г. Москва, ул. Земляной вал, д. 9 (495) 698-93-53 7701107259
770901001
ИФНС № 2 (ЦАО) 129110, г. Москва, ул. Б. Переяславская, д. 16 (495) 680-78-49 7702143179
770201001
ИФНС № 3 (ЦАО) 123100 Москва , ул. Анатолия Живова, д. 2, стр. 6 (495) 605-61-93 7703037470
770301001
ИФНС № 4 (ЦАО) 119048 Москва, ул. Доватора, д. 12, корп. 2, стр. 5 (499) 248-72-81 7704058987
770401001
ИФНС № 5 (ЦАО) 115184, г. Москва, ул. М. Ордынка, д. 33, стр. 1 (495) 698-92-09 7705045236
770501001
ИФНС № 6 (ЦАО) 129110, г. Москва, ул. Б. Переяславская, д. 16 (495) 649-39-88 7706044740
770201001
ИФНС № 7 (ЦАО) 105064, г. Москва, ул. Земляной вал, д. 9 (495) 698-96-01 7707081688
770701001
ИФНС № 8 (ЦАО) 109316, г. Москва, Волгоградский проспект, д. 46Б, стр.1 (495) 647-05-08 7708034472
770801001
ИФНС № 9 (ЦАО) 109147, г. Москва, Марксистская ул., д. 34, корп.6
109316, г. Москва, Волгоградский проспект, д. 42, корп. 26
(495) 646-58-94 7709000010
770901001
ИФНС № 10 (ЦАО) 109316, г. Москва, Волгоградский проспект, д. 46Б, стр. 1 (495) 647-05-48 7710047253
771001001
ИФНС № 13 (САО) 105064, г. Москва, ул. Земляной вал, д. 9 (495) 698-91-00 7714014428
770901001
ИФНС № 14 (САО) 125057, г. Москва, Чапаевский пер., д. 8
125284, г. Москва, 2-ой Боткинский проезд, д. 8, стр. 1
(499) 157-62-46
(495) 945-11-72
7714014428
771401001
ИФНС № 15 (СВАО) 127254, г. Москва, ул. Руставели, д. 12/7 (499) 760-50-52 7715045002
771501001
ИФНС № 16 (СВАО) 129346, г. Москва, ул. Малыгина, д. 3, корп. 2 (495) 471-13-55 7716103458
771601001
ИФНС № 17 (СВАО) 129226, г. Москва, ул.Сельскохозяйственная, д. 11, корп. 4, 3 (499) 181-30-18 7717018935
771701001
ИФНС № 18 (ВАО) 107113, г. Москва, ул. Шумкина д. 25 (499) 268-39-69 7718111790
771801001
ИФНС № 19 (ВАО) 105523, г. Москва, Щелковское шоссе, д. 90А (499) 748-87-53 7719107193
771901001
ИФНС № 20 (ВАО) 111141, г.Москва, Зелёный пр-т, д. 7а (495) 368-01-01 7720143220
772001001
ИФНС № 21 (ЮВАО) 109377, г. Москва, ул. 1-я Новокузьминская, д. 5 (495) 371-02-21 7721049904
772101001
ИФНС № 22 (ЮВАО) 111024, г. Москва, шоссе Энтузиастов, д. 14 (495) 649-37-14 7722093737
772201001
ИФНС № 23 (ЮВАО) 109386, г. Москва, Таганрогская ул., д. 2 (495) 350-27-39 7723013452
772301001
ИФНС № 24 (ЮАО) 115409, г. Москва, Каширское шоссе, д. 44, корп. 4. (499) 725-20-28 7724111558
772401001
ИФНС № 25 (ЮАО) 115193, г. Москва, 5-я Кожуховская ул., д. 1/11 (495) 675-08-78 7725068979
772501001
ИФНС № 26 (ЮАО) 117639, г. Москва, Черноморский бул., д. 1, корп. 1 (499) 619-66-41 7726062105
772601001
ИФНС № 27 (ЮЗАО) 117418, г. Москва, ул. Новочеремушкинская, д. 58, корп. 1 (499) 128-97-42 7727092173
772701001
ИФНС № 28 (ЮЗАО) 117449, ул. Шверника, д. 7, корп. 1 (499) 126-38-55 7728124050
772801001
ИФНС № 29 (ЗАО) 119618, г. Москва,ул. 50 лет Октября, д. 6
119454, г. Москва, ул. Лобачевского, д. 66а
(495) 439-29-25
(495) 432-98-39
7729150007
772901001
ИФНС № 30 (ЗАО) 121433, г. Москва, ул. М. Филевская, д. 10, стр. 3 (499) 144-81-60 7730057570
773001001
ИФНС № 31 (ЗАО) 12135, г. Москва, ул. Молодогвардейская, д. 23, корп. 1; д. 21, корп. 1; д. 27, корп. 1
12135, г. Москва, Рублевское шоссе, д. 14, к. 3
(495) 417-87-02 7731154880
773101001
ИФНС № 33 (СЗАО) 125373б, г. Москва, Походный проезд, влд. 3, корп. В (495) 649-37-69 7733053334
773301001
ИФНС № 34 (СЗАО) 123154, г. Москва, ул. Народного Ополчения, д. 33, корп. 3 (499)192-55-29 7734110842
773401001
ИФНС № 35
(Зеленоградский АО)
124482, г. Зеленоград, ул. Юности, д. 5 (499) 734-17-53 7735071603
773501001
ИФНС № 36 (ЮЗАО) 119296, г. Москва, Ленинский пр-т, д. 70/11; д. 69
119311, г. Москва, Ломоносовский пр-т, д. 23
(495) 938-25-52 7736119488
773601001
ИФНС № 43 (САО) 125493, г. Москва, ул. Смольная, д. 25а (495) 456-63-85 7743777777
774301001
ИФНС № 45
(Межрайонные инспекции)
125373, г. Москва, Походный проезд, д. 3 (495) 955-99-11 7733116418
773301001
ИФНС № 46
(Межрайонные инспекции)
125373, г. Москва, Походный проезд, влд. 3, корп. 1 (495) 955-99-99 7733506810
773301001
ИФНС № 47
(Межрайонные инспекции)
125373, г. Москва, Походный проезд, корп.4.5, 2 эт.
109012, г. Москва, Б. Черкасский пер., д. 17, стр. 1, 2 эт.
(495) 955-97-35 7710326120
773301001
ИФНС № 48
(Межрайонные инспекции)
125373, г. Москва, Походный проезд, д. 3, корп. 1
125047, г. Москва, ул. Чаянова, д. 8
(495) 955-97-79 7710286205
773301001
ИФНС № 49
(Межрайонные инспекции)
125373, г. Москва, Походный проезд влд. 3, стр. 1 (495) 649-39-23 7725109336
773301001
ИФНС № 50
(Межрайонные инспекции)
125373, г. Москва, Походный проезд, влд. 3, корп. А (495) 649-38-52 7702265064
773301001

Узнать адрес налоговой, график работы налоговой, телефоны ИФНС, код ИФНС, платежные реквизиты ИФНС, узнать ИФНС по адресу, определение реквизитов ИФНС.

Данная статья поможет узнать ИФНС по адресу регистрации, если Вы не знаете где находится Ваша налоговая инспекция;
Узнать код ИФНС, если Вы заполняете форму, но не знаете код налогового органа;
Узнать название налоговой, если Вы пишите заявление, но не знаете полное наименование Вашей ИФНС;
Получить реквизиты Вашей налоговой, если хотите заплатить налоги, но не знаете платёжные реквизиты ИФНС;
Узнать контактные номера ИФНС, если хотите позвонить в свою налоговую инспекцию, но не знаете номер телефона;
Узнать график работы ИФНС, если хотите посетить налоговую, но не знаете дни и часы работы Вашей ИФНС.

Внимание! Если реквизиты необходимы Вам для оплаты госпошлины, воспользуйтесь сервисом ФНС по уплате госпошлины.


Определение реквизитов ИФНС

Для поиска информации о территориальной налоговой инспекции, воспользуйтесь сервисом «Определение реквизитов ИФНС», который позволяет узнать:

— Код ИФНС
— Адрес ИФНС
— Платёжные реквизиты ИФНС
— Полное наименование ИФНС
— Контактные телефоны ИФНС
— Режим работы ИФНС


Как пользоваться сервисом «Определение реквизитов ИФНС»

Чтобы получить реквизиты ИФНС, перейдите по ссылке на сервис «Определение реквизитов ИФНС». В открывшемся окне появится форма запроса, в которой нужно ввести:

1. Код ИФНС. Если не знаете код налоговой инспекции, то пропустите данный шаг, нажав кнопку «Далее»;

2. Регион. Выберите из выпадающего списка Ваш регион;

3. Район. Если Вы не знаете Ваш район или его попросту нет, то пропустите данный шаг, нажав кнопку «Далее»;

4. Город. Выберите из выпадающего списка Ваш город;

5. В немногих случаях потребуется указать населенный пункт и улицу.

После успешного заполнения формы сервис выдаст таблицу с полной информацией о налоговом органе по Вашему адресу. 



Семейство интерферонов (IFN) — Creative Diagnostics

Обзор

Интерфероны (IFN) представляют собой группу сигнальных белков, вырабатываемых и высвобождаемых клетками-хозяевами в ответ на присутствие нескольких патогенов, таких как вирусы, бактерии, паразиты и опухолевые клетки. В типичном сценарии инфицированная вирусом клетка выделяет интерфероны, заставляя соседние клетки повышать свою противовирусную защиту.

IFN относятся к большому классу белков, известных как цитокины / молекулы, которые используются для связи между клетками, чтобы запустить защитные механизмы иммунной системы, которые помогают уничтожить патогены.Интерфероны названы из-за их способности «мешать» репликации вирусов, защищая клетки от вирусных инфекций. IFN также имеют различные другие функции: они активируют иммунные клетки, такие как естественные клетки-киллеры и макрофаги; они повышают защиту хозяина за счет активации презентации антигена за счет увеличения экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости (MHC). Определенные симптомы инфекций, такие как лихорадка, мышечная боль и «симптомы гриппа», также вызваны выработкой IFNs и других цитокинов.

Члены IFN

У животных, включая человека, идентифицировано более двадцати различных генов и белков IFN. Их обычно делят на три класса: IFN типа I, IFN типа II и IFN типа III. IFN, принадлежащие ко всем трем классам, важны для борьбы с вирусными инфекциями и для регуляции иммунной системы.

Таблица 1. Продукты, относящиеся к семейству IFN

Все IFN типа I связываются со специфическим рецепторным комплексом клеточной поверхности, известным как рецептор IFN-α / β (IFNAR), который состоит из цепей IFNAR1 и IFNAR2.Интерфероны типа I, присутствующие у человека, представляют собой IFN-α, IFN-β, IFN-ε, IFN-κ и IFN-ω.

Рисунок 1. Трехмерная структура человеческого интерферона бета.

IFN-α Белки IFN-α продуцируются лейкоцитами. Они в основном участвуют в врожденном иммунном ответе против вирусной инфекции. Гены, ответственные за их синтез, делятся на 13 подтипов, которые называются IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA21.Эти гены находятся вместе в кластере на хромосоме 9. IFN-α также производится синтетически в качестве лекарства от лейкемии волосатых клеток. Международное непатентованное название (МНН) продукта — интерферон альфа. Рекомбинантный тип — интерферон альфакон-1. Пегилированные типы представляют собой пегилированный интерферон альфа-2a и пегилированный интерферон альфа-2b.
IFN-β Белки IFN-β в больших количествах продуцируются фибробластами.Они обладают противовирусной активностью, которая участвует в основном в врожденном иммунном ответе. Были описаны два типа IFN-β: IFN-β1 (IFNB1) и IFN-β3 (IFNB3) (ген, обозначенный IFN-β2, на самом деле является IL-6). IFN-β1 используется для лечения рассеянного склероза, поскольку он снижает частоту рецидивов. IFN-β1 не подходит для лечения пациентов с прогрессирующими, не рецидивирующими формами рассеянного склероза.
IFN-κ Интерферон каппа, также известный как IFN-каппа, представляет собой белок, который у человека кодируется геном IFNK.IFN-каппа является членом семейства интерферонов типа I. Интерфероны типа I представляют собой группу родственных гликопротеинов, которые играют важную роль в защите хозяина от вирусных инфекций. Этот белок экспрессируется в кератиноцитах, и ген находится на хромосоме 9, рядом с кластером интерферона типа I.
IFN-ω IFN-ω, хотя и имеет только одну функциональную форму, описанную на сегодняшний день (IFNW1), имеет несколько псевдогенов: IFNWP2, IFNWP4, IFNWP5, IFNWP9, IFNWP15, IFNWP18 и IFNWP19 у человека.Многие плацентарные млекопитающие, не являющиеся приматами, экспрессируют несколько подтипов IFN-ω.

Единственный член составляет интерфероны типа II (IFN), которые называются IFN-γ (гамма). Зрелый IFN-γ представляет собой антипараллельный гомодимер, который связывается с комплексом рецептора IFN-γ (IFNGR), чтобы вызвать сигнал в своей клетке-мишени. IFNGR состоит из двух субъединиц, и каждая из молекул обозначает IFNGR1 и IFNGR2.

IFN-γ участвует в регуляции иммунных и воспалительных реакций; у человека есть только один тип гамма-интерферона.Он вырабатывается активированными Т-клетками и естественными клетками-киллерами. IFN-γ обладает некоторыми противовирусными и противоопухолевыми эффектами, но, как правило, слабыми. Однако этот цитокин усиливает действие IFN типа I. IFN-γ, выделяемый клетками Th2, привлекает лейкоциты к месту инфекции, что приводит к усилению воспаления. Он также стимулирует макрофаги убивать бактерии, которые были поглощены. IFN-γ, выделяемый клетками Th2, также важен для регуляции ответа Th3. Поскольку IFN-γ жизненно важен для регуляции иммунного ответа, его продукция может приводить к аутоиммунным нарушениям.

Рисунок 2. Трехмерная структура гамма-интерферона человека.

Группа интерферонов III типа, классифицированная недавно, состоит из трех молекул IFN-λ (лямбда), называемых IFN-λ1, IFN-λ2 и IFN-λ3 (также называемых IL29, IL28A и IL28B соответственно). Эти сигналы IFN через рецепторный комплекс состоят из IL10R2 (также называемого CRF2-4) и IL28RA (также называемого IFNLR1, CRF2-12). Недавно новый белок со сходной функцией, связанный с IFN-λ3, был обнаружен в том же геномном локусе и был обозначен как IFN-λ4.Его внутриклеточная передача сигналов осуществляется через IFNLR1 и, следовательно, считается интерфероном типа III. Однако доказательства его биологической активности in vivo до сих пор остаются спорными.

IL29

Интерлейкин-29 (IL-29) представляет собой белок, который у человека кодируется геном IL29, который находится на хромосоме 19. Он является членом семейства спиральных цитокинов и представляет собой интерферон III типа.Он также известен как IFNλ1 и очень похож по аминокислотной последовательности на IL-28, другой интерферон типа III. IL-29 играет важную роль в защите хозяина от микробов, и его ген в высокой степени регулируется в клетках, инфицированных вирусами. IL29 не присутствует в геноме мыши.
IL28 Интерлейкин-28 (IL-28) представляет собой цитокин, который представлен в двух изоформах, IL-28A и IL-28B, и играет роль в иммунной защите от вирусов, включая индукцию «антивирусного состояния» путем включения белков Mx, 2 ‘, 5’-олигоаденилатсинтетаза, а также ISGF3G (фактор 3 генов, стимулированный интерфероном).IL-28A и IL-28B относятся к семейству цитокинов интерферона III типа и очень похожи (по аминокислотной последовательности) на IL-29. Их классификация как интерферонов обусловлена ​​их способностью вызывать противовирусное состояние, в то время как их дополнительная классификация как цитокинов обусловлена ​​их хромосомным положением, а также тем фактом, что они кодируются несколькими экзонами, а не одним экзоном, как большинство типов. -I IFNs есть.

Функции сотовой связи

Все интерфероны обладают несколькими общими эффектами: они являются противовирусными агентами и модулируют функции иммунной системы.Экспериментально показано, что введение IFN типа I ингибирует рост опухоли у животных, но положительное действие в отношении опухолей человека широко не подтверждено. Клетка, инфицированная вирусом, выделяет вирусные частицы, которые могут заразить соседние клетки. Однако инфицированная клетка может подготовить соседние клетки к потенциальной инфекции вирусом, высвобождая интерфероны. В ответ на интерферон клетки производят большое количество фермента, известного как протеинкиназа R (PKR). Этот фермент фосфорилирует белок, известный как eIF-2, в ответ на новые вирусные инфекции; фосфорилированный eIF-2 образует неактивный комплекс с другим белком, называемым eIF2B, для снижения синтеза белка в клетке.Другой клеточный фермент, РНКаза L, также индуцируемый действием интерферона, разрушает РНК внутри клеток, чтобы еще больше снизить синтез белка как вирусных генов, так и генов хозяина. Подавленный синтез белка разрушает как вирус, так и инфицированные клетки-хозяева. Кроме того, интерфероны индуцируют выработку сотен других белков, известных под общим названием гены, стимулированные интерфероном (ISG), которые играют роль в борьбе с вирусами и других действиях, вызываемых интерфероном. Они также ограничивают распространение вируса за счет увеличения активности р53, который убивает инфицированные вирусом клетки, способствуя апоптозу.Влияние IFN на p53 также связано с его защитной ролью против некоторых видов рака.

Другой функцией интерферонов является активация основных молекул комплекса гистосовместимости, MHC I и MHC II, и повышение активности иммунопротеасом. Более высокая экспрессия MHC I увеличивает представление вирусных пептидов цитотоксическим Т-клеткам, в то время как иммунопротеасома обрабатывает вирусные пептиды для загрузки на молекулу MHC I, тем самым увеличивая узнавание и уничтожение инфицированных клеток.Более высокая экспрессия MHC II увеличивает представление вирусных пептидов хелперным Т-клеткам; эти клетки выделяют цитокины (например, большее количество интерферонов и интерлейкинов, среди прочих), которые сигнализируют и координируют активность других иммунных клеток. Интерфероны, такие как гамма-интерферон, непосредственно активируют другие иммунные клетки, макрофаги и естественные клетки-киллеры.

Рис. 3. Линейное и мультипликационное изображение димера IFNγ.

Роль в болезни

Интерферон бета-1a и интерферон бета-1b используются для лечения и контроля рассеянного склероза, аутоиммунного заболевания.Это лечение эффективно для уменьшения приступов рецидивирующе-ремиттирующего рассеянного склероза и замедления прогрессирования и активности заболевания при вторичном прогрессирующем рассеянном склерозе.

Интерферонотерапия используется (в сочетании с химиотерапией и лучевой терапией) для лечения некоторых видов рака. Это лечение можно использовать при гематологических злокачественных новообразованиях; лейкоз и лимфомы, включая лейкоз волосатых клеток, хронический миелоидный лейкоз, узловую лимфому и кожную Т-клеточную лимфому.Пациенты с рецидивирующими меланомами получают рекомбинантный IFN-α2b. И гепатит В, и гепатит С лечат IFN-α, часто в сочетании с другими противовирусными препаратами. Некоторые из тех, кто лечится интерфероном, обладают устойчивым вирусологическим ответом и могут элиминировать вирус гепатита. Наиболее опасный штамм — вирус гепатита С генотипа I — можно лечить с 60-80% успешностью лечения с помощью действующего стандарта лечения интерфероном-α, рибавирином и недавно одобренными ингибиторами протеазы, такими как телапревир (Инсивек), май 2011 г. , Боцепревир (Victrelis) май 2011 г. или ингибитор нуклеотидного аналога полимеразы Софосбувир (Sovaldi) декабрь 2013 г.Биопсия пациентов, получавших лечение, показывает уменьшение повреждений печени и цирроза. Некоторые данные показывают, что введение интерферона сразу после заражения может предотвратить хронический гепатит С, хотя диагностика на ранней стадии инфекции затруднена, поскольку физические симптомы на ранней стадии инфицирования гепатитом С редки. Контроль хронического гепатита C с помощью IFN связан с уменьшением гепатоцеллюлярной карциномы.

Имеются доказательства низкого качества, свидетельствующие о том, что глазные капли с интерфероном могут быть эффективным средством лечения людей с эпителиальным кератитом, вызванным вирусом простого герпеса, типом глазной инфекции.Нет четких доказательств того, что удаление инфицированной ткани (санация) с последующим нанесением капель интерферона является эффективным подходом к лечению этих типов глазных инфекций. Доказательства низкого качества предполагают, что комбинация интерферона и противовирусного агента может ускорить процесс заживления по сравнению с одной противовирусной терапией.

Артикул:

1. Де Андреа М., Равера Р., Джоя Д., Гариглио М., Ландольфо С. (2002).«Интерфероновая система: обзор». Европейский журнал детской неврологии . 6 Suppl A (6): A41–6; обсуждение A55–8.
2. Леви Д.Е., Мари И. Дж., Дурбин Дж. Э. (декабрь 2011 г.). «Индукция и функция интерферона типа I и III в ответ на вирусную инфекцию». Текущее мнение в области вирусологии. 1 (6): 476–86.
3. Германт П., Михильс Т. (2014).«Интерферон-λ в контексте вирусных инфекций: продукция, ответ и терапевтические последствия». Журнал врожденного иммунитета . 6 (5): 563–74.
4. Navratil V, de Chassey B, Meyniel L, Pradezynski F, André P, Rabourdin-Combe C, Lotteau V (июль 2010 г.). «Сравнение на системном уровне белок-белковых взаимодействий между вирусами и сетью системы интерферона человека I типа». Журнал протеомных исследований. 9 (7): 3527–36.
5. Шарифф К.А., Дункан Д., Юноси З. (февраль 2002 г.). «Достижения в лечении хронического гепатита С:« пегилированные »интерфероны». Кливлендский медицинский журнал клиники. 69 (2): 155–9.
6. Тан Й.Х., Тишфилд Дж., Раддл Ф.Х. (февраль 1973 г.). «Связывание генов человеческого интерферон-индуцированного противовирусного белка и признаков индофенолоксидазы-B с хромосомой G-21». Журнал экспериментальной медицины. 137 (2): 317–30.

Вернуться к ресурсам

Твиттер Facebook

границ | Стратегии уклонения от вирусов при передаче сигналов IFN типа I — Краткое изложение последних достижений

Введение

Иммунная система млекопитающих эволюционировала для эффективного обнаружения вирусных инфекций и борьбы с ними. Индукция интерферона I типа (IFN), преимущественно IFN-α и IFN-β, образует первую линию защиты.Ответ IFN типа I состоит из двух частей. Во-первых, клетка вырабатывает IFN типа I, когда ее запускает вирусный стимул. Затем секретируется IFN, и во второй части ответа он ощущается продуцирующими, а также соседними клетками, что приводит к продукции генов, стимулированных IFN (ISG) [см. (1)].

Вирусы

, которые эволюционировали вместе со своим хозяином, разрабатывают стратегии противодействия сигнальным каскадам врожденной иммунной системы и обеспечения их репликации.Недавно было опубликовано несколько обзоров, описывающих стратегии уклонения от врожденного иммунитета отдельных вирусов или семейств вирусов, таких как вирус гриппа (2, 3), флебовирусы (4), вирусы герпеса (5-7), тяжелый острый респираторный синдром коронавирусов (SARS). ) и ближневосточного респираторного синдрома (MERS) (8), вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) (9, 10), а также множественных РНК-вирусов (11, 12). Более того, в последнее время появились статьи, в которых рассматривается, как вирусы предотвращают обнаружение рецепторами распознавания патогенов (PRR) (13, 14) и как вирусы модулируют передачу сигналов врожденного иммунитета с помощью вирусных деубиквитиназ (15).

В этом обзоре мы сравним различные стратегии, разработанные вирусами для подавления передачи сигналов врожденного иммунитета отдельных компонентов каскада передачи сигналов врожденного иммунитета. Из-за огромного количества данных в этой области мы сосредоточимся на недавних открытиях. Более ранние исследования были обобщены в работе. (16, 17).

Распознавание вирусов

Заражающие вирусы распознаются с помощью PRR [см. (14)]. Наиболее важными вирусными маркерами для системы врожденного иммунитета являются вирусные нуклеиновые кислоты.Обнаружение вирусной ДНК через путь cGAS-Sting и счетные измерения, проводимые вирусами, были недавно рассмотрены (18) и не являются частью этого обзора.

Вирусные РНК, которые в основном представляют собой двухцепочечную (ds-) РНК, распознаются тремя PRR: эндосомным toll-подобным рецептором 3 (TLR3), цитоплазматическими рецепторами, индуцируемыми ретиноевой кислотой, геном I (RIG-I) ( RLR) и рецепторы, подобные домену олигомеризации нуклеотидов (NOD) (NLR) (19). TLR3 и RLR важны для индукции ответа IFN типа I, тогда как было показано, что NLR регулируют созревание интерлейкина-1β (IL-1β) посредством активации каспазы-1 (20).Группа RLR состоит из RIG-I, гена 5, связанного с дифференцировкой меланомы (MDA5), и лаборатории генетики и физиологии 2 (LGP2). Три рецептора имеют схожую структуру, все они содержат кабоксиконцевой домен, который функционирует как репрессорный домен (RD) в RIG-I и LGP2 (21) и центральный домен геликазы, но LGP2 не имеет доменов активации и рекрутирования каспаз ( CARD), которые функционируют при передаче сигналов [см. (19, 22)]. И геликаза, и карбоксиконцевой домен необходимы для связывания РНК.RIG-1 и MDA-5 обнаруживают специфические вирусные РНК PAMP, тогда как LGP2 негативно регулирует передачу сигналов RIG-I и способствует связыванию РНК с MDA5 [подробно рассмотрено в Ref. (14)].

В нестимулированных клетках RIG-I и MDA-5 сохраняются в подавленном состоянии за счет фосфорилирования остатков серина и треонина в CARD и карбоксиконцевых доменах (23, 24). При связывании РНК и RIG-I, и MDA-5 претерпевают конформационные изменения, что приводит к высвобождению их CARD (25, 26). Рекрутированные фосфатазы удаляют фосфатные остатки, а убиквитинлигазы E3 присоединяют Lys63-связанные полимеры убиквитина к CARD и C-концевому домену RIG-I, которые важны для тетрамеризации RIG-I (27–31).

РНК-связанный RIG-1 затем взаимодействует с 14-3-3ε, митохондриальным транспортным белком, и убиквитин-лигазой TRIM25, которые вместе транспортируют RIG-I в митохондрии (32). Там CARD RIG-I или MDA-5 взаимодействуют с CARD митохондриального активатора вирусной передачи сигналов (MAVS, также известного как IPS-1, VISA и Cardif), который является важным сигнальным адаптерным белком. Активация MAVS недавно была подробно рассмотрена в работе. (33).

TLR3 взаимодействует с TRIF, который служит молекулярной платформой и образует физические взаимодействия с несколькими адапторными молекулами (34).Взаимодействуя с вышестоящими адаптерами, TRIF претерпевает конформационные изменения и рекрутирует нижестоящий фактор, связанный с рецептором TNF (TRAF) 3 и TRAF6 [см. (35)]. Белок-1, взаимодействующий с киназным рецептором (RIP-1), является частью обоих сигнальных путей ниже TLR3 и RIG-I. Он может взаимодействовать с TRIF, чтобы вызвать активацию NFκB (36). Более того, активированный дцРНК TLR3 может рекрутировать TRIF, RIP-1 и каспазу-8 и вызывать апоптоз (37). Кроме того, RIP-1 и его адаптерный белок, ассоциированный с Fas белок с доменом смерти (FADD), являются частью сигнального каскада ниже RIG-I и MDA-5 и участвуют в активации факторов транскрипции, фактора регуляции интерферона (IRF) 3. и IRF7 (38).TRAF3 служит связующим звеном между вышестоящими адапторными белками (TRIF или MyD88 для TLR и MAVS для RLR) и расположенными ниже сигнальными киназами TBK1 / IKKε или IRAK1 / IKKα. Рекрутирование TRAF3 в сигнальные комплексы TLR или RLR активирует E3-лигазную активность TRAF3, которая затем катализирует его собственное K63-связанное убиквитинилирование. Последующий TRAF3 активирует TBK1 / IKKε или IRAK / IKKα [см. (39)] (Рисунок 1).

Рисунок 1. Активация регуляторных факторов интерферона и противодействие, предпринимаемое вирусами .DsRNA воспринимается PRR, что приводит к активации различных адаптерных белков и привлечению TRAF3. TBK1 и / или IKKε активируются и фосфорилируют IRF3 и / или IRF7, которые затем перемещаются в ядро, чтобы вызвать экспрессию IFN типа I. CSFV, вирус классической чумы свиней; DENV, вирус денге; Ящур, вирус ящура; ВГВ, вирус гепатита В; HP-PRRSV, высокопатогенный вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней; ВПГ-1, вирус простого герпеса 1 типа; HTLV-1, лимфотропный вирус Т-клеток человека типа I; KSHV, вирус герпеса, связанный с саркомой Капоши; БВРС-КоВ, коронавирус ближневосточного респираторного синдрома; PBoV, бокавирус свиней; PEDV, вирус эпидемической диареи свиней; Вирус РРСС, вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней; RRV, радиновирус макаки-резуса.

Вирусы прямо или косвенно нацелены на RIG-I, чтобы заблокировать ответ IFN типа I. Флебовирус Toscana Virus экспрессирует неструктурный белок, который напрямую взаимодействует с RIG-I и вызывает его протеасомную деградацию (40, 41). Белки L pro , 3C pro и 2B вируса ящура увеличивают экспрессию мРНК RIG-I, но снижают экспрессию белка RIG-I. L pro и 3C pro индуцируют деградацию RIG-I, тогда как механизм того, как 2B снижает уровни белка RIG-I, еще не решен (42).Другие вирусы нацелены на RIG-I косвенно. Вирус гепатита B (HBV) индуцирует miR146a, которая затем посттранскрипционно подавляет экспрессию RIG-I и подавляет продукцию IFN типа I (43).

Белок NS3 вируса денге связывается с 14-3-3ε и предотвращает транслокацию RIG-I в MAVS. Сайт связывания на NS3 представляет собой высококонсервативный фосфомиметический мотив, что было подтверждено созданием вируса, содержащего мутацию в этом мотиве (44).

Было высказано предположение, что в некоторых типах клеток RIG-I требует сторожевых устройств, таких как белок DDX60, который связывается с RIG-I и способствует РНК-связывающей активности RIG-I (45, 46).Другие исследования ставят под сомнение DDX60, действующий как широко активный усилитель противовирусного ответа (47, 48), и вместо этого предполагают, что DDX60 действует только в противовирусном ответе на определенные вирусы, такие как вирус гепатита C (47). Однако есть данные, указывающие на то, что вирус гриппа А и вирус гепатита С ослабляют активацию промотора IFNβ, нацеливаясь на дозорный DDX60. Оба вируса активируют рецептор эпидермального фактора роста (EGF), который, в свою очередь, фосфорилирует DDX60 по Tyr-793 и Tyr-796. Это приводит к ослаблению DDX60-зависимой активации RIG-I.Кроме того, независимо от своей роли в качестве дозорного для распознавания вирусной РНК RIG-I, DDX60 играет роль в деградации вирусной РНК (46) (Рисунок 1).

Митохондриальный активатор вирусной передачи сигналов блокируется разными вирусами по-разному. Белок вируса денге NS4A нацелен на MAVS, и взаимодействие предотвращает связывание MAVS с RIG-I (49). 3C-подобная протеаза (3CLSP) вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV), напротив, расщепляет MAVS протеасомно- и независимым от каспаз образом по Glu268 (E268 / G269).Оба продукта расщепления не активируют IFN-ответ типа I (50). Аналогичным образом, белок вируса гепатита С NS3-4A (51, 52), а также высокопатогенный белок вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (HP-PRRSV) nsp4 (53), как было показано, расщепляют MAVS и блокируют передачу сигналов RLR. Вирус эпидемической диареи свиней (PEDV) также нацелен на MAVS в эпителиальных клетках тонкого кишечника (IEC). Однако точный механизм еще не решен (54) (Рисунок 1).

Белок коронавируса SARS ORF9b не только влияет на передачу противовирусных сигналов, но и изменяет морфологию митохондрий клетки-хозяина, вызывая деградацию динаминоподобного белка (DRP1).MAVS концентрируется в мелкие точки в присутствии ORF9b (55). Кроме того, ORF9b запускает K48-связанное убиквитинилирование MAVS, воздействуя на поли (C) -связывающий белок 2 (PCBP2) и лигазу AIP4 домена E3 HECT. В нормальных условиях PCBP2 контролирует уровни MAVS, связывая убиквитинлигазу AID4 E3 с MAVS (56). Помимо MAVS, уровни TRAF3 и TRAF6 также снижаются с помощью ORF9b. Однако маловероятно, что TRAF3 и TRAF6 будут нацелены напрямую. Скорее всего, они деградировали из-за взаимодействия с MAVS (55) (Рисунок 1).

T-клеточный лимфотропный вирус типа I человека (HTLV-1) белок Tax нарушает передачу сигналов врожденного иммунитета множеством способов: он связывается с доменами мотива гомотипического взаимодействия RIP (RHIM) RIP-1 и нарушает взаимодействие между RIP-1 и RIG -I или MDA-5 и активация промотора IFN типа I. Tax также связывается с TRIF и тем самым прерывает сигнальный каскад TLR3. Наконец, Tax блокирует связь между RIP-1 и IRF7, что приводит к подавлению активности IRF7 (57) (Рисунок 1).

Белок коронавируса М ближневосточного респираторного синдрома взаимодействует с TRAF3 и нарушает взаимодействие между TRAF3 и TBK1, что в конечном итоге приводит к снижению активации IRF3. Для взаимодействия с TRAF3 достаточно N-концевого трансмембранного домена белка M MERS-CoV (58), аналогично тому, что было показано ранее для SARS-CoV (59) (рисунок 1).

Активация факторов транскрипции и транскрипция IFN

Запуск каскада передачи сигналов TLR3 и RLR приводит к активации факторов транскрипции NFκB и IRF3 / IRF7.В неактивном состоянии фактор транскрипции NFκB образует комплекс со своим ингибитором IκB (60). При стимуляции IκB фосфорилируется комплексом киназы IκB (IKK), который состоит из двух каталитических субъединиц, таких как IKKα и IKKβ, и регуляторной субъединицы, такой как эссенциальный модулятор NFκB (NEMO) (61). Фосфорилирование IκBα вызывает его полиубиквитинирование через белок, содержащий повторение β-трансдуцина E3 убиквитинлигазы (β-TrCP), и последующую протеасомную деградацию (62), позволяя NFκB перемещаться в ядро ​​и индуцировать экспрессию генов-мишеней (63) ( Фигура 2).

Рисунок 2. Активация передачи сигналов NFκB и противодействие, предпринимаемое вирусами . Запуск TLR3 приводит к активации сначала TRAF6, а затем IKK (состоящего из NEMO, IKKα и IKKβ). Вместе с β-TrCP, IKK опосредует убиквитинилирование IκB, что приводит к высвобождению NFκB. EAV, вирус артериита лошадей; EMCV, вирус энцефаломиокардита; Вирус ящура, ящура; PEDV, вирус эпидемической диареи свиней; PRRSV, вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней.

Белок 3C вируса энцефаломиокардита (EMCV) расщепляет активатор NFκB, связанный с членом семейства TRAF (TANK), который ингибирует TRAF6-опосредованную активацию NFκB на Gln291. В результате активируется NFκB, и нестабильный C-концевой фрагмент TANK подвергается протеасомной деградации (64). Также другие вирусы экспрессируют протеазы, которые расщепляют TANK, хотя и на других остатках, таких как вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV) (TANK расщепляется Nsp4), ящур (протеаза 3C расщепляет TANK) и вирус артериита лошадей (EAV) ( TANK расщепляется Nsp4).Таким образом, TANK, по-видимому, является общей мишенью для нескольких вирусных протеаз с положительной РНК (64) (Рисунок 2).

Было показано, что несколько вирусов нарушают передачу сигналов IFN, расщепляя NEMO. PEDV 3C-подобная протеаза, nsp5, расщепляет NEMO по Gln231 (65), тогда как протеаза 3C вируса гепатита A (3C pro ) расщепляет NEMO по Gln304 (66) и протеазу пикорнавируса ящура 3C pro по Gln383, удаляя С-концевой домен цинкового пальца из белка (67). Ротавирус человека развился другим путем.Его неструктурный белок 1 (NSP1), как было показано, ингибирует путь NFκB за счет деградации β-TrCP и, следовательно, стабилизации IκB (68) (Рисунок 2).

TANK-связывающая киназа 1 (TBK1) и ингибитор κB-киназы ε (IKKε) классифицируются как неканонические серин / треониновые киназы и оба способны индуцировать фосфорилирование IRF3 и IRF7 и последующую димеризацию (69–72). Однако, хотя TBK1 конститутивно экспрессируется в большинстве типов клеток, экспрессия IKKε более ограничена (73). При стимуляции TBK1 и IKKε рекрутируются адапторными белками в сигнальные комплексы, которые активируются фосфорилированием на Ser172, и оба, как было показано, подвергаются полиубиквитинированию, связанному с K63 [обзор в Ref.(73, 74)]. Для TBK1 K63-связанное полиубиквитинирование, по-видимому, важно для TLR- и RLR-индуцированной продукции IFN, поскольку цепи убиквитина могут служить платформой для сборки сигнальных комплексов TBK1. Более того, деубиквитиназы способны прекращать TBK1-опосредованный путь путем расщепления K63-связанных цепей убиквитина [обзор в Ref. (74, 75)]. Активированный TBK1 / IKKε фосфорилирует IRF3 и / или IRF7 в цитозоле по определенным сериновым остаткам. Это фосфорилирование приводит к гомо- или гетеродимеризации IRF3 и IRF7 и ядерной транслокации (76, 77).Интересно, что хотя IRF3 экспрессируется конститутивно, IRF7 экспрессируется на низких уровнях в большинстве типов клеток, и экспрессия индуцируется при передаче сигналов IFN. Следовательно, в большинстве клеток IRF7 сильно увеличивает продукцию IFN [см. (78)]. После того, как фосфорилированные димеры IRF3 и / или IRF7 перемещаются в ядро, они связываются с коактиватором транскрипции CREB-связывающим белком (CPB) / p300 (79, 80). Вместе с другими факторами, такими как NFκB, они образуют энхансосомы на промоторе IFNβ и индуцируют экспрессию IFN типа I [см. Обзор в Ref.(76)].

Вирусные белки, нацеленные на TBK1, действуют либо путем блокирования активации TBK1 с помощью MAVS, либо путем ингибирования активации IRF3 с помощью TBK1. Белок ORF4b MERS-CoV блокирует продукцию IFNβ за счет связывания с TBK1 и IKKε и подавления образования комплекса MAVS / IKKε (81). Помимо ингибирования активации TBK1 / IKKε, ORF4b может также ингибировать продукцию IFNβ в ядре; однако механизм еще не решен (81). Недавно было показано, что два белка вируса простого герпеса нацелены на TBK1 / IKKε и ингибируют фосфорилирование IRF3: ICP27 (82) и VP24 (83).Кроме того, неструктурные белки NS2A и NS4B вируса денге серотипа 4, а также белки NS2A и NS4B других вирусов денге ингибируют фосфорилирование TBK1 (84), и было показано, что белок N PEDV взаимодействует с TBK1, препятствуя ассоциации. TBK1 с IRF3 и предотвращение активации активации IRF3 (85). Было показано, что Tax онкобелка вируса Т-клеточного лейкоза человека типа 1 также взаимодействует с TBK1. Однако исследования пришли к противоречивым результатам о том, как это влияет на продукцию IFNβ.В то время как одна группа показала, что Tax активирует TBK1 и продукцию IFNβ (86), другая группа показала, что Tax подавляет продукцию IFN за счет взаимодействия с TBK1 (87). Интересно, что когда в недавнем исследовании проверялось, как белок P вируса бешенства уличных штаммов ведет себя по сравнению с адаптированными к лаборатории штаммами в отношении индукции IFN типа I, они обнаружили, что как уличные, так и лабораторные штаммы ингибируют передачу сигналов, опосредованную TBK1, но только белок P уличных штаммов также взаимодействует и ингибирует IKKε-индуцируемую IRF3-зависимую экспрессию IFNβ (88) (рис. 1).

Регуляторный фактор интерферона 3 является мишенью многих вирусов для нарушения передачи сигналов врожденного иммунитета. Большинство вирусов ингибируют фосфорилирование и тем самым также димеризацию и транслокацию IRF3, таких как дельтакоронавирус свиньи (89) или полиовирус (90). Белок вируса гепатита Е ORF3 также подавляет фосфорилирование IRF3, но косвенным образом. Он активирует белок-регулятор сигнала α (SIRP-α), который негативно регулирует индукцию IFN I типа (91). Напротив, белок NP1 бокавируса свиньи (PBoV) не влияет на экспрессию, фосфорилирование или ядерную транслокацию IRF3.Вместо этого он взаимодействует с ДНК-связывающим доменом IRF3 и ингибирует ДНК-связывающую активность (92). Очень интересный способ обойти врожденный иммунный ответ хозяина был обнаружен при изучении гамма-герпесвирусов, герпесвируса Капоши, связанного с саркомой (KSHV), и радиновируса макака-резуса (RRV). Они экспрессируют несколько вирусных гомологов IRF, называемых вирусными IRF (vIRF). Эти vIRF нашли несколько способов подавить продукцию IFN типа I. Для KSHV различные стратегии были рассмотрены в работе.(6). Недавно было показано, что RRV vIRF R6 взаимодействует с транскрипционным коактиватором CBP в ядре, подобно KSHV vIRF1. В результате CBP не может образовывать комплекс с фосфорилированным IRF3, и экспрессия IFN не индуцируется (93–95). Интересно, что RRV R6 является первым vIRF, для которого может быть показана связь с вироном. Следовательно, vIRF V6 может отключать IFN-ответ типа I вскоре после инфицирования клетки, делая клетку более восприимчивой к инфекции (95).Белок PEDV nsp1 также нацелен на CBP. Nsp1 индуцирует деградацию CBP протеасомозависимым образом и тем самым прерывает сборку энхансом и продукцию IFN типа I (96) (Рисунок 1).

Для большинства этих взаимодействий молекулярные механизмы еще не раскрыты. Некоторое время назад было показано, что белок, который взаимодействует с протеасомной деградацией IRF3 и индуцирует его протеасомную деградацию, представляет собой вирус классической чумы свиней (CSFV) Npro (97, 98). Недавно был опубликован молекулярный механизм.IRF3 и Npro взаимодействуют напрямую и образуют растворимый комплекс 1: 1. Более того, было показано, что Npro взаимодействует с полноразмерным IRF3, а не с отдельными доменами, и что Npro связывает конститутивно активную форму IRF3 в присутствии CPB. Таким образом, Npro взаимодействует как с мономером, так и с активным димером IRF3 и, вероятно, нацелен на оба вида для убиквитинилирования и протеасомной деградации (99).

Фактор 7, регулирующий интерферон, нацелен на два энтеровируса человека, такие как энтеровирус 71 и энтеровирус 68.Они подавляют регуляцию IRF7, расщепляя его своей протеазой 3c, оставляя продукты расщепления неспособными индуцировать экспрессию IFN. В то время как энтеровирус 71 расщепляет IRF7 один раз по Gln189 – Ser190 (100), энтеровирус 68 расщепляет его дважды, сайты расщепления — Gln167 и Gln189 (101). Более того, мегалоцивирус, ДНК-вирус, поражающий морских и пресноводных рыб, индуцирует экспрессию микроРНК хозяина pol-miR-731, которая затем специфически подавляет экспрессию IRF7 (102) (рис. 1).

Сигнализация IFN типа I

IFN типа I действуют аутокринным, паракринным или системным образом, стимулируя противовирусные реакции.Они распознаются рецептором IFNα / β (IFNAR), который состоит из субъединиц IFNAR1 и IFNAR2, экспрессируемых практически на всех типах клеток (103). Взаимодействие IFN типа I с рецептором приводит к фосфорилированию и активации IFNAR1- и IFNAR2-ассоциированных тирозинкиназ тирозинкиназы 2 (TYK2) и Janus-киназы 1 (JAK1), которые затем фосфорилируют тирозиновые остатки IFNAR, что приводит к привлечению и активация сигнальных молекул, таких как преобразователь сигнала и активатор транскрипции (STAT) семейства факторов транскрипции (104, 105).После активации STAT1 и STAT2 вместе с IRF9 образуют IFN-стимулированный генный фактор 3 (ISGF3), который затем перемещается в ядро, чтобы индуцировать транскрипцию ISG [подробно рассмотрено в Ref. (106–108)].

Некоторые вирусы нацелены на IFNAR, чтобы запретить связывание IFN и передачу сигналов. Вирус гриппа вызывает расщепление IFNAR1. Гемагглютинин (НА) запускает фосфорилирование и убиквитинилирование IFNAR1, тем самым способствуя деградации белка (109). Энцефалитные флавивирусы, такие как вирус клещевого энцефалита или вирус Западного Нила, ингибируют поверхностную экспрессию IFNAR1.Их белок NS5 связывает клеточную дипептидазу пролидазу (PEPD), которая участвует в созревании и накоплении IFNAR1, активации стимулированной IFNβ индукции гена и IFN-зависимом вирусном контроле. Это взаимодействие ингибирует внутриклеточный транспорт и гликозилирование IFNAR1, но не способствует деградации IFNAR1 (110) (рис. 3).

Рисунок 3. Передача сигналов IFN типа I и противодействие, предпринимаемое вирусами . IFN связывается со своим рецептором и тем самым активирует Tyk2 и Jak1, которые затем фосфорилируют Stat1 и Stat2.Вместе с IRF9, Stat1 и Stat2 образуют ISGF3, который перемещается в ядро ​​и индуцирует экспрессию ISG. HMPV, метапневмовирус человека; ИБК, вирус инфекционного бронхита; JEV, вирус японского энцефалита; LPMV, вирус Ла-Пьедад-Мичоакан, Мексика; PEDV, вирус эпидемической диареи свиней; RSV, респираторно-синцитиальный вирус; СФЦВ, тяжелая лихорадка с вирусом синдрома тромбоцитопении; VZV, вирус ветряной оспы.

И STAT1, и STAT2 являются мишенью многих вирусов для подавления индукции ISG.PEDV индуцирует убиквитинилирование Stat1 и направляет его на деградацию в протеасомах (111). Некоторые вирусы эволюционировали, чтобы предотвратить фосфорилирование Stat1 или Stat2. Белок V парамиксовируса La Piedad Michoacán Mexico Virus (LPMV) связывается со Stat2 и предотвращает IFN-зависимое фосфорилирование I типа и ядерную транслокацию Stat1 и Stat2 (112). Точно так же белок SH метапневмовируса человека (HMPV) нарушает экспрессию, фосфорилирование и активацию Stat1 (113). Вирус ветряной оспы обезьян не только ингибирует фосфорилирование Stat2, но также способствует деградации IRF9 протеасомозависимым образом через свой белок ORF63 (114).Кроме того, вирус инфекционного бронхита (IBV) ингибирует фосфорилирование и ядерную транслокацию Stat1. Однако, несмотря на подробный анализ, неясно, какой вирусный белок отвечает за это. Однако было показано, что дополнительный белок 3a способствует устойчивости IBV к IFN типа I, хотя цель также неизвестна (115). В случае человеческого парвовируса B19 становится очевидным, что и вирус, и иммунная система постоянно развиваются, чтобы преобладать. В то время как его белок NS1 подавляет фосфорилирование Stat, иммунная система воспринимает белок и запускает производство IFN типа I (116).SFTSV, новый клещевой патоген, разработал несколько способов предотвращения индукции ISG. Вирусный неструктурный белок NS нарушает экспрессию, фосфорилирование и активацию Stat1 (117) и взаимодействует со STAT2 и секвестрирует STAT1 и STAT2 в вирусные тельца включения, где они захватываются (118) (Рисунок 3).

Путь передачи сигналов JAK-STAT негативно регулируется супрессорами семейства белков цитокиновых сигналов (SOCS) в форме классической петли обратной связи (119, 120).Некоторые вирусы индуцируют экспрессию SOCS, чтобы воспользоваться этим механизмом, чтобы минимизировать индукцию ISG. Вирус японского энцефалита (JEV) подавляет экспрессию микроРНК miR-432, что затем приводит к повышению уровня SOCS5 (121). Инфекция вируса ветряной оспы (VZV) индуцирует экспрессию SOCS3 (122), а неструктурные белки NS1 и NS2 респираторно-синцитиального вируса (RSV) вызывают повышенную регуляцию SOCS1 и SOCS3, что также ингибирует индукцию хемокинов (123) (рис. ).

Отключение узла

Вирусы полностью зависят от трансляционного аппарата клетки-хозяина для репликации. Соответственно, они разработали несколько способов препятствовать синтезу белка-хозяина [см. (124)]. Один из способов — отключить синтез белка хозяина. Некоторое время считалось, что гамма- и дельтакоронавирусы не вызывают отключение хозяина, в отличие от альфа- и бетакоронавирусов. Однако недавнее исследование показало, что гаммакоронавирус инфекционного бронхита вызывает отключение хозяина, используя свой белок 5b.Похоже, что 5b является функциональным эквивалентом nsp1, белка отключения хозяина альфа- и бетакоронавирусов (125).

Заключение

Вирусы эволюционировали, чтобы иметь различные стратегии обхода врожденного иммунного ответа путем блокирования продукции IFN типа I или экспрессии ISG. Хотя эти разнообразные стратегии могут показаться противоречивыми для разных вирусов, необходимо учитывать несколько факторов. Например, использование клинических изолятов по сравнению со штаммами, подвергнутыми пассированию в лаборатории, может дать разные результаты, особенно с РНК-вирусами, которые быстро накапливают мутации из-за подверженных ошибкам РНК-зависимых РНК-полимераз.Более того, выбор клеточной линии может сильно повлиять на результаты экспериментов, поскольку многие иммортализованные или трансформированные непрерывные клеточные линии несут мутации в критической передаче сигналов врожденного иммунитета (126). Точно так же использование генетических нокаутных клеточных линий или организмов может влиять на результаты экспериментов, как и сами экспериментальные процедуры, особенно когда эндогенные взаимодействия нарушаются с использованием подходов сверхэкспрессии.

Изучение механизмов, используемых вирусами для предотвращения иммунного ответа, имеет большое значение для разработки новых стратегий ограничения последствий вирусных инфекций.Идентификация ключевых белков уклонения от иммунитета позволяет разработать противовирусные препараты, нацеленные на эти белки. В качестве альтернативы, идентификация ключевых клеточных антивирусных путей позволяет разработать стратегии по усилению этих путей для подавления поступающих вирусов. Информация о ключевых факторах уклонения от иммунитета дополнительно облегчает конструирование безопасных и эффективных вакцинных штаммов и разработку стратегий нацеливания на новые появляющиеся вирусы из того же или близкородственного семейства.

Авторские взносы

KS и KM концептуализировали объем обзорной статьи.KS написал обзор при участии KM.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Финансирование

Эта работа была поддержана докторской стипендией Deutsche Forschungsgemeinschaft (SCHU3011 / 1-1). Работа в лаборатории Моссмана по врожденной антивирусной передаче сигналов поддерживается Канадскими институтами исследований в области здравоохранения.

Список литературы

1. Нагараджан У. Индукция и функция IFNbeta при вирусной и бактериальной инфекции. Crit Rev Immunol (2011) 31 (6): 459–74. DOI: 10.1615 / CritRevImmunol.v31.i6.20

CrossRef Полный текст | Google Scholar

3. Вебер-Герлах М., Вебер Ф. Чтобы победить хозяина, вирус гриппа упаковывает его в: стратегии антагонизма интерферона за пределами NS1. J Virol (2016) 90 (19): 8389–94. DOI: 10.1128 / JVI.00041-16

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5.Амслер Л., Вервей М.С., ДеФилиппис В.Р. Уровни и размеры уклонения цитомегаловируса человека от ответа на интерферон I типа. J Mol Biol (2013) 425 (24): 4857–71. DOI: 10.1016 / j.jmb.2013.08.023

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Кумари П., Нараянан С., Кумар Х. Герпесвирусы: вмешательство в врожденный иммунитет путем нацеливания на вирусное зондирование и пути интерферона. Rev Med Virol (2015) 25 (3): 187–201. DOI: 10.1002 / RMV.1836

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11.Зинзула Л., Трамонтано Э. Стратегии высокопатогенных РНК-вирусов по блокированию обнаружения дцРНК рецепторами, подобными RIG-I: скрыть, замаскировать, ударить. Antiviral Res (2013) 100 (3): 615–35. DOI: 10.1016 / j.antiviral.2013.10.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Чаттерджи С., Basler CF, Amarasinghe GK, Leung DW. Молекулярные механизмы ингибирования врожденного иммунитета несегментированными вирусами с отрицательной РНК. J Mol Biol (2016) 428 (17): 3467–82.DOI: 10.1016 / j.jmb.2016.07.017

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14. Чан Ю.К., Гак М.Ю. Вирусное уклонение от восприятия внутриклеточной ДНК и РНК. Nat Rev Microbiol (2016) 14 (6): 360–73. DOI: 10.1038 / nrmicro.2016.45

CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Келл А.М., Гейл М. мл. RIG-I в распознавании РНК-вирусов. Вирусология (2015) 47 (9–480): 110–21. DOI: 10.1016 / j.virol.2015.02.017

CrossRef Полный текст | Google Scholar

21.Сайто Т., Хираи Р., Лоо Ю.М., Оуэн Д., Джонсон С.Л., Синха С.К. и др. Регуляция врожденной противовирусной защиты через общий репрессорный домен в RIG-I и LGP2. Proc Natl Acad Sci U S A (2007) 104 (2): 582–7. DOI: 10.1073 / pnas.0606699104

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Фицджеральд, М. Е., Роулинг, округ Колумбия, Вела А., Пайл А. М.. Развивающийся арсенал: обнаружение вирусной РНК рецепторами, подобными RIG-I. Curr Opin Microbiol (2014) 20: 76–81. DOI: 10.1016 / j.mib.2014.05.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Gack MU, Nistal-Villan E, Inn KS, Garcia-Sastre A, Jung JU. Опосредованная фосфорилированием негативная регуляция противовирусной активности RIG-I. J Virol (2010) 84 (7): 3220–9. DOI: 10.1128 / JVI.02241-09

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25. Ковалински Э., Лунарди Т., Маккарти А.А., Лубер Дж., Брунель Дж., Григоров Б. и др. Структурная основа активации рецептора распознавания паттернов врожденного иммунитета RIG-I вирусной РНК. Cell (2011) 147 (2): 423–35. DOI: 10.1016 / j.cell.2011.09.039

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Gack MU, Shin YC, Joo CH, Urano T, Liang C, Sun L и др. Убиквитинлигаза TRIM25 RING-finger E3 необходима для противовирусной активности, опосредованной RIG-I. Nature (2007) 446 (7138): 916–20. DOI: 10.1038 / nature05732

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Цзэн В., Сунь Л., Цзян Х, Чен Х, Хоу Ф, Адхикари А. и др.Восстановление пути RIG-I показывает сигнальную роль незакрепленных цепей полиубиквитина в врожденном иммунитете. Cell (2010) 141 (2): 315–30. DOI: 10.1016 / j.cell.2010.03.029

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Махарадж Н.П., Вис Э., Столл А, Гак М.Ю. Обычные протеинкиназы C-альфа (PKC-альфа) и PKC-бета отрицательно регулируют передачу противовирусного сигнала RIG-I. J Virol (2012) 86 (3): 1358–71. DOI: 10.1128 / JVI.06543-11

CrossRef Полный текст | Google Scholar

30.Oshiumi H, Miyashita M, Matsumoto M, Seya T. Особая роль Riplet-опосредованного K63-связанного полиубиквитинирования репрессорного домена RIG-I в человеческих противовирусных врожденных иммунных ответах. PLoS Pathog (2013) 9 (8): e1003533. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1003533

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

31. Виз Э., Ван М.К., Махарадж Н.П., Чен К., Чжоу С., Финберг Р.В. и др. Дефосфорилирование РНК-сенсоров RIG-I и MDA5 фосфатазой PP1 необходимо для передачи сигналов врожденного иммунитета. Иммунитет (2013) 38 (3): 437–49. DOI: 10.1016 / j.immuni.2012.11.018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

32. Лю Х.М., Лоо Ю.М., Хорнер С.М., Зорнецер Г.А., Катце М.Г., Гейл М. мл. Шаперон 14-3-3-эпсилон, направленный на митохондрии, регулирует транслокон RIG-I, который опосредует мембранную ассоциацию и врожденный противовирусный иммунитет. Клеточный микроб-хозяин (2012) 11 (5): 528–37. DOI: 10.1016 / j.chom.2012.04.006

CrossRef Полный текст | Google Scholar

35.Хюн Дж., Канагавелу С., Фуката М. Уникальный путь защиты хозяина: TRIF опосредует как противовирусные, так и антибактериальные иммунные ответы. Микробы заражают (2013) 15 (1): 1–10. DOI: 10.1016 / j.micinf.2012.10.011

CrossRef Полный текст | Google Scholar

36. Мейлан Э., Бернс К., Хофманн К., Бланшето В., Мартинон Ф., Келлихер М. и др. RIP1 является важным медиатором активации NF-каппа B, индуцированной Toll-подобным рецептором 3. Nat Immunol (2004) 5 (5): 503–7. DOI: 10.1038 / ni1061

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

37.Estornes Y, Toscano F, Virard F, Jacquemin G, Pierrot A, Vanbervliet B и др. дцРНК вызывает апоптоз через атипичный комплекс смерти, связывающий TLR3 с каспазой-8. Cell Death Differ (2012) 19 (9): 1482–94. DOI: 10.1038 / cdd.2012.22

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

40. Гори-Савеллини Г, Валентини М, Куси MG. Белок NSs вируса тосканы ингибирует индукцию интерферона I типа, взаимодействуя с RIG-I. J Virol (2013) 87 (12): 6660–7.DOI: 10.1128 / JVI.03129-12

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

41. Гори Савеллини G, Гандольфо C, Куси MG. Усечение С-концевой области белка NS вируса Тоскана имеет решающее значение для антагонизма бета-интерферона и стабильности белка. Вирусология (2015) 486: 255–62. DOI: 10.1016 / j.virol.2015.09.021

CrossRef Полный текст | Google Scholar

42. Zhu Z, Wang G, Yang F, Cao W., Mao R, Du X и ​​др. Вирус ящура виропорин 2B противодействует опосредованным RIG-I противовирусным эффектам, подавляя экспрессию его белка. J Virol (2016). DOI: 10.1128 / JVI.01310-16

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

43. Hou Z, Zhang J, Han Q, Su C, Qu J, Xu D, et al. Вирус гепатита B подавляет внутреннюю иммунную передачу сигналов RIG-I и RIG-G посредством индукции miR146a. Sci Rep (2016) 6: 26150. DOI: 10.1038 / srep26150

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

44. Чан Ю.К., Гак М.Ю. Механизм вируса денге, основанный на фосфомиметике, противодействующий врожденному иммунитету. Nat Immunol (2016) 17 (5): 523–30. DOI: 10.1038 / ni.3393

CrossRef Полный текст | Google Scholar

45. Miyashita M, Oshiumi H, Matsumoto M, Seya T. DDX60, DEXD / H-бокс-геликаза, представляет собой новый противовирусный фактор, способствующий передаче сигналов, опосредованной RIG-I-подобным рецептором. Mol Cell Biol (2011) 31 (18): 3802–19. DOI: 10.1128 / MCB.01368-10

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

46. Осиуми Х., Мияшита М., Окамото М., Мориока Й., Окабе М., Мацумото М. и др.DDX60 участвует в RIG-I-зависимых и независимых противовирусных реакциях, и его функция ослабляется активацией EGFR, индуцированной вирусом. Cell Rep (2015) 11 (8): 1193–207. DOI: 10.1016 / j.celrep.2015.04.047

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

47. Schoggins JW, Wilson SJ, Panis M, Murphy MY, Jones CT, Bieniasz P, et al. Различные генные продукты являются эффекторами противовирусного ответа интерферона типа I. Nature (2011) 472 (7344): 481–5.DOI: 10.1038 / nature09907

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

48. Губау Д., ван дер Вин А.Г., Чакраварти П., Лин Р., Роджерс Н., Ревинкель Дж. И др. Мышиная суперкиллер-2-подобная геликаза DDX60 незаменима для индукции IFN типа I и иммунитета к множественным вирусам. Eur J Immunol (2015) 45 (12): 3386–403. DOI: 10.1002 / eji.201545794

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

49. He Z, Zhu X, Wen W, Yuan J, Hu Y, Chen J, et al.Вирус денге подрывает врожденный иммунитет хозяина, воздействуя на адаптерный белок MAVS. J Virol (2016) 90 (16): 7219–30. DOI: 10.1128 / JVI.00221-16

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

50. Дун Дж., Сюй С., Ван Дж., Ло Р., Ван Д., Сяо С. и др. Протеаза вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней 3C расщепляет митохондриальный противовирусный сигнальный комплекс, противодействуя экспрессии IFN-бета. J Gen Virol (2015) 96 (10): 3049–58. DOI: 10.1099 / JGV.0,000257

CrossRef Полный текст | Google Scholar

51. Ли XD, Сун Л., Сет РБ, Пинеда Дж., Чен З.Дж. Протеаза вируса гепатита С NS3 / 4A отщепляет митохондриальный противовирусный сигнальный белок от митохондрий, чтобы избежать врожденного иммунитета. Proc Natl Acad Sci U S A (2005) 102 (49): 17717–22. DOI: 10.1073 / pnas.0508531102

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

52. Феррейра А.Р., Магальяеш А.С., Камоэс Ф., Гувейя А., Виейра М., Каган Дж.С. и др.Вирус гепатита C NS3-4A подавляет пероксисомальный MAVS-зависимый ответ на передачу сигналов противовирусными препаратами. J Cell Mol Med (2016) 20 (4): 750–7. DOI: 10.1111 / jcmm.12801

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

53. Хуанг Ц., Ду И, Ю З, Чжан Ц., Лю И, Тан Дж и др. Высокопатогенный вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней Nsp4 расщепляет VISA, чтобы ослабить противовирусные реакции, опосредованные RIG-I-подобными рецепторами. Sci Rep (2016) 6: 28497. DOI: 10.1038 / srep28497

CrossRef Полный текст | Google Scholar

54. Cao L, Ge X, Gao Y, Herrler G, Ren Y, Ren X и др. Вирус эпидемической диареи свиней подавляет индуцированную дцРНК продукцию интерферона-бета в эпителиальных клетках кишечника свиней путем блокады пути, опосредованного RIG-I. Вирол J (2015) 12: 127. DOI: 10.1186 / s12985-015-0345-x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

55. Shi CS, Qi HY, Boularan C, Huang NN, Abu-Asab M, Shelhamer JH, et al.Открытая рамка считывания-9b коронавируса SARS подавляет врожденный иммунитет, воздействуя на митохондрии и сигналосому MAVS / TRAF3 / TRAF6. J Immunol (2014) 193 (6): 3080–9. DOI: 10.4049 / jimmunol.1303196

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

56. Ю Ф, Сунь Х, Чжоу Х, Сун В., Лян С., Чжай З. и др. PCBP2 опосредует деградацию адаптера MAVS через убиквитинлигазу HECT AIP4. Nat Immunol (2009) 10 (12): 1300–8. DOI: 10.1038 / ni.1815

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

57.Хён Дж., Рамос Дж. К., Туми Н., Балачандран С., Лаворгна А., Хархадж Е. и др. Онкогенный человеческий Т-клеточный лимфотропный вирус типа 1, налоговое подавление первичных сигнальных путей врожденного иммунитета. J Virol (2015) 89 (9): 4880–93. DOI: 10.1128 / JVI.02493-14

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

58. Луи П.Й., Вонг Л.Й., Фунг К.Л., Сиу К.Л., Йунг М.Л., Юен К.С. и др. Белок коронавируса М ближневосточного респираторного синдрома подавляет экспрессию интерферона I типа за счет ингибирования TBK1-зависимого фосфорилирования IRF3. Emerg Microbes Infect (2016) 5: e39. DOI: 10.1038 / emi.2016.33

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

59. Сиу К.Л., Чан С.П., Кок К.Х., Чиу-Ят Ву П, Джин Д.Й. Подавление врожденного противовирусного ответа белком М коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома опосредуется через первый трансмембранный домен. Cell Mol Immunol (2014) 11 (2): 141–9. DOI: 10,1038 / cmi.2013.61

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

62.Kroll M, Margottin F, Kohl A, Renard P, Durand H, Concordet JP, et al. Индуцируемая деградация IkappaBalpha протеасомой требует взаимодействия с F-бокс-белком h-betaTrCP. J Biol Chem (1999) 274 (12): 7941-5. DOI: 10.1074 / jbc.274.12.7941

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

63. Чен Л.Ф., Грин WC. Формируя ядерное действие NF-kappaB. Nat Rev Mol Cell Biol (2004) 5 (5): 392-401. DOI: 10.1038 / nrm1368

CrossRef Полный текст | Google Scholar

64.Хуан Л., Лю Ц., Чжан Л., Чжан Ц., Ху Л., Ли Ц. и др. Протеаза 3C вируса энцефаломиокардита снимает ингибирующий эффект связанного с членом семейства TRAF активатора NF-kappaB (TANK) на TRAF6-опосредованную передачу сигналов NF-kappaB посредством расщепления TANK. J Biol Chem (2015) 290 (46): 27618–32. DOI: 10.1074 / jbc.M115.660761

CrossRef Полный текст | Google Scholar

65. Ван Д., Фанг Л., Ши И, Чжан Х, Гао Л., Пэн Г. и др. 3С-подобная протеаза вируса эпидемической диареи свиней регулирует свой антагонизм к интерферону путем расщепления NEMO. J Virol (2016) 90 (4): 2090–101. DOI: 10.1128 / JVI.02514-15

CrossRef Полный текст | Google Scholar

66. Ван Д., Фанг Л., Вэй Д., Чжан Х., Луо Р., Чен Х и др. Протеаза 3C вируса гепатита А расщепляет NEMO, нарушая индукцию бета-интерферона. J Virol (2014) 88 (17): 10252–8. DOI: 10.1128 / JVI.00869-14

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

67. Ван Д., Фанг Л., Ли К., Чжун Х., Фан Дж., Оуян С. и др. Протеаза 3C вируса ящура расщепляет NEMO, нарушая передачу сигналов врожденного иммунитета. J Virol (2012) 86 (17): 9311–22. DOI: 10.1128 / JVI.00722-12

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

68. Ди Фиоре И. Дж., Пейн Дж. А., Холлоуэй Г., Колсон Б. С.. NSP1 ротавирусов человека обычно ингибирует передачу сигналов NF-kappaB, индуцируя деградацию бета-TrCP. J Gen Virol (2015) 96 (Pt 7): 1768–76. DOI: 10.1099 / vir.0.000093

CrossRef Полный текст | Google Scholar

69. Фитцджеральд К.А., МакВиртер С.М., Файя К.Л., Роу, округ Колумбия, Латц Э., Голенбок Д.Т. и др.IKKepsilon и TBK1 являются важными компонентами сигнального пути IRF3. Nat Immunol (2003) 4 (5): 491–6. DOI: 10.1038 / ni921

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

70. Sharma S, tenOever BR, Grandvaux N, Zhou GP, Lin R, Hiscott J. Запуск противовирусного ответа интерферона через IKK-зависимый путь. Science (2003) 300 (5622): 1148–51. DOI: 10.1126 / science.1081315

CrossRef Полный текст | Google Scholar

72.Икеда Ф., Хеккер С.М., Розенкноп А., Нордмайер Р.Д., Рогов В., Хофманн К. и др. Участие убиквитиноподобного домена киназ TBK1 / IKK-i в регуляции IFN-индуцибельных генов. EMBO J (2007) 26 (14): 3451–62. DOI: 10.1038 / sj.emboj.7601773

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

73. Verhelst K, Verstrepen L, Carpentier I, Beyaert R. Киназа IkappaB эпсилон (IKKepsilon): терапевтическая мишень при воспалении и раке. Biochem Pharmacol (2013) 85 (7): 873–80.DOI: 10.1016 / j.bcp.2013.01.007

CrossRef Полный текст | Google Scholar

74. Weil R, Laplantine E, Genin P. Регулирование активности TBK1 оптинейрином способствует зависимой от клеточного цикла экспрессии пути интерферона. Cytokine Growth Factor Rev (2016) 29: 23–33. DOI: 10.1016 / j.cytogfr.2016.03.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

76. Хонда К., Танигучи Т. IRF: главные регуляторы передачи сигналов толл-подобными рецепторами и цитозольными рецепторами распознавания образов. Nat Rev Immunol (2006) 6 (9): 644–58. DOI: 10.1038 / nri1900

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

77. Тамура Т., Янаи Х, Савицкий Д., Танигучи Т. Факторы транскрипции семейства IRF в иммунитете и онкогенезе. Annu Rev Immunol (2008) 26: 535–84. DOI: 10.1146 / annurev.immunol.26.021607.0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

78. Икусима Х., Негиси Х., Танигучи Т. Факторы транскрипции семейства IRF на стыке врожденных и адаптивных иммунных ответов. Колд Спринг Харб Symp Quant Biol (2013) 78: 105–16. DOI: 10.1101 / sqb.2013.78.020321

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

79. Йонеяма М., Сухара В., Фукухара Ю., Фукуда М., Нишида Е., Фудзита Т. Прямое включение системы интерферона типа I вирусной инфекцией: активация комплекса факторов транскрипции, содержащего IRF-3 и CBP / p300. EMBO J (1998) 17 (4): 1087–95. DOI: 10.1093 / emboj / 17.4.1087

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

80.Ян Х, Ма Г, Лин Ч., Орр М, Уотелет МГ. Механизм транскрипционного синергизма между фактором регуляции интерферона (IRF) -3 и IRF-7 при активации промотора гена интерферона-β. Eur J Biochem (2004) 271 (18): 3693–703. DOI: 10.1111 / j.1432-1033.2004.04310.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

81. Ян Й, Е Ф, Чжу Н., Ван В., Дэн Й, Чжао З. и др. Белок ORF4b коронавируса ближневосточного респираторного синдрома подавляет выработку интерферона I типа через цитоплазматические и ядерные мишени. Научный журнал (2015) 5: 17554. DOI: 10.1038 / srep17554

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

82. Christensen MH, Jensen SB, Miettinen JJ, Luecke S, Prabakaran T, Reinert LS, et al. HSV-1 ICP27 нацелен на активированный TBK1 сигналсом STING, чтобы ингибировать индуцированную вирусом экспрессию IFN типа I. EMBO J (2016) 35 (13): 1385–99. DOI: 10.15252 / embj.201593458

CrossRef Полный текст | Google Scholar

83. Zhang D, Su C, Zheng C. Сериновая протеаза VP24 вируса простого герпеса 1 блокирует сигнальный путь чувствительности к ДНК, отменяя активацию фактора регуляции интерферона 3. J Virol (2016) 90 (12): 5824–9. DOI: 10.1128 / JVI.00186-16

CrossRef Полный текст | Google Scholar

84. Далримпл Н.А., Чимика В., Макков Э.Р. Белки NS вируса денге подавляют передачу сигналов RIG-I / MAVS, блокируя фосфорилирование TBK1 / IRF3: NS4A вируса денге серотипа 1 является уникальной детерминантой вирулентности, регулирующей интерферон. MBio (2015) 6 (3): e515–53. DOI: 10.1128 / mBio.00553-15

CrossRef Полный текст | Google Scholar

85. Ding Z, Fang L, Jing H, Zeng S, Wang D, Liu L и др.Белок нуклеокапсида вируса эпидемической диареи свиней противодействует выработке бета-интерферона, секвестрируя взаимодействие между IRF3 и TBK1. J Virol (2014) 88 (16): 8936–45. DOI: 10.1128 / JVI.00700-14

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

86. Диани Э., Авесани Ф, Бергамо Э, Кремонезе Дж, Бертаццони У, Романелли М.Г. Рекрутирование белка HTLV-1 Tax в киназные комплексы IKKepsilon и TBK1 усиливает экспрессию IFN-I. Вирусология (2015) 476: 92–9.DOI: 10.1016 / j.virol.2014.12.005

CrossRef Полный текст | Google Scholar

87. Yuen CK, Chan CP, Fung SY, Wang PH, Wong WM, Tang HM и др. Подавление продукции интерферона типа I налогом онкобелка типа 1 вируса Т-клеточной лейкемии человека посредством ингибирования фосфорилирования IRF3. J Virol (2016) 90 (8): 3902–12. DOI: 10.1128 / JVI.00129-16

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

88. Масатани Т., Одзава М., Ямада К., Ито Н., Хори М., Мацуу А. и др.Вклад взаимодействия между белком Р вируса бешенства и киназой I-каппа B в ингибирование передачи сигналов индукции IFN типа I. J Gen Virol (2016) 97 (2): 316–26. DOI: 10.1099 / jgv.0.000362

CrossRef Полный текст | Google Scholar

89. Ло Дж., Фанг Л., Донг Н, Фанг П, Динг З., Ван Д. и др. Инфекция, вызванная дельтакоронавирусом свиней (PDCoV), подавляет продукцию интерферона-бета, опосредованную RIG-I. Вирусология (2016) 495: 10–7. DOI: 10.1016 / j.virol.2016.04.025

CrossRef Полный текст | Google Scholar

91. Хуанг Ф., Ян Ц., Ю В, Би Й., Лонг Ф., Ван Дж. И др. Инфекция вируса гепатита E активирует сигнальный белок-регулятор альфа, подавляющий интерферон I типа. Immunol Res (2016) 64 (1): 115–22. DOI: 10.1007 / s12026-015-8729-y

CrossRef Полный текст | Google Scholar

92. Чжан Р., Фанг Л., Ву В., Чжао Ф., Сун Т., Се Л. и др. Белок NP1 бокавируса свиньи подавляет продукцию IFN типа I, препятствуя ДНК-связывающей активности IRF3. Вирусные гены (2016) 52 (6): 797–805. DOI: 10.1007 / s11262-016-1377-z

CrossRef Полный текст | Google Scholar

93. Burysek L, Yeow WS, Lubyova B, Kellum M, Schafer SL, Huang YQ и др. Функциональный анализ регуляторного фактора 1 вирусного интерферона, кодируемого вирусом герпеса 8 человека, и его связи с клеточными регуляторными факторами интерферона и p300. J Virol (1999) 73 (9): 7334–42.

PubMed Аннотация | Google Scholar

94. Со Т, Ли Д., Ли Б., Чунг Дж. Х., Чхве Дж.Регуляторный фактор 1 вирусного интерферона вируса герпеса Капоши, ассоциированного с саркомой (вирус герпеса человека 8), связывается с CREB-связывающим белком и ингибирует его трансактивацию. Biochem Biophys Res Commun (2000) 270 (1): 23–7. DOI: 10.1006 / bbrc.2000.2393

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

95. Морин Г., Робинсон Б.А., Роджерс К.С., Вонг SW. Фактор регуляции вирусного интерферона (IFN) резус-радиновируса связан с вирионом и ингибирует ранний противовирусный ответ IFN. J Virol (2015) 89 (15): 7707–21. DOI: 10.1128 / JVI.01175-15

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

96. Чжан К., Ши К., Ю Д. Подавление продукции интерферона типа I вирусом эпидемической диареи свиней и деградация CREB-связывающего белка с помощью nsp1. Вирусология (2016) 489: 252–68. DOI: 10.1016 / j.virol.2015.12.010

CrossRef Полный текст | Google Scholar

97. Bauhofer O, Summerfield A, Sakoda Y, Tratschin JD, Hofmann MA, Ruggli N.Вирус классической чумы свиней Npro взаимодействует с регуляторным фактором 3 интерферона и вызывает его протеасомную деградацию. J Virol (2007) 81 (7): 3087–96. DOI: 10.1128 / JVI.02032-06

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

98. Сиго Дж., Хилтон Л., Рид Э., Дочеул В., Джейасисан Дж., Моганерадж К. и др. Продукт Npro вируса классической чумы свиней и вируса вирусной диареи крупного рогатого скота использует консервативный механизм для нацеливания на регуляторный фактор-3 интерферона. J Gen Virol (2007) 88 (Pt 11): 3002–6.DOI: 10.1099 / vir.0.82934-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

99. Gottipati K, Holthauzen LM, Ruggli N, Choi KH. Пестивирус Npro напрямую взаимодействует с мономером и димером фактора регуляции интерферона 3 (IRF3). J Virol (2016) 90 (17): 7740–7. DOI: 10.1128 / JVI.00318-16

CrossRef Полный текст | Google Scholar

100. Лей X, Сяо X, Сюэ Q, Джин Q, He B, Ван Дж. Расщепление интерферонового регуляторного фактора 7 энтеровирусом 71 3C подавляет клеточные ответы. J Virol (2013) 87 (3): 1690–8. DOI: 10.1128 / JVI.01855-12

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

101. Xiang Z, Liu L, Lei X, Zhou Z, He B, Wang J. 3C протеаза энтеровируса D68 ингибирует клеточную защиту, опосредованную регуляторным фактором 7 интерферона. J Virol (2016) 90 (3): 1613– 21. DOI: 10.1128 / JVI.02395-15

CrossRef Полный текст | Google Scholar

102. Zhang BC, Zhou ZJ, Sun L. pol-miR-731, костистая миРНК, активированная мегалоцивирусом, отрицательно регулирует индуцированный вирусом ответ интерферона типа I, апоптоз и остановку клеточного цикла. Sci Rep (2016) 6: 28354. DOI: 10.1038 / srep28354

CrossRef Полный текст | Google Scholar

103. де Верд Н.А., Нгуен Т. Интерфероны и их рецепторы — распределение и регуляция. Immunol Cell Biol (2012) 90 (5): 483–91. DOI: 10.1038 / icb.2012.9

CrossRef Полный текст | Google Scholar

104. Шиндлер C, Леви Д.Е., Деккер Т. Передача сигналов JAK-STAT: от интерферонов к цитокинам. J Biol Chem (2007) 282 (28): 20059–63. DOI: 10.1074 / jbc.R700016200

CrossRef Полный текст | Google Scholar

108. Porritt RA, Hertzog PJ. Динамическое управление сигнализацией IFN типа I с помощью интегрированной сети отрицательных регуляторов. Trends Immunol (2015) 36 (3): 150–60. DOI: 10.1016 / j.it.2015.02.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

109. Xia C, Vijayan M, Pritzl CJ, Fuchs SY, McDermott AB, Hahm B. Гемагглютинин вируса гриппа A противодействует ответам интерферона I типа (IFN), вызывая деградацию рецептора IFN 1 типа I. J Virol (2016) 90 (5): 2403–17. DOI: 10.1128 / JVI.02749-15

CrossRef Полный текст | Google Scholar

110. Любик К.Дж., Робертсон С.Дж., МакНалли К.Л., Фридман Б.А., Расмуссен А.Л., Тейлор Р.Т. и др. Антагонизм флавивирусов к передаче сигналов интерферона типа I показывает, что пролидаза является регулятором поверхностной экспрессии IFNAR1. Клеточный микроб-хозяин (2015) 18 (1): 61–74. DOI: 10.1016 / j.chom.2015.06.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

111.Го Л, Ло Х, Ли Р, Сюй И, Чжан Дж, Ге Дж и др. Инфекция вируса эпидемической диареи свиней подавляет передачу сигналов интерферона за счет целенаправленной деградации STAT1. J Virol (2016) 90 (18): 8281–92. DOI: 10.1128 / JVI.01091-16

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

112. Пизанелли Г., Лоран-Ролль М., Маникассами Б., Белича-Вильянуэва А., Моррисон Дж., Лозано-Дубернар Б. и др. Белок вируса V Ла-Пьедад Мичоакан Мексика противодействует интерфероновому ответу I типа, связывая белок STAT2 и предотвращая ядерную транслокацию STAT. Virus Res (2016) 213: 11–22. DOI: 10.1016 / j.virusres.2015.10.027

CrossRef Полный текст | Google Scholar

113. Гастингс А.К., Амато К.Р., Вен С.К., Петерсон Л.С., Уильямс СП. Малый гидрофобный (SH) белок метапневмовируса человека подавляет передачу сигналов пути IFN типа I, влияя на экспрессию и фосфорилирование STAT1. Вирусология (2016) 494: 248–56. DOI: 10.1016 / j.virol.2016.04.022

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

114.Verweij MC, Wellish M, Whitmer T., Malouli D, Lapel M, Jonjic S и др. Вирусы ветряной оспы подавляют стимулируемую интерфероном передачу сигналов JAK-STAT с помощью нескольких механизмов. PLoS Pathog (2015) 11 (5): e1004901. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1004901

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

115. Кинт Дж., Дикхаут А., Каттер Дж., Майер Х. Дж., Бриттон П., Куманс Дж. И др. Коронавирус инфекционного бронхита подавляет передачу сигналов STAT1 и требует дополнительных белков для устойчивости к активности интерферона I типа. J Virol (2015) 89 (23): 12047–57. DOI: 10.1128 / JVI.01057-15

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

116. Wu J, Chen X, Ye H, Yao M, Li S, Chen L. Неструктурный белок (NS1) парвовируса человека B19 стимулирует врожденный иммунитет хозяина и подавляет передачу сигналов экзогенного интерферона I типа in vitro. Virus Res (2016) 222: 48–52. DOI: 10.1016 / j.virusres.2016.06.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

117.Чаудхари В., Чжан С., Юен К.С., Ли С., Луи П.Й., Фунг С.И. и др. Подавление передачи сигналов IFN типа I и типа III белком NSs тяжелой лихорадки с вирусом синдрома тромбоцитопении посредством ингибирования фосфорилирования и активации STAT1. J Gen Virol (2015) 96 (11): 3204–11. DOI: 10.1099 / jgv.0.000280

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

118. Нин Ю.Дж., Фенг К., Мин Ю.К., Цао В.С., Ван М., Дэн Ф. и др. Нарушение передачи сигналов интерферона типа I неструктурным белком тяжелой лихорадки с вирусом синдрома тромбоцитопении через захват STAT2 и STAT1 в тельца включения. J Virol (2015) 89 (8): 4227–36. DOI: 10.1128 / JVI.00154-15

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

119. Александр WS, Hilton DJ. Роль супрессоров белков передачи сигналов цитокинов (SOCS) в регуляции иммунного ответа. Annu Rev Immunol (2004) 22: 503–29. DOI: 10.1146 / annurev.immunol.22.0.0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

121. Шарма Н., Кумават К.Л., Растоги М., Басу А., Сингх С.К.Вирус японского энцефалита использует микроРНК-432 для регулирования экспрессии супрессора передачи сигналов цитокинов (SOCS) 5. Sci Rep (2016) 6: 27685. DOI: 10.1038 / srep27685

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

122. Чой Э.Дж., Ли Ч., Шин О.С. Супрессор экспрессии цитокинов 3, индуцированный вирусом ветряной оспы, приводит к модуляции репликации вируса. Scand J Immunol (2015) 82 (4): 337–44. DOI: 10.1111 / sji.12323

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

123. Zheng J, Yang P, Tang Y, Pan Z, Zhao D. Неструктурные белки респираторно-синцитиального вируса активируют SOCS1 и SOCS3 иначе, чем эндогенная передача сигналов IFN. J Immunol Res (2015) 2015: 738547. DOI: 10.1155 / 2015/738547

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

125. Kint J, Langereis MA, Maier HJ, Britton P, van Kuppeveld FJ, Koumans J, et al.Коронавирус инфекционного бронхита ограничивает выработку интерферона, вызывая отключение хозяина, которому требуется дополнительный белок 5b. J Virol (2016) 90 (16): 7519–28. DOI: 10.1128 / JVI.00627-16

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

126. Кацулидис Э., Каур С., Платаниас Л.С. Нарушение регуляции передачи сигналов интерферона в злокачественных клетках. Pharmaceuticals (Базель) (2010) 3 (2): 406–18. DOI: 10.3390 / ph4020406

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дифференциальные ответы на подтипы IFN-α в человеческих Т-клетках и дендритных клетках

Реферат

IFN типа I (IFN-αβ) составляют семейство цитокинов, которые обладают важными противовирусными и иммунорегуляторными свойствами и успешно используются при лечении широкого спектра заболеваний.Существует 12 функциональных подтипов человеческого IFN-α и один подтип IFN-β, которые передают сигнал через IFN-αβR на общей клеточной поверхности. На сегодняшний день практически отсутствует информация о специфичности ответов IFN-α в иммунных клетках. В этом исследовании анализировали передачу сигналов киназы Janus / STAT и транскрипционные ответы на выбранные подтипы IFN-α в человеческих Т-клетках и дендритных клетках. Были обнаружены доказательства специфичности IFN-α к подтипу и типу клеток. Также наблюдались различия между кинетикой экспрессии IFN-стимулированных генов (ISG) и потребностями отдельных ISG в дополнительных сигнальных путях.В частности, IFN-γ-индуцируемый белок-10 (IP-10), ключевой хемокин при воспалительных заболеваниях Th2-типа, регулировался дифференцированно. В дендритных клетках он сильно индуцировался IFN-α2 и IFN-α21, но гораздо менее эффективно IFN-α1. Эти подтипы Т-лимфоцитов лишь незначительно индуцировали его. В отличие от других проанализированных ISG, оптимальная индукция IP-10 зависела от активации киназы (ей) p38. Наблюдаемые вариации (дифференциалы, связанные с подтипом, типом клеток и ISG) позволяют лучше понять сложность и пластичность ответа IFN-αβ.Кроме того, новое наблюдение о том, что IFN-α1 плохо индуцирует IP-10, потенциально имеет клиническое значение, поскольку этот подтип может быть более полезным в случаях, когда Th2-опосредованные побочные эффекты (например, обострение аутоиммунных заболеваний) нежелательны.

IFN типа I (IFN-αβ) представляют собой семейство гомологичных цитокинов. Первоначально они были идентифицированы из-за их сильной противовирусной активности, но также было показано, что они обладают как антипролиферативной, так и широким спектром иммунорегуляторной активности (1, 2).IFN-αβ являются наиболее часто используемыми цитокинами для лечения широкого спектра заболеваний, включая рассеянный склероз, вирусный гепатит и меланому (3, 4).

IFN-αβ сильно индуцируются в ответ на вирусную инфекцию, но также могут продуцироваться при воздействии невирусных патогенов, включая грамотрицательные бактерии и простейшие (например, Escherichia coli , Leishmania major ) (5, 6). IFN-αβ является частью врожденного цитокинового ответа. Они быстро продуцируются при инфицировании и запускают ранние неспецифические защитные механизмы, включая индукцию генов, которые ингибируют репликацию вирусов и активацию цитотоксичности NK-клеток.IFN-αβ также обеспечивает важную связь между врожденным и адаптивным иммунитетом, формируя многие компоненты Ag-специфического иммунного ответа. Например, IFN-αβ способствует ответам CTL, увеличивает продукцию Ab и способствует развитию наивных Th-клеток в направлении фенотипа Th2. Считается, что эти поздние иммунорегуляторные эффекты IFN-αβ опосредуются скорее косвенными, чем прямыми действиями, и, вероятно, будет задействована модуляция экспрессии цитокинов / цитокиновых рецепторов и функции дендритных клеток (DC) 5 (7, 8, 9) .

У человека имеется несколько генов IFN-α и один ген IFN-β (2, 10, 11). Транскрибируется не менее 13 генов IFN-α. Кодирующие последовательности этих генов расходятся до 8%, давая начало 12 различным функциональным белкам подтипов (IFN-α1 и -α13 идентичны). Все подтипы IFN-α и IFN-β сходны по структуре и имеют общий рецептор клеточной поверхности, состоящий из двух известных субъединиц, IFNAR1 и IFNAR2 (12, 13, 14). Обычно связывание IFN-αβ с рецепторным комплексом инициирует сигнальный каскад посредством активации тирозинкиназ Tyk2 и Janus-киназы (Jak) 1 и, следовательно, фосфорилирования и димеризации STAT1 и STAT2 (15).Активированные димеры STAT отделяются от рецепторного комплекса и перемещаются в ядро, где они регулируют экспрессию IFN-стимулированных генов (ISG) (5). В ответ на IFN-αβ образуется ряд комплексов факторов транскрипции. Фактор ISG 3 (ISGF3) состоит из STAT1, STAT2 и регуляторного фактора p48 / ISGF3γ / IFN (IRF) 9 и связывает IFN-стимулированные ответные элементы (ISRE), присутствующие во многих промоторах ISG. Гетеродимеры STAT1-2 и гомодимеры STAT1 управляют экспрессией подмножества ISG через элементы γ-активированной последовательности (GAS).Другие члены семейства STAT участвуют в передаче сигналов IFN-αβ. Например, было обнаружено, что IFN-αβ активирует STAT3 в большинстве типов клеток, STAT4 и STAT5 в Т-клетках и NK-клетках (16, 17, 18) и STAT6 в B-клетках (19). Кроме того, задействованы пути, опосредованные фосфатидилинозитол-3 (PI3) киназой (20, 21), киназой митоген-активированного протеина (MAP) p38 (22, 23, 24) и регулируемой внеклеточными сигналами киназой 1/2 (25). в передаче сигналов IFN-αβ, но их точные роли еще предстоит установить.

Существование множества различных подтипов IFN-α поднимает вопрос об их биологической значимости. Известно, что разные вирусы индуцируют разные паттерны экспрессии подтипа IFN-α (26, 27) и что продукция отдельных подтипов регулируется разными IRF (28, 29, 30). Сообщалось об отчетливой относительной активности отдельных подтипов in vitro и in vivo (31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38). Однако все подтипы IFN-α, вероятно, обладают способностью проявлять классические активности IFN-αβ (например,g., противовирусные эффекты), как и следовало ожидать, учитывая, что они действуют через общий рецептор. Однако есть существенные биохимические доказательства того, что отдельные подтипы IFN связываются с разными сайтами IFN-αβR и имеют разную аффинность связывания, что приводит к образованию различных сигнальных комплексов (39, 40, 41, 42, 43, 44, 45), которые, априори, можно было ожидать по-разному рекрутировать нижестоящие сигнальные пути. Соответственно, разумно предположить следующее: 1) наложенные на широко перекрывающиеся классические функции, такие специфичные для подтипа сигнальные комплексы могут быть способны по-разному активировать вспомогательные ответы, характерные для этого подтипа; 2) любые такие различия, вероятно, зависят от клеточного фона и будут проявляться различиями в профилях экспрессии генов; и 3) принимая во внимание важность IFN-αβ для иммунной функции, различия подтипов IFN-α будут наиболее очевидными и соответствующим образом проанализированы в первичных клетках иммунной системы.

В этом исследовании изучали передачу сигналов через пути Jak / STAT и профили экспрессии генов для человеческих Т-клеток и DC, обработанных различными подтипами IFN-α. Помимо количественных различий между IFN-α1, -α2 и -α21 в их способности активировать STAT1–5 и ISG, были обнаружены доказательства специфичности IFN по подтипу и типу клеток, а также дифференциальные требования для дополнительных путей. Ярким примером является индукция IFN-γ-индуцибельного белка-10 (IP-10), хемокина, который играет важную роль в привлечении Th2-клеток и NK-клеток к участкам воспаления.Он сильно индуцировался IFN-α2 и -α21, но в гораздо меньшей степени IFN-α1 в DC. Напротив, он плохо индуцировался всеми этими подтипами IFN-α в Т-клетках. Оптимальная индукция IP-10, в отличие от других проанализированных классических ISG, зависела от активации киназы (ей) p38 MAP. Индуцибельная NO-синтаза (iNOS) и IL-12Rβ2 также дифференцированно индуцировались в DC и T-клетках. Существенные различия в кинетике накопления мРНК для разных подгрупп ISG усложняют ответ IFN-α.

Материалы и методы

Культура клеток и цитокин

РВМС выделяли из лейкоцитов центрифугированием плотности на Lymphoprep (Nycomed, Осло, Норвегия). Для получения Т-клеток PBMC активировали PHA (Murex, Kent, UK) и поддерживали в RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированной FCS и rIL-2 человека (20 нг / мл) в течение 1 недели. Перед обработкой IFN-α бласты Т-клеток промывали и затем культивировали в течение 48 часов в отсутствие rIL-2.Для генерации DC моноциты выделяли из PBMC путем сортировки MACS с использованием анти-CD14-конъюгированных магнитных микрошариков (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия) и культивировали в течение 6 дней в RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированной FCS, 50 нг / мл GM- CSF и 50 нг / мл IL-4 (оба от R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота). Были использованы следующие бактериальные подтипы rIFN-α: IFN-α1 (IFN-αD; удельная активность, 5,0 × 10 7 ед. / Мг), IFN-α21 (IFN-αF; удельная активность, 6,3 × 10 8 ед. / Мг). / мг), как от PBL Biomedical Laboratories (Нью-Брансуик, штат Нью-Джерси), так и IFN-α2 (IFN-α2a; роферон; удельная активность, 5.4 × 10 8 Ед / мг) от Roche (Базель, Швейцария). Все цитокины не содержали эндотоксина, как определено анализом лизата амебоцитов Limulus (т.е. <0,1 ЕД / мл эндотоксина). Соединения SB203580 и LY294002 были получены от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури).

Лизис клеток, иммунопреципитация, аффинная очистка и вестерн-блоттинг

Клетки обрабатывали в течение 20 минут подтипами IFN-α, а затем лизировали в 0,5% Nonidet P-40, 50 мМ Трис (pH 8.0), 10% глицерина, 150 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 1 мМ EDTA, 1 мМ ортованадат натрия, 1 мМ PMSF, 100 Ед / мл апротинина и 1 мкг / мл лейпептина. Лизаты очищали центрифугированием и использовали либо непосредственно для SDS-PAGE, либо для иммунопреципитации с антителами против STAT2 (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Калифорния) и протеином A-сефарозой. Аффинную очистку ДНК-связывающих белков проводили, как описано ранее (46), с использованием биотинилированного олигонуклеотида ДНК, содержащего консенсусный элемент GAS (5′-GTGGCTTTCCGGGAATCCTTG-3 ‘).Белки, элюированные загрузочным буфером, подвергали электрофорезу в гелях 7,5% полиакриламид-SDS и переносили на поливинилидендифторидные мембраны (Immobilon-P; Millipore, Bedford, MA). Мембраны были зондированы следующими Abs: анти-фосфотирозиновый Abs PY20 (Affinity, Ноттингем, Великобритания) и 4G10, анти-STAT1-фосфосерин 727 (оба от Upstate Biotechnology, Лейк-Плэсид, Нью-Йорк), анти-STAT1-фосфотирозин 701, анти-фосфотирозин. p38 и анти-p38 (все из New England Biolabs, Беверли, Массачусетс), анти-STAT1 p91 (NovoCastra, Newcastle, U.K.) и анти-STAT2, анти-STAT3, анти-STAT4 и анти-STAT5B (все от Santa Cruz Biotechnology). После ECL и авторадиографии мембраны очищали в 62,5 мМ Трис (pH 6,8), 2% SDS и 100 мМ 2-ME, а затем повторно зондировали при необходимости.

Экстракция РНК

Общую РНК

выделяли из клеток с использованием Trireagent (Helena Biosciences, Сандерленд, Великобритания) в соответствии с инструкциями производителя. Количество и качество РНК оценивали путем определения OD 260 и OD 280 с использованием спектрофотометрии и дополнительной визуализации с помощью электрофореза в агарозном геле.

Профилирование экспрессии генов: анализ макромассивов

кДНК, меченная радиоактивным изотопом, была получена из 5–10 мкг тотальной РНК путем обратной транскрипции с помощью Superscript II (Life Technologies, Rockville, MD) в присутствии [ 33 P] dCTP. Остаточную РНК гидролизовали щелочной обработкой при 70 ° C в течение 20 минут, и кДНК очищали с использованием колонок G-50 (Amersham Pharmacia, Bucks, UK). Перед гибридизацией с макромассивами меченую кДНК смешивали с 50 мкг COT-ДНК (Life Technologies) и 10 мкг поли (A) ДНК (Sigma-Aldrich), денатурировали при 95 ° C в течение 5 минут и гибридизовали в течение 1 часа. для минимизации неспецифического связывания.Подготовка макромассивов (представляющих 150 известных ISG), гибридизация радиоактивных кДНК, сканирование и анализ макромассивов проводились, как описано ранее (47).

Анализ защиты от РНКазы (RPA)

Как и ранее, проведено

РПА (48). Зонды IP-10, IL-12Rβ2, iNOS, супрессор передачи сигналов цитокинов (SOCS) 1, SOCS3 и GAPDH были приобретены у BD PharMingen (Сан-Диего, Калифорния). Вкратце, зонды были синтезированы из транскрипционных векторов SP6 / T7 и помечены [ 32 P] UTP до 2–5 × 10 8 имп / мин на микрограмм входящей ДНК.Для анализа использовали аликвоты, эквивалентные 1–3 × 10 5 имп / мин каждого зонда и 5–10 мкг общей РНК. Интенсивность радиоактивных полос определяли количественно с использованием PhosphorImager (Storm; Molecular Dynamics, Саннивейл, Калифорния). Представляющие интерес полосы были количественно оценены, скорректированы на фон и нормализованы к контрольной полосе (то есть, GAPDH или γ-актину). Результаты выражаются в виде интенсивностей PhosphorImager.

IP-10 ELISA

DC культивировали в 96-луночных планшетах (1 × 10 5 DC на 200 мкл) и обрабатывали подтипами IFN-α в течение 18 часов.Уровни белка IP-10 в супернатантах определяли с помощью специфического ELISA (HyCult Biotechnology, Норвуд, Массачусетс).

Результаты

Способность IFN подтипов IFN-α1, -α2 и -α21 активировать путь Jak / STAT и индуцировать значительный набор ISG была исследована на Т-клетках и DC. Эти подтипы были выбраны потому, что 1) IFN-α1 и -α2 обычно являются основными видами IFN, продуцируемыми в ответ на многие вирусы и поли (I: C) (49, 50, 51), 2) rIFN-α2 широко используется в терапевтических целях ( 4) и 3) IFN-α21 проявляет повышенную ингибирующую активность по сравнению с IFN-α2 (45).Кроме того, как рекомбинантный, так и природный IFN-α1 имеют в ~ 10 раз более низкую специфическую противовирусную активность, чем большинство подтипов, включая IFN-α2 и -α21 (52, 53). В соответствии с этим специфическая (противовирусная) активность используемых rIFN находилась в диапазоне 5 × 10 7 и 5 × 10 8 МЕ / мг белка для IFN-α1 по сравнению с -α2 и -α21, соответственно. В соответствии с действующей практикой везде указаны абсолютные концентрации подтипов. Для удобства, абсолютные концентрации 2 нг / мл для IFN-α2 и -α21 и 20 нг / мл для IFN-α1 каждая соответствуют ~ 1000 МЕ / мл в зависимости от противовирусной активности.

Активация STAT в ответ на подтипы IFN-α

Человеческие Т-клетки и DC обрабатывали в течение 20 мин диапазоном концентраций различных подтипов IFN-α. Экстракты цельных клеток (фиг. 1⇓, A , верхние панели и C ) или иммунопреципитированные белки STAT2 ( A , нижние панели ) фракционировали с помощью SDS-PAGE, и фосфорилирование STAT было исследовали с помощью вестерн-блоттинга с антителами, специфичными для фосфорилированных остатков Tyr и / или Ser.Альтернативно, активированные димеры STAT подвергали аффинной очистке по их способности связываться с биотинилированным олигонуклеотидом, содержащим консенсусный элемент GAS, и связанные активированные STAT анализировали аналогичным образом (фиг. 1- B ).

РИСУНОК 1.

Активация STAT подтипами IFN-α в Т-клетках и DC. Т-клетки ( A и B ) или DC ( C ) стимулировали различными концентрациями IFN-α1, IFN-α2 или IFN-α21 в течение 20 минут и получали лизаты цельных клеток. A и C , лизаты Т-клеток ( A ) и DC ( C ) разделяли с помощью SDS-PAGE, блотировали и исследовали на фосфорилирование STAT1 S727 и Y701 ( верхние панели ). Блот отделяли и повторно зондировали mAb против STAT1. Параллельно лизаты подвергали иммунопреципитации с помощью антител против STAT2 и иммуноблотировали с помощью антител против фосфотирозина (анти-P-Tyr), отделяли и повторно зондировали с помощью антител против STAT2 ( A , нижние панели ). B , лизаты Т-клеток подвергали аффинной очистке с биотинилированным GAS-олигонуклеотидом (материал и методы ), подвергали электрофорезу, блоттингу и зондированию с помощью анти-STAT1, анти-STAT3, анти-STAT4 и анти-STAT5B Abs.Данные представляют как минимум два независимых эксперимента.

В Т-клетках мы наблюдали, что все три подтипа IFN-α индуцировали фосфорилирование тирозина STAT1 до -5 (рис. 1, A и B ). Однако фосфорилирование / активация этих STAT под действием IFN-α1 было сравнительно слабым: для детектируемого фосфорилирования тирозина для каждого из STAT требовались от 10 до 100 раз более высокие абсолютные концентрации этого подтипа (рис. 1⇑, A и ). B ).Аналогичным образом, для обнаружения положительного сигнала в менее чувствительном анализе фосфорилирования Ser 727 для STAT1 требовались от 10 до 100 раз более высокие концентрации подтипа IFN-α1 (рис. 1⇑ A ). Такое фосфорилирование не было обнаружено с помощью анализа экстракта целых клеток при любой из протестированных концентраций IFN-α1 (до 10 нг / мл; фиг. 1⇑ A ). Однако при более высоких концентрациях (20 и 200 нг / мл) фосфорилированные формы STAT1 Ser 727 можно было наблюдать в анализе GAS oligo pull-down.В этом анализе (рис. 1⇑ B ) две формы STAT1 с различной электрофоретической подвижностью представляют собой STAT1, фосфорилированный по тирозину (нижняя полоса , ), и STAT1, фосфорилированный как по тирозину, так и по серину ( верхняя полоса ) (46). Для IFN-α2 и IFN-α21 наблюдались сходные кривые доза-ответ как для фосфорилирования тирозина, так и для фосфорилирования серина, хотя IFN-α2 оказался немного более эффективным при более низких концентрациях.

В DC сравнение ответов на IFN-α1 и IFN-α2 аналогичным образом выявило большие количественные различия между этими подтипами в их способности индуцировать фосфорилирование тирозина и серина STAT1 (рис.1 C ) и STAT3 (данные не показаны) и индуцировать образование комплекса ISGF3, как определено с помощью EMSA (данные не показаны).

Также была исследована кинетика активации STAT в Т-клетках (рис. 2⇓ A ) и DC ( B ). Фосфорилирование STAT1 на Y701 поддерживалось в течение 1-2 часов, а затем снижалось. Учитывая количественно более низкую активность IFN-α1, не наблюдалось явных различий между подтипами IFN-α в кинетике фосфорилирования STAT1 Y701.Аналогичный анализ кинетики активации STAT2, -3 и -4 в Т-клетках и STAT3 в DC не выявил различий между подтипами IFN-α (данные не показаны).

ФИГУРА 2.

Кинетика активации STAT1 в Т-клетках и ДК. Т-клетки ( A ) или DC ( B ) стимулировали различными концентрациями IFN-α1, IFN-α2 или IFN-α21 в течение разных периодов времени, как указано. Готовили лизаты цельных клеток и проводили иммуноблоттинг с антифосфо-Y701.Блоты удаляли и повторно зондировали mAb против STAT1. Данные представляют два независимых эксперимента.

Взятые вместе, результаты показывают, что существуют существенные количественные, но не качественные различия между подтипами IFN-α в отношении активации STAT как в Т-клетках, так и в DC.

Профилирование экспрессии генов

Индивидуальные макромассивы на основе кДНК, каждый из которых представляет 150 известных ISG в трех экземплярах ( Материалы и методы и Ref.47), были использованы в начальном скрининге дифференциальной экспрессии генов в ответ на три подтипа IFN-α. В предыдущих экспериментах для IFN-α2 в линиях клеток на основе HT1080 оптимальная индукция практически всех представленных ISG обычно наблюдалась при 2 нг / мл в течение 6-8 часов (47). Соответственно, в этом исследовании ответы на все три подтипа были проанализированы при 2 нг / мл, что соответствует физиологическим концентрациям ∼1000 МЕ / мл для IFN-α2 и IFN-α21 и 100 МЕ / мл для IFN-α1 (материалы ). и методы ).Чтобы компенсировать более низкую специфическую противовирусную активность, подтип IFN-α1 также анализировали в DC при более высокой абсолютной концентрации 20 нг / мл (1000 МЕ / мл). Была проанализирована общая РНК из необработанных и обработанных подтипом клеток. Результаты показаны как кратность индукции по сравнению с необработанными клетками. Данные для этих генов, индуцированных в 2 или более раз (27 в Т-клетках и 36 в DC), включая классические ISG MxA, 2′-5′-олигоаденилатсинтетазу и PKR , которые, как известно, участвуют в противовирусных ответах, представлены (Таблица I⇓).Как и ожидалось для ISG, не наблюдалось значительной репрессии (> 2-кратной) любого из представленных генов. Что касается активации STAT, как в Т-клетках, так и в DC, в целом ISG сильнее индуцируются IFN-α2 и -α21, чем IFN-α1. И снова IFN-α21 был немного менее эффективным, чем IFN-α2 (Таблица I⇓). IFN-α1 в концентрации 2 нг / мл достаточно для активации STAT1 и -2 (рис. 1 и 2). В соответствии с этим, хотя и менее эффективен, чем IFN-α2 или -α21, IFN-α1 в концентрации 2 нг / мл явно индуцировал, особенно в DC, более высоко индуцибельный из спектра ISG, наблюдаемый с более сильными IFN-α2 и -α21. подтипы.То, что любое различие в значительной степени является количественным, было по существу подтверждено более близким соответствием, наблюдаемым при увеличении концентрации IFN-α1 с 2 до 20 нг / мл (таблица I, DC, , первая колонка ). Интересно, однако, что IFN α2 и α21 индуцировали экспрессию хемокина IP-10 и мРНК iNOS в DC, но не в T-клетках. Это является еще одним примером специфичности клеточного типа в ответе на IFN-α (47). Что еще более важно в этом исследовании, что касается специфичности подтипа IFN-α, не наблюдалось значительной индукции гена IP-10 в DC в ответ на IFN-α1, даже при повышенной концентрации 20 нг / мл, тогда как он был сильно индуцирован в этих клетках 2 нг / мл IFN-α2 (14.В 4 раза) и IFN-α21 (в 6,6 раза) (таблица I⇓). Потенциально подобные различия, специфичные для подтипа IFN-α, наблюдались для ряда других ISG (например, RING4, GBP-1, IFI16 и Caspase 1 ). Однако эти различия были менее значительными и менее последовательными среди трех проанализированных образцов доноров, и их еще предстоит установить. Следовательно, из проанализированных IP-10 оказался наиболее вероятным кандидатом на ген ответа, специфичный для подтипа IFN-α. Соответственно, индукцию мРНК и белка IP-10 анализировали дополнительно.

Таблица I.

Индукция ISG подтипами IFN-α a

Индукция мРНК и белка IP-10 подтипами IFN-α

Кинетику индукции мРНК IP-10 сравнивали с помощью RPA с кинетикой для отбора IFN-α-индуцибельных мРНК как в DC, так и в T-клетках, обработанных IFN-α1 (2 и 20 нг / мл) или IFN-α2 ( 0,2 и 2 нг / мл) в течение 1, 4 и 8 ч (рис. 3⇓). Наблюдались различия 1) в кинетике индукции различных ISG, 2) между типами клеток и 3) между подтипами IFN-α.

РИСУНОК 3.

Подтипы и типы клеток в профилях экспрессии мРНК, индуцированных IFN-α. A , Кинетика индукции мРНК ISG. Т-клетки и DC обрабатывали IFN-α1 (20 и 2 нг / мл) или IFN-α2 (2 и 0,2 нг / мл) в течение указанного времени. Аликвоты (5 мкг) цитоплазматической РНК анализировали на предмет индуцируемой экспрессии генов с помощью RPA с использованием зондов IP-10, iNOS, IL-12Rβ2, SOCS3 и SOCS1 с GAPDH в качестве контроля загрузки ( верхние панели ) и ISG-65K, 6-16 и 9-27 зонды и γ-актин в качестве контроля нагрузки ( нижние панели ).Данные представляют из трех независимых экспериментов. B , Количественный анализ данных постоянного тока. Гели ( A , левая панель ) подвергали количественному анализу PhosphorImager. Были рассчитаны данные для кратности индукции после поправки на контрольные нагрузки GAPDH и γ-актина. Данные для IP-10, ISG-56K, 6-16 и 9-27 представлены в качестве примеров.

Дифференциальная кинетика индукции.

Индукция мРНК SOCS3 была исключительно ранней и преходящей, индукция ISG-56K была ранней, но продолжительной, тогда как индукция даже первично индуцированных мРНК 6-16, 9-27 и STAT1 оказалась немного задержанной.Ясно, что точка обнаружения зависит от чувствительности анализа, но различия в формах (переходные и продолжительные) кривых остаются. Транскрипционный ответ для всех основных идентифицированных мРНК (Рис. 3⇑ и Таблица I⇑) хорошо установлен. Поскольку мы изучаем накопление мРНК, нельзя, конечно, исключить дополнительную модуляцию через различия в стабильности мРНК.

Дифференциалы клеточного типа.

В ответ, например, на 2 нг / мл IFN-α2, IP-10 и iNOS были сильно индуцированы в DC (IP-10, 242-кратно через 4 часа; iNOS, 30-кратно через 1 час; рис.3⇑ A , дорожки 8 и 4 ), но лишь незначительно в Т-клетках (IP-10, 4 раза через 4 часа; iNOS 2 раза через 1 час; A , полосы 21 и 17 ), таким образом подтверждая дифференциацию клеточного типа, наблюдаемую в макромассивах (Таблица I⇑). Дополнительным примером специфичности клеточного типа является ген IL-12Rβ2 , который активируется в Т-клетках (рис. 3⇑ A , дорожки 19–22 ), но не в DC ( A , переулки 1–13 ).

Дифференциалы подтипа IFN-α.

В DC, все время анализируемого, мРНК IP-10 сильно индуцировалась IFN-α2 (0,2 и 2 нг / мл), но гораздо менее эффективно при 10-кратных более высоких концентрациях (2 и 20 нг / мл) IFN- α1 (рис. 3⇑). Это особенно очевидно в 8-часовой временной точке на рис. 3 A (сравните полосы 10, и 11 с 12 и 13 ) и соответствует фактическому отсутствию IFN-α1. -индуцированный ответ IP-10 через 8 ч в макромассиве (таблица I⇑).В соответствии с этим повышенные уровни мРНК IP-10 все еще определялись через 24 часа в ответ на IFN-α2 (2 нг / мл), но не на IFN-α1 (20 нг / мл) (данные не показаны). Более того, что важно, в ответ на IFN-α1 вырабатывалось значительно меньше белка IP-10, чем IFN-α2 (рис. 4). Действительно, для индукции сравнимых количеств белка IP-10 требовались по крайней мере в 100 раз более высокие концентрации IFN-α1 (20 нг / мл), чем IFN-α2 (0,2 нг / мл) (рис. 4⇓), в результате согласуется с аналогичной разницей в эффективности индукции мРНК IP-10 (рис.3⇑, A , сравните полосы 2 и 5 , 6 и 9 , 10 и 13 и B ). Это контрастирует с данными для подавляющего большинства ISG, для которых индукция в ответ на IFN-α2 (0,2 и 2 нг) и в 10 раз более высокие концентрации IFN-α1 (2 и 20 нг / мл) были весьма сопоставимы ( Рис. 3⇑ и Таблица I⇑). Таким образом, хотя при абсолютных концентрациях, скорректированных в 10 раз, чтобы компенсировать 10-кратную разницу в специфической противовирусной активности и сродстве к рецептору (см. Выше), IFN-α1 и -α2 могут проявлять аналогичную противовирусную активность и индуцировать большинство ISG в одинаковой степени, они гораздо больше различаются по своей способности индуцировать IP-10.Данные свидетельствуют о том, что для оптимальной индукции IP-10, но не для большинства ISG, оцененных в таблице I⇑, может потребоваться, по крайней мере, в DC, дополнительный сигнал (ы), активируемый IFN-α2, но не IFN- α1.

РИСУНОК 4.

Индукция белка IP-10 IFN-α1 и IFN-α2. DC стимулировали различными концентрациями IFN-α1 или -α2 в течение 18 часов. Среду из трех лунок собирали и объединяли, и уровни IP-10 определяли в двух экземплярах с помощью ELISA (материалы и методы , ).Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для двух независимых экспериментов.

Активация p38 необходима для оптимальной индукции IP-10

Промотор IP-10 содержит ISRE (54). Активированные STAT1 и -2 необходимы (вместе с уже существующим p48 / ISGF3γ / IRF9) для образования ISGF3, который опосредует ответы IFN-α через ISRE. Следовательно, можно разумно предположить, что активированные STAT1 и -2 необходимы (хотя и не обязательно достаточны) для индукции IP-10 с помощью IFN-α.Никакой разницы в активации STAT1 и -2 или в образовании ISGF3 в ответ на IFN-α1 и -α2 не наблюдалось (например, фиг. 1). Следовательно, различия в индукции IP-10 подтипами IFN-α1 и -α2 нельзя объяснить различиями в активации STAT. Помимо передачи сигналов Jak / STAT, пути киназ p38 и PI3 участвуют в ответах IFN-α (20, 21, 22, 23, 24). Поэтому была исследована роль этих путей в индукции IP-10 и других классических ISG в ответ на IFN-α1 и -α2.ДК обрабатывали IFN-α1 и -α2 (при 20 и 2 нг / мл соответственно) в отсутствие или в присутствии хорошо охарактеризованных ингибиторов киназы PI3 (LY294002) и p38 (SB203580) путей (рис. 5⇓). А ). Транскрипционные ответы оценивали через 8 часов, в этот момент разница между подтипами IFN-α при этих концентрациях была наиболее очевидной (рис. 3⇑ A ). Индукция IP-10 в ответ на оба подтипа IFN-α сильно ингибировалась SB203580, но не LY294002, что указывает на то, что путь киназы p38, но не PI3, участвует в регуляции этого гена.SB203580 ингибировал индукцию мРНК IP-10 дозозависимым образом, при этом ингибирование IP-10 наблюдалось с использованием всего лишь 1 мкМ этого соединения (данные не показаны). Напротив, этот ингибитор не влиял на индукцию мРНК ISG-56K, 2′-5′-олигоаденилатсинтетазы и 6-16 (фиг. 5⇓, A и B ) даже при значительно более высоких концентрациях. (20 мкМ; данные не показаны). Хотя LY294002 не влиял на индукцию мРНК IP-10, он был активен в этих клетках. Он сильно ингибировал накопление белка IP-10 в среде обработанных клеток (ELISA; три независимых эксперимента; данные не показаны).Это, скорее всего, отражает потребность в киназе PI3 для секреции белка посредством экзоцитоза секреторных везикул (55).

РИСУНОК 5.

Участие p38 в индукции IP-10. A , Влияние ингибиторов киназы PI3 и p38 на IFN-α-индуцированную экспрессию генов. DC обрабатывали IFN-α1 или IFN-α2 в концентрации 20 и 2 нг / мл соответственно в отсутствие или в присутствии LY294002 (LY) или SB203580 (SB) (оба по 10 мкМ) в течение 8 часов. Аликвоты (5 мкг) цитоплазматической РНК анализировали на предмет индуцируемой экспрессии гена с помощью RPA с использованием зондов IP-10, ISG-56K и 6-16 и GAPDH в качестве контроля загрузки. B , Количественное определение данных RPA с помощью анализа PhosphorImager двух независимых экспериментов (показано в A , а данные не показаны). Индукцию складок рассчитывали после поправки на контроль GAPDH. Данные представлены в виде процента ответа IFN-α2 в отсутствие ингибиторов (средние значения ± стандартная ошибка среднего). C , IFN-α индуцирует фосфорилирование p38. ДК обрабатывали IFN-α1 (20 нг / мл) или IFN-α2 (2 нг / мл) в течение 20 минут. Готовили лизаты цельных клеток и подвергали иммуноблоттингу с использованием антител против фосфо-p38, отделяли и повторно зондировали антителами против p38.

В соответствии с требованиями к p38 для оптимальной индукции IP-10, как IFN-α1 (при 20 нг / мл), так и IFN-α2 (при 2 нг / мл) индуцировали фосфорилирование p38 (рис. 5⇑ C ). ). Фосфорилирование протеинкиназы B, субстрата киназы PI3, не наблюдалось (данные не показаны). Очевидно, что путь p38 используется обоими подтипами IFN-α и необходим для оптимальной индукции IP-10, но не для других анализируемых ISG.

Обсуждение

В этом исследовании мы впервые представляем анализ передачи сигналов через Jak / STAT и дополнительные пути, а также экспрессию генов в человеческих Т-клетках и DC в ответ на различные подтипы IFN-α.Наблюдались существенные вариации, включая различия в ответах IFN-α-подтипа и клеточного типа и экспрессии ISG. Важно отметить, что хемокин IP-10 дифференциально индуцировался в DC под действием IFN-α1 по сравнению с IFN-α2 и IFN-α21. При физиологических концентрациях (2 нг / мл) мРНК и белок IP-10 сильно индуцировались IFN-α2 и -α21, но слабо — IFN-α1 (таблица I и фиг. 3 и 4). В отличие от других проанализированных ISG, увеличение концентрации IFN-α1 до 20 нг / мл не приводило к индукции уровней IP-10, сравнимых с уровнями, индуцированными 2 нг / мл IFN-α2.

IP-10 был первоначально идентифицирован как IFN-γ-индуцированный белок (56). Исследования in vivo с использованием либо нейтрализующих IP-10 Abs, либо мышей с дефицитом IP-10 показывают, что этот хемокин играет важную неизбыточную роль в привлечении / перемещении эффекторных клеток Th2 в участки воспаления ткани (57, 58). Было высказано предположение, что ранняя экспрессия, в частности IP-10 in vivo, имеет решающее значение для установления защитных клеточно-опосредованных иммунных ответов против определенных патогенов, и что ответственны за это компоненты врожденной иммунной системы, а не IFN-γ (57).IFN-αβ являются вероятными кандидатами на роль таких компонентов. Действительно, недавно было показано, что индуцированная IFN-αβ продукция IP-10 DC в ответ на Mycobacterium tuberculosis имеет решающее значение для селективного набора активированных Т-клеток (59). Следовательно, есть основания полагать, что нарушение индукции IP-10 под действием IFN-α1 в физиологических концентрациях может иметь важные последствия для иммунной регуляции. Следует отметить, что IFN-α1 играет важную роль в ответе на IFN-α, потому что он обычно является одним из основных продуцируемых подтипов (49, 50, 51).

Помимо защитной роли IP-10 при инфекциях, требующих сильных клеточно-опосредованных иммунных ответов, IP-10 также может способствовать прогрессированию определенных заболеваний. Экспрессия IP-10 наблюдалась при многих воспалительных / аутоиммунных заболеваниях Th2-типа, включая псориаз (60), рассеянный склероз (61, 62), ревматоидный артрит (63) и диабет 1 типа (64). Более того, мышиные модели аутоиммунитета Th2-типа in vivo установили критическую роль IP-10 в возникновении и прогрессировании заболевания (58, 65, 66).Очевидно, что индукция IP-10 и последующее привлечение клеток Th2 к участкам воспаления нежелательны при этих заболеваниях. В этом отношении интересно отметить, что терапевтическое применение IFN-α противопоказано пациентам с Th2-связанными расстройствами в анамнезе. Более того, были клинические примеры, когда введение IFN-α вызывало индукцию аутоиммунных заболеваний (67, 68) и приводило к обострению псориатических поражений (69). Принимая во внимание важную роль IP-10 в воспалительных заболеваниях Th2-типа, наблюдение, что индукция этого хемокина нарушается в ответ на IFN-α1, может иметь клиническое значение, поскольку этот подтип может быть более подходящим кандидатом для терапевтического применения в случаях, когда Воспалительные реакции Th2 нежелательны.Хотя эту возможность еще предстоит установить, удивительно, что IFN-α1 вызывал меньше побочных эффектов, чем IFN-α2, у пациентов со злокачественными заболеваниями (70).

В двух предыдущих исследованиях применялись инструменты глобального профилирования экспрессии генов для решения связанного с этим вопроса о том, существуют ли функциональные различия между IFN-α2 и IFN-β (37, 71). Эти исследования продемонстрировали, что при данной концентрации IFN-β индуцировал больше генов, чем -α2 (37, 71), но модели индукции ISG становились идентичными при увеличении концентрации IFN-α2 (37) — результат схожий. к этому для большинства ISG в ответ на IFN-α2 по сравнению с IFN-α1 в этом исследовании (Таблица I⇑).Принимая во внимание, что IFN-αβ действует через общий рецептор, это перекрытие в ответах, возможно, неудивительно. Тем не менее, текущие данные показывают, что даже при относительно высокой физиологической концентрации 2 нг / мл индукция IP-10 IFN-α1 серьезно нарушалась. Хотя индукция IFN-αβ может быть высокой в ​​ответ, по крайней мере, на некоторые вирусные инфекции (72), она может быть относительно низкой в ​​ответ на другие патогены (6), и есть также хорошие доказательства низкой конститутивной экспрессии (73). Таким образом, различия в действиях IFN-αβ при более низких концентрациях также могут быть биологически значимыми.

Были обнаружены существенные количественные различия между IFN-α1, -α2 и -α21 в способности активировать STAT1 до -5 и спектре ISG. При высоких концентрациях IFN-α все подтипы индуцировали фосфорилирование STAT1 до -5 в Т-клетках и STAT1 до -3 в DC (STAT4 и -5 не анализировались) и аналогичные паттерны экспрессии ISG (рис. 1 и таблица I). ). Различия между подтипами в этом отношении являются количественными, а не качественными и аналогичны тем, которые описаны для IFN-α2 и IFN-β (37).Важно отметить, что никаких существенных различий в кинетике активации STAT разными подтипами в диапазоне концентраций не наблюдалось (рис. 2, данные не представлены). Следовательно, нет очевидной специфичности активации STAT для этих конкретных подтипов в этих конкретных клетках. Недавно Cull et al. (38) сообщили о селективной активации STAT5 в ответ на различные подтипы IFN-α в иммортализованной линии клеток эритробластов мыши. Однако остается возможным, что это снова отражает количественную разницу в зависимости от концентрации, особенно потому, что активация STAT1 и -3 различными подтипами, как было показано, сильно зависит от используемой дозы.

Менее эффективное фосфорилирование / активация STAT под действием IFN-α1, чем -α2 (рис. 1⇑), коррелирует с известным более низким сродством связывания с рецептором IFN-αβ (в 20 раз ниже K d ) (39) и более низкая (в 5-20 раз) специфическая противовирусная активность в зависимости от типа клеток (52). Однако индукция большинства ISG была только в 2–4 раза ниже в ответ на IFN-α1, чем на IFN-α2 и -α21 (все при 2 нг / мл). Увеличение концентрации IFN-α1 до 20 нг / мл приводило к индукции ISG, сравнимой с IFN-α2 и -α21 (за исключением IP-10), несмотря на более низкую активацию STAT даже при этой более высокой концентрации IFN-α1 (Таблица I⇑ и Рис. .1⇑). Таким образом, количественная разница между IFN-α1 и IFN-α2 или -α21 оказывается меньше для индукции ISG, чем для активации STAT. Это произошло не просто из-за различий в чувствительности используемых анализов, потому что относительно небольшие различия в индукции ISG наблюдались в широком диапазоне концентраций (для IFN-α1, от 20 до 0,2 нг / мл; IFN-α2, от 2 до 0,02 нг / мл), и формы кривых доза-ответ для IFN-α1 и IFN-α2 были аналогичными (данные не показаны). Ранее сообщалось о различиях между активацией STAT и функциональными ответами; например, различия в противовирусной и антипролиферативной активности ряда гибридов IFN-α2 / 21 не коррелировали с их способностью активировать STAT1 / 2 (45) и противовирусной активностью IFN-β в клеточной линии, экспрессирующей усеченный IFN. Рецептор -αβ был сильно нарушен, в отличие от активации передачи сигналов Jak / STAT (43).Соответственно, вероятно, будут задействованы дополнительные факторы, ограничивающие скорость.

Оба пути киназы p38 и PI3 участвуют в передаче сигналов IFN-α (20, 21, 22, 23, 24). В DC ​​активация p38, но не киназы PI3, по-разному требовалась для оптимальной индукции IP-10 по сравнению с другими мРНК ISG (фиг. 5). И IFN-α1, и IFN-α2 активируют киназу (ы) p38 (рис. 5⇑ C ). Соответственно, дифференциальная индукция p38 кажется маловероятной, чтобы быть основой наблюдаемой разницы в индукции IP-10 в ответ на два подтипа IFN-α.Сообщалось о потребности в p38 как для ISRE-, так и для GAS-управляемой экспрессии репортерных конструкций (22, 23, 24). Требование активации p38 для IFN-α для оптимальной индукции IP-10, насколько нам известно, является первой демонстрацией участия этого пути в регуляции эндогенного ISG с помощью IFN-α. Таким образом, среди ISG, проанализированных в этом исследовании, IP-10 был уникальным в том, что он 1) дифференциально регулируется подтипами IFN-α, 2) зависит от активации p38 и 3) индуцируется в DC, но не в Т-клетках.

Хотя это исследование не является конкретным направлением, оно также предоставило дополнительные доказательства специфичности клеточного типа для ответа на IFN-α (см. Ссылку 47) и основных различий в кинетике экспрессии подмножеств ISG. В дополнение к IP-10, примеры специфичности клеточного типа включают индукцию iNOS в DC, но не в T-клетках, и IL-12Rβ2 в T-клетках, но не в DC (таблица I и фиг. 3). В соответствии с последним, IL-12Rβ2 является геном, чувствительным к STAT4, а незрелые DC не экспрессируют STAT4 (74, 75, 76).Среди исследованных мРНК ISG наблюдалась очень разная кинетика накопления (рис. 3⇑ B и данные не представлены). Например, SOCS1 показал очень раннюю переходную кинетику, IP-10 и ISG-56K были аналогичными временными, но с небольшой задержкой, тогда как 6-16, 9-27 и STAT1 показали более устойчивую индукцию (рис. 3⇑). Очевидно, что точка обнаружения зависит от чувствительности анализа и выбранных временных точек, но различия в форме кривых, которые могут отражать или не отражать основные различия в стабильности мРНК, остаются.Интересно, что такие различия не наблюдались в аналогичном анализе для IFN-α2 в клетках фибросаркомы человека HT1080. В них накопление мРНК для всех 150 проанализированных ISG было продолжительным и оптимальным через 6-8 часов (ссылка 47; J. F. Schlaak и I. M. Kerr, неопубликованные данные). Эти противоположные результаты подчеркивают как сложность ответов, так и их зависимость от типа клеток. Очевидно, что в этой области данные, полученные в одной системе ячеек, не обязательно могут быть экстраполированы на другие.

В заключение, настоящее исследование предоставляет новую информацию об ответах подтипа IFN-α в человеческих Т-клетках и DC.Наблюдались существенные различия в активности подтипа IFN-α, в специфичности типа клеток и в требованиях к пути p38 MAPK. Индукция IP-10 была наиболее ярким примером в этом отношении. Дальнейшие примеры вариаций активности IFN-α-подтипа, вероятно, по-прежнему будут иметь важное значение для развития понимания роли (-ей) различных подтипов в иммунном ответе.

Благодарности

Мы благодарим докторов наук. Дорин Кантрелл, Патрик Костелло, Сандра Диболд и Факундо Батиста за критическое прочтение рукописи.

Сноски

  • №1 Эта работа поддержана грантом Федора-Линена от Общества Александра фон Гумбольдта компании J.F.S.

  • №2 Cancer Research UK Лондонский научно-исследовательский институт включает лаборатории Lincoln’s Inn Fields и Clare Hall, входившие в состав бывшего Императорского фонда исследования рака после слияния Императорского фонда исследований рака с Кампанией по исследованию рака в феврале 2002 года.

  • №3 Фактический адрес: Эссенский университет, отделение гастроэнтерологии и гепатологии, Hufelandstrasse 55, 45122 Essen, Germany.

  • ↵4 Адрес для корреспонденции и перепечатки запросов на перепечатку д-ру Яну М. Керру, Лондонский научно-исследовательский институт рака, Великобритания, Lincoln’s Inn Fields Laboratories, 44 Lincoln’s Inn Fields, London WC2A 3PX, UK Адрес электронной почты: ian.kerr {at} Cancer .org.uk

  • ↵5 В статье использованы сокращения: DC — дендритная клетка; Jak, Janus kinase; ISG, IFN-стимулированный ген; ISGF3, фактор ISG 3; IRF, регуляторный фактор IFN; ISRE, IFN-стимулированный ответный элемент; ГАЗ, γ-активированная последовательность; PI3, фосфатидилинозитол 3; MAP, митоген-активированный белок; IP-10, IFN-γ-индуцибельный белок-10; iNOS, индуцибельная NO-синтаза; SOCS, супрессор передачи сигналов цитокинов; RPA, анализ защиты от РНКазы.

  • Получено 15 апреля 2003 г.
  • Принято 2 сентября 2003 г.
  • Copyright © 2003 Американская ассоциация иммунологов

Ссылки

  1. Герберман, Р. Б. 1997. Влияние α-интерферонов на иммунную функцию. Семин. Онкол. 24: (Прил. 9) : S9.78.

  2. De Maeyer, E., J. De Maeyer-Guignard.1998. Интерфероны типа I. Int. Rev. Immunol. 17:53.

  3. Беларделли, Ф., И. Грессер. 1996. Игнорированная роль интерферона типа I в ответе Т-клеток: значение для его клинического использования. Иммунол. Сегодня 17:369.

  4. Gutterman, J. U .. 1994. Цитокиновая терапия: уроки интерферона-α. Proc. Natl. Акад. Sci. США 91: 1198.

  5. Дифенбах, А., Х. Шиндлер, Н. Донхаузер, Э. Лоренц, Т. Ласкей, Дж. МакМикинг, М. Роллингхофф, И. Грессер, К. Богдан. 1998. Интерферон 1-го типа (IFNα / β) и синтаза оксида азота 2-го типа регулируют врожденный иммунный ответ на простейших паразитов. Иммунитет 8:77.

  6. Синг, А., Т. Мерлин, Х. П. Кнопф, П. Дж. Нильсен, Х. Лоппнов, К. Галанос, М. А. Фройденберг. 2000. Бактериальная индукция β-интерферона у мышей является функцией липополисахаридного компонента.Заразить. Иммун. 68: 1600.

  7. Фаррар, Дж. Д., К. М. Мерфи. 2000. Развитие интерферонов I типа и Т-хелперов. Иммунол. Сегодня 21:48.

  8. Бирон, К. А. 2001. Интерфероны α и β как иммунные регуляторы: новый взгляд. Иммунитет 14: 661.

  9. Ле Бон, А., Дж. Скьявони, Дж. Д’Агостино, И. Грессер, Ф. Беларделли, Д.F. Жесткий. 2001. Интерфероны типа I сильно усиливают гуморальный иммунитет и могут способствовать переключению изотипа, стимулируя дендритные клетки in vivo. Иммунитет 14: 461.

  10. Weissmann, C., H. Weber. 1986. Гены интерферона. Прог. Nucleic Acid Res. Мол. Биол. 33: 251.

  11. Pestka, S .. 1997. Виды человеческого интерферона-α и гибридные белки. Семин. Онкол. 24: (Прил. 9) : S9.4.

  12. Узе Г., Лутфалла Г., Грессер И. 1990. Генетический перенос функционального рецептора интерферона-α человека в клетки мыши: клонирование и экспрессия его кДНК. Ячейка 60: 225.

  13. Новик Д., Б. Коэн, М. Рубинштейн. 1994. Рецептор интерферона α / β человека: характеристика и молекулярное клонирование. Ячейка 77: 391.

  14. Лутфалла, Г., SJ Holland, E. Cinato, D. Monneron, J. Reboul, NC Rogers, JM Smith, GR Stark, K. Gardiner, KE Mogensen, et al. 1995. Мутантные клетки U5A дополняются субъединицей рецептора интерферона-αβ, генерируемой путем альтернативного процессинга нового члена кластера генов рецепторов цитокинов. EMBO J. 14: 5100.

  15. Старк, Г. Р., И. М. Керр, Б. Р. Уильямс, Р. Х. Сильверман, Р. Д. Шрайбер. 1998. Как клетки реагируют на интерфероны.Анну. Rev. Biochem. 67: 227.

  16. Чо, С. С., К. М. Бэкон, К. Сударшан, Р. К. Рис, Д. Финблум, Р. Пайн, Дж. Дж. О’Ши. 1996. Активация STAT4 IL-12 и IFN-α: доказательства участия лиганд-индуцированного фосфорилирования тирозина и серина. J. Immunol. 157: 4781.

  17. Yu, C. R., J. X. Lin, D. W. Fink, S. Akira, E. T. Bloom, A. Yamauchi. 1996. Дифференциальное использование активатора сигнального преобразователя киназы Janus сигнальных путей транскрипции при стимуляции естественных киллеров человека IL-2, IL-12 и IFN-α.J. Immunol. 157: 126.

  18. Матикайнен, С., Т. Саренева, Т. Ронни, А. Лехтонен, П. Дж. Коскинен, И. Юлкунен. 1999. Интерферон-α активирует несколько белков STAT и активирует связанные с пролиферацией гены IL-2Rα , c- myc и pim-1 в Т-клетках человека. Кровь 93: 1980.

  19. Гупта, С., М. Цзян, А. Б. Пернис. 1999. IFN-α активирует Stat6 и приводит к образованию комплексов Stat2: Stat6 в B-клетках.J. Immunol. 163: 3834.

  20. Янг, К. Х., А. Мурти, С. Р. Пфеффер, Дж. Г. Ким, Д. Б. Доннер, Л. М. Пфеффер. 2001. Интерферон α / β способствует выживанию клеток, активируя ядерный фактор κB через фосфатидилинозитол-3-киназу и Akt. J. Biol. Chem. 276: 13756.30.

  21. Рани, М. Р., Л. Хибберт, Н. Сиземор, Г. Р. Старк, Р. М. Рансохофф. 2002. Необходимость фосфоинозитид-3-киназы и Akt для опосредованной интерфероном-β индукции гена β- R1 ( SCYB11 ).J. Biol. Chem. 277: 38456.

  22. Го, К. К., С. Дж. Хак, Б. Р. Уильямс. 1999. Киназа p38 MAP необходима для фосфорилирования серина STAT1 и активации транскрипции, индуцированной интерферонами. EMBO J. 18: 5601.

  23. Уддин, С., Б. Майчшак, Дж. Вудсон, П. Арункумар, Ю. Алсайед, Р. Пайн, П. Р. Янг, Э. Н. Фиш, Л. К. Платаниас. 1999. Активация митоген-активируемой протеинкиназы p38 интерферонами I типа.J. Biol. Chem. 274: 30127.

  24. Уддин, С., Ф. Лекмине, Н. Шарма, Б. Майчжак, И. Майер, П. Р. Янг, Г. М. Бокоч, Э. Н. Фиш, Л. К. Платаниас. 2000. Путь митоген-активируемой протеинкиназы Rac1 / p38 необходим для интерферон-зависимой транскрипционной активации, но не фосфорилирования серина белков Stat. J. Biol. Chem. 275: 27634.

  25. Дэвид М., Э.Петрикоин, III, К. Бенджамин, Р. Пайн, М. Дж. Вебер, А. К. Ларнер. 1995. Потребность в активности киназы MAP (ERK2) в экспрессии генов, стимулированной интерфероном α и β интерфероном, через белки STAT. Наука 269: 1721.

  26. Hiscott, J., K. Cantell, C. Weissmann. 1984. Дифференциальная экспрессия генов интерферона человека. Nucleic Acids Res. 12: 3727.

  27. Макдональд, Н. Дж., D. Kuhl, D. Maguire, D. Naf, P. Gallant, A. Goswamy, H. Hug, H. Bueler, M. Chaturvedi, J. de la Fuente, et al. 1990. Различные пути опосредуют индуцируемость вирусом гены IFN-α1 и IFN -β человека. Ячейка 60: 767.

  28. Мари И., Дж. Э. Дурбин, Д. Э. Леви. 1998. Дифференциальная вирусная индукция отдельных генов интерферона-α посредством положительной обратной связи через фактор регуляции интерферона-7. EMBO J. 17: 6660.

  29. Лин, Р., П. Генин, Ю. Мамане, Дж. Хискотт. 2000. Селективное связывание ДНК и ассоциация с коактиватором связывающего белка CREB способствуют дифференциальной активации генов интерферона α / β факторами регуляции интерферона 3 и 7. Mol. Клетка. Биол. 20: 6342.

  30. Барнс, Б. Дж., П. А. Мур, П. М. Пита. 2001. Вирус-специфическая активация нового фактора регуляции интерферона, IRF-5, приводит к индукции различных генов интерферона α.J. Biol. Chem. 276: 23382.

  31. Реберг, Э., Б. Келдер, Э. Г. Хоул, С. Пестка. 1982. Удельная молекулярная активность рекомбинантных и гибридных лейкоцитарных интерферонов. J. Biol. Chem. 257: 11497.

  32. Белл, Д. М., Н. Дж. Робертс, младший, К. Б. Холл. 1983. Различные противовирусные спектры активности интерферона макрофагов человека. Природа 305: 319.

  33. Рыба, Е.Н., К. Банерджи, Н. Стеббинг. 1983. Подтипы лейкоцитарного интерферона человека обладают различной антипролиферативной и противовирусной активностью в отношении клеток человека. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 112: 537.

  34. Фостер, Г. Р., О. Родригес, Ф. Гуз, Э. Шульте-Фролинде, Д. Теста, М. Дж. Ляо, Г. Р. Старк, Л. Ледбитер, Х. К. Томас. 1996. Различная относительная активность подтипов интерферона-α человеческого клеточного происхождения: IFN-α8 обладает очень высокой противовирусной активностью.J. Interferon Cytokine Res. 16: 1027.

  35. Йео, В. С., К. М. Лоусон, М. В. Бейльгарц. 1998. Противовирусная активность отдельных подтипов мышиного IFN-α in vivo: внутримышечная инъекция конструкций экспрессии IFN снижает репликацию цитомегаловируса. J. Immunol. 160: 2932.

  36. Hibbert, L., G.R. Foster. 1999. Интерфероны человека типа I сильно различаются по своему влиянию на пролиферацию первичных В-клеток.J. Interferon Cytokine Res. 19: 309.

  37. да Силва, А. Дж., М. Брикельмайер, Г. Р. Мажо, А. В. Лукашин, Дж. Пейман, А. Уитти, П. С. Хохман. 2002. Сравнение паттернов экспрессии генов, индуцированных обработкой эндотелиальных клеток пупочной вены человека IFN-α2b по сравнению с IFN-β1a: понимание функциональной взаимосвязи между отдельными интерферонами типа I, которые действуют через общий рецептор. J. Interferon Cytokine Res. 22: 173.

  38. Калл, В.С., П. А. Тилбрук, Э. Дж. Бартлетт, Н. Л. Брекало, К. М. Джеймс. 2003. Дифференциальная терапия интерфероном I типа при эритролейкозе: специфичность активации STAT. Кровь 101: 2727.

  39. Йонехара, С., М. Йонехара-Такахаши, А. Исии, С. Нагата. 1983. Различное связывание человеческого интерферона α1 и α2 с общими рецепторами на человеческих и бычьих клетках: исследования с рекомбинационными интерферонами, продуцируемыми в Escherichia coli . J. Biol.Chem. 258: 9046.

  40. Ху Р., Й. Ган, Дж. Лю, Д. Миллер, К. С. Зун. 1993. Доказательства множественных сайтов связывания для нескольких компонентов человеческого лимфобластоидного интерферона-α. J. Biol. Chem. 268: 12591.

  41. Абрамович К., Л. М. Шульман, Э. Ратовицкий, С. Харроч, М. Тови, П. Эйд, М. Ревель. 1994. Дифференциальное фосфорилирование тирозина цепи IFNAR рецептора интерферона типа I и связанного поверхностного белка в ответ на IFN-α и IFN-β.EMBO J. 13: 5871.

  42. Платаниас, Л. К., С. Уддин, П. Домански, О. Р. Коламоничи. 1996. Различия в передаче сигналов интерферона α и β: интерферон β избирательно индуцирует взаимодействие субъединиц α и βL рецептора интерферона I типа. J. Biol. Chem. 271: 23630.

  43. Domanski, P., O. W. Nadeau, L.C. Platanias, E. Fish, M. Kellum, P. Pitha, O.R. Colamonici.1998. Дифференциальное использование субъединицы βL рецептора интерферона I типа (IFN) определяет специфичность передачи сигналов для IFNα2 и IFNβ. J. Biol. Chem. 273: 3144.

  44. Леверенц, М., К. Э. Могенсен, Г. Узе. 1998. Общие рецепторные компоненты, но отдельные комплексы для α и β интерферонов. J. Mol. Биол. 282: 585.

  45. Ху Р., Дж. Бекиш, М. Хейс, С. Одет, Дж. Билер, Э. Петрикоин, К.Зун. 1999. Дивергенция связывания, передачи сигналов и биологических ответов на рекомбинантный гибридный IFN человека. J. Immunol. 163: 854.

  46. Athie-Morales, V., H. Flotow, K. L. Hilyard, D. A. Cantrell. 2000. IL-12 селективно регулирует STAT4 через фосфатидилинозитол-3-киназу и Ras-независимые пути передачи сигнала. Евро. J. Immunol. 30: 1425.

  47. Шлаак, Дж. Ф., К. М. Хилкенс, А.П. Коста-Перейра, Б. Штробл, Ф. Абергер, А. М. Фришауф, И. М. Керр. 2002. Типы клеток и специфичные для доноров транскрипционные ответы на интерферон-α: использование настроенных массивов генов. J. Biol. Chem. 277: 49428.27.

  48. Мюллер М., К. Лакстон, Дж. Бриско, К. Шиндлер, Т. Импрота, Дж. Э. Дарнелл-младший, Г. Р. Старк, И. М. Керр. 1993. Комплементация мутантной клеточной линии: центральная роль полипептида 91 кДа ISGF3 в путях передачи сигналов интерферона-α и -γ.EMBO J. 12: 4221.

  49. Лаллеманд, К., П. Лебон, П. Рицца, Б. Бланшар, М. Г. Тови. 1996. Конститутивная экспрессия определенных изотипов интерферона в лейкоцитах периферической крови здоровых людей и в промоноцитарных клетках U937. J. Leukocyte Biol. 60: 137.

  50. Поль Г., У. Хеллман, Э. Лундгрен, С. Лундберг. 1994. Пять доминирующих подтипов α-интерферона вируса Сендай стимулировали лейкоциты человека.J. Interferon Res. 14: S63.

  51. Foster, G. R., N. B. Finter. 1998. Все ли интерфероны человека I типа эквивалентны ?. J. Viral Hepat. 5: 143.

  52. Streuli, M., A. Hall, W. Boll, W. E. Stewart, II, S. Nagata, C. Weissmann. 1981. Специфичность клеток-мишеней двух видов человеческого интерферона-α, продуцируемого в Escherichia coli , и гибридных молекул, полученных из них.Proc. Natl. Акад. Sci. США 78: 2848.

  53. Zoon, K. C., D. Miller, J. Bekisz, D. zur Nedden, J. C. Enterline, N. Y. Nguyen, R.Q. Hu. 1992. Очистка и характеристика множества компонентов человеческого лимфобластоидного интерферона-α. J. Biol. Chem. 267: 15210.

  54. Омори Ю., Т. А. Гамильтон. 1995. Стимулированный интерфероном элемент ответа и сайт κB опосредуют синергетическую индукцию транскрипции мышиного гена IP-10 IFN-γ и TNF-α.J. Immunol. 154: 5235.

  55. Одзава К., Т. Масудзима, К. Икеда, Ю. Кодама, Ю. Нономура. 1996. С помощью видеоусиленного светового микроскопа выявлены различные пути ингибирующего действия вортманнина на экзоцитоз. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 222: 243.

  56. Lustre, A. D., J. C. Unkeless, J. V. Ravetch. 1985. γ-Интерферон транскрипционно регулирует ген раннего ответа, содержащий гомологию с белками тромбоцитов.Природа 315: 672.

  57. Хан, И. А., Дж. А. Маклин, Ф. С. Ли, Л. Кашотти, Э. ДеХаан, Дж. Д. Шварцман, А. Д. Ластер. 2000. IP-10 имеет решающее значение для транспортировки эффекторных Т-клеток и выживания хозяина при инфекции Toxoplasma gondii . Иммунитет 12: 483.

  58. Dufour, J. H., M. Dziejman, M. T. Liu, J. H. Leung, T. E. Lane, A. D. Luster. 2002. Мыши с дефицитом IFN-γ-индуцируемого белка 10 (IP-10; CXCL10) обнаруживают роль IP-10 в генерации и перемещении эффекторных Т-клеток.J. Immunol. 168: 3195.

  59. Ланде, Р., Э. Джакомини, Т. Грасси, М. Э. Ремоли, Э. Иона, М. Миеттинен, И. Юлкунен, Э. М. Кочча. 2003. IFN-αβ, высвобождаемый дендритными клетками человека, инфицированными Mycobacterium tuberculosis , индуцирует экспрессию CXCL10: селективное привлечение NK и активированных Т-клеток. J. Immunol. 170: 1174.

  60. Готтлиб А.Б., Ластер А.Д., Д.Н. Познетт, Д. М. Картер. 1988. Обнаружение индуцированного γ-интерфероном белка IP-10 в псориатических бляшках. J. Exp. Med. 168: 941.

  61. Балашов, К. Э., Дж. Б. Роттман, Х. Л. Вайнер, В. В. Хэнкок. 1999. CCR5 + и CXCR3 + Т-клетки увеличиваются при рассеянном склерозе, и их лиганды MIP-1α и IP-10 экспрессируются в демиелинизирующих поражениях головного мозга. Proc. Natl. Акад. Sci. США 96: 6873.

  62. Соренсен, Т.L., M. Tani, J. Jensen, V. Pierce, C. Lucchinetti, VA Folcik, S. Qin, J. Rottman, F. Sellebjerg, RM Strieter, et al. 1999. Экспрессия специфических хемокинов и рецепторов хемокинов в центральная нервная система больных рассеянным склерозом. J. Clin. Инвестировать. 103: 807.

  63. Патель, Д. Д., Дж. П. Захария, Л. П. Уичард. 2001. Лиганды CXCR3 и CCR5 в синовиальной оболочке ревматоидного артрита. Clin. Иммунол. 98:39.

  64. Шимада, А., Дж. Моримото, К. Кодама, Р. Судзуки, Ю. Оикава, О. Фунае, А. Касуга, Т. Сарута, С. Наруми. 2001. Повышенный уровень сывороточного IP-10 наблюдается при диабете 1 типа. Уход за диабетом 24: 510.

  65. Лю М. Т., Х. С. Кейрстед, Т. Э. Лейн. 2001. Нейтрализация хемокина CXCL10 снижает инвазию воспалительных клеток и демиелинизацию и улучшает неврологическую функцию в вирусной модели рассеянного склероза. J. Immunol. 167: 4091.

  66. Саломон, И., Н. Нецер, Г. Вильдбаум, С. Шиф-Цук, Г. Маор, Н. Карин. 2002. Нацеливание на функцию IFN-γ-индуцируемого белка 10 подавляет продолжающийся адъювантный артрит. J. Immunol. 169: 2685.

  67. Роннблом, Л. Э., Г. В. Альм, К. Оберг. 1991. Аутоиммунные явления у больных злокачественными карциноидными опухолями при лечении интерфероном-α. Acta Oncol. 30: 537.

  68. Бози Э., Минелли Р., Э.Баззигалуппи, М. Салви. 2001. Фульминантный аутоиммунный диабет 1 типа во время терапии интерфероном-α: случай Th2-опосредованного заболевания ?. Диабет. Med. 18: 329.

  69. Quesada, J. R., J. U. Gutterman. 1986. Псориаз и α-интерферон. Ланцет 1: 1466.

  70. Хокинс, М. Дж., Э. К. Борден, Дж. А. Мерритт, Б. С. Эдвардс, Л. А. Болл, Э. Гроссбард, К. Дж. Саймон. 1984. Сравнение биологических эффектов двух рекомбинантных человеческих интерферонов α (rA и rD) на человека.J. Clin. Онкол. 2: 221.

  71. Дер, С. Д., А. Чжоу, Б. Р. Уильямс, Р. Х. Сильверман. 1998. Идентификация генов, дифференциально регулируемых интерфероном α, β или γ с использованием массивов олигонуклеотидов. Proc. Natl. Акад. Sci. США 95: 15623.

  72. Маркус, П. И., М. Дж. Секеллик. 1994. Индукция интерферона: регуляция как вирусом, так и клеткой. Хоккайдо Игаку Засси 69: 1320.

  73. Танигучи, Т., А. Такаока. 2001. Слабый сигнал для сильных ответов: пересмотр интерферона-α / β. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 378.

  74. Sinigaglia, F., D. D’Ambrosio, P. Panina-Bordignon, L. Rogge. 1999. Регулирование оси IL-12 / IL-12R: критический шаг в дифференцировке Т-хелперных клеток и эффекторной функции. Иммунол. Откр.170: 65.

  75. Frucht, D. M., M. Aringer, J. Galon, C. Danning, M.Браун, С. Фан, М. Чентола, К. Ю. Ву, Н. Ямада, Х. Эль Габалави, Дж. Дж. О’Ши. 2000. Stat4 экспрессируется в активированных моноцитах периферической крови, дендритных клетках и макрофагах в местах Th2-опосредованного воспаления. J. Immunol. 164: 4659.

  76. Fukao, T., D. M. Frucht, G. Yap, M. Gadina, J. J. O’Shea, S. Koyasu. 2001. Индуцируемая экспрессия Stat4 в дендритных клетках и макрофагах и его критическая роль в врожденных и адаптивных иммунных ответах.J. Immunol. 166: 4446.

Производство IFN типа I и передача сигналов | Отзыв

Наиболее изученными представителями семейства интерферонов I типа являются множественные изотипы IFNα и IFNβ . IFN типа I ответственны за индукцию транскрипции большой группы генов, которые играют роль в устойчивости хозяина к вирусным инфекциям, а также за активацию ключевых компонентов врожденной и адаптивной иммунной систем, включая презентацию антигена и продукцию цитокинов, участвующих в активации T клетки, В-клетки и естественные клетки-киллеры.

IFN типа I регулируются транскрипцией и индуцируются после распознавания компонентов патогена во время инфекции различными рецепторами распознавания паттернов хозяина. Практически все клетки человека способны синтезировать IFNα / β, однако некоторые клетки обладают более выраженной способностью продуцировать эти цитокины. В таблице 1 приведены некоторые характеристики трех основных путей, ведущих к продукции IFN типа I. Путь RIG-I активируется при заражении РНК-вирусами. Второй путь включает адаптерный белок TRIF, который рекрутируется TLR3 и TLR4.Последний путь запускается TLR7 / 8 и TLR9, что приводит к активации фактора транскрипции IRF7. После их производства IFN типа I запускают противовирусные реакции, связываясь с общим рецептором (IFNAR). Связывание IFNα / β с IFNAR стимулирует путь JAK1-STAT, ведущий к сборке комплекса ISGF3, который состоит из димеров STAT1-STAT2 и IRF9. ISGF3 связывается с IFN-стимулированными элементами ответа (ISRE) в промоторах IFN-стимулированных генов, чтобы регулировать их экспрессию. Среди этих генов есть IRF7, который инициирует транскрипцию второй волны IFN типа I.Эта аутокринная / паракринная обратная связь позволяет IFN типа I создавать антивирусное состояние в окружающих клетках.

Таблица 1: Три основных пути, участвующих в продукции IFNα / β у людей и мышей.

ПУТИ ОСНОВНЫЕ АКТЕРЫ МЕСТОПОЛОЖЕНИЕ ИНДУКТОРЫ ЯЧЕЙКИ ССЫЛКИ
Путь RIG-I РИГ-И (МДА-5) Цитоплазматический Многие одно- и двухцепочечные РНК-вирусы Обычные DC, фибробласты, гепатоциты 1, 2, 3, 4, 5, 6
Путь TRIF TLR3-TRIF Внутренние пузырьки Неметилированная дцРНК Макрофаги, гепатоциты 4, 5, 6, 7, 8
TLR4-TRIF Плазматическая мембрана Вирусные гликолипиды
Путь IRF7 TLR9-MyD88-IRF7 (IRF5) Эндосома Неметилированная РНК патогенов и поврежденных клеток-хозяев Плазмацитоидные ДК 8, 9, 10
TLR7 / 8-MyD88-IRF7 (IRF5) Неметилированная ДНК CpG, иммунокомплексы хроматина

Артикул:

1.Като Х. и др., 2005. Типовое участие RIG-I в противовирусном ответе. Иммунитет. 23 (1): 19-28.
2. Йонейама М. и др., 2005. Общие и уникальные функции DExD / H-Box Helicases RIG-I, MDA5 и LGP2 в противовирусном врожденном иммунитете. J Immunol. 175 (5): 2851-8.
3. Kawai T. et al., 2005. IPS-1, адаптер, запускающий RIG-I- и Mda5-опосредованную индукцию интерферона I типа. Nat Immunol. [Epub перед печатью]
4. Li K. et al., 2005. Четкие поли (I-C) и активируемые вирусом сигнальные пути, ведущие к продукции интерферона-бета в гепатоцитах.J Biol Chem. 280 (17): 16739-47.
5. Перри А.К. et al., 2005. Реакция хозяина интерфероном типа I на вирусные и бактериальные инфекции. Cell Res 15: 407.
6. Гейл М. мл., Фой Е.М., 2005. Уклонение от внутриклеточной защиты хозяина вирусом гепатита С. Природа. 436 (7053): 939-45.
7. Шредер М., Боуи А.Г., 2005. TLR3 в противовирусном иммунитете: ключевой игрок или сторонний наблюдатель? Trends Immunol. 26 (9): 462-8.
8. Карико К. и др., 2005. Подавление распознавания РНК Toll-подобными рецепторами: влияние модификации нуклеозидов и эволюционное происхождение РНК.Иммунитет. 23 (2): 165-75.
9. Honda K. et al., 2005. IRF-7 является главным регулятором интерферон-зависимых иммунных ответов I типа. Природа. 434 (7034): 772-7.
10. Рифкин И.Р. и др., 2005. Толл-подобные рецепторы, эндогенные лиганды и системные аутоиммунные заболевания. Immunol Rev.204: 27-42. Рассмотрение.

Сентябрь / Октябрь 2005


(PDF) IFN типа I опосредуют развитие постгриппозной бактериальной пневмонии у мышей

научная статья

The Journal of Clinical Investigation http: // www.jci.org Volume 119 Number 7 July 2009 1919

Макрофаги, полученные из костного мозга. Костный мозг выделяли из большеберцовой кости

и бедренной кости мышей и дифференцировали в присутствии M-CSF в 10% FBS

, содержащем DMEM. На 7 день клетки стимулировали, как описано в тексте.

Рекомбинантный IFN-α4 (1000 Ед / мл) добавляли к среде за 30 минут

перед стимуляцией либо P3C (100 нг / мл), либо CpG (100 нМ). Общую клеточную РНК

собирали через 4 часа с помощью реагента Trizol и выделяли после экстракции хлороформом и осаждения изопропанолом.

Опосредованная антителами нейтрализация и восстановление цитокинов. IFNAR1 нейтральный-

Процесс осуществляли введением 1,5 мг антитела MAR1-5A3 (Leinco

Technologies) в день 0 (в тот же день, что и инфекция гриппа), с последующим введением

бустерных доз 0,75 мг во 2 и 4 дни. Нормальный мышиный IgG

использовали в качестве контроля. На 5 день мышей инфицировали S. pneumoniae, и на 6 день было собрано

легких. Для экспериментов по нейтрализации Cxcr2 мышей influenza-infect-

ed были истощены одним 300 мкл i.п. инъекция козьей сыворотки против Cxcr2

или неспецифической козьей сыворотки, как описано ранее (51–53). На следующий день мышей были инфицированы

S. pneumoniae. Через 24

часов после вторичной бактериальной инфекции мышей умерщвляли для измерения

бактериальной нагрузки в легких и проведения анализа MPO на гомогенатах легких.

Для восстановлений Mip2 плюс KC инфицированных гриппом животных лечили

однократной дозой i.т. KC плюс Mip2 (по 1 мкг каждого) ресуспендировали в 0,1% BSA

в PBS. KC и Mip2 содержали менее 1,0 ед. Эндотоксина / 1 мкг цитокина,

, как определено анализом лизата амебоцитов Limulus (R&D Systems). Животные, обработанные Mock-

, получали PBS и 0,1% BSA. Одновременно вводили бактериальные инокуляты

человек. Легочная бактериальная нагрузка и активность гомогената легких

МПО оценивали через 24 часа после инфицирования.

Статистика. Кривые выживаемости сравнивали с использованием лог-рангового теста.

Для других данных статистическую значимость определяли с использованием двустороннего непарного t-критерия

, двухстороннего U-критерия Манна-Уитни (для данных КОЕ) или одностороннего дисперсионного анализа

, скорректированного для множественных сравнений, где это необходимо. Статистически значимым считалось значение

P 0,05 или меньше. Все расчеты

были выполнены с использованием программы Prism для Win-

dows (GraphPad Software Inc.). Все столбцы данных КОЕ представлены

как медианы биологических повторов.Столбики ошибок на всех графиках указывают на

SEM и представляют собой биологические реплики.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами NIH T32 AI007323-19 и

GM08042 (A. Shahangian), K08 HL081229 (J.C. Deng) и

1R01 AI056154 and 1R01 AI069120. Мы благодарны

Полу В. Демпси за бесценные отзывы и обсуждения и

Тесс Э. Лин за техническую помощь в исследованиях.

Поступила в печать 22 февраля 2008 г. и принята в доработке

от 1 апреля 2009 г.

Адресная корреспонденция: Jane C. Deng, Отделение легочной медицины

и реанимации, Калифорнийский университет, Лос-Анджелес,

10833 Le Conte Ave., 37-131 CHS, Los Angeles, California ,

USA . Телефон: (310) 983-3446. Факс: (310) 206-8622; Электронная почта: jdeng @

mednet.ucla.edu.

1. Hamilton, B.E., et al. 2007. Годовая сводка

статистики естественного движения населения: 2005. Педиатрия. 119: 345–360.

2. Левин, А.М., Кенингскнехт В. и Старк Дж. М.

2001. Снижение легочного клиренса S. pneu-

moniae после инфекции гриппа А у мышей.

J. Virol. Методы. 94: 173–186.

3. Сетхи, С. 2002. Бактериальная пневмония. Управление

смертельным осложнением гриппа у пожилых людей

с сопутствующим заболеванием. Гериатрия. 57: 56–61.

4. McCullers, J.A. 2006. Анализ взаимодействия

между вирусом гриппа и пневмококком.Clin.

Microbiol. Ред. 19: 571–582.

5. Broug-Holub, E., et al. 1997. Альвеолярные макрофаги

необходимы для защитной защиты легких.

при мышиной Klebsiella pneumonia: устранение

альвеолярных макрофагов увеличивает рекрутмент нейтрофилов —

, но снижает бактериальный клиренс и выживаемость.

Заражение. Иммун. 65: 1139–1146.

6. Тэйвс, Г.Б., Хансен, Э.Дж., и Стритер, Р.М. 1990.

Легочная защита хозяина и ротоглотка

патогенов.Являюсь. J. Med. 88: 20С – 24С.

7. Чжан П., Саммер В. Р., Бэгби Г. Дж. И Нельсон,

S. 2000. Врожденный иммунитет и легочный хозяин

защита. Иммунол. Откр. 173: 39–51.

8. Абрамсон, Дж. С., Гибинк, Г. С., Миллс, Э. Л., и Куи,

П. Дж. 1981. Дисфункция полиморфноядерных лейкоцитов при инфицировании вирусом гриппа шиншилл.

J. Infect. Дис. 143: 836–845.

9. Abramson, J.S., et al. 1982. Ингибирование слияния нейтрофилов

лизосома-фагосома, связанное с инфекцией вируса фермента

in vitro.Роль в подавлении бактерицидной активности. J. Clin. Инвестировать. 69: 1393–1397.

10. Абрамсон, Дж. С., Лайлс, Д. С., Хеллер, К. А., и Басс,

Д. А. 1982. Грипп А вирус-индуцированный полимор-

дисфункция фонуклеарных лейкоцитов. Заразить. Иммун.

37: 794–799.

11. Abramson, J.S., et al. 1986. Подавление эндоцитоза в нейтрофилах вирусом гриппа А in vitro.

J. Infect. Дис. 154: 456–463.

12.Астри, К.Л., Якаб, Г.Дж. 1984. Вирус гриппа

, индуцированный иммунными комплексами, подавляет фагоцитоз альвеолярного макрофага

. J. Virol. 50: 287–292.

13. Jakab, G.J. 1982. Иммунная недостаточность альвеолярного

фагоцитоз макрофагов при вирусном гриппе

пневмония. Являюсь. Преподобный Респир. Дис. 126: 778–782.

14. Jakab, G.J., Warr, G.A., and Knight, M.E., 1979.

Легочная и системная защита от chal-

, вызванная Staphylococcus aureus у мышей с

пневмонией, вызванной вирусом гриппа А.J. Infect. Дис.

140: 105–108.

15. McNamee, L.A., и Harmsen, A.G. 2006. Как

,

, индуцированная гриппом дисфункция нейтрофилов, так и

нейтрофил-независимых механизмов способствуют

повышенной восприимчивости к вторичной инфекции Strep-

tococcus pneumoniae. Заразить. Иммун.

74: 6707–6721.

16. Никерсон, К.Л., Якаб, Г.Дж. 1990. Легочная

антибактериальная защита при легком и тяжелом притоке

энза-вирусной инфекции.Заразить. Иммун. 58: 2809–2814.

17. Ньюджент, К.М., Пезанти, Э.Л. 1979. Влияние инфекции гриппа

на фагоцитарную и бактерицидную

рицидную активность легочных макрофагов. Заразить.

Иммун. 26: 651–657.

18. Ньюджент, К.М., Пезанти, Э.Л. 1982. Staphylococ-

клиренс калорий и функция легочных макрофагов

во время гриппозной инфекции. Заразить. Иммун.

38: 1256–1262.

19. van der Sluijs, K.F., et al. 2004. IL-10 является важным медиатором

повышенной восприимчивости к пневмонии мококка

после инфекции гриппа.

J. Immunol. 172: 7603–7609.

20. МакКуллерс, Дж. А. и Рег, Дж. Э. 2002. Летальный синер-

гизм между вирусом гриппа и Streptococcus

pneumoniae: характеристика модели мыши

и роль рецептора фактора активации тромбоцитов.

J. Infect. Дис. 186: 341–350.

21. МакКуллерс, Дж. А., Бартмесс, К. 2003. Роль нейраминидазы

в летальном синергизме между

вирусом энзы

и Streptococcus pneumoniae. J. Infect.

Дис. 187: 1000–1009.

22. Sprenger, H., et al. 1996. Хемокины в спинномозговой жидкости

больных менингитом. Clin.

Immunol. Immunopathol. 80: 155–161.

23. Matikainen, S., et al. 2000. Вирусы гриппа А и сендаи

индуцируют дифференциальную экспрессию гена хемокина

и активацию фактора транскрипции в макрофагах человека

.Вирусология. 276: 138–147.

24. Yoneyama, H., et al. 2005. Плазмацитоидные ДК помогают

ДК лимфатических узлов индуцировать ЦТЛ против ВПГ. J. Exp.

Мед. 202: 425–435.

25. Таф Д.Ф., Борроу П. и Спрент Дж. 1996. Индукция пролиферации случайных Т-клеток вирусами и

интерфероном типа I in vivo. Наука. 272: 1947–1950.

26. Кокс, штат Нью-Джерси, и Фукуда, К. 1998. Грипп. Заразить.

Дис. Clin. North Am. 12: 27–38.

27. Price, GE, Gaszewska-Mastarlarz, A., and Mosko-

phidis, D. 2000. Роль альфа / бета- и гамма-интерферонов

в развитии иммунитета к вирусу гриппа

энза А у мышей. J. Virol. 74: 3996–4003.

28. Sheehan, K.C.F., et al. 2006. Блокирование моноклональных антител

, специфичных для мышиного IFN-a / β рецептора суб-

единица 1 (IFNAR-1) от мышей, иммунизированных гидродинамической трансфекцией in vivo

. J. Interferon Cytokine

Res.26: 804–819.

29. Chang, EY, Guo, B., Doyle, SE, and Cheng, G.

2007. Передний край: участие IFN

типа I и сигнальный путь в индуцированном липополисаком-

харидом IL -10 производство. J. Immunol.

178: 6705–6709.

30. van der Poll, T., Marchant, A., Keogh, C.V., Gold-

man, M., and Lowry, S.F. 1996. Интерлейкин-10

нарушает защиту хозяина при мышиной пневмококковой

пневмонии.J. Infect. Дис. 174: 994–1000.

31. Seki, M., et al. 2004. Иммунокинетика при тяжелой

пневмонии, вызванной вирусом гриппа и бактериями

, коинфекция у мышей. Евро. Респир. J. 24: 143–149.

32. Гарви Б.А. и Хармсен А.Г. 1996. Роль нейтрофилов в устойчивости к пневмококковой пневмонии

у взрослых и новорожденных мышей. Воспаление.

20: 499–512.

33. Reutershan, J., et al. 2006. Критическая роль эндотелия

CXCR2 в LPS-индуцированной миграции нейтрофилов в легкое

.J. Clin. Инвестировать. 116: 695–702.

34. Сан, К., и Мецгер, Д.В. 2008. Ингибирование

легочной антибактериальной защиты интерфероном-

[гамма] во время выздоровления от инфекции гриппа.

Нат. Med. 14: 558–564.

35. Dockrell, D.H., et al. 2003. Апоптоз альвеолярных макрофагов

способствует исчезновению пневмококков в разрешающей модели легочной инфекции.

J. Immunol. 171: 5380–5388.

36.Татеда, К. и др. 2001. Хемокин-зависимый

TRIM68 отрицательно регулирует продукцию IFN-β путем деградации слитого гена TRK, нового драйвера IFN-β после антивирусных систем обнаружения

Abstract

В последние годы было показано, что члены семейства тричастичных мотивов (TRIM) убиквитин-лигаз E3 как положительно, так и отрицательно регулируют вирусную защиту и, как таковые, становятся неотразимыми мишенями для модуляции противовирусного иммунного ответа.В этом исследовании мы идентифицируем TRIM68, близкий гомолог TRIM21, как новый регулятор продукции IFN типа I, управляемой Toll-подобными рецепторами (TLR) и RIG-I-подобными рецепторами (RLR). Протеомный анализ комплексов, содержащих TRIM68, выявил TRK-слитый ген (TFG) в качестве потенциальной мишени для TRIM68. Сверхэкспрессия TRIM68 и TFG подтвердила их способность связываться, причем стимуляция TLR3, по-видимому, усиливает взаимодействие. TFG является известным активатором NF-κB благодаря своей способности взаимодействовать с ингибитором субъединицы киназы NF-κB гамма (IKK-γ) и активатором NF-κB, ассоциированным с членом семейства TRAF (TANK).Наши данные идентифицируют новую роль TFG как позитивного регулятора продукции IFN типа I и предполагают, что TRIM68 нацелен на TFG для лизосомной деградации, тем самым отключая TFG-опосредованную продукцию IFN-β. Нокдаун TRIM68 в первичных моноцитах человека приводил к повышенным уровням IFN и TFG типа I после обработки поли (I: C). Таким образом, TRIM68 нацелен на TFG, новый регулятор продукции IFN, и тем самым отключает и ограничивает продукцию IFN типа I в ответ на антивирусные системы обнаружения.

Образец цитирования: Винн С., Лаззари Э., Смит С., Маккарти Е.М., Ни Габханн Дж., Каллал Л.Е., et al.(2014) TRIM68 негативно регулирует продукцию IFN-β путем разрушения гена, слитого с TRK, нового драйвера IFN-β, расположенного ниже по течению антивирусных систем обнаружения. PLoS ONE 9 (7): e101503. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101503

Редактор: Куи Ли, Научный центр здравоохранения Университета Теннесси, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 6 декабря 2013 г .; Принята к печати: 8 июня 2014 г .; Опубликовано: 7 июля 2014 г.

Авторские права: © 2014 Wynne et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа финансировалась Советом по исследованиям в области здравоохранения Ирландии (грант PHD / 2007/11), Научным фондом Ирландии (грант 08 / IN.1 / B2091) и Национальными институтами здравоохранения (грант AI055677). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Врожденные иммунные рецепторы играют ключевую роль в распознавании вирусов и активации факторов транскрипции, важных для управления как IFN типа I, так и выработкой провоспалительных цитокинов. Продукция IFN типа I (IFN-α и IFN-β) после вирусной и бактериальной инфекции является критическим этапом врожденного иммунного ответа. Хотя IFN и провоспалительные цитокины важны как для противовирусного, так и для антибактериального иммунитета, они могут стать патогенными при избыточном производстве, что приводит к воспалительным аутоиммунным заболеваниям, таким как системная красная волчанка (СКВ) или болезнь Крона.Таким образом, белки, которые отключают и ограничивают производство таких цитокинов, являются важными иммунорегуляторными факторами. Было показано, что члены семейства тричастичных мотивов (TRIM) убиквитинлигаз E3 как положительно [1] — [6], так и отрицательно [7] — [13] регулируют иммунные ответы, в основном за счет убиквитинирования ключевых промежуточных сигналов и, таким образом, либо усиливая их активность или нацеливая их на убиквитин-опосредованную деградацию, соответственно.

Распознавание вирусов, в широком смысле, приводит к активации путей, регулирующих активность либо NF-κB, либо фактора регуляции интерферона (IRF) 3, либо IRF7.Антивирусные сенсоры в основном обнаруживают вирусную нуклеиновую кислоту, а при патогенных обстоятельствах могут обнаруживать РНК и ДНК, высвобождаемые из поврежденных клеток-хозяев. Они включают Toll-подобные рецепторы (TLR), TLR3, 7 и 9, которые расположены внутри эндосом, и цитозольные РНК-чувствительные рецепторы RIG-подобных геликаз (RLR). RIG-I и связанный с дифференцировкой меланомы белок 5 (MDA-5), как было показано, распознают вирусную РНК, тогда как существует множество ДНК-рецепторов (обзор в [14], [15]). После активации эти PRR привлекают адаптерные белки, такие как адаптерный белок, содержащий домен TIR, индуцирующий интерферон-β (TRIF) и ген 88 первичного ответа миелоидной дифференцировки (MyD88) на TLR и митохондриальный антивирусный сигнальный белок (MAVS) к RLR, которые способствуют образованию сигнальных комплексов, которые в конечном итоге приводят к активации следующих киназ, таких как киназы IκB и TANK-связывающая киназа 1 (TBK1).Вместе они регулируют активность факторов транскрипции NF-κB и членов семейства IRF (IRF3 и 7) и последующую продукцию провоспалительных цитокинов и IFN типа I (обзор см. В [16]).

Недавно была подчеркнута роль TRIMs в противовирусном иммунитете (обзор см. В [17]). Белки TRIM действуют как положительные или отрицательные регуляторы продукции IFN типа I, используя свою активность лигазы E3 для активации (посредством полиубиквитинирования, связанного с K63) или деградации (посредством полиубиквитинирования, связанного с K48) ключевых сигнальных молекул на путях распознавания вирусом.Структурно семейство белков TRIM характеризуется наличием домена RING finger, одного или двух B-боксовых доменов и домена coiled-coil в их N-концевых областях [18]. Наиболее распространенным С-концевым доменом, экспрессируемым TRIM, является домен SPRY (также известный как домен B30.2), домен, который, как известно, регулирует противовирусные иммунные ответы [19]. TRIM21 был впервые описан как мишень для продукции аутоантител при СКВ и синдроме Шегрена (СС) [20] — [22] и был одним из первых белков TRIM, которые, как было показано, негативно регулируют продукцию IFN [7], [23].Как негативный регулятор, TRIM21 нацелен на деградацию членов семейства IRF, IRF3 и IRF7 [7], [8]. Однако также была продемонстрирована положительная роль TRIM21 в стимулировании продукции провоспалительных цитокинов, что подчеркивает сложную роль, которую этот белок играет в врожденных иммунных ответах [24] — [26]. TRIM68 наиболее структурно и филогенетически сходен с TRIM21, причем оба TRIMs экспрессируют PRY / SPRY домен в их С-концевом районе [27]. Мало что известно о роли TRIM68 в регуляции передачи сигналов врожденного иммунитета, однако было показано, что он значительно усиливается в клетках рака простаты [28], [29], а также было показано, что он перекрестно реагирует с ингибитором меланомы белка апоптоза (ML -IAP) -специфические цитотоксические Т-клетки, выделенные от пациентов с меланомой [30].Хотя TRIM68 был идентифицирован как клеточная мишень для ответов аутоантител при SS и SLE [31], остается неизвестным, играет ли он какую-либо роль в иммунных ответах.

Наши результаты указывают на неизвестную до сих пор роль TRIM68 как негативного регулятора продукции IFN типа I. В этом отношении мы идентифицируем TRK-слитый ген (TFG) как мишень TRIM68, белок, который, как известно, взаимодействует с каркасными белками, ингибитором субъединицы гамма-киназы NF-κB (IKK-γ) и активатором NF-κB, ассоциированным с членом семейства TRAF ( TANK), что положительно влияет на активацию NF-κB и выработку провоспалительных цитокинов [32].В этом исследовании мы определяем положительную роль TFG в стимулировании выработки IFN-β, при этом нокдаун TFG значительно ингибирует индуцируемую TRIF индукцию IFN-β. Мы демонстрируем, что TRIM68 связывает и полиубиквитинирует TFG, что приводит к его лизосомной деградации и, следовательно, к ингибированию TFG-зависимой передачи сигналов. Мы показываем, что нокдаун TRIM68 в моноцитах человека приводит к увеличению уровней IFN-β и TFG после стимуляции TLR3, дополнительно подтверждая отрицательную роль TRIM68 в этих ответах. Это первый отчет, который демонстрирует роль TFG как положительного регулятора продукции IFN типа I и роль TRIM68 как отрицательного регулятора этого процесса.

Материалы и методы

Заявление об этике

В случае взятия крови человека для выделения моноцитов участники предоставили письменное информированное согласие на участие в этом исследовании. Все образцы были собраны с информированного согласия и использовались в строгом соответствии с этическим одобрением Королевского колледжа хирургов в Ирландии, комитета по этике исследований REC269.

Культура клеток

Эмбриональные почки человека (HEK) Клетки 293T (Unitech Ltd) и клетки HeLa (ATCC) культивировали в среде DMEM (Biosera) с добавлением 10% FCS (Biosera), пенициллина и стрептомицина (100 мкг / мл) (Biosera).Человеческие PBMC выделяли из цельной крови центрифугированием в градиенте плотности с использованием Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). Затем моноциты человека экстрагировали из PBMC путем положительной селекции с использованием шариков CD14 (Miltenyi Biotec) и культивировали в среде RPMI-1640 (Biosera) с добавлением 10% FCS и пенициллин-стрептомицин (100 мкг / мл). После стимуляции собирали супернатанты и определяли уровни RANTES с помощью ELISA (R&D Systems) в соответствии с рекомендациями производителя.

Плазмиды и реагенты

FLAG-TRIM68 был любезным подарком от Dr.Сигецугу Хатакэяма (Высшая школа медицины Университета Хоккайдо, Саппоро, Япония). FLAG-TRIF, FLAG-TBK1, FLAG-IRF3, FLAG-RIG-I, FLAG-MAVS и репортерная конструкция IFN-β люциферазы были любезными подарками от профессора Кэтрин Фицджеральд (Медицинская школа Массачусетского университета, Вустер, Массачусетс, США). . Репортерная конструкция κB-люциферазы была любезным подарком доктора Р. Хофмайстера (Университет Регенсбурга, Германия). Конструкция MYC-MyD88 была любезным подарком доктора Эйслинга Данна (Тринити-колледж Дублина, Ирландия).HA-убиквитин был любезным подарком от доктора Эндрю Боуи (Тринити-колледж в Дублине, Ирландия). Конструкция GFP-TRIM68 была любезным подарком доктора Дэвида Роудса (Кембриджский институт медицинских исследований, Великобритания). MYC-TFG был любезным подарком от доктора Анджелы Греко (Фонд Неврологического института Карло Беста, Италия). Используемые лиганды представляли собой 5’ppp-dsRNA и полиинозин: полицитидиловая кислота (поли (I: C)) (Invivogen). Используемые shRNA представляли собой shRNA TRIM68 человека и shRNA TFG человека (Sigma). В качестве первичных используемых антител были анти-альфа-актинин, анти-HA (Santa Cruz Biotechnologies), анти-FLAG (Sigma), анти-TFG и анти-MYC (Abcam).

Анализы репортерного гена люциферазы

Клетки

HEK293T или HeLa высевали при 2 × 10 5 / мл и временно трансфицировали в течение 18–24 часов 40 нг указанных репортерных конструкций, увеличивая количество конструкции TRIM68 / TFG (10 нг, 50 нг и 100 нг). ) и соответствующую конструкцию драйвера (50 нг). В случае работы TFG shRNA клетки HEK293T временно трансфицировали 40 нг p125 и 250 нг shRNA (Scrambled или TFG) и через 24 часа 50 нг TRIF. Все трансфекции были выполнены с использованием Metafectene (Biontex) в соответствии с рекомендациями производителя.Активность люциферазы стандартизировали по активности плазмиды люциферазы renilla для нормализации эффективности трансфекции.

Конфокальная микроскопия

Клетки

HeLa трансфицировали 2 мкг GFP-TRIM68 в течение 18–24 часов, а затем обрабатывали поли (I: C) (20 мкг / мл) в течение 6 или 24 часов. Клетки фиксировали смесью метанол / ацетон (Sigma) в соотношении 1: 1, окрашивали антителом против TFG и помещали в среду, содержащую DAPI (Dako). Локализацию TFG визуализировали с использованием вторичного антитела против кролика, конъюгированного с Alexa fluor 546 (Molecular Probes), и визуализацию клеток проводили с помощью конфокальной микроскопии на Zeiss LSM 510 META (Oberkochen, Германия).

Вестерн-блоттинг и анализ иммунопреципитации

Для экспериментов по иммунопреципитации клетки HEK293T высевали при 5 × 10 5 / мл, в 10 мл, в чашки диаметром 10 см и трансфицировали всего 4 мкг плазмиды в течение 18–24 часов. Клетки лизировали на льду в буфере для лизиса радиоиммунопреципитации (1 × PBS, 1% Nonidet P-40, 0,5% Na-дезоксихолат, 0,1% SDS, 1 мМ KF, 1 мМ Na 3 VO 4 , 10 мкг / мл лейпептин и 1 мМ PMSF) с последующей иммунопреципитацией либо анти-FLAG (M2), либо анти-TFG, либо анти-HA (Y-11 / 12CA5), предварительно связанных с гранулами протеин-G-сефарозы (Sigma).В некоторых случаях клетки HEK293T обрабатывали лизосомальным ингибитором NH 4 Cl (20 мМ) в течение 18 часов, как указано, или протеосомным ингибитором MG132 (10 мкМ) (Sigma) в течение 2 часов.

Переваривание трипсина и анализ МС / МС

10% акриламидных гелей окрашивали с использованием набора Pierce Silver Staining Kit (Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. Кусочки геля вырезали, обесцвечивали и расщепляли в модифицированном трипсине для секвенирования (Promega) (20 нг / мкл). Полученные смеси пептидов ресуспендировали в 0.1% муравьиной кислоты и анализировали с помощью жидкостной хроматографии с наноэлектрораспылением, масс-спектрометрии (Nano-LC MS / MS). Спектры просматривали с использованием алгоритма SEQUEST по базе данных Международного белкового индекса (IPI) (http://www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhelp.html).

ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК экстрагировали из клеточных культур с использованием набора RNeasy (Qiagen) и обратно транскрибировали в кДНК с использованием обратной транскриптазы Omniscript (Qiagen) в соответствии с рекомендациями производителя. Количественную ПЦР в реальном времени выполняли с использованием SYBR Green Taq ReadyMix (Sigma) на машине для ПЦР в реальном времени Applied Biosystems 7500, и данные были нормализованы по эталону 18S РНК .Матрицы IFN-β , TRIM68, и 18S РНК амплифицировали с использованием праймеров (последовательности доступны по запросу) при температуре отжига 56 ° C. Данные ПЦР в реальном времени анализировали с использованием метода 2 −ΔΔCt [33].

Клонирование TRIM68 PRY / SPRY

Вкратце, область TRIM68 PRY / SPRY размером 780 п.н. амплифицировали с помощью ПЦР из геномной ДНК. Использовали следующие праймеры: вперед 5 ‘atgttgcaggatattcag -3’ и обратный 5 ‘- gtcctccccatccaggga -3’.Прямой и обратный праймеры создавали сайты Not1 и HindIII, соответственно, и продукты ПЦР лигировали в эти сайты в векторе pCDNA3.1 / myc-His (-). Трансформанты были подтверждены секвенированием (MWG Eurofins Genetics, Эберсберг, Германия).

Производство микрочастиц и нокдаун TRIM68 shRNA

Микрочастицы сополимера молочной и гликолевой кислоты (PLGA) 503 (Boehringer Ingelheim), содержащие скремблированную (Scr) или TRIM68 кшРНК (Sigma), получали с использованием метода испарения растворителя двойной эмульсии.Размер лиофилизированных микрочастиц определяли с помощью Malvern Mastersizer 2000 (Malvern Instruments), а эффективность инкапсуляции определяли с помощью анализа Quant-iT PicoGreen (Invitrogen). Флуоресценцию детектировали при длине волны возбуждения 485 нм и длине волны излучения 535 нм с использованием устройства Victor Wallac Multiplate Reader. Человеческие моноциты высевали в количестве 2 × 10 6 / мл и обрабатывали микрочастицами, содержащими 150 нг shRNA (Scr или TRIM68), растворенных в 150 мкл бессывороточной среды RPMI-1640 в течение 48 часов. Через 24 часа после добавления микрочастиц клетки обрабатывали поли (I: C) (20 мкг / мл) в течение оставшихся 24 часов перед проведением анализа ПЦР в реальном времени или вестерн-блоттинга.

Статистический анализ

Все данные представлены как среднее значение трех отдельных экспериментов ± стандартная ошибка среднего (S.E.M). Статистическая значимость для анализов репортерного гена определялась с использованием двухфакторного анализа ANOVA с последующим пост-тестом Бонферрони, в котором все сравнивалось с набором данных 0 нг. Для всех других сравнений использовался двусторонний t-критерий Стьюдента. Считалось, что данные значительно различаются при значении p <0,05 (*) (** p <0,01, *** p <0.001). Программное обеспечение GraphPad Prism 5.0 использовалось для проверки статистической значимости.

Результаты

TRIM68 представляет собой новый негативный регулятор активности промотора IFN-β, управляемой TLR / RLR

И TRIM21, и TRIM68 ранее были идентифицированы как мишени для продукции аутоантител при СКВ [34], [35]. В дополнение к этому, биоинформатический анализ показывает, что TRIM68 является наиболее тесно связанным с TRIM21 членом семейства TRIM, причем оба TRIM кластеризуются вместе в 66% реплицируемых деревьев [27]. TRIM21 и TRIM68 также расположены в непосредственной близости друг от друга в кластере TRIM на хромосоме 11 в положениях p15.4 и p15.5 соответственно (27). Подобно TRIM21 и др. Белкам, обнаруженным в этом кластере (за исключением TRIM3), TRIM68 содержит домен SPRY / PRY, домен, который, как было показано, важен для иммунной регуляции (обзор в [36]). Выравнивание T-Coffee аминокислотной последовательности обоих членов TRIM дало оценку сходства последовательностей 98% (рис. 1A), тогда как выравнивание Clustal W показывает, что TRIM68 и TRIM21 разделяют всего 43.Идентичность последовательностей 16% (фиг. S1), что позволяет предположить, что TRIM68 мог отделиться от TRIM21 посредством дупликации гена . Чтобы определить, действует ли TRIM68 также как негативный регулятор ответов IFN типа I, аналогичный TRIM21, мы оценили его способность влиять на активность промотора IFN-β. Добавление увеличивающихся количеств плазмиды, экспрессирующей TRIM68, значительно ингибировало активность промотора IFN-β, управляемую поли (I: C), TRIF- и TBK1, но не влияло на активность промотора IFN-β, управляемую IRF3 (рис. 1B).Чтобы определить потенциальную роль TRIM68 в активности промотора IFN-β, управляемой RIG-I, клетки временно трансфицировали дцРНК лиганда RIG-I, RIG-I и его адаптерным белком MAVS, а также увеличивающимися количествами TRIM68 (рис. 1С). Как и в случае активности промотора IFN-β, управляемой TRIF, TRIM68 негативно регулирует dsRNA, активацию репортерного гена, управляемую RIG-I и MAVS (рис. 1C). Уровни RANTES также были значительно снижены в клетках, в которых TRIM68 был сверхэкспрессирован после обработки поли (I: C) и дцРНК, что позволяет предположить, что TRIM68 негативно регулирует высвобождение RANTES, управляемое TLR3 и RLR (рис. 1D).В совокупности наши результаты указывают на новую отрицательную регуляторную роль TRIM68 ниже по течению как TLR-, так и RLR-управляемой продукции IFN-β и предполагают, что мишень для TRIM68 находится ниже TBK1, но выше IRF3. Интересно, что TRIM68 также отрицательно регулирует активность промотора NF-κB ниже MyD88, TRIF и TBK1, предполагая, что он работает в точке перекрестного взаимодействия между путями, контролирующими как продукцию типа IFN, так и активацию NF-κB, или, альтернативно, предполагая, что TRIM68 может иметь две разные мишени на IRF. по сравнению с путями NF-κB (Рисунок S2).

Рис. 1. TRIM68 структурно подобен TRIM21 и подавляет продукцию IFN типа I ниже TBK1.

(A) Выравнивание аминокислотных последовательностей TRIM68 и TRIM21 человека с использованием T-Coffee (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular). * (Звездочка) указывает положения, которые имеют единственный полностью консервативный остаток. A: (двоеточие) указывает на сохранение между группами сильно схожих свойств — оценка> 0,5 в матрице Gonnet PAM 250. A. (точка) указывает на сохранение между группами слабо схожих свойств — оценка <0.5 в матрице Gonnet PAM 250. (B – C) Клетки HeLa трансфицировали 40 нг полноразмерного промотора IFN-β, контролем пустого вектора (EV) и возрастающими количествами TRIM68, как указано, в течение 18 часов, а затем стимулировали 20 мкг / мл поли (I: C). ) в течение 24 часов. Во всех других случаях клетки HEK293T трансфицировали 40 нг полноразмерного промотора IFN-β и котрансфицировали 50 нг соответствующих драйверов промотора TRIF, TBK1, IRF3 (B) или дцРНК, RIG-I, MAVS (C ), а также с контролем пустого вектора (EV) и увеличением количества TRIM68, как указано.Клетки анализировали на относительное кратное увеличение активности репортерного гена через 18-24 часа после трансфекции. (D) Клетки HeLa временно трансфицировали 1 мкг TRIM68 вместе с 1 мкг / мл 5'ppp-dsRNA в течение 6 и 24 часов или 18 часов спустя 20 мкг / мл поли (I: C) в течение 6 и 24 часов перед супернатанты собирали для RANTES ELISA. Во всех случаях представленные данные представляют собой среднее значение трех отдельных экспериментов ± S.E.M. * p <0,05 считалось значимым.

https://doi.org/10.1371 / journal.pone.0101503.g001

TRIM68 взаимодействует с слитым геном TRK (TFG), новым регулятором продукции IFN-β

Продемонстрировав, что TRIM68 ингибирует как TLR-, так и RLR-управляемую продукцию IFN типа I, мы затем попытались определить потенциальные мишени для TRIM68. Для этого иммунокомплексы, содержащие FLAG-TRIM68, разделяли с помощью SDS-PAGE, окрашивали серебром, и полосы, которые присутствовали в иммунопреципитированной дорожке FLAG-TRIM68, но не в контрольной полосе IgG, вырезали и анализировали с помощью Nano-LC MS / MS ( Рисунок 2A, Рисунок S3).TFG был идентифицирован как потенциальная мишень для TRIM68, и способность двух белков взаимодействовать была подтверждена после сверхэкспрессии TRIM68, меченного FLAG, в клетках HEK293T с последующим вестерн-блоттингом TRIM68-содержащих комплексов для TFG (рис. 2B). Взаимодействие между TRIM68 и TFG значительно усилилось после 24-часовой стимуляции поли (I: C), при этом также очевидно сопутствующее снижение уровней TFG (рис. 2В). Чтобы дополнительно подтвердить взаимодействие между TRIM68 и TFG, иммунопреципитация также была проведена в обратном порядке, при котором TFG-содержащие комплексы были подвергнуты иммуноблоттингу для TRIM68, в результате чего снова стало очевидным индуцируемое поли (I: C) взаимодействие между TRIM68 и TFG (рис. 2С).Наконец, взаимодействие между TRIM68 и TFG было дополнительно подтверждено конфокальной микроскопией, при этом наблюдали, что временно трансфицированный GFP-меченный TRIM68 взаимодействует с TFG после обработки поли (I: C) клеток HeLa в течение 24 часов (фигура 2D). Хотя на этом изображении TFG представляется стабилизированным после обработки поли (I: C), количественная оценка была проведена на нескольких изображениях с использованием программного обеспечения «ImageJ», демонстрирующего, что абсолютные уровни TFG действительно снижаются по сравнению с нестимулированными контролями, что подтверждает наблюдение, что TFG деградирует после стимуляции поли (I: C) (рисунок 2D, нижний рисунок).

Рисунок 2. Взаимодействие TRIM68 с TRK-слитым генным белком (TFG) увеличивает пост-стимуляцию TLR3.

(A) Белки, связанные с TRIM68, подвергали иммунопреципитации из лизатов с помощью гранул агарозы, покрытых анти-FLAG (Sigma). Иммунопреципитация с использованием нормального мышиного IgG функционировала как отрицательный контроль. Выбранные полосы вырезали, расщепляли трипсином и анализировали масс-спектрометрией. Вестерн-блоттинг, показывающий соответствующие лизаты из окрашенного серебром геля, был подвергнут иммуноблоттингу на FLAG, чтобы подтвердить успешную трансфекцию и иммунопреципитацию FLAG-TRIM68.Показанные иммуноблоты относятся к одному эксперименту и представляют два независимых эксперимента. (B) Клетки HEK293T трансфицировали 2 мкг EV и FLAG-TRIM68. Комплексы, содержащие TRIM68, подвергали иммунопреципитации с использованием гранул, покрытых анти-FLAG, и блотировали на TFG и FLAG. Лизаты подвергали иммуноблоттингу на TFG и FLAG. Показанные иммуноблоты взяты из одного эксперимента и представляют три независимых эксперимента. (C) Клетки HEK293T трансфицировали 2 мкг EV и FLAG-TRIM68. Комплексы, содержащие TFG, подвергали иммунопреципитации с использованием гранул, покрытых анти-TFG, и проводили иммуноблоттинг на FLAG и TFG.Лизаты подвергали иммуноблоттингу на TFG и FLAG. Показанные иммуноблоты взяты из одного эксперимента и представляют три независимых эксперимента. (D) Клетки HeLa трансфицировали 2 мкг экспрессионной плазмиды GFP-TRIM68 (зеленый) и стимулировали 20 мкг / мл поли (I: C) в течение 6 и 24 часов. Клетки фиксировали и затем окрашивали анти-TFG перед установкой в ​​DAPI для визуализации ядер (синий цвет). Изображения были получены под масляной иммерсией при 63-кратном увеличении. Панели справа содержат увеличенные изображения белого поля на предыдущей панели.Показанные изображения относятся к одному эксперименту и представляют три независимых эксперимента. Необработанное интегрированное значение плотности (сумма значений пикселей) было рассчитано с использованием программного обеспечения ImageJ (1,48 4-битная Java) для изображений только для TFG для каждой временной точки poly (I: C). Представленные данные построены на основе среднего значения шестнадцати отдельных изображений ± S.E.M. * p <0,05 считалось значимым.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101503.g002

TRIM68 полиубиквитинирует TFG, что приводит к его деградации через его домен RING, который также играет важную роль в отрицательном ингибировании TRIM68 продукции IFN-β

Интересно, что мы постоянно наблюдали снижение уровней TFG в клеточных лизатах в присутствии TRIM68 после стимуляции, что позволяет предположить, что TRIM68 может дестабилизировать TFG.В соответствии с этим мы наблюдали заметное снижение уровней белка TFG в клетках, коэкспрессирующих убиквитин, TFG и TRIM68, даже в отсутствие стимуляции, что указывает на то, что TFG может быть убиквитинирован и, следовательно, нацелен на деградацию с помощью TRIM68 (рис. 3A). В соответствии с этой гипотезой было показано, что TFG, меченный MYC, полиубиквитинируется при совместной экспрессии как с убиквитином, меченным HA, так и с TRIM68, меченным FLAG (фиг. 3B). Анализ природы полиубиквитиновых цепей, добавленных TRIM68, оказался неубедительным, предполагая, что TRIM68-опосредованное полиубиквитинирование процесса TFG не полностью зависит от K48- или K63-связанных цепей убиквитина и может включать смешанные K48 / K63-связанные цепи. цепи или цепи с использованием альтернативных связей, таких как K29 (Рисунок S4).Поскольку убиквитинирование может сигнализировать о деградации белков-мишеней через протеасомные или лизосомные пути (обзор в (37)), клетки HEK293T, сверхэкспрессирующие TFG, TRIM68 и убиквитин, обрабатывали либо ингибитором протеасом, MG132 (или контроль носителя DMSO), либо ингибитором лизосомальной деградации. , NH 4 Cl (или контрольный носитель PBS) и влияние TRIM68 на уровни TFG, оцененные с помощью вестерн-блоттинга (рис. 3C). В то время как протеосомное ингибирование не влияло на деградацию TFG (рис. 3C, верхние панели), ингибирование слияния лизосома-фагосома с помощью NH 4 Cl приводило к значительному накоплению TFG в присутствии TRIM68 и убиквитина (рис. 3C, нижние панели) , предполагая, что TFG на самом деле убиквитинируется и деградирует с помощью TRIM68 через лизосомальные пути деградации .

Рисунок 3. TRIM68 негативно регулирует продукцию IFN типа I посредством полиубиквитинирования и лизосомной деградации TFG.

(A) Клетки HEK293T котрансфицировали MYC-TFG, HA-убиквитином, FLAG-TRIM68 и EV. Лизаты подвергали иммуноблоттингу на TFG, альфа-актинин, HA и FLAG. Показанные иммуноблоты взяты из одного эксперимента и представляют три независимых эксперимента. (B) Клетки HEK293T трансфицировали 1 мкг EV, MYC-TFG, HA-убиквитин и FLAG-TRIM68. Комплексы, содержащие убиквитин, подвергали иммунопреципитации с использованием гранул, покрытых анти-HA, и проводили иммуноблоттинг на MYC, FLAG и HA.Лизаты подвергали иммуноблоттингу на FLAG и HA. Показанные иммуноблоты взяты из одного эксперимента и представляют три независимых эксперимента. (C) Клетки обрабатывали протеасомным ингибитором MG132 (10 мкМ) и контрольным носителем ДМСО в течение 2 часов или лизосомным ингибитором NH 4 Cl (20 мМ) или контрольным носителем PBS в течение 18 часов, прежде чем клетки лизировали и подвергали иммуноблоттингу на MYC, альфа. актинин, ФЛАГ и НА. Во всех случаях представленные иммуноблоты относятся к одному эксперименту и представляют три независимых эксперимента.Данные денситометрии представлены в виде среднего значения трех отдельных экспериментов ± S.E.M. ТФГ, нормализованный до альфа-актинина.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101503.g003

TFG, новый драйвер образования IFN типа I, увеличивается в отсутствие TRIM68

Принимая во внимание предыдущие сообщения о том, что TFG может положительно влиять на продукцию провоспалительных цитокинов, мы решили выяснить, оказывает ли TFG какое-либо влияние на продукцию IFN типа I. Временная трансфекция клеток HEK293T увеличивающимся количеством TFG приводит к активации промотора IFN-β (рис. 4A).Кроме того, нокдаун TFG в тех же клетках приводил к снижению активности промотора IFN-β, управляемой TRIF, что указывает на то, что TFG действительно является положительным регулятором продукции IFN-β в этой системе (фиг. 4B). Напротив, сверхэкспрессия TFG в клетках HeLa приводила к значительному увеличению высвобождения RANTES как до, так и через 24 часа после стимуляции поли (I: C), что дополнительно указывает на функции TFG в качестве положительного регулятора ответа IFN типа I (фиг. 4C). Показав, что TFG положительно влияет на продукцию IFN-β, а TRIM68 способствует убиквитинированию и деградации TFG, мы затем решили определить, участвует ли это убиквитинирование в ингибировании передачи сигналов IFN-β.Активность большинства лигаз E3, таких как TRIM68, определяется доменом пальца RING (действительно интересный новый ген). Чтобы исследовать, играет ли этот домен роль в том, как TRIM68 негативно регулирует активность промотора IFN-β, управляемую TFG-, TBK1 и dsRNA, была клонирована мутантная плазмида TRIM68 без домена RING (TRIM68 PRY / SPRY), и клетки временно были трансфицированные TFG, TBK1 или dsRNA и увеличивающиеся количества мутантной плазмиды TRIM68 и% ингибирования активности промотора IFN-β сравнивали с полноразмерным TRIM68 (фиг. 4D).Удаление домена RING значительно снизило управляемое TFG, TBK1 и dsRNA ингибирование активности промотора IFN-β, предполагая, что этот домен играет важную роль в том, как TRIM68 оказывает свое негативное влияние на продукцию IFN типа I. Остающееся ингибирование промотора IFN-β в отсутствие домена RING предполагает, что не все эффекты TRIM68 зависят от домена RING. Промотор IFN-β имеет три основных сайта связывания факторов транскрипции; область PRD IV, которая связывает фактор транскрипции ATF-2 / c-Jun, область PRD III-I, которая связывает факторы транскрипции IRF3 и IRF7, и область PRD II, которая связывает NF-κB (рис. 4E).Чтобы исследовать, какие сайты связывания на промоторе IFN-β TRIM68 могут негативно регулироваться, мы провели анализы репортерных генов, управляемых TFG, на полноразмерном промоторе IFN-β, а также на каждом из трех сегментов (рис. 4E). В соответствии с тем, что TFG является мишенью для TRIM68, добавление увеличивающихся концентраций плазмиды, экспрессирующей TRIM68, значительно ингибировало управляемую TFG активность полноразмерного промотора IFN-β, а также активность промоторов PRD II и PRD III-I, управляемую TFG, при отсутствии влияние на активность промотора PRD IV, управляемую TFG (рис. 4F).Показав, что TRIM68 нацелен на TFG для деградации in vitro , мы затем оценили эффекты нокдауна TRIM68 на уровни как IFN-β, так и TFG. Моноциты человека трансфицировали либо скремблированной (Scr) контрольной кшРНК, либо кшРНК, направленной против TRIM68, и эффективность нокдауна определяли путем оценки уровней мРНК TRIM68 (фиг. 4G). Значительное увеличение как уровней мРНК IFN-β, так и уровней белка TFG до и после 24-часовой стимуляции поли (I: C) было очевидно в моноцитах с дефицитом TRIM68 (рис. 4H и 4I) с денситометрическим анализом, показанным справа), что согласуется с TRIM68 отрицательно. регулирование продукции IFN типа I через разложение TFG.Таким образом, TRIM68, индуцируя деградацию TFG, воздействует на активность как NF-κB, так и IRF3 / 7 ниже PRR, чтобы выключить и ограничить продукцию IFN типа I.

Рисунок 4. Нокдаун TRIM68 приводит к увеличению уровней IFN-β и TFG после стимуляции TLR3.

(A) Клетки HEK293T трансфицировали 40 нг полноразмерного промотора IFN-β и возрастающими количествами TFG, как указано. Клетки анализировали на относительное кратное увеличение активности репортерного гена через 18-24 часа после трансфекции.(B) Клетки HEK293T трансфицировали 400 нг полноразмерного промотора IFN-β и котрансфицировали 250 нг Scrambled (Scr) или кшРНК TFG, как указано, и через 24 часа 50 нг TRIF. Клетки анализировали на относительное кратное увеличение активности репортерного гена через 18-24 часа после трансфекции. Представленные данные представлены в виде графика одного эксперимента. (C) Клетки HeLa временно трансфицировали 1 мкг TFG и через 18 часов стимулировали 20 мкг / мл поли (I: C) в течение 24 часов перед сбором супернатантов для RANTES ELISA.(D) Клетки HEK293T трансфицировали 40 нг полноразмерного промотора IFN-β и котрансфицировали 50 нг TFG, TBK1 или дцРНК, а также контрольным пустым вектором (EV) и 50 нг полноразмерным TRIM68 или TRIM68. мутант, лишенный домена RING и B-бокса (TRIM PRY / SPRY), как указано. Клетки анализировали на относительное кратное увеличение активности репортерного гена через 18-24 ч после трансфекции и рассчитывали% ингибирования активности промотора. Представленные данные представляют собой среднее значение трех отдельных экспериментов ± S.E.M. * p <0,05 считалось значимым. (E) Схема промотора IFN-β, который состоит из трех основных сайтов связывания факторов транскрипции, области PRD IV, которая связывает фактор транскрипции ATF-2 / c-Jun, области PRD III – I, которая связывает факторы транскрипции IRF3. и IRF7 и область PRD II, которая связывает NF-κB. (F) Клетки HEK293T трансфицировали 40 нг полноразмерного промотора IFN-β или сегментами PRD (PRD II, PRD III-I, PRD IV) и 50 нг TFG, а также контрольным EV и увеличивающимися количествами TRIM68 как указано.Клетки анализировали на относительное кратное увеличение активности репортерного гена через 18-24 часа после трансфекции. (G – I) Человеческие моноциты обрабатывали микрочастицами PLGA, содержащими либо скремблированную (Scr), либо кшРНК TRIM68, в течение 48 часов. ПЦР в реальном времени использовали для измерения уровней мРНК TRIM68 после обработки (G). После обработки микрочастицами PLGA моноциты стимулировали поли (I: C) в течение 24 часов перед измерением мРНК IFN-β (H). Человеческие моноциты, обработанные микрочастицами, содержащими кшРНК, как указано выше, подвергали иммуноблоттингу на TFG и альфа-актинин.Показанные иммуноблоты взяты из одного эксперимента и представляют три независимых эксперимента (I). Во всех остальных случаях представленные данные построены на основе среднего значения трех отдельных экспериментов ± S.E.M. * p <0,05 считалось значимым.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101503.g004

Обсуждение

Критическая роль, которую отрицательные регуляторы играют в TLR- и RLR-индуцированных ответах и ​​в защите от начала аутоиммунных и воспалительных заболеваний, демонстрируется развитием спонтанного заболевания у мышей, лишенных этих белков, таких как TRIM21 и TIR8 / SIGGIR. [23], [37], [38].Хотя в настоящее время широко признано участие TRIM в определенных биологических процессах, включая рак, ретровирусную рестрикцию и аутоиммунитет [27], [39], [40], только недавно возникла реальная оценка специфической и решающей роли TRIMs. играют роль регуляторов врожденных иммунных путей [41], [42]. Считается, что TRIM, содержащие SPRY-домен, играют множество ролей в качестве противовирусных факторов [43]. Хотя было показано, что многие из них, такие как TRIM5α, обладают прямыми противовирусными свойствами [44], другие, такие как TRIM21, могут регулировать продукцию IFN типа I, чтобы предположительно предотвратить перепроизводство этих потенциально патогенных цитокинов [44]. 7], [8].Таким образом, наблюдаемые отрицательные эффекты TRIM68 на продукцию IFN согласуются с этой теорией.

В ходе этого исследования мы наблюдали, что TRIM68 является мощным негативным регулятором продукции IFN типа I, ниже как TLR, так и RLR путей. Результаты анализов репортерного гена предполагают, что TRIM68 оказывает свое влияние на продукцию IFN типа I ниже TBK1. Протеомный анализ идентифицировал TFG как bona fide TRIM68 мишень, новый регулятор индукции IFN-β и, следовательно, идеальную мишень для TRIM68 в этом отношении.Большая часть литературы, посвященной TFG, демонстрирует участие этого белка в развитии рака, и только два исследования предполагают, что он играет роль в иммунной регуляции [32], [45]. Что касается его роли в развитии рака, было обнаружено, что TFG преимущественно активируется в клеточных линиях и тканях рака простаты, причем экспрессия TFG связана с более высокой вероятностью рецидива опухоли после хирургического вмешательства [46]. Вдобавок TFG был идентифицирован как предполагаемый ген-супрессор метастатической меланомы [47] и, как полагают, также играет роль в немелкоклеточном раке легкого, действуя как партнер транслокации киназы анапластической лимфомы (ALK) [48].Миранда и др. были первыми, кто предположил, что TFG может играть роль в иммунной регуляции, показывая, что сверхэкспрессия TFG может усиливать эффект TNF-α, TANK, TRAF2 и TRAF6 в индукции активности NF-κB, предполагая, что TFG является частью комплекса, содержащего ТАНК и ИКК-γ [32]. Мы впервые демонстрируем, что TFG может управлять активностью промотора IFN-β, эффект, который подавляется в присутствии TRIM68, потенциально за счет его эффектов на NF-κB, как сообщается Miranda et al .Фактически, TBK1, хотя в основном ценится за его роль в активации IRF3, также, как было показано, играет важную роль в регуляции активности NF-κB [49], [50]. Наши результаты предполагают, что TRIM68 деградирует TFG в точке конвергенции путей, в которой нижестоящие события приводят к активации как NF-κB, так и IRF3.

Недавно стало очевидно, что существует значительный уровень перекрестных помех между путями, управляемыми TRIF и MyD88. Например, было показано, что TBK1 и IKKε активируются лигандами TLR, которые передают сигнал через MyD88, и считается, что канонические IKK и IKK-родственные киназы имеют несколько общих субстратов в дополнение к их уникальным физиологическим субстратам, таким как IκBα и IRF3 [ 51], [52].Таким образом, возможно, что TFG может быть частью сигнального комплекса TBK1 / IKKε / TANK / IKKγ, впервые идентифицированного Chariot et al [53], и деградация TFG посредством TRIM68-опосредованного убиквитинирования приводит к разрушению этого комплекса. и последующее ингибирующее действие на продукцию IFN типа I. Хотя мы не смогли установить точные остатки лизина, участвующие в убиквитинировании TRIM68 TFG, возможно, что обе связи убиквитина K48 и K63 играют роль, поскольку недавно было показано, что оба лизина сигнализируют о деградации лизосом [54].Интересно, что недавнее исследование показало, что TFG связывает TRIM25 при вирусной инфекции и негативно регулирует передачу сигналов IFN типа I, опосредованную RIG-I [45]. Напротив, мы не наблюдали никаких ингибирующих эффектов TFG на продукцию IFN-β, вместо этого наши результаты указывают на роль TFG в стимулировании продукции IFN-β.

Интересно, что и TRIM68, и TRIM21 являются известными аутоантигенами при СКВ и первичном синдроме Шегрена (pSS), аутоиммунных заболеваниях, связанных с высоким уровнем циркулирующего IFN типа I и сигнатуры IFN-стимулированного гена (ISG) [20], [31] .В то время как ряд недавних исследований связали TRIM21 с патогенезом СКВ [23], [55], на сегодняшний день не было продемонстрировано известной роли TRIM68 в регуляции продукции IFN или потенциального участия в СКВ или пСС [35], [56] . Интересно, однако, что недавний отчет показал, что ген TRIM68 подавляется в pSS [57], потенциально, с учетом наших результатов, что приводит к потере негативной регуляции продукции IFN типа I и способствует повышению уровней IFN и ISG. подпись наблюдается в pSS.Поэтому необходим анализ роли TRIM68 и потенциально TFG в pSS и SLE.

В этом исследовании мы демонстрируем TRIM68 как мощный негативный регулятор продукции IFN типа I посредством расщепления активирующего белка TFG. Таким образом, мы предполагаем, что потеря активности TRIM68 или подавление экспрессии может способствовать избыточной продукции IFN типа I, обычно наблюдаемой при воспалительных состояниях, таких как SLE и pSS. Хотя молекулярные пути, лежащие в основе этих воспалительных заболеваний, еще предстоит полностью выяснить, модуляция активности TRIM68 может иметь некоторый потенциал в качестве новой терапевтической мишени для лечения нарушений, связанных с избыточной продукцией IFN типа I.

Вспомогательная информация

Рисунок S2.

TRIM68 отрицательно регулирует активность промотора NF-κB. Клетки HEK293T трансфицировали 40 нг полноразмерной репортерной конструкции κB-люциферазы и 50 нг соответствующих драйверов промоторов MyD88, TRIF и TBK1, а также контрольным EV и возрастающими количествами TRIM68, как указано. Клетки анализировали на относительное кратное увеличение активности репортерного гена через 18-24 часа после трансфекции. Представленные данные представляют собой среднее значение трех отдельных экспериментов ± S.E.M. * p <0,05 считалось значимым.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101503.s002

(TIF)

Рисунок S3.

TRIM68 потенциально взаимодействующих белковых пептидов определяли с использованием нано-LC MS / MS. Таблица потенциальных взаимодействующих с TRIM68 белков, идентифицированных из вырезанного фрагмента геля с использованием анализа MS / MS. Этот список составлен из совпадений пептидов из двух отдельных экспериментов. «Глобальная протеомная машина (GPM)» http://www.thegpm.org/ и «Mascot» http: // www.Для идентификации белков по данным масс-спектрометрии использовались поисковые системы matrixscience.com/ home. Список включает название протеина со швейцарским идентификатором протеина (sp), молекулярную массу протеина в Дальтонах (Да), оценку пропептида, оценку кросс-корреляции (XC) и процент покрытия последовательности.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101503.s003

(TIF)

Рисунок S4.

Лизины 48 и 63 представляют собой два возможных лизина, участвующих в TRIM68-опосредованном полиубиквитинировании TFG.Клетки HEK293T котрансфицировали MYC-TFG, FLAG-TRIM68, НА-убиквитин дикого типа или мутантами убиквитина (НА-убиквитин K48R, HA-убиквитин K63R) в течение 18–24 часов. Убиквитинированные белки иммунопреципитировали из лизатов с использованием гранул агарозы, покрытых анти-НА, а возможное убиквитинирование TFG оценивали с помощью иммуноблоттинга с анти-MYC. Показанные иммуноблоты относятся к одному эксперименту и представляют два независимых эксперимента.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101503.s004

(TIF)

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: CW CAJ.Проведены эксперименты: CW EL SS EMC JNG LK RH. Проанализированы данные: CW EL SS JNG LK. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты для анализа: SAC CAB. Написал статью: CW CAJ.

Список литературы

  1. 1. Versteeg Gijs A, Rajsbaum R, Sánchez-Aparicio Maria T, Maestre Ana M, Valdiviezo J, et al. (2013) Семейство белков E3-лигазы TRIM регулирует сигнальные пути, запускаемые врожденными рецепторами распознавания иммунных образов. Иммунитет 38: 384–398.
  2. 2. Ян Б., Ван Дж, Ван И, Чжоу Х, Ву Х и др.(2013) Новая функция Trim44 способствует противовирусному ответу за счет стабилизации VISA. Журнал иммунологии 190: 3613–3619.
  3. 3. Сюэ Ц., Чжоу З., Лэй Х, Лю Х, Хэ Б и др. (2012) TRIM38 негативно регулирует TLR3-опосредованную передачу сигналов IFN-β, направляя TRIF на деградацию. PLoS ONE 7: e46825.
  4. 4. Ли Кью, Ян Дж., Мао А.П., Ли Ц., Ран Й. и др. (2011) Трехчастный мотив 8 (TRIM8) модулирует TNFα- и IL-1β-запускаемую активацию NF-κB путем нацеливания на TAK1 для K63-связанного полиубиквитинирования.Труды Национальной академии наук 108: 19341–19346.
  5. 5. Ногучи К., Окумура Ф., Такахаши Н., Катаока А., Камияма Т. и др. (2011) TRIM40 способствует недилированию IKKγ и подавляется при раке желудочно-кишечного тракта. Канцерогенез 32: 995–1004.
  6. 6. Yu S, Gao B, Duan Z, Xu W, Xiong S (2011) Идентификация трехчастичного мотива, содержащего 22 (TRIM22), в качестве нового активатора NF-κB. Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях 410: 247–251.
  7. 7. Хиггс Р., Ни Габханн Дж., Ларби Н.Б., Брин Е.П., Фицджеральд К.А. и др. (2008) Убиквитинлигаза E3 Ro52 отрицательно регулирует постпатогенное распознавание продукции IFN-β посредством полиубиквитин-опосредованной деградации IRF3. Журнал иммунологии 181: 1780–1786.
  8. 8. Хиггс Р., Лаззари Э., Винн С., Ни Габханн Дж., Эспиноза А. и др. (2010) Самозащита от антивирусных реакций — Ro52 способствует деградации транскрипционного фактора IRF7, расположенного ниже вирусных толл-подобных рецепторов.PLoS ONE 5: e11776.
  9. 9. Kondo T, Watanabe M, Hatakeyama S (2012) TRIM59 взаимодействует с ECSIT и негативно регулирует сигнальные пути, опосредованные NF-κB и IRF-3/7. Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях 422: 501–507.
  10. 10. Shibata M, Sato T, Nukiwa R, Ariga T, Hatakeyama S (2012) TRIM45 отрицательно регулирует транскрипцию, опосредованную NF-κB, и подавляет пролиферацию клеток. Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях 423: 104–109.
  11. 11.Чжао В., Ван Л., Чжан М., Ван П, Юань С. и др. (2012) Tripartite Motif-Consing Protein 38 отрицательно регулирует TLR3 / 4- и RIG-I-опосредованную продукцию IFN-β и противовирусный ответ путем нацеливания на NAP1. Журнал иммунологии 188: 5311–5318.
  12. 12. Zhao W, Wang L, Zhang M, Yuan C, Gao C (2012) E3 Ubiquitin Ligase Tripartite Motif 38 негативно регулирует TLR-опосредованные иммунные ответы путем протеасомной деградации фактора 6, ассоциированного с рецептором TNF, в макрофагах.Журнал иммунологии 188: 2567–2574.
  13. 13. Qiu H, Huang F, Xiao H, Sun B, Yang R (2013) TRIM22 ингибирует TRAF6-стимулированный путь NF-κB, направляя TAB2 для деградации. Virologica Sinica: 1–7.
  14. 14. Goubau D, Deddouche S, Reise Sousa C (2013) Цитозольное зондирование вирусов. Иммунитет 38: 855–869.
  15. 15. Палудан С.Р., Боуи А.Г. (2013) Иммунное зондирование ДНК. Иммунитет 38: 870–880.
  16. 16. Каваи Т., Акира С. (2008) Сигнализация с помощью Toll-подобного рецептора и RIG-1-подобного рецептора.Анналы Нью-Йоркской академии наук 1143: 1–20.
  17. 17. Ozato K, Shin D-M, Chang T-H, Morse HC (2008) Белки семейства TRIM и их новые роли в врожденном иммунитете. Nat Rev Immunol 8: 849–860.
  18. 18. Реймонд А., Мерони Дж., Фантоцци А., Мерла Дж., Каир С. и др. (2001) Семейство трехчастных мотивов идентифицирует клеточные компартменты. EMBO J 20: 2140–2151.
  19. 19. Перес-Кабальеро Д., Хатциоанну Т., Янг А., Коуэн С., Биениас П.Д. (2005) Трехсторонние домены мотива 5α человека, ответственные за активность и специфичность рестрикции ретровирусов.Журнал вирусологии 79: 8969–8978.
  20. 20. Clark G, Reichlin M, Tomasi TB Jr (1969) Характеристика растворимых цитоплазматических антиген-реактивных сывороток пациентов с системной красной волчанкой. J Immunol 102: 117–122.
  21. 21. Маттиоли М., Райхлин М. (1974) Гетерогенность белковых антигенов РНК, реагирующих с сыворотками пациентов с системной красной волчанкой. Описание цитоплазматического нерибосомного антигена. Arthritis Rheum 17: 421–429.
  22. 22.Alspaugh MA, Tan EM (1975) Антитела к клеточным антигенам при синдроме Шегрена. Дж. Клин Инвест 55: 1067–1073.
  23. 23. Эспиноза А., Дардалхон В., Браунер С., Амбрози А., Хиггс Р. и др. (2009) Потеря аутоантигена волчанки Ro52 / Trim21 вызывает воспаление тканей и системный аутоиммунитет, нарушая регуляцию пути IL-23 – Th27. Журнал экспериментальной медицины 206: 1661–1671.
  24. 24. Kong HJ, Anderson DE, Lee CH, Jang MK, Tamura T и др. (2007) На переднем крае: аутоантиген Ro52 представляет собой индуцируемую интерфероном лигазу E3, которая убиквитинирует IRF-8 и усиливает экспрессию цитокинов в макрофагах.Журнал иммунологии 179: 26–30.
  25. 25. Ян К., Ши Х-Х, Лю Х-И, Шан И-Ф, Вэй Б. и др. (2009) TRIM21 необходим для поддержания активации регулирующего фактора 3 IFN во время противовирусного ответа. Журнал иммунологии 182: 3782–3792.
  26. 26. Макьюэн В.А., Тэм Дж.Ч., Уоткинсон Р.Э., Бидгуд С.Р., Маллери Д.Л. и др. (2013) Патогены, связанные с внутриклеточными антителами, стимулируют передачу иммунных сигналов через Fc-рецептор TRIM21. Nat Immunol 14: 327–336.
  27. 27. Джеффрис С., Винн С., Хиггс Р. (2011) Противовирусные TRIM: друг или враг в аутоиммунных и аутовоспалительных заболеваниях? Nat Rev Immunol 11: 617–625.
  28. 28. Миядзима Н., Маруяма С., Боггаки М., Кано С., Шигемура М. и др. (2008) TRIM68 регулирует лиганд-зависимую транскрипцию рецептора андрогена в клетках рака простаты. Исследования рака 68: 3486–3494.
  29. 29. Ли Й, Конг Д., Ахмад А., Бао Б., Дайсон Дж. И др. (2012) Эпигенетическая дерегуляция miR-29a и miR-1256 изофлавоном способствует ингибированию роста и инвазии клеток рака простаты. Эпигенетика 7: 940–949.
  30. 30. Бэк Соренсен Р., Фауршу М., Трельсен Л., Шрама Д., Якобсен С. и др.(2009) Цитотоксические Т-лимфоциты, специфичные для ингибитора меланомы апоптоза (ML-IAP), перекрестно реагируют с эпитопом из аутоантигена SS56. J Invest Dermatol 129: 1992–1999.
  31. 31. Billaut-Mulot OC, Kolesnitchenko C, Truong V, Chan MJ, Hachula EK (2001) SS-56, новая клеточная мишень реакций аутоантител при синдроме Шегрена и системной красной волчанке. Дж. Клин Инвест 108: 861–869.
  32. 32. Миранда С., Роккато Э., Рахо Г., Пальярдини С., Пьеротти М.А. и др.(2006) Белок TFG, участвующий в онкогенных перестройках, взаимодействует с TANK и NEMO, двумя белками, участвующими в пути NF-κB. Журнал клеточной физиологии 208: 154–160.
  33. 33. Ливак К.Дж., Шмитген Т.Д. (2001) Анализ данных относительной экспрессии генов с использованием количественной ПЦР в реальном времени и метода 2-ΔΔCT. Методы 25: 402–408.
  34. 34. Clark G, Reichlin M, Tomasi TB (1969) Характеристика растворимого цитоплазматического антигена, реагирующего с сыворотками пациентов с системной красной волчанкой.Журнал иммунологии 102: 117–122.
  35. 35. Billaut-Mulot O, Cocude Cc, Kolesnitchenko V, Truong M-J, Chan EKL, et al. (2001) SS-56, новая клеточная мишень реакций аутоантител при синдроме Шегрена и системной красной волчанке. Журнал клинических исследований 108: 861–869.
  36. 36. D’Cruz AA, Babon JJ, Norton RS, Nicola NA, Nicholson SE (2013) Структура и функция белков домена SPRY / B30.2, участвующих в врожденном иммунитете. Наука о белке 22: 1–10.
  37. 37. Гарланда С., Рива Ф., Полентарутти Н., Бураки С., Сирони М. и др. (2004) Воспаление кишечника у мышей с дефицитом Tir8, члена-ингибитора семейства рецепторов IL-1. Слушания Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 101: 3522–3526.
  38. 38. Сяо Х., Инь В., Хан М.А., Гюлен М.Ф., Чжоу Х. и др. (2010) Потеря одной молекулы, связанной с рецептором интерлюкина-1 иммуноглобулина, приводит к усилению полипоза толстой кишки у мышей Apcmin.Гастроэнтерология 139: 574–585.
  39. 39. Hatakeyama S (2011) TRIM белки и рак. Нат Рев Рак 11: 792–804.
  40. 40. Nisole S, Stoye J, Saib A (2005) Белки семейства TRIM: ретровирусная рестрикция и противовирусная защита. Nat Rev Microbiol 3: 799–808.
  41. 41. Каваи Т., Акира С. (2011) Регулирование сигнальных путей врожденного иммунитета с помощью белков семейства трехчастных мотивов (TRIM). EMBO Molecular Medicine 3: 513–527.
  42. 42. McNab FW, Rajsbaum R, Stoye JP, O’Garra A (2011) Трехкомпонентные белки и регуляция врожденного иммунитета.Текущее мнение в иммунологии 23: 46–56.
  43. 43. Rajsbaum R, Stoye JP, O’Garra A (2008) Интерферон-зависимая и независимая экспрессия трехчастичных мотивных белков в иммунных клетках. Европейский журнал иммунологии 38: 619–630.
  44. 44. Stremlau M, Owens CM, Perron MJ, Kiessling M, Autissier P, et al. (2004) Цитоплазматический компонент тела TRIM5α ограничивает инфекцию ВИЧ-1 у обезьян Старого Света. Природа 427: 848–853.
  45. 45. Ли Н-Р, Шин Х-Б, Ким Х-И, Чой М.-С, Inn K-S (2013) Отрицательная регуляция передачи противовирусных сигналов, опосредованной RIG-I, с помощью белка слитого гена TRK (TFG).Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях 437: 168–172.
  46. 46. Эндох К., Ниши М., Исигуро Х., Уэмура Х., Мияги Й. и др. (2012) Идентификация фосфорилированных белков, участвующих в онкогенезе рака простаты, с помощью Pin1-протеомного анализа. Простата 72: 626–637.
  47. 47. Dutton-Regester K, Aoude LG, Nancarrow DJ, Stark MS, O’Connor L, et al. (2012) Идентификация TFG (слитый с TRK ген) в качестве предполагаемого гена-супрессора метастатической меланомы.Гены, хромосомы и рак 51: 452–461.
  48. 48. Тисео М., Джельсомино Ф., Бартолотти М., Борди П., Берсанелли М. и др. (2011) Киназа анапластической лимфомы как новая мишень для лечения немелкоклеточного рака легкого. Экспертный обзор противоопухолевой терапии 11: 1677–1687.
  49. 49. Tojima Y, Fujimoto A, Delhase M, Chen Y, Hatakeyama S и др. (2000) NAK представляет собой киназу, активирующую киназу I [каппа] B. Nature 404: 778–782.
  50. 50. Фитцджеральд К.А., МакВиртер С.М., Файя К.Л., Роу, округ Колумбия, Латц Э. и др.(2003) IKK [epsi] и TBK1 являются важными компонентами пути передачи сигналов IRF3. Nat Immunol 4: 491–496.
  51. 51. Clark K, Takeuchi O, Akira S, Cohen P (2011) TRAF-связанный белок TANK способствует перекрестному взаимодействию внутри семейства киназ IκB во время передачи сигналов Toll-подобного рецептора. Труды Национальной академии наук 108: 17093–17098.
  52. 52. Кларк К., Пегги М., Платер Л., Сорсек Р.Дж., Янг ЭРР и др. (2011) Новый перекрестный разговор в семье IKK контролирует врожденный иммунитет.Биохимический журнал 434: 93–104.
  53. 53. Колесница А, Леонарди А., Мюллер Дж., Бониф М., Браун К. и др. (2002) Ассоциация адаптера TANK с регулятором киназы IκB (IKK) NEMO соединяет комплексы IKK с киназами IKKε и TBK1. Журнал биологической химии 277: 37029–37036.
  54. 54. Zhang L, Xu M, Scotti E, Chen ZJ, Tontonoz P (2013) Убиквитиновые связи K63 и K48 сигнализируют о лизосомной деградации рецептора LDL. Журнал исследований липидов 54: 1410–1420.
  55. 55. Zhang Z, Bao M, Lu N, Weng L, Yuan B и др. (2013) E3-убиквитинлигаза TRIM21 отрицательно регулирует врожденный иммунный ответ на внутриклеточную двухцепочечную ДНК. Нат Иммунол 14: 172–178.
  56. 56. Ben-Chetrit E, Chan EK, Sullivan KF, Tan EM (1988) Белок массой 52 кДа является новым компонентом антигенной частицы SS-A / Ro. Журнал экспериментальной медицины 167: 1560–1571.
  57. 57. Sjöstrand M, Brauner S, Kvarnström M, Wahren-Herlenius M, Espinosa A (2012) Гены TRIM являются частью сигнатуры интерферона, наблюдаемой у пациентов с первичным синдромом Шегрена.Анналы ревматических болезней 71: A81.

Домашняя страница Общества антител

23 июля 2021 года корпорация Incyte объявила, что Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) выпустило письмо с полным ответом на заявку на получение лицензии на биологические препараты (BLA) для ретифанлимаба (ранее INCMGA00012, MGA012) для лечения взрослых пациентов с местнораспространенным или метастатическим плоскоклеточным раком анального канала (SCAC), которые прогрессировали или не переносят химиотерапию на основе платины.Ретифанлимабу, который представляет собой гуманизированное, стабилизированное шарниром моноклональное антитело IgG4κ, нацеленное на белок 1 запрограммированной гибели клеток (PD-1), было присвоено звание FDA Fast Track и Orphan Drug для лечения рака анального канала.

Представление BLA было основано на данных фазы 2 исследования POD1UM-202 (NCT03597295 ), оценивающего ретифанлимаб у ранее леченных пациентов с местнораспространенным или метастатическим SCAC, которые прогрессировали или не соответствовали критериям или не переносили химиотерапию на основе платины. . Частота объективного ответа составила 13,8% (95% доверительный интервал [Cl]: 7,6, 22,5) на основании подтвержденных ответов опухоли независимым центральным рентгенографическим обзором. Двенадцать пациентов (12,8%) имели частичный ответ, 1 пациент (1,1%) имел полный ответ и 33 (35,1%) имели стабильное заболевание. 24 июня 2021 года Консультативный комитет FDA по онкологическим препаратам 13 голосами против 4 проголосовал за отсрочку утверждения ретифанлимаба Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов. В письме FDA указано, что заявка не может быть одобрена в ее нынешнем виде и необходимы дополнительные данные, чтобы продемонстрировать клиническую пользу ретифанлимаба для лечения пациентов с запущенным или метастатическим SCAC.

В дополнение к SCAC, ретифанлимаб в настоящее время оценивается как монотерапия для пациентов с раком эндометрия с высокой микросателлитной нестабильностью и карциномой из клеток Меркеля; и в сочетании с химиотерапией на основе платины для пациентов с немелкоклеточным раком легкого. Incyte имеет эксклюзивное соглашение о сотрудничестве и лицензионное соглашение с MacroGenics, Inc. о глобальных правах на ретифанлимаб, а также соглашение о сотрудничестве и лицензионное соглашение с Zai Lab для разработки и коммерциализации ретифанлимаба в Большом Китае.

Нужна помощь в том, чтобы быть в курсе разрешений в США и ЕС?

Общество антител ведет полную таблицу одобренных терапевтических препаратов с моноклональными антителами и тех, которые включены в нормативный обзор в ЕС или США, в разделе веб-ресурсов нашего веб-сайта.

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *