Ифнс проверка по инн: Реестры и проверка контрагентов | ФНС России

Содержание

в каких случаях она понадобится

Выписка ― многостраничный документ, где собраны все данные о компании начиная с полного наименования и заканчивая датой последних изменений, внесенных в ЕГРЮЛ. Во время проверки не нужно изучать каждую букву, смотрите на следующие пункты.

Когда компанию зарегистрировали в ФНС. Считается, что компания не однодневка, если проработала более трех лет. Дату смотрите сразу после наименования компании, в пункте №3 «ГРН и дата внесения в ЕГРЮЛ записи, содержащей указанные сведения».

Где находится компания. В выписке указывают полный адрес, вплоть до номера офиса. При подписании договора уточните у контрагента, действительно ли он находится по этому адресу. Так проверите, дойдут ли ваши письма до адресата.

Когда вносили изменения в устав компании. Так узнаете, последнюю ли версию устава предоставил вам контрагент. Дата — в разделе «Сведения о записях, внесенных в Единый государственный реестр юридических лиц».

Кто вправе подписывать документы от имени компании. Эта информация — в графе «Сведения о лице, имеющем право без доверенности действовать от имени юридического лица». Там указывают ФИО, личный ИНН и дату, когда человек начал работать в должности, а также размер его доли в компании, если она есть.

Аналогичную информацию можно узнать об учредителях, если проверяете ООО, или участниках — если ОАО. В выписке указывают их ФИО, ИНН, размеры долей и номинальные стоимости долей в рублях.

Чем вправе заниматься компания. Налоговики разрешают компаниям заниматься любыми видами деятельности. Но все равно на коды ОКВЭД контрагента нужно обращать внимание.

Если деятельность на бумаге и по факту не совпадают или у компании много разных кодов, не связанных друг с другом, нужно насторожиться. Если налоговики установят, что деятельность контрагента не соответствует кодам ОКВЭД, то могут проверить реальность сделки. Логика такая: купили товар у поставщика без нужного кода ОКВЭД ― наверное, заключили сделку с однодневкой для ухода от налогов. И придется обосновывать, почему выбрали именно этого контрагента.

Какой размер уставного капитала. У большинства компаний уставный капитал — 10 000 ₽. Это минимальная сумма, которая должна быть у ООО для регистрации в налоговой. Если уставной капитал больше, это хороший знак: чем больше сумма, тем больше долгов компания сможет покрыть при банкротстве. То есть вероятность, что вам вернут долг, выше.

Как узнать налоги по ИНН и проверить задолженность и налоговые начисления онлайн

Обязательные платежи

В России действует система налоговых платежей и сборов. Налоговое законодательство обязует каждого гражданина платить в казну часть средств от полученных доходов, а также за владение имуществом:

недвижимостью;
землей;
транспортом.

Налог на доходы физлиц (НДФЛ) платит каждый работающий человек и даже не замечает этого. Всю работу выполняет бухгалтерия предприятия: направляет в ФНС отчеты, перечисляет налоговые взносы.

Но в группу доходов физических лиц согласно ‌Налоговому кодексу‌‌ ‌входит не только зарплата. Это еще и прибыль от акций, облигаций и других ценных бумаг, выигрышей, продажи недвижимости, получения ценных подарков. Об уплате налога с этих доходов необходимо беспокоиться самостоятельно. Если этого не сделать, государство может строго наказать.

За неуплату сбора положен ‌штраф‌‌ ‌— 20% от непогашенной суммы. За каждый день просрочки начисляются ‌пени‌. Налоговики имеют право обратиться в суд и взыскать задолженность, наложив арест на имущество или доход. Если речь идет об уклонении от уплаты в крупном размере, неплательщика могут привлечь к ‌уголовной ответственности‌. Максимальное наказание — три года лишения свободы.

Что такое налоговая задолженность

Ежегодно сотрудники ФНС подсчитывают, какую сумму должен уплатить в бюджет гражданин, и направляют ему уведомление. По почте приходит квитанция, а в личном кабинете электронных сервисов ‌Госуслуги‌‌ ‌и ‌ФНС‌ появляется сообщение.

В уведомлении указывают дату, до которой необходимо перечислить средства в бюджет. Если этого не сделать, через пять дней от срока уплаты формируется налоговая задолженность.

Налоговики закрывают глаза на незначительные просрочки. Погасить задолженность без штрафа и единой копейки пеней можно ‌в течение трех месяцев‌‌ ‌с момента ее появления. Через три месяца ФНС направляет в адрес должника требование об уплате с указанием новой конечной даты. Если не погасить задолженность в течение восьми дней, к должнику применяются штрафные санкции.

К сожалению, нередки случаи, когда у человека нет личного кабинета на сайтах «Госуслуги» или ФНС, а налоговое уведомление теряется на почте и не доходит до адресата. Тогда налогоплательщик не знает о том, что должен государству, и не умышленно становится уклонистом от уплаты сборов. От ответственности незнание не освобождает. Штрафы и пени начисляться все равно будут, что станет неприятным сюрпризом, когда накопится крупная сумма.

Поэтому каждому важно знать, как проверить наличие задолженности. А для этого можно использовать ИНН.

Где можно узнать свой ИНН

ИНН — это идентификатор налогоплательщика, индивидуальный номер, который налоговики присваивают каждому физическому и юридическому лицу. Он используется для контроля налоговых начислений и учета поступлений в бюджет от налогоплательщика.

Физлицам ИНН присваивают один раз и больше не меняют. Раньше это происходило при приеме на работу, при получении наследства, то есть в момент, когда у гражданина возникали налоговые обязательства перед государством. Сегодня — в момент регистрации ребенка в загсе и получения свидетельства о рождении.

Специально обращаться за получением номера в налоговую не нужно. Если вы постоянно живете и работаете в России, он у вас точно есть. Найти данные по ИНН можно на сайте ФНС, для этого достаточно заполнить заявку «‌Узнать ИНН‌».

Как узнать налоги по ИНН для физических лиц

Можно обратиться в отделение налоговой службы в вашем городе.

Предварительно придется записаться на прием, для этого есть сервис‌‌ онлайн-записи‌. После этого в указанный день прийти к специалисту с паспортом.

Если недалеко от вашего дома или работы находится центр «Мои документы», можно пойти туда. С собой нужно взять паспорт, а при посещении заполнить заявление о признании конфиденциальности налоговых сведений.

В центре «Мои документы» вам предложат оформить заявку на получение уведомлений о платежах и задолженностях по электронной почте или SMS. Эта услуга бесплатна, и воспользовавшись ею, в будущем вы будете точно знать, когда и сколько должны платить государству.

Как узнать налоги по ИНН для физлиц удаленно

Если обращаться лично в эти службы нет времени или желания, можно воспользоваться онлайн-сервисами.

Госуслуги‌.‌ Чтобы пользоваться сервисом, нужен личный кабинет и подтвержденная учетная запись. Узнать налоги по ИНН без личного кабинета на Госуслугах не получится. Подтвердить запись можно:

в центре обслуживания пользователей Госуслуг в вашем городе;
в отделениях банков: Сбербанк, ВТБ, Тинькофф, Почта банк;
отправив заявку из личного профиля Госуслуг на получение кода подтверждения личности по почте.

Если учетная запись подтверждена, после авторизации нужно‌‌ заполнить заявку‌‌ ‌и указать ИНН. Информация появится в уведомлениях в личном кабинете. Таким способом можно получить сведения только о своих задолженностях как физлица.

Личный кабинет налогоплательщика‌.‌ Здесь можно проверить долги по ИНН сразу, без заявки. Уведомления от налоговой поступают без сбоев. И если вы что-то должны в бюджет, вам сообщат. Но и для использования этого сервиса нужна регистрация. Получить пароль и доступ в ЛК можно только после визита в налоговую.

Как проверить налоги по ИНН без регистрации

Если у вас нет времени посещать налоговую, а учетную запись на электронных порталах вы пока не зарегистрировали, воспользуйтесь бесплатным сервисом «‌Автоналоги‌». Наш сайт поможет вам узнать налоги по ИНН без регистрации и оплатить задолженность безопасно онлайн.

Для этого введите в форму справа ваш ИНН и укажите электронный адрес. Через некоторое время на указанную почту поступит уведомление о существующих задолженностях. Вы можете погасить их тут же, без комиссии и переплат.

Как проверить налоги ИП по ИНН

Индивидуальные предприниматели не могут пользоваться своей учетной записью на портале Госуслуг для проверки налоговых задолженностей. Для этого ИП должен авторизоваться как физическое лицо, то есть нужно иметь зарегистрированную и подтвержденную учетную запись.

При наличии‌‌ личного кабинета‌‌ ‌ИП на сайте ФНС сведения можно посмотреть там.

Как узнать налоги по ИНН для другого физического лица

Если вам нужно проверить налоговую задолженность ребенка или пожилого родителя, сделать это с помощью официальных сервисов «Госуслуги» и «Личный кабинет налогоплательщика» не получится. Они не предоставляют информацию о третьих лицах, даже если вы родитель или официальный опекун.

Личный кабинет придется подключать в обычном режиме:

регистрировать и подтверждать запись на «Госуслугах» для ребенка старше 14 лет, если у него уже есть паспорт и СНИЛС;
регистрировать в налоговой по месту жительства «Личный кабинет налогоплательщика».

С помощью ‌нашего сервиса‌‌ ‌вы можете получить эту информацию без регистрации и посещения налоговой службы. Для этого достаточно ввести ИНН человека, о котором нужны сведения, и ваш электронный адрес. Вы также можете погасить долг: с 2016 года платить налоги можно не только за себя, но и за третьих лиц.

10 сервисов для проверки контрагентов по ИНН: бесплатные и платные

Сервисы для проверки контрагентов помогут предпринимателю избежать рисков. Ненадежный партнер может легко сорвать сроки, бездумно распределить бюджет, «исчезнуть» после внесения предоплаты. Минимум, чем вы отделаетесь – разово потерянные деньги и потраченные нервы.

В статье мы расскажем, зачем проверять партнеров, и познакомим вас с инструментами, благодаря которым получить хорошую подсказку получится в несколько кликов.

Автоматическое продвижение в Instagram без блоков

Рекомендуем: Jesica – приложение для продвижения в Instagram (от создателей Instaplus.me). Установите Jesica на Android-телефон или компьютер и приложение будет ставить лайки, подписываться и отписываться, как будто это делаете вы сами:

Без блоков. Действуют лимиты, как будто вы делаете это всё вручную.
Безопасно. Не нужно вводить пароль от своего аккаунта.
Высокая скорость. Вы можете поставить до 1000 лайков и 500 подписок в день.

Попробовать 5 дней бесплатно >> Реклама

Читайте также: Как открыть бизнес с нуля

Зачем проверять партнеров на надёжность

Для начала разберемся в причинах и ответим на вопрос, зачем проверять контрагентов. Делать это нужно, чтобы:

Убедиться, что партнер сдержит слово и не подведет вас

Информация о судебных разбирательствах, в которых участвовала любая компания, находится в открытом доступе. Посмотрите, какие иски уже предъявлены новому партнеру, и вы не повторите ошибок других заказчиков.

Обратите внимание: если сумма, которую потенциальный партнер требует у других компаний через суд, подозрительно большая, +/- равна или превышает его среднюю годовую прибыль, есть вероятность, что он изначально намерен перевернуть условия договора с ног на голову и хорошенько на этом нажиться.

Все зависит от того, насколько ему выгодно сотрудничать с вами постоянно и в чем специфика бизнеса такого партнера.

Быть уверенным в серьезном отношении партнера к долговым обязательствам и условиям

Сервисы для проверки контрагентов помогут определить финансовое положение организации и оценить способность довести работу до конца.

Если контрагент берет у других деньги, но не умеет с ними обращаться, он влезет в долги и потянет за собой вас. Помимо дополнительных затрат безответственное поведение партнера повлечет для вас потерю деловой репутации. Проверяйте наличие задолженностей и смотрите судебные разбирательства.

Кроме того:

Если прибыль компании подозрительно низкая или уходит в «минус», велика вероятность, что у вас возьмут предоплату и исчезнут.
Если у компании много имущества, но нет денег, расценивайте это как «красный сигнал». Задумайтесь, откуда могло взяться такое имущество.

Сохранить репутацию перед налоговой и избежать дополнительных взносов

Если вам «посчастливилось» связаться с ИП или компанией, которая не уплачивает налоги или скрывает от ФНС настоящий род своей деятельности, налоговики заподозрят в этом и вас. Начнется проверка, появится лишняя «бумажная» работа для бухгалтера.

В качестве «бонуса» придётся доказывать, что сделка реальна и исполнителем выступал именно тот человек, чьи данные указаны в договоре/контракте (подробности – в ст. 54.1 НК РФ). В противном случае вас обвинят в намерении сократить расходы на налоги, придется платить штраф.

Удостовериться, что ваш партнер не связан с компаниями-мошенниками

Узнайте, не входит ли контрагент в состав компании с плохой репутацией и, напротив, не играет ли он роли учредителя для нечистых на руку организаций.

С помощью инструментов, описанных ниже, можно получить полную информацию об организациях, с которыми связан партнер. Если «закроют» их, вас обвинят в соучастии.

Фирмы-однодневки найдут способ выйти сухими из воды и откроют очередное ООО, а вы потеряете имя и сведете на «нет» свои усилия по развитию бренда.

10 сервисов для проверки контрагентов: обзор, сравнение, цены

Сервисы, которые мы собрали в статье, покажут достоверную и точную информацию о ваших партнерах. Помогут в этом индикаторы риска, рейтинги и инфографики. Так, вы сможете принять верное решение о сотрудничестве быстро и просто.

Однако помните: финальный вывод о партнере остается за вами – живым человеком, понимающим, чем может и чем не может обернуться конкретная сделка для бизнеса с учетом обозначенных рисков.

Если сомневаетесь, а решение нужно принять быстро и точно, привлеките эксперта для разъяснения спорных моментов: юрист составит заключение о надежности конкретной компании и объяснит вам, что к чему.

Поехали! 😉

«Прозрачный бизнес» от ФНС

«Прозрачный бизнес» – это бесплатный сервис для проверки контрагентов по названию и адресу компании, ФИО и ИНН. Подходит для ИП и организаций, бухгалтеров, руководителей, сотрудников отдела продаж.

Особенности сервиса:

Цель – собрать всю информацию о налогоплательщиках в общем месте.
Источники – не только ЕГРЮЛ и ЕГРИП, но и реестр дисквалифицированных лиц, единый реестр субъектов малого и среднего предпринимательства (МСП).
Работает у ФНС в тестовом режиме.
Позволяет узнать точное название компании, ИНН и ОГРН, размер уставного капитала, дату и место регистрации и т. д.
Можно получить выписку из ЕГРИП/ЕГРЮЛ онлайн. Выписка представляет собой pdf-файл с таблицами, в которых содержится актуальная информация о предприятиях (сведения обновляются ежедневно).

Плюсы:

прост в использовании;
предоставляет актуальную и достоверную информацию из первоисточников;
не требует регистрации.

Минусы:

не вся информация добавлена, поскольку сервис новый;
нет данных о зарубежных контрагентах;
не подходит тем, кому информация о контрагенте нужна срочно и в полном объеме, а также тем, кто нацелен получить готовое заключение с оценкой рисков;
не подходит крупным игрокам, сотрудничающим с зарубежными компаниями.

Это интересно: 20 идей бизнеса в маленьком городе

Сервис для проверки юрлиц и ИП от Сбербанка

Сервис проверки контрагентов от Сбербанка позволяет быстро оценить риски сотрудничества с организацией или ИП по десяткам параметров. Подходит ООО, крупным игрокам, сотрудникам фирм с развитой инфраструктурой, бухгалтерам и всем тем, кто стремится оптимизировать рабочее время. Платный, но часть информации находится в свободном доступе.

Особенности сервиса:

Выделяет разными цветами индикатора-«светофора» предприятия, которым можно и нельзя доверять.
Проводит мониторинг контрагентов и высылает уведомления о важных изменениях в делах выбранных компаний на e-mail пользователя.
Дает возможность получить расширенную информацию из ФНС с электронной подписью.
Предоставляет сведения о финансовом состоянии, блокировках счёта, судебных разбирательствах, дочерних и связанных компаниях.
С помощью инструмента «Финансы» позволяет оценить риски банкротства.
Позволяет получить данные по госконтрактам компании.
Оценивает риск выездной проверки налоговой.

Плюсы:

полнота, достоверность и точность информации;
возможность подключения уведомлений;
автоматическая оценка надежности контрагента без необходимости анализировать информацию самостоятельно.

Минусы:

нужна авторизация;
нет данных о зарубежных компаниях.

Стоимость: 720 ₽ в месяц с учетом НДС. Бесплатно можно узнать основную информацию о компании (юридический адрес, размер уставного капитала, дату регистрации, основные виды деятельности), получить общую оценку надежности, выписку из ФНС без электронной подписи.

СБИС

СБИС – это платный онлайн-сервис для проверки контрагентов по названию компании, ФИО и ИНН руководителя. Подходит крупным организациям, которые хотят свести к минимуму риски сотрудничества с контрагентами, а также амбициозным новичкам, бухгалтерам, руководителям, бизнес-брокерам.

Особенности сервиса:

Разработчик сервиса – поставщик различных услуг для бизнеса, в том числе комплектов оборудования и отраслевых решений. Среди них электронный обмен документами (ЭДО), факторинг, маркировка товаров, установка и обслуживание онлайн-касс и многое другое.
Благодаря API проверка контрагентов происходит автоматически: перед внесением оплаты или подтверждением отгрузки товара достаточно ввести ИНН партнера, чтобы узнать индекс его надежности.
С помощью СБИС легко не только оценить, но и подобрать контрагентов с хорошей репутацией. Информация об имуществе в лизинге, финансовом состоянии, судебных делах, участии в торгах и даже стоимости бизнеса – все это доступно в рамках сервиса.
Доступно 3 тарифа – «базовые сведения», «расширенные сведения» и «работа через API». Они отличаются набором услуг и стоимостью годового обслуживания.

Плюсы:

полнота и достоверность информации;
возможность оптимизировать рабочее время, узнать все о контрагентах, конкурентах и провести комплексный анализ собственной отчетности;
бесплатный тестовый период.

Минусы:

тариф можно подключить не менее чем на 1 год;
создание аккаунта оплачивается отдельно;
нет информации о зарубежных компаниях.

Стоимость создания аккаунта: 500 ₽. Тарифы от 6 000 до 50 000 ₽ в год. При подключении услуг на 2 года предоставляется скидка 5 %, на 3 года – 10 %.

Контур.Фокус

Контур.Фокус — это платный сервис для проверки партнёров по ИНН или фамилии руководителя, названию организации или адресу регистрации. Подходит крупным компаниям, сотрудничающим с контрагентами по России, СНГ, Украине, Европе и Китаю.

Особенности сервиса:

Лаконичный дизайн и понятный интерфейс.
Есть API, который интегрирует данные о партнерах с 1С, SAP и т. д.
Есть инструмент «Призма», благодаря которому можно оценить контрагента на признаки обналичивания для банков и финансовых организаций, а также настроить оценку надежности по 60 критериям, важных для вас.
Не подходит новичкам – только потому, что для них есть более выгодные решения без потери качества результата.

Плюсы:

полнота, актуальность и точность информации;
показывает «лицо» контрагента в цифрах и понятных инфографиках в общем окне;
сервис держит пользователей в курсе новостей о партнерах, в том числе зарубежных;
подходит для подбора партнеров и поставщиков;
есть разовые и постоянные тарифы;
бесплатный тестовый период (демоверсия).

Минусы:

высокая относительно других платных сервисов стоимость обслуживания.

Стоимость: от 22 000 ₽ в год, 1 300 ₽ за разовую проверку.

Статья в тему: Как участвовать в тендерах и выигрывать

Seldon.Basis

Seldon.Basis – платный сервис для проверки контрагентов по ИНН, ОГРН, КПП, ОКПО, названию, адресу, ФИО руководителя, телефону, адресу электронной почты, домену. Идеально подходит крупным игрокам с международными связями.

Особенности сервиса:

Позволяет узнать, стоит ли сотрудничать с организацией или ИП, в 1 клик.
Данные из всех существующих источников регулярно обновляются, информация представляется в едином окне с понятной инфографикой.
В базе более 24 млн организаций.
«Лента событий» позволяет оперативно отслеживать события в жизни выбранных организаций.
С инструментом «Индекс благонадежности» легко оценить стабильность компании по методике ФНС и увидеть, какие претензии могут предъявить вам другие компании.
«Индекс финансовой устойчивости» поможет оценить способность выполнить обязательства.
Инструмент «Арбитражные дела и исполнительные производства» предоставит данные о судебных разбирательствах и их исходах, а также поможет узнать, прибегал ли партнер к помощи приставов.
Для любой организации можно построить дерево связей с другими компаниями.

Плюсы:

удобство использования;
наглядность представления информации;
полный и точный анализ партнёров из 168 стран мира;
API;
мобильная версия;
бесплатная демо-версия на сутки;
формирование готового заключения о благонадежности контрагента.

Минусы:

высокая стоимость.

Стоимость: 990 ₽ – за сутки, 2 990 ₽ – за неделю, 7 990 ₽ – за 31 день, 69 000 ₽ – за 365 дней.

СПАРК

СПАРК – платный сервис для проверки компаний по названию, адресу, телефону, сайту, домену, ФИО руководителя, совладельца, доверительного управляющего, ИНН, ОГРН, ОКПО или БИК. Подходит крупным игрокам и развивающимся предприятиям.

Особенности сервиса:

Позволяет найти данные контрагентов с 220 стран мира и провести полный анализ расчетных коэффициентов, финансовых показателей.
Сервис заранее сообщает о возможном банкротстве компании-партнера и предоставляет отчеты из суда.
В информационной базе более 24 млн документов.
Показывает информацию в виде текста, графиков и таблиц.
Позволяет провести проверку партнера по регламентированным в вашей компании критериям.
Отслеживает изменения в деловой жизни выбранных ИП и компаний.
Позволяет посмотреть информацию о заключенных контрактах.
Показывает, какая информация о вас находится в открытом доступе для других.
Показывает сообщения о компании из СМИ.

Плюсы:

полнота информации;
удобные выборки и графики;
есть мобильное приложение;
бесплатная проверка своей компании и демо-доступ.

Минусы:

нужна авторизация;
стоимость расширенного тарифа высокая.

Стоимость от 100 ₽ до момента подключения дополнительных услуг.

Casebook

Casebook – это платный сервис для проверки организаций по номеру судебного дела и ИНН. Подходит крупным игрокам, юристам, адвокатам, финансовым компаниям, госструктурам, правовым департаментам, службам безопасности.

Особенности сервиса:

Собирает и предоставляет информацию о судебных разбирательствах, состоявшихся заседаниях, исках и помогает оценить риски сотрудничества с контрагентом.
«Лента событий» позволяет отслеживать изменения о компаниях, судах, персонах.
С Casebook предприниматель всегда будет осведомлен об исковой нагрузке, финансовом состоянии и связанности партнера с другими компаниями сейчас и в прошлом (до 30 узлов).
Помогает оценить продолжительность и исход дела.
Выдает сведения о требованиях кредиторов.
Дает подсказки, позволяющие сократить время на анализ контрагента.

Плюсы:

детализированность информации о судебных разбирательствах компании;
удобные инфографики;
понятный интерфейс;
полезные инструменты;
бесплатное тестирование.

Минусы:

дорого;
только один тариф.

Стоимость 48 000 ₽ в год за одно рабочее место.

Это интересно: 10 лучших конструкторов сайтов

СКРИН

СКРИН – это сервис для проверки юрлиц и ИП по ИНН, ФИО руководителя, ОКПО, ОГРН, ОГРНИП и названию. Подходит ИП, начинающим предпринимателям, компаниям, работающим с контрагентами только по России. Часть информации предоставляется бесплатно, часть – платно.

Особенности сервиса:

Позволяет контролировать сделки, рассчитывать рентабельность, визуализирует связи компании.
Не подходит тем, кому нужна информация об отечественных и зарубежных контрагентах в общем месте.

Плюсы:

полнота информации;
базовый набор предоставляется бесплатно – в том числе краткая справка об участии в арбитражных делах и суммах иска;
позволяет скачать выписку из ЕГРЮЛ с сайта;
доступные цены;
возможность подключить дополнительные услуги для бизнеса.

Минусы:

не рассчитан на поиск информации о контрагентах за пределами России.

Стоимость от 38 000 ₽ в год.

КАРТОТЕКА

КАРТОТЕКА – это платный сервис для проверки контрагентов по ФИО руководителя и адресу компании. Подходит как крупным игрокам, банкам, юридическим и финансовым компаниям, так и ИП, начинающим предпринимателям. Отличный выбор для тех, кто сотрудничает с отечественными и зарубежными контрагентами.

Особенности сервиса:

Предоставляет отчет об отечественных и зарубежных компаниях.
Благодаря инструменту «API поисковой системы» реквизиты контрагентов в рабочих системах пользователей (в т. ч. CRM и 1C) заполняются автоматически. Поисковая система интегрируется с базами данных физлиц и юрлиц, выдавая актуальную информацию. Критерии проверки можно настроить с учетом требований организации.
Инструмент «Выборка по компаниям» помогает найти потенциальных клиентов.
Оценивает риски, отмечает спорные моменты в деятельности компании-партнёра.
Предоставляет справки из Европейского бизнес-реестра.

Плюсы:

комплексная оценка рисков;
подробная информация о контрагентах;
есть API, позволяющий интегрировать сервис с вашей базой данных для ускорения массовой проверки и обновления данных;
можно оплатить желаемую услугу отдельно, без годовой подписки;
минимум информации о контрагенте предоставляется бесплатно;
доступные цены.

Минусы:

для получения полной информации нужна авторизация.

Стоимость от 120 ₽ за справку об одном партнере.

Интегрум

Интегрум – это сервис для проверки компаний по названию организации, ФИО руководителя, ИП или физлица. Подходит компаниям, сотрудничающим с партнерами только по России.

Особенности сервиса:

В базе более 500 млн профилей.
Позволяет оценить благонадежность компании по заданным критериям и избежать рисков.
Проводит мониторинг СМИ, находя публикации о партнерах.
Не подходит тем, кому нужна информация об отечественных и зарубежных контрагентах в общем месте.
Помогает сформировать репутацию в соцсетях: «Интегрум» предоставляет услуги по продвижению бренда, работе с негативом и определению бот-атак.

Плюсы:

точность и полнота информации;
удобный интерфейс;
API;
индексы, отражающие, как идут дела у компании в виде простого и понятного рейтинга;
есть бесплатная демо-версия.

Минусы:

нет информации о зарубежных компаниях.

Стоимость от 5 000 ₽ в месяц.

Читайте также: Госпрограммы и виды помощи для малого бизнеса

Коротко

Сервисы для проверки контрагентов нужны, чтобы оценивать риски перед сотрудничеством с ИП или организацией.
Проверить партнера можно по названию организации, ФИО руководителя, ИП, ИНН, ОГРН, ОГРНИП и многим другим исходным данным.
У каждого сервиса есть свой набор инструментов. Благодаря им проверить партнера можно по подходящим для вашей организации критериям.
Решение о сотрудничестве следует принимать руководствуясь умом, а не только подсказками и наводками сервисов.
Если ситуация остается спорной даже после привлечения сервиса, подключите эксперта, который составит для вас заключение.

Запущен сервис проверки условий на субсидию по ИНН

УФНС России по Владимирской области сообщает, что выплата субсидий субъектам малого и среднего предпринимательства, ведущим деятельность в отраслях, в наибольшей степени пострадавших в условиях ухудшения ситуации в результате распространения новой коронавирусной инфекции, будет производиться, начиная с 18 мая 2020 года.

Обращаем внимание! Для определения размера субсидии необходимо представление получателем субсидии в Пенсионный фонд РФ отчетности по форме «Сведения о застрахованных лицах», утвержденной постановлением Правления Пенсионного фонда РФ от 01.02.2016 № 83п.

Проверить право на получении субсидии можно на официально сайте ФНС России с помощью сервиса «Проверка права на получение субсидии субъектом МСП, ведущим деятельность в пострадавших отраслях» https://service.nalog.ru/subsidy/.

Сервис в автоматическом режиме определяет соответствие ИНН всем необходимым условиям.

Заявление можно заполнить в Личном кабинете юридического лица или индивидуального предпринимателя. Форма доступна в разделе «Жизненные ситуации».

Заявления, сформированные в Личном кабинете юридического лица или индивидуального предпринимателя, а так же по ТКС отправляется в электронном виде.

Также Заявление можно заполнить на сайте ФНС России. В этом случае после формирования заявления, распечатайте его для отправки почтовым отправлением.

Заявление на получение субсидии за апрель 2020 года следует направить с 1 мая до 1 июня 2020 года, за май 2020 года – с 1 июня до 1 июля 2020 года.

При возникновении дополнительных вопросов звоните на телефон горячей линии: 8(920) 916-65-58.

Дата публикации: 06.05.2020 г.

← Правила предоставления субсидии для субъектов МСП, ведущих деятельность в отраслях, наиболее пострадавших от пандемииИнформационный сервис Правительства РФ →

Свежие новости:

в ФНС приостановлены проверки онлайн-касс до конца 2020 года — modulkassa.ru

Из-за коронавируса ФНС отменила проверки онлайн-касс до 31 декабря 2020 года. Это установлено в постановлениях правительства № 409, № 438 и в постановлении ФНС № ЕД-7-2/[email protected]

Приостановление проверок не освобождает предпринимателей от ответственности. Срок давности привлечения к административной ответственности за нарушение 54 ФЗ, закона о применении контрольно-кассовой техники — один год со дня совершения нарушения. За работу без онлайн-кассы или за работу с нарушениями, налоговая выписывает штраф: минимум 10 000 ₽ для ИП и минимум 30 000 ₽ для компаний.

Как налоговая узнает о торговле без онлайн-кассы

До конца 2020 года ФНС не будет проводить выездные проверки и контрольные закупки. Но если покупатель сообщит о том, что торговая точка работает без онлайн-кассы — после снятия моратория на проверки предприниматель понесет административную ответственность.

Налоговая выпустила приложение «Проверка кассового чека». Покупатель сканирует QR-код с чека или вводит реквизиты вручную. С помощью программы можно проверить, легален ли чек, и отправить жалобу в ФНС.

Как работать по 54 ФЗ

По закону предприниматель может выбрать любую модель онлайн-кассы из реестра налоговой. Главное — передавать информацию обо всех продажах в ФНС через оператора фискальных данных и выдавать покупателям бумажный или отправлять электронный чек.

МодульКасса работает по 54 ФЗ и включена в Госреестр контрольно-кассовой техники, использование которой разрешено в России. Мобильная МодульКасса называется там MSPOS-K, МодульКасса с эквайрингом — ПТК MSPOS-Е-Ф.

В мобильную МодульКассу встроены принтер чеков и сканер штрихкодов, который помогает быстро оформить товарную накладную и считывает коды маркировки. Устройство занимает мало места и весит всего 600 грамм. МодульКасса работает без подзарядки до 48 часов. С ней официантам удобно обслуживаться столики, а курьерам — принимать оплату. У МодульКассы отзывчивый сенсорный экран, который реагирует на касания за секунду и распознает даже руки в перчатках.

В любой момент к МодульКассе можно подключить терминал для эквайринга, чтобы принимать к оплате карты. В мобильную МодульКассу с эквайрингом уже встроен терминал для безналичной оплаты.

Перед тем как начать работать с новым аппаратом, его надо зарегистрировать в налоговой и заключить договор с оператором фискальных данных. С услугой «Касса под ключ» мы готовим онлайн-кассу к работе за вас, настраиваем ее и обучаем сотрудников.

Мы постоянно улучшаем кассу, чтобы сделать ее быстрее и удобнее. Поэтому цена и количество моделей могут меняться. Актуальная информация — на нашем сайте.

Напишите в чат нашему консультанту на сайте. Он поможет выбрать подходящую модель фискального накопителя, расскажет, как поменять ФН и оформит доставку. Курьер привезет ФН за один-два дня по Москве и до семи рабочих дней в регионы.

Купить онлайн-кассу

проверки ккт в 2020 году фнс отменила проверки онлайн касс проверки ккт приостановлены купить кассовый аппарат для ип недорого с регистрацией в москве будут ли обязательны кассовые аппараты для ип в 2020 году штраф за отсутствие кассового аппарата у ооо в 2020 году нужна ли касса для ооо на усн в 2020 году онлайн кассы для ип на енвд в 2020 году закон отсрочка от онлайн касс для ип на усн последние новости кассовый аппарат для ооо на усн закон до 2021 года енвд и онлайн касса при розничной торговле с 2020 года онлайн касса для усн в 2020 году изменения свежие новости онлайн касса для кафе с алкоголем с выпуском предварительного чека обязательно ли применение кассового аппарата при енвд в 2020 году онлайн кассы для ооо на енвд отсрочка до 2021 года операторы фискальных данных в россии список фнс реестр операторов фискальных данных фнс россии сайт фнс россии коронавирус меры поддержки бизнеса фнс россии официальный сайт маркировка товаров фнс россии коронавирус меры поддержки бизнеса оператор фискальных данных список фнс реестр операторов фискальных данных фнс фнс проверка маркировки товаров из натурального меха фнс меры поддержки бизнеса коронавирус по инн маркировка товара согласно законодательства рф нарушение санитарного режима коап рф коап рф маркировка товара нарушение санитарно эпидемиологического режима коап нарушение санитарного режима коап о применении контрольно кассовой техники в тсж эксплуатация контрольно кассовой техники ккт эксплуатация контрольно кассовой техники и расчеты с покупателями ооо ремонт и обслуживание контрольно кассовой техники требования предъявляемые к контрольно кассовой технике какие допущены нарушения санитарно противоэпидемического режима нарушения санитарно противоэпидемического режима постановление правительства рф о коронавирусе форс мажор честный знак рф официальный сайт как зарегистрироваться честный знак рф официальный сайт личный кабинет как зарегистрироваться на сайте честный знак рф https честный знак рф business projects medicines упрощение применения ккт жкх онлайн касса для ооо на енвд дата применения необходимость применения ккм для ооо новости применения онлайн касс онлайн касса в кинотеатре установка регистрация отчетность закон о применении кассовых аппаратов в жкх новости о применении ккт какой бизнес в россии пострадает от коронавируса поэтапное снятие ограничений в россии проект роспотребнадзора является ли коронавирус форс мажором в россии признан ли коронавирус форс мажором в россии считается ли пандемия форс мажором в россии является ли карантин форс мажором в россии признается ли коронавирус форс мажором в россии признана ли пандемия форс мажором в россии нарушение санитарных требований к организациям торговли нарушение требований к маркировке товаров приказ об организации тестирования работников на коронавирус нужна ли онлайн касса образовательной организации нужна ли онлайн касса строительной организации нужен ли кассовый аппарат некоммерческой организации кассовый аппарат для некоммерческой организации требования к кассе организации 2020 касса в строительной организации как узнать офд организации некоммерческие организации онлайн кассы требования к кассе организации какие организации офд правила эксплуатации ккт при осуществлении денежных расчетов с покупателями правила эксплуатации ккм при осуществлении денежных расчетов с населением типовые правила эксплуатации ккм при осуществлении денежных расчетов терминал для расчетов пластиковыми картами нарушение санитарных правил в период режима чс нарушение санитарных правил во время карантина маркировка обуви 2020 порядок проведения для розницы маркировка остатков обуви 2020 порядок проведения порядок проведения тестирования работников на коронавирус введение кассовых аппаратов с 2020 года кассовый аппарат для безналичного расчета купить кассовый аппарат для безналичного расчета цена интернет магазин способ расчета без ккм стоимость терминала для безналичного расчета сколько стоит терминал безналичного расчета кассовый аппарат для безналичного расчета терминал для расчета банковскими картами терминал для безналичного расчета как отправить фискальные данные в офд отправить данные в офд вручную отправить документы в офд мобильный терминал для оплаты банковскими картами для физических лиц мобильный мини терминал для физических лиц мобильный терминал для физических лиц

ИНН Прозрачный бизнес ЕГРЮЛ инструкция ФССП через Госуслуги МФЦ Налоговая инспекция

Проверка бизнес-партнера в Новочебоксарске позволяет установить, что субъект хозяйственной деятельности, индивидуальный предприниматель являются достаточно благонадежными. Это значит, что сделка будет признана законной и юридически чистой. Существует несколько способов для бесплатной проверки партнёра по бизнесу по ИНН. База данных, как правило, актуализируется ежедневно.

Отправляя запрос, заявитель может быть уверен, что получает актуальные сведения. Главное — удостовериться, что ИНН, указанный гражданином, не является случайным набором цифр. Проверить ИНН не сложно — для этого функционирует бесплатный сервис. Всего за несколько секунд он сравнит данные с базой данных и даст ответ. Здесь собраны данные как касательно физических лиц, так и компаний.

Проверить контрагента на портале налоговой по ИНН

Результатом будет выписка из соответствующего реестра или справка об отсутствии проверяемой информации, которая предоставлена в электронном формате и подписана электронной цифровой подписью.

Перейти на сайт ФНС.

Проверить контрагента через сервис «Прозрачный бизнес»

Интернет-ресурс «Прозрачный бизнес» – универсальный портал, предоставляющий сведения о деловых партнерах, в том числе зарегистрированных в Новочебоксарске. Данные заявителям предоставляются бесплатно, а непосредственно проверка занимает всего несколько секунд.

Актуальная выписка подтверждает, что предприниматель либо фирма на момент выдачи не сняты с учёта в Налоговой службе. Также воспользовавшись ею возможно проверить реквизиты, указанные в договорах и других документах.

Начать проверку в базе «Прозрачный бизнес».

Куда обращаться

База данных ЕГРЮЛ, ЕГРИП формируется и проверяется Налоговой инспекцией Российской Федерации.

На портале Госуслуги или в МФЦ в Новочебоксарске проверить контрагента возможности нет.

ИФНС России по городу Новочебоксарску

Куда обратиться

Название учреждения	ИФНС России по городу Новочебоксарску
В каком районе

Когда работает	Инспекция понедельник-четверг: с 09:00 до 18:00, перерыв: с 13:00 до 13:45 пятница: с 09:00 до 16:45, перерыв: с 13:00 до 13:45 Операционный зал понедельник, среда: с 09:00 до 18:00 вторник, четверг: с 09:00 до 20:00 пятница: с 09:00 до 16:45 Операционный зал суббота: с 10:00 до 15:00
Сайт организации	https://www. nalog.ru
Регион	Чувашия (республика)
Адрес учреждения	Республика Чувашия, Новочебоксарск, Солнечная улица, 1
Телефоны	8 (800) 222-22-22 +7 (8352) 78-36-25 (приемная) +7 (8352) 74-51-11 (телефон доверия) +7 (8352) 78-31-38 (горячая линия по ККТ) +7 (8352) 78-54-76 (факс)
Почта

Адрес на карте

Авторский коллектив сайта, юристы: Ураев Константин, Лисицына Мария, Бондаренко Елена, Барнева Ирина, Иванов Владимир.

Дифференциальные ответы на подтипы IFN-α в человеческих Т-клетках и дендритных клетках

Реферат

IFN типа I (IFN-αβ) представляют собой семейство цитокинов, которые обладают важными противовирусными и иммунорегуляторными свойствами и успешно используются при лечении широкого ряда заболеваний. Существует 12 функциональных подтипов человеческого IFN-α и один подтип IFN-β, которые передают сигнал через IFN-αβR на общей клеточной поверхности. На сегодняшний день практически отсутствует информация о специфичности ответов IFN-α в иммунных клетках.В этом исследовании были проанализированы передача сигналов киназы Janus / STAT и транскрипционные ответы на выбранные подтипы IFN-α в человеческих Т-клетках и дендритных клетках. Обнаружены доказательства специфичности IFN-α к подтипу и типу клеток. Также наблюдались различия между кинетикой экспрессии IFN-стимулированных генов (ISG) и потребностями отдельных ISG в дополнительных сигнальных путях. В частности, IFN-γ-индуцируемый белок-10 (IP-10), ключевой хемокин при воспалительных заболеваниях Th2-типа, регулировался дифференцированно.В дендритных клетках он сильно индуцировался IFN-α2 и IFN-α21, но гораздо менее эффективно IFN-α1. Эти подтипы Т-лимфоцитов лишь незначительно индуцировали его. В отличие от других проанализированных ISG, оптимальная индукция IP-10 зависела от активации киназы (ей) p38. Наблюдаемые вариации (дифференциалы, связанные с подтипом, типом клеток и ISG) позволяют лучше понять сложность и пластичность ответа IFN-αβ. Кроме того, новое наблюдение о том, что IFN-α1 плохо индуцирует IP-10, потенциально имеет клиническое значение, поскольку этот подтип может быть более полезным в случаях, когда Th2-опосредованные побочные эффекты (например,g., обострение аутоиммунных заболеваний) нежелательны.

IFN типа I (IFN-αβ) представляют собой семейство гомологичных цитокинов. Первоначально они были идентифицированы из-за их мощной противовирусной активности, но также было показано, что они обладают как антипролиферативной, так и широким спектром иммунорегуляторной активности (1, 2). IFN-αβ являются наиболее часто используемыми цитокинами для лечения широкого спектра заболеваний, включая рассеянный склероз, вирусный гепатит и меланому (3, 4).

IFN-αβ сильно индуцируются в ответ на вирусную инфекцию, но также могут продуцироваться при воздействии невирусных патогенов, включая грамотрицательные бактерии и простейшие (например,g., Escherichia coli , Leishmania major ) (5, 6). IFN-αβ является частью врожденного цитокинового ответа. Они быстро продуцируются при инфицировании и запускают ранние неспецифические защитные механизмы, включая индукцию генов, которые ингибируют репликацию вирусов и активацию цитотоксичности NK-клеток. IFN-αβ также обеспечивает важную связь между врожденным и адаптивным иммунитетом, формируя многие компоненты Ag-специфического иммунного ответа. Например, IFN-αβ способствует ответам CTL, увеличивает продукцию Ab и способствует развитию наивных Th-клеток в направлении фенотипа Th2.Считается, что эти поздние иммунорегуляторные эффекты IFN-αβ опосредуются скорее косвенными, чем прямыми действиями, и, вероятно, будет задействована модуляция экспрессии цитокинов / цитокиновых рецепторов и функции дендритных клеток (DC) ⁵ (7, 8, 9) .

У человека имеется несколько генов IFN-α и один ген IFN-β (2, 10, 11). Транскрибируется не менее 13 генов IFN-α. Кодирующие последовательности этих генов расходятся до 8%, давая начало 12 различным функциональным белкам подтипов (IFN-α1 и -α13 идентичны). Все подтипы IFN-α и IFN-β сходны по структуре и имеют общий рецептор клеточной поверхности, состоящий из двух известных субъединиц, IFNAR1 и IFNAR2 (12, 13, 14). Как правило, связывание IFN-αβ с рецепторным комплексом инициирует сигнальный каскад посредством активации тирозинкиназ Tyk2 и Janus-киназы (Jak) 1 и, следовательно, фосфорилирования и димеризации STAT1 и STAT2 (15). Активированные димеры STAT отделяются от рецепторного комплекса и перемещаются в ядро, где они регулируют экспрессию IFN-стимулированных генов (ISG) (5).В ответ на IFN-αβ образуется ряд комплексов факторов транскрипции. Фактор ISG 3 (ISGF3) состоит из STAT1, STAT2 и регуляторного фактора p48 / ISGF3γ / IFN (IRF) 9 и связывает IFN-стимулированные ответные элементы (ISRE), присутствующие во многих промоторах ISG. Гетеродимеры STAT1-2 и гомодимеры STAT1 управляют экспрессией подмножества ISG через элементы γ-активированной последовательности (GAS). Другие члены семейства STAT участвуют в передаче сигналов IFN-αβ. Например, было обнаружено, что IFN-αβ активирует STAT3 в большинстве типов клеток, STAT4 и STAT5 в Т-клетках и NK-клетках (16, 17, 18) и STAT6 в B-клетках (19). Кроме того, задействованы пути, опосредованные фосфатидилинозитол-3 (PI3) киназой (20, 21), митоген-активированным протеином (MAP) p38 (22, 23, 24) и внеклеточной киназой 1/2 (25), регулируемой внеклеточными сигналами. в передаче сигналов IFN-αβ, но их точные роли еще предстоит установить.

Существование множества различных подтипов IFN-α поднимает вопрос об их биологической значимости. Известно, что разные вирусы вызывают разные паттерны экспрессии подтипа IFN-α (26, 27) и что продукция отдельных подтипов регулируется разными IRF (28, 29, 30).Сообщалось об отчетливой относительной активности отдельных подтипов in vitro и in vivo (31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38). Однако все подтипы IFN-α, вероятно, обладают способностью проявлять классические активности IFN-α (например, противовирусные эффекты), как и следовало ожидать, учитывая, что они действуют через общий рецептор. Однако есть существенные биохимические доказательства того, что отдельные подтипы IFN связываются с разными сайтами IFN-αβR и имеют разную аффинность связывания, что приводит к образованию различных сигнальных комплексов (39, 40, 41, 42, 43, 44, 45), которые, априори, можно было ожидать по-разному рекрутировать нижестоящие сигнальные пути. Соответственно, разумно предположить следующее: 1) наложенные на широко перекрывающиеся классические функции, такие специфичные для подтипа сигнальные комплексы могут быть способны по-разному активировать вспомогательные ответы, свойственные этому подтипу; 2) любые такие различия, вероятно, зависят от клеточного фона и будут проявляться различиями в профилях экспрессии генов; и 3) принимая во внимание важность IFN-αβ для иммунной функции, различия подтипов IFN-α будут наиболее очевидными и соответствующим образом проанализированы в первичных клетках иммунной системы.

В этом исследовании изучали передачу сигналов через пути Jak / STAT и профили экспрессии генов для человеческих Т-клеток и ДК, обработанных различными подтипами IFN-α. Помимо количественных различий между IFN-α1, -α2 и -α21 в их способности активировать STAT1–5 и ISG, были обнаружены доказательства специфичности IFN по подтипу и типу клеток, а также дифференциальные требования для дополнительных путей. Ярким примером является индукция IFN-γ-индуцируемого белка-10 (IP-10), хемокина, который играет важную роль в привлечении Th2-клеток и NK-клеток к участкам воспаления. Он сильно индуцировался IFN-α2 и -α21, но в гораздо меньшей степени IFN-α1 в DC. Напротив, он плохо индуцировался всеми этими подтипами IFN-α в Т-клетках. Оптимальная индукция IP-10, в отличие от других проанализированных классических ISG, зависела от активации киназы (ей) p38 MAP. Индуцибельная NO-синтаза (iNOS) и IL-12Rβ2 также дифференцированно индуцировались в DC и T-клетках. Существенные различия в кинетике накопления мРНК для разных подмножеств ISG добавляют сложности к ответу IFN-α.

Материалы и методы

Культура клеток и цитокин

PBMC выделяли из лейкоцитов центрифугированием плотности на Lymphoprep (Nycomed, Осло, Норвегия). Для получения Т-клеток PBMC активировали с помощью PHA (Murex, Kent, UK) и поддерживали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированной FCS и rIL-2 человека (20 нг / мл) в течение 1 недели. Перед обработкой IFN-α бласты Т-клеток промывали и затем культивировали в течение 48 часов в отсутствие rIL-2. Для генерации DC моноциты выделяли из PBMC путем сортировки MACS с использованием анти-CD14-конъюгированных магнитных микрошариков (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия) и культивировали в течение 6 дней в RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированной FCS, 50 нг / мл GM- CSF и 50 нг / мл IL-4 (оба от R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота). Использовали следующие бактериальные подтипы rIFN-α: IFN-α1 (IFN-αD; удельная активность 5,0 × 10 ⁷ Ед / мг), IFN-α21 (IFN-αF; удельная активность 6,3 × 10 ⁸ Ед. / мг), как от PBL Biomedical Laboratories (Нью-Брансуик, штат Нью-Джерси), так и IFN-α2 (IFN-α2a; роферон; удельная активность, 5.4 × 10 ⁸ Ед / мг) от Roche (Базель, Швейцария). Все цитокины не содержали эндотоксина, как определено анализом лизата амебоцитов Limulus (т.е. <0,1 ед. Эндотоксина / мл). Соединения SB203580 и LY294002 были получены от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури).

Лизис клеток, иммунопреципитация, аффинная очистка и вестерн-блоттинг

Клетки обрабатывали в течение 20 минут подтипами IFN-α, а затем лизировали в 0,5% Nonidet P-40, 50 мМ Трис (pH 8. 0), 10% глицерин, 150 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 1 мМ EDTA, 1 мМ ортованадат натрия, 1 мМ PMSF, 100 Ед / мл апротинина и 1 мкг / мл лейпептина. Лизаты очищали центрифугированием и использовали либо непосредственно для SDS-PAGE, либо для иммунопреципитации с помощью анти-STAT2 Abs (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) и протеина A-сефарозы. Аффинную очистку ДНК-связывающих белков проводили, как описано ранее (46), с использованием биотинилированного ДНК-олигонуклеотида, содержащего консенсусный элемент GAS (5′-GTGGCTTTCCGGGAATCCTTG-3 ‘).Белки, элюированные загрузочным буфером, подвергали электрофорезу в гелях 7,5% полиакриламид-SDS и переносили на поливинилидендифторидные мембраны (Immobilon-P; Millipore, Bedford, MA). Мембраны были зондированы следующими Abs: анти-фосфотирозиновый Abs PY20 (Affinity, Ноттингем, Великобритания) и 4G10, анти-STAT1-фосфосерин 727 (оба от Upstate Biotechnology, Лейк-Плэсид, Нью-Йорк), анти-STAT1-фосфотирозин 701, анти-фосфотирозин. p38 и анти-p38 (все из New England Biolabs, Беверли, Массачусетс), анти-STAT1 p91 (NovoCastra, Newcastle, U. K.) и анти-STAT2, анти-STAT3, анти-STAT4 и анти-STAT5B (все от Santa Cruz Biotechnology). После ECL и авторадиографии мембраны очищали в 62,5 мМ Трис (pH 6,8), 2% SDS и 100 мМ 2-ME, а затем повторно зондировали при необходимости.

Извлечение РНК

Общую РНК

выделяли из клеток с использованием Trireagent (Helena Biosciences, Сандерленд, Великобритания) в соответствии с инструкциями производителя. Количество и качество РНК оценивали путем определения OD ₂₆₀ и OD ₂₈₀ с использованием спектрофотометрии и дополнительной визуализации с помощью электрофореза в агарозном геле.

Профилирование экспрессии генов: анализ макромассивов

кДНК, меченная радиоактивным изотопом, была получена из 5–10 мкг тотальной РНК путем обратной транскрипции с помощью Superscript II (Life Technologies, Rockville, MD) в присутствии [³³ P] dCTP. Остаточную РНК гидролизовали щелочной обработкой при 70 ° C в течение 20 минут, и кДНК очищали с использованием колонок G-50 (Amersham Pharmacia, Bucks, UK). Перед гибридизацией с макромассивами меченую кДНК смешивали с 50 мкг COT-ДНК (Life Technologies) и 10 мкг поли (A) ДНК (Sigma-Aldrich), денатурировали при 95 ° C в течение 5 минут и гибридизовали в течение 1 часа. для минимизации неспецифического связывания.Подготовка макромассивов (представляющих 150 известных ISG), гибридизация радиоактивных кДНК, сканирование и анализ макромассивов проводились, как описано ранее (47).

Анализ защиты от РНКазы (RPA)

Как и ранее, проведено

РПА (48). Зонды IP-10, IL-12Rβ2, iNOS, супрессор передачи сигналов цитокинов (SOCS) 1, SOCS3 и GAPDH были приобретены у BD PharMingen (Сан-Диего, Калифорния). Вкратце, зонды были синтезированы из транскрипционных векторов SP6 / T7 и помечены [³² P] UTP до 2–5 × 10 ⁸ имп / мин на микрограмм входной ДНК.Аликвоты, эквивалентные 1–3 × 10 ⁵ имп / мин каждого зонда и 5–10 мкг общей РНК, использовали для каждого анализа. Интенсивность радиоактивных полос определяли количественно с использованием PhosphorImager (Storm; Molecular Dynamics, Саннивейл, Калифорния). Представляющие интерес полосы были количественно оценены, скорректированы с учетом фона и нормализованы к контрольной полосе (то есть GAPDH или γ-актину). Результаты выражаются в виде интенсивностей PhosphorImager.

IP-10 ELISA

DC культивировали в 96-луночных планшетах (1 × 10 ⁵ DC на 200 мкл) и обрабатывали подтипами IFN-α в течение 18 часов.Уровни белка IP-10 в супернатантах определяли с помощью специфического ELISA (HyCult Biotechnology, Norwood, MA).

Результаты

Способность IFN подтипов IFN-α1, -α2 и -α21 активировать путь Jak / STAT и индуцировать значительный набор ISG была исследована на Т-клетках и DC. Эти подтипы были выбраны потому, что 1) IFN-α1 и -α2 обычно являются основными видами IFN, продуцируемыми в ответ на многие вирусы и поли (I: C) (49, 50, 51), 2) rIFN-α2 широко используется в терапевтических целях ( 4) и 3) IFN-α21 проявляет повышенную ингибирующую активность по сравнению с IFN-α2 (45). Кроме того, как рекомбинантный, так и природный IFN-α1 имеют в ~ 10 раз более низкую специфическую противовирусную активность, чем большинство подтипов, включая IFN-α2 и -α21 (52, 53). В соответствии с этим специфическая (противовирусная) активность используемых rIFN находилась в диапазоне 5 × 10 ⁷ и 5 × 10 ⁸ МЕ / мг белка для IFN-α1 по сравнению с -α2 и -α21, соответственно. В соответствии с существующей практикой везде указаны абсолютные концентрации подтипов. Для удобства, абсолютные концентрации 2 нг / мл для IFN-α2 и -α21 и 20 нг / мл для IFN-α1 каждая соответствуют ~ 1000 МЕ / мл на основе противовирусной активности.

Активация STAT в ответ на подтипы IFN-α

Человеческие Т-клетки и DC обрабатывали в течение 20 минут диапазоном концентраций различных подтипов IFN-α. Экстракты целых клеток (фиг. 1⇓, A , верхние панели и C ) или иммунопреципитированные белки STAT2 ( A , нижние панели ) фракционировали с помощью SDS-PAGE, и фосфорилирование STAT было исследовали с помощью вестерн-блоттинга с антителами, специфичными для фосфорилированных остатков Tyr и / или Ser. Альтернативно, активированные димеры STAT подвергали аффинной очистке по их способности связываться с биотинилированным олигонуклеотидом, содержащим консенсусный элемент GAS, и связанные активированные STAT анализировали аналогичным образом (фиг. 1- B ).

РИСУНОК 1.

Активация STAT подтипами IFN-α в Т-клетках и DC. Т-клетки ( A и B ) или DC ( C ) стимулировали различными концентрациями IFN-α1, IFN-α2 или IFN-α21 в течение 20 минут и получали лизаты целых клеток. A и C , лизаты Т-клеток ( A ) и DC ( C ) разделяли с помощью SDS-PAGE, блотировали и исследовали на фосфорилирование STAT1 S727 и Y701 ( верхние панели ). Блот отделяли и повторно зондировали mAb против STAT1. Параллельно лизаты подвергали иммунопреципитации с помощью антител против STAT2 и иммуноблотировали с помощью антител против фосфотирозина (анти-P-Tyr), отделяли и повторно зондировали с помощью антител против STAT2 ( A , нижние панели ). B , лизаты Т-клеток очищали аффинно биотинилированным GAS-олигонуклеотидом ( Материал и методы ), подвергали электрофорезу, блоттингу и зондированию с помощью анти-STAT1, анти-STAT3, анти-STAT4 и анти-STAT5B Abs.Данные представляют как минимум два независимых эксперимента.

В Т-клетках мы наблюдали, что все три подтипа IFN-α индуцировали фосфорилирование тирозина STAT1 до -5 (рис. 1, A и B ). Однако фосфорилирование / активация этих STAT под действием IFN-α1 было сравнительно слабым: для детектируемого фосфорилирования тирозина для каждого из STAT требовались от 10 до 100 раз более высокие абсолютные концентрации этого подтипа (рис. 1, A и ). B ).Аналогичным образом, для обнаружения положительного сигнала в менее чувствительном анализе фосфорилирования Ser ⁷²⁷ для STAT1 требовались от 10 до 100 раз более высокие концентрации подтипа IFN-α1 (рис. 1– A ). Такое фосфорилирование не было обнаружено анализом экстракта целых клеток при любой из протестированных концентраций IFN-α1 (до 10 нг / мл; фиг. 1⇑ A ). Однако при более высоких концентрациях (20 и 200 нг / мл) фосфорилированные формы STAT1 Ser ⁷²⁷ можно было наблюдать в анализе GAS oligo pull-down.В этом анализе (рис. 1⇑ B ) две формы STAT1 с различной электрофоретической подвижностью представляют собой STAT1, фосфорилированный по тирозину ( нижняя полоса ), и STAT1, фосфорилированный как по тирозину, так и по серину ( верхняя полоса ) (46). Для IFN-α2 и IFN-α21 наблюдались аналогичные кривые доза-ответ для фосфорилирования тирозина и серина, хотя IFN-α2 оказался немного более эффективным при более низких концентрациях.

В DC сравнение ответов на IFN-α1 и IFN-α2 аналогичным образом выявило большие количественные различия между этими подтипами в их способности индуцировать фосфорилирование тирозина и серина STAT1 (рис.1- C ) и STAT3 (данные не показаны) и индуцировать образование комплекса ISGF3, как определено с помощью EMSA (данные не показаны).

Также была исследована кинетика активации STAT в Т-клетках (рис. 2⇓ A ) и DC ( B ). Фосфорилирование STAT1 на Y701 поддерживалось в течение 1-2 часов, а затем снижалось. Учитывая количественно более низкую активность IFN-α1, не наблюдалось явных различий между подтипами IFN-α в кинетике фосфорилирования STAT1 Y701.Аналогичные анализы кинетики активации STAT2, -3 и -4 в Т-клетках и STAT3 в DC не выявили различий между подтипами IFN-α (данные не показаны).

ФИГУРА 2.

Кинетика активации STAT1 в Т-клетках и ДК. Т-клетки ( A ) или DC ( B ) стимулировали различными концентрациями IFN-α1, IFN-α2 или IFN-α21 в течение разных периодов времени, как указано. Готовили лизаты цельных клеток и проводили иммуноблоттинг с антифосфо-Y701.Блоты удаляли и повторно зондировали mAb против STAT1. Данные представляют два независимых эксперимента.

Взятые вместе, результаты показывают, что существуют существенные количественные, но не качественные различия между подтипами IFN-α в отношении активации STAT как в Т-клетках, так и в DC.

Профиль экспрессии генов

настраиваемых макромассивов на основе кДНК, каждый из которых представляет 150 известных ISG в трех экземплярах ( Материалы и методы и Ref.47), были использованы в начальном скрининге дифференциальной экспрессии генов в ответ на три подтипа IFN-α. В предыдущих экспериментах для IFN-α2 в линиях клеток на основе HT1080 оптимальная индукция практически всех представленных ISG обычно наблюдалась при 2 нг / мл в течение 6-8 часов (47). Соответственно, в этом исследовании ответы на все три подтипа были проанализированы при 2 нг / мл, что соответствует физиологическим концентрациям ∼1000 МЕ / мл для IFN-α2 и IFN-α21 и 100 МЕ / мл для IFN-α1 ( материалов. и методы ).Чтобы компенсировать более низкую специфическую противовирусную активность, подтип IFN-α1 также исследовали в DC при более высокой абсолютной концентрации 20 нг / мл (1000 МЕ / мл). Была проанализирована общая РНК из необработанных и обработанных подтипом клеток. Результаты показаны как кратность индукции по сравнению с необработанными клетками. Данные для этих генов, индуцированных в 2 раза или более (27 в Т-клетках и 36 в DC), включая классические ISG MxA, 2′-5′-олигоаденилатсинтетазу и PKR , которые, как известно, участвуют в противовирусных ответах, представлены (Таблица I⇓).Как и ожидалось для ISG, значительной репрессии (> 2-кратной) любого из представленных генов не наблюдалось. Что касается активации STAT, как в Т-клетках, так и в DC, в целом ISG сильнее индуцируются IFN-α2 и -α21, чем IFN-α1. И снова IFN-α21 был немного менее эффективным, чем IFN-α2 (Таблица I⇓). IFN-α1 в концентрации 2 нг / мл достаточно для активации STAT1 и -2 (рис. 1 и 2). В соответствии с этим, хотя и менее эффективен, чем IFN-α2 или -α21, IFN-α1 в концентрации 2 нг / мл явно индуцировал, особенно в DC, более высоко индуцибельный спектр ISG, наблюдаемый с более сильными IFN-α2 и -α21. подтипы.То, что любое различие в значительной степени является количественным, было по существу подтверждено более близким соответствием, наблюдаемым при увеличении концентрации IFN-α1 с 2 до 20 нг / мл (таблица I⇓, DC, , первая колонка ). Интересно, однако, что IFN α2 и α21 индуцировали экспрессию хемокина IP-10 и мРНК iNOS в DC, но не в T-клетках. Это является еще одним примером специфичности клеточного типа в ответе на IFN-α (47). Что еще более важно в этом исследовании, что касается специфичности подтипа IFN-α, не наблюдалось значительной индукции гена IP-10 в DC в ответ на IFN-α1, даже при повышенной концентрации 20 нг / мл, тогда как он был сильно индуцирован в этих клетках 2 нг / мл IFN-α2 (14.В 4 раза) и IFN-α21 (в 6,6 раза) (таблица I⇓). Потенциально похожие различия, специфичные для подтипа IFN-α, наблюдались для ряда других ISG (например, RING4, GBP-1, IFI16 и Caspase 1 ). Однако эти различия были менее значительными и менее последовательными среди трех проанализированных образцов доноров, и их еще предстоит установить. Таким образом, из проанализированных IP-10 оказались наиболее вероятными кандидатами на ген ответа, специфичного для подтипа IFN-α. Соответственно, индукцию мРНК и белка IP-10 анализировали дополнительно.

Таблица I.

Индукция ISG подтипами IFN-α ^a

Индукция мРНК и белка IP-10 подтипами IFN-α

Кинетику индукции мРНК IP-10 сравнивали с помощью RPA с кинетикой для отбора IFN-α-индуцибельных мРНК как в DC, так и в Т-клетках, обработанных IFN-α1 (2 и 20 нг / мл) или IFN-α2 ( 0,2 и 2 нг / мл) в течение 1, 4 и 8 ч (рис. 3⇓). Наблюдались различия 1) в кинетике индукции различных ISG, 2) между типами клеток и 3) между подтипами IFN-α.

РИСУНОК 3.

Подтипные и типовые различия в профилях экспрессии мРНК, индуцированные IFN-α. A , Кинетика индукции мРНК ISG. Т-клетки и DC обрабатывали IFN-α1 (20 и 2 нг / мл) или IFN-α2 (2 и 0,2 нг / мл) в течение указанного времени. Аликвоты (5 мкг) цитоплазматической РНК анализировали на предмет индуцируемой экспрессии гена с помощью RPA с использованием зондов IP-10, iNOS, IL-12Rβ2, SOCS3 и SOCS1 с GAPDH в качестве контроля загрузки ( верхние панели ) и ISG-65K, 6-16 и 9-27 зонды и γ-актин в качестве контроля нагрузки ( нижние панели ). Данные представляют из трех независимых экспериментов. B , Количественный анализ данных постоянного тока. Гели ( A , левые панели ) подвергали количественному анализу PhosphorImager. Были рассчитаны данные для кратности индукции после поправки на контрольные нагрузки GAPDH и γ-актина. Данные для IP-10, ISG-56K, 6-16 и 9-27 представлены в качестве примеров.

Дифференциальная кинетика индукции.

Индукция мРНК SOCS3 была исключительно ранней и преходящей, индукция ISG-56K была ранней, но продолжительной, тогда как индукция даже первично индуцированных мРНК 6-16, 9-27 и STAT1 оказалась немного задержанной.Ясно, что точка обнаружения зависит от чувствительности анализа, но различия в формах (переходные и продолжительные) кривых остаются. Транскрипционный ответ для всех основных идентифицированных мРНК (Рис. 3⇑ и Таблица I⇑) хорошо установлен. Поскольку мы изучаем накопление мРНК, нельзя, конечно, исключить дополнительную модуляцию через различия в стабильности мРНК.

Дифференциалы клеточного типа.

В ответ, например, на 2 нг / мл IFN-α2, IP-10 и iNOS сильно индуцировались в DC (IP-10, 242-кратно через 4 часа; iNOS, 30-кратно через 1 час; рис.3⇑ A , дорожек 8 и 4 ), но лишь незначительно в Т-клетках (IP-10, 4 раза через 4 часа; iNOS 2 раза через 1 час; A , дорожек 21 и 17 ), тем самым подтверждая дифференциацию клеточного типа, наблюдаемую в макромассивах (Таблица I⇑). Дополнительным примером специфичности клеточного типа является ген IL-12Rβ2 , который активируется в Т-клетках (рис. 3 ( A , дорожек 19–22 ), но не в DC ( A , переулки 1–13 ).

дифференциалов подтипа IFN-α.

В DC, все время анализируемого, мРНК IP-10 сильно индуцировалась IFN-α2 (0,2 и 2 нг / мл), но гораздо менее эффективно при 10-кратных более высоких концентрациях (2 и 20 нг / мл) IFN- α1 (рис. 3⇑). Это особенно очевидно в момент времени 8 часов на рис. 3 A (сравните дорожек 10 и 11 с 12 и 13 ) и согласуется с фактическим отсутствием IFN-α1. -индуцированный ответ IP-10 через 8 ч в макромассиве (таблица I⇑).В соответствии с этим повышенные уровни мРНК IP-10 все еще определялись через 24 часа в ответ на IFN-α2 (2 нг / мл), но не на IFN-α1 (20 нг / мл) (данные не показаны). Более того, что важно, в ответ на IFN-α1 продуцируется значительно меньше белка IP-10, чем IFN-α2 (фиг. 4⇓). Действительно, для индукции сопоставимых количеств белка IP-10 требовались по крайней мере в 100 раз более высокие концентрации IFN-α1 (20 нг / мл), чем IFN-α2 (0,2 нг / мл) (рис. 4⇓), в результате согласуется с аналогичной разницей в эффективности индукции мРНК IP-10 (рис.3⇑, A , сравните полос 2 и 5 , 6 и 9 , 10 и 13 и B ). Это контрастирует с данными для подавляющего большинства ISG, для которых индукция в ответ на IFN-α2 (0,2 и 2 нг) и в 10 раз более высокие концентрации IFN-α1 (2 и 20 нг / мл) были весьма сопоставимы ( Рис. 3⇑ и Таблица I⇑). Таким образом, хотя при абсолютных концентрациях, скорректированных в 10 раз, чтобы компенсировать 10-кратную разницу в специфической противовирусной активности и сродстве к рецепторам (см. Выше), IFN-α1 и -α2 могут проявлять аналогичную противовирусную активность и индуцировать большинство ISG в одинаковой степени, они гораздо больше различаются по своей способности индуцировать IP-10.Данные предполагают, что для оптимальной индукции IP-10, но не для большинства ISG, оцененных в таблице I⇑, может потребоваться, по крайней мере, в DC, дополнительный сигнал (ы), активируемый IFN-α2, но не IFN- α1.

РИСУНОК 4.

Индукция белка IP-10 IFN-α1 и IFN-α2. ДК стимулировали различными концентрациями IFN-α1 или -α2 в течение 18 часов. Среду из трех лунок собирали и объединяли, и уровни IP-10 определяли в двух экземплярах с помощью ELISA ( материалов и методов ).Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для двух независимых экспериментов.

Активация p38 необходима для оптимальной индукции IP-10

Промотор IP-10 содержит ISRE (54). Активированные STAT1 и -2 необходимы (вместе с уже существующим p48 / ISGF3γ / IRF9) для образования ISGF3, который опосредует ответы IFN-α через ISRE. Следовательно, можно разумно предположить, что активированные STAT1 и -2 необходимы (хотя и не обязательно достаточны) для индукции IP-10 с помощью IFN-α.Никакой разницы в активации STAT1 и -2 или в образовании ISGF3 в ответ на IFN-α1 и -α2 не наблюдалось (например, фиг. 1). Поэтому различия в индукции IP-10 подтипами IFN-α1 и -α2 нельзя объяснить различиями в активации STAT. Помимо передачи сигналов Jak / STAT, пути киназ p38 и PI3 участвуют в ответах IFN-α (20, 21, 22, 23, 24). Таким образом, была исследована роль этих путей в индукции IP-10 и других классических ISG в ответ на IFN-α1 и -α2.ДК обрабатывали IFN-α1 и -α2 (при 20 и 2 нг / мл соответственно) в отсутствие или в присутствии хорошо охарактеризованных ингибиторов киназы PI3 (LY294002) и p38 (SB203580) путей (рис. 5⇓ ). А ). Транскрипционные ответы оценивали через 8 ч, в этот момент разница между подтипами IFN-α при этих концентрациях была наиболее очевидной (рис. 3⇑ A ). Индукция IP-10 в ответ на оба подтипа IFN-α сильно ингибировалась SB203580, но не LY294002, что указывает на то, что путь киназы p38, но не PI3, участвует в регуляции этого гена.SB203580 ингибировал индукцию мРНК IP-10 дозозависимым образом, при этом ингибирование IP-10 наблюдалось при использовании всего лишь 1 мкМ этого соединения (данные не показаны). Напротив, этот ингибитор не влиял на индукцию мРНК ISG-56K, 2′-5′-олигоаденилатсинтетазы и 6-16 (фиг. 5, A и B ) даже при значительно более высоких концентрациях. (20 мкМ; данные не показаны). Хотя LY294002 не влиял на индукцию мРНК IP-10, он был активен в этих клетках. Он сильно ингибировал накопление белка IP-10 в среде обработанных клеток (ELISA; три независимых эксперимента; данные не показаны).Скорее всего, это отражает потребность в киназе PI3 для секреции белка посредством экзоцитоза секреторных везикул (55).

РИСУНОК 5.

Вовлечение p38 в индукцию IP-10. A , Влияние ингибиторов киназы PI3 и p38 на экспрессию генов, индуцированную IFN-α. DC обрабатывали IFN-α1 или IFN-α2 в концентрации 20 и 2 нг / мл, соответственно, в отсутствие или в присутствии LY294002 (LY) или SB203580 (SB) (оба по 10 мкМ) в течение 8 часов. Аликвоты (5 мкг) цитоплазматической РНК анализировали на предмет индуцируемой экспрессии гена с помощью RPA с использованием зондов IP-10, ISG-56K и 6-16 и GAPDH в качестве контроля загрузки. B , Количественное определение данных RPA с помощью анализа PhosphorImager двух независимых экспериментов (показано в A , а данные не показаны). Индукцию складок рассчитывали после поправки на контроль GAPDH. Данные представлены в виде процента ответа IFN-α2 в отсутствие ингибиторов (средние значения ± SEM). C , IFN-α индуцирует фосфорилирование p38. DC обрабатывали IFN-α1 (20 нг / мл) или IFN-α2 (2 нг / мл) в течение 20 минут. Готовили лизаты цельных клеток и подвергали иммуноблоттингу с использованием анти-фосфо-p38 Abs, отделяли и повторно зондировали анти-p38 Abs.

В соответствии с требованием для p38 для оптимальной индукции IP-10, как IFN-α1 (при 20 нг / мл), так и IFN-α2 (при 2 нг / мл) индуцировали фосфорилирование p38 (рис. 5⇑ C ). Фосфорилирование протеинкиназы B, субстрата киназы PI3, не наблюдалось (данные не показаны). Очевидно, что путь p38 используется обоими подтипами IFN-α и необходим для оптимальной индукции IP-10, но не для других анализируемых ISG.

Обсуждение

В этом исследовании мы впервые представляем анализ передачи сигналов через Jak / STAT и дополнительные пути, а также экспрессию генов в человеческих Т-клетках и DC в ответ на различные подтипы IFN-α.Наблюдались существенные вариации, в том числе различия в ответах IFN-α-подтипа и клеточного типа и экспрессии ISG. Важно отметить, что хемокин IP-10 дифференциально индуцировался в DC под действием IFN-α1 по сравнению с IFN-α2 и IFN-α21. При физиологических концентрациях (2 нг / мл) мРНК и белок IP-10 сильно индуцировались IFN-α2 и -α21, но слабо — IFN-α1 (таблица I и фиг. 3 и 4). В отличие от других проанализированных ISG, увеличение концентрации IFN-α1 до 20 нг / мл не приводило к индукции уровней IP-10, сравнимых с уровнями, индуцированными 2 нг / мл IFN-α2.

IP-10 был первоначально идентифицирован как IFN-γ-индуцированный белок (56). Исследования in vivo с использованием либо нейтрализующих IP-10 Abs, либо мышей с дефицитом IP-10 показывают, что этот хемокин играет важную неизбыточную роль в привлечении / перемещении эффекторных клеток Th2 в участки ткани воспаления (57, 58). Было высказано предположение, что ранняя экспрессия, в частности IP-10 in vivo, имеет решающее значение для установления защитных клеточно-опосредованных иммунных ответов против определенных патогенов, и что ответственны за это компоненты врожденной иммунной системы, а не IFN-γ (57).IFN-αβ являются вероятными кандидатами на роль таких компонентов. Действительно, недавно было показано, что индуцированная IFN-αβ продукция IP-10 DC в ответ на Mycobacterium tuberculosis имеет решающее значение для селективного набора активированных Т-клеток (59). Следовательно, есть основания полагать, что нарушение индукции IP-10 IFN-α1 в физиологических концентрациях может иметь важные последствия для иммунной регуляции. Следует отметить, что IFN-α1 играет важную роль в ответе на IFN-α, потому что он обычно является одним из основных продуцируемых подтипов (49, 50, 51).

Помимо защитной роли IP-10 при инфекциях, требующих сильных клеточно-опосредованных иммунных ответов, IP-10 также может способствовать прогрессированию определенных заболеваний. Экспрессия IP-10 наблюдалась при многих воспалительных / аутоиммунных заболеваниях Th2-типа, включая псориаз (60), рассеянный склероз (61, 62), ревматоидный артрит (63) и диабет 1 типа (64). Более того, мышиные модели аутоиммунитета Th2-типа in vivo установили критическую роль IP-10 в возникновении и прогрессировании заболевания (58, 65, 66). Ясно, что индукция IP-10 и последующее привлечение клеток Th2 к участкам воспаления нежелательны при этих заболеваниях. В этом отношении интересно отметить, что терапевтическое применение IFN-α противопоказано пациентам с Th2-связанными расстройствами в анамнезе. Более того, были клинические примеры, когда введение IFN-α вызывало индукцию аутоиммунных заболеваний (67, 68) и приводило к обострению псориатических поражений (69). Принимая во внимание важную роль IP-10 в воспалительных заболеваниях Th2-типа, наблюдение, что индукция этого хемокина нарушается в ответ на IFN-α1, может иметь клиническое значение, поскольку этот подтип может быть более подходящим кандидатом для терапевтического применения в случаях, когда Воспалительные реакции Th2 нежелательны.Хотя эту возможность еще предстоит установить, удивительно, что IFN-α1 вызывал меньше побочных эффектов, чем IFN-α2, у пациентов со злокачественными заболеваниями (70).

В двух предыдущих исследованиях применялись инструменты глобального профилирования экспрессии генов для решения связанного с этим вопроса о том, существуют ли функциональные различия между IFN-α2 и IFN-β (37, 71). Эти исследования продемонстрировали, что при данной концентрации IFN-β индуцировал больше генов, чем -α2 (37, 71), но что модели индукции ISG становились идентичными при увеличении концентрации IFN-α2 (37) — результат схожий. к этому для большинства ISG в ответ на IFN-α2 по сравнению с IFN-α1 в этом исследовании (Таблица I⇑).Принимая во внимание тот факт, что IFN-αβ действует через общий рецептор, это перекрытие в ответах, возможно, неудивительно. Тем не менее, текущие данные показывают, что даже при относительно высокой физиологической концентрации 2 нг / мл индукция IP-10 IFN-α1 серьезно нарушалась. Хотя индукция IFN-αβ может быть высокой в ответ, по крайней мере, на некоторые вирусные инфекции (72), она может быть относительно низкой в ответ на другие патогены (6), и есть также хорошие доказательства низкой конститутивной экспрессии (73). Таким образом, различия в действиях IFN-αβ при более низких концентрациях также могут иметь биологическое значение.

Обнаружены существенные количественные различия между IFN-α1, -α2 и -α21 в способности активировать STAT1 до -5 и спектре ISG. При высоких концентрациях IFN-α все подтипы индуцировали фосфорилирование STAT1 до -5 в Т-клетках и STAT1 до -3 в DC (STAT4 и -5 не анализировались) и аналогичные паттерны экспрессии ISG (рис. 1 и таблица I). ). Различия между подтипами в этом отношении количественные, а не качественные и аналогичны тем, которые описаны для IFN-α2 и IFN-β (37).Важно отметить, что никаких существенных различий в кинетике активации STAT разными подтипами в диапазоне концентраций не наблюдалось (рис. 2, данные не представлены). Следовательно, нет явной специфичности активации STAT для этих конкретных подтипов в этих конкретных клетках. Недавно Cull et al. (38) сообщили о селективной активации STAT5 в ответ на различные подтипы IFN-α в иммортализованной линии клеток эритробластов мыши. Однако остается возможным, что это снова отражает количественную зависимость от концентрации, особенно потому, что активация STAT1 и -3 различными подтипами, как было показано, сильно зависит от используемой дозы.

Менее эффективное фосфорилирование / активация STAT под действием IFN-α1, чем -α2 (рис. 1⇑), коррелирует с известной более низкой аффинностью связывания для рецептора IFN-αβ (в 20 раз ниже K _d) (39) и более низкая (в 5-20 раз) специфическая противовирусная активность в зависимости от типа клеток (52). Однако индукция большинства ISG была лишь в 2–4 раза ниже в ответ на IFN-α1, чем на IFN-α2 и -α21 (все при 2 нг / мл). Увеличение концентрации IFN-α1 до 20 нг / мл дало индукцию ISG, сравнимую с IFN-α2 и -α21 (за исключением IP-10), несмотря на более низкую активацию STAT даже при этой более высокой концентрации IFN-α1 (Таблица I⇑ и Рис. .1⇑). Таким образом, количественная разница между IFN-α1 и IFN-α2 или -α21 оказывается меньше для индукции ISG, чем для активации STAT. Это произошло не просто из-за различий в чувствительности используемых анализов, поскольку относительно небольшие различия в индукции ISG наблюдались в широком диапазоне концентраций (для IFN-α1 от 20 до 0,2 нг / мл; для IFN-α2 от 2 до 0,02 нг / мл), и формы кривых доза-ответ для IFN-α1 и IFN-α2 были аналогичными (данные не показаны). Ранее сообщалось о различиях между активацией STAT и функциональными ответами; например, различия в противовирусной и антипролиферативной активности ряда гибридов IFN-α2 / 21 не коррелировали с их способностью активировать STAT1 / 2 (45) и противовирусной активностью IFN-β в клеточной линии, экспрессирующей усеченный IFN. -αβ рецептор был сильно нарушен, в отличие от активации передачи сигналов Jak / STAT (43).Соответственно, вероятно, будут задействованы дополнительные факторы, ограничивающие скорость.

Оба пути киназы p38 и PI3 участвуют в передаче сигналов IFN-α (20, 21, 22, 23, 24). В DC активация p38, но не киназы PI3, по-разному требовалась для оптимальной индукции IP-10 по сравнению с другими мРНК ISG (фиг. 5⇑). И IFN-α1, и IFN-α2 активируют киназу (ы) p38 (рис. 5⇑ C ). Соответственно, дифференциальная индукция p38 кажется маловероятной, чтобы быть основой наблюдаемой разницы в индукции IP-10 в ответ на два подтипа IFN-α.Сообщалось о потребности в p38 как для ISRE-, так и для GAS-управляемой экспрессии репортерных конструкций (22, 23, 24). Требование активации p38 для IFN-α для оптимальной индукции IP-10, насколько нам известно, является первой демонстрацией участия этого пути в регуляции эндогенного ISG с помощью IFN-α. Таким образом, среди ISG, проанализированных в этом исследовании, IP-10 был уникальным в том, что он 1) дифференциально регулируется подтипами IFN-α, 2) зависит от активации p38 и 3) индуцируется в DC, но не в Т-клетках.

Хотя это и не является конкретным направлением, это исследование также предоставило дополнительные доказательства специфичности клеточного типа для ответа IFN-α (см. Ссылку 47) и основных различий в кинетике экспрессии подмножеств ISG. В дополнение к IP-10, примеры специфичности клеточного типа включают индукцию iNOS в DC, но не в Т-клетках, и IL-12Rβ2 в Т-клетках, но не в DC (таблица I и фиг. 3). В соответствии с последним, IL-12Rβ2 является геном, чувствительным к STAT4, а незрелые DC не экспрессируют STAT4 (74, 75, 76).Среди исследованных мРНК ISG наблюдалась очень разная кинетика накопления (рис. 3⇑ B и данные не представлены). Например, SOCS1 показал очень раннюю переходную кинетику, IP-10 и ISG-56K были аналогичными временными, но с небольшой задержкой, тогда как 6-16, 9-27 и STAT1 показали более устойчивую индукцию (рис. 3⇑). Ясно, что точка обнаружения зависит от чувствительности анализа и выбранных временных точек, но различия в форме кривых, которые могут или не могут отражать основные различия в стабильности мРНК, остаются.Интересно, что такие различия не наблюдались в аналогичном анализе для IFN-α2 в клетках фибросаркомы человека HT1080. В них накопление мРНК для всех 150 проанализированных ISG было продолжительным и оптимальным через 6-8 часов (ссылка 47; J. F. Schlaak и I.M. Kerr, неопубликованные данные). Эти противоположные результаты подчеркивают сложность ответов и их зависимость от типа клеток. Ясно, что в этой области данные, полученные в одной системе ячеек, не обязательно экстраполировать на другие.

В заключение, настоящее исследование предоставляет новую информацию об ответах подтипа IFN-α в человеческих Т-клетках и DC. Наблюдались существенные различия в активности подтипа IFN-α, в специфичности типа клеток и в требованиях к пути p38 MAPK. Индукция IP-10 была наиболее ярким примером в этом отношении. Дальнейшие примеры вариаций активности IFN-α-подтипа, вероятно, по-прежнему будут иметь важное значение для развития понимания роли (-ей) различных подтипов в иммунном ответе.

Благодарности

Мы благодарим докторов наук. Дорин Кантрелл, Патрик Костелло, Сандра Диболд и Факундо Батиста за критическое чтение рукописи.

Сноски

№1 Эта работа поддержана грантом Федора-Линена от Общества Александра фон Гумбольдта компании J.F.S.
№2 Cancer Research UK Лондонский исследовательский институт включает лаборатории Lincoln’s Inn Fields и Clare Hall, входившие в состав бывшего Императорского фонда исследований рака после слияния Императорского фонда исследований рака с Кампанией по изучению рака в феврале 2002 года.
№3 Фактический адрес: Эссенский университет, отделение гастроэнтерологии и гепатологии, Hufelandstrasse 55, 45122 Essen, Germany.
№4 Адрес для корреспонденции и перепечатки запросов на перепечатку д-ру Яну М. Керру, Лондонский исследовательский институт рака, Великобритания, Lincoln’s Inn Fields Laboratories, 44 Lincoln’s Inn Fields, London WC2A 3PX, UK Адрес электронной почты: ian.kerr {at} раком .org.uk
↵5 Сокращения, использованные в данной статье: DC — дендритная клетка; Jak, Janus kinase; ISG, ген, стимулированный IFN; ISGF3, фактор ISG 3; IRF, регуляторный фактор IFN; ISRE, IFN-стимулированный ответный элемент; ГАЗ, γ-активированная последовательность; PI3, фосфатидилинозитол 3; MAP, митоген-активированный белок; IP-10, IFN-γ-индуцибельный белок-10; iNOS, индуцибельная NO-синтаза; SOCS, супрессор передачи сигналов цитокинов; RPA, анализ защиты от РНКазы.

Получено 15 апреля 2003 г.
Принято 2 сентября 2003 г.

Ссылки

↵
Герберман Р. Б. 1997. Влияние альфа-интерферонов на иммунную функцию. Семин. Онкол. 24: (Дополнение 9) : S9.78.
↵
De Maeyer, E., J. De Maeyer-Guignard.1998. Интерфероны I типа. Int. Rev. Immunol. 17:53.
↵
Беларделли, Ф., И. Грессер. 1996. Игнорированная роль интерферона типа I в Т-клеточном ответе: значение для его клинического использования. Иммунол. Сегодня 17:369.
↵
Gutterman, J. U .. 1994. Цитокиновая терапия: уроки интерферона-α. Proc. Natl. Акад. Sci. США 91: 1198.
↵
Дифенбах, А., Х. Шиндлер, Н. Донхаузер, Э. Лоренц, Т. Ласкей, Дж. МакМикинг, М. Роллингхофф, И. Грессер, К. Богдан. 1998. Интерферон 1 типа (IFNα / β) и синтаза оксида азота 2 типа регулируют врожденный иммунный ответ на простейших паразитов. Иммунитет 8:77.
↵
Синг, А., Т. Мерлин, Х. П. Кнопф, П. Дж. Нильсен, Х. Лоппнов, К. Галанос, М. А. Фройденберг. 2000. Бактериальная индукция β-интерферона у мышей является функцией липополисахаридного компонента.Заразить. Иммун. 68: 1600.
↵
Фаррар, Дж. Д., К. М. Мерфи. 2000. Развитие интерферонов I типа и Т-хелперов. Иммунол. Сегодня 21:48.
↵
Бирон, К. А. 2001. Интерфероны α и β как иммунные регуляторы: новый взгляд. Иммунитет 14: 661.
↵
Ле Бон, А. , Дж. Скьявони, Дж. Д’Агостино, И. Грессер, Ф. Беларделли, Д.F. Жесткий. 2001. Интерфероны типа I сильно усиливают гуморальный иммунитет и могут способствовать переключению изотипа, стимулируя дендритные клетки in vivo. Иммунитет 14: 461.
↵
Weissmann, C., H. Weber. 1986. Гены интерферона. Прог. Nucleic Acid Res. Мол. Биол. 33: 251.
↵
Пестка, С. 1997. Виды человеческого интерферона-α и гибридные белки. Семин. Онкол. 24: (Приложение 9) : S9.4.
↵
Узе Г., Лутфалла Г., Грессер И. 1990. Генетический перенос функционального человеческого рецептора интерферона-α в клетки мыши: клонирование и экспрессия его кДНК. Ячейка 60: 225.
↵
Новик, Д., Б. Коэн, М. Рубинштейн. 1994. Человеческий рецептор интерферона α / β: характеристика и молекулярное клонирование. Ячейка 77: 391.
↵
Лутфалла, Г., SJ Holland, E. Cinato, D. Monneron, J. Reboul, NC Rogers, JM Smith, GR Stark, K. Gardiner, KE Mogensen, et al 1995. Мутантные клетки U5A дополняются субъединицей рецептора интерферона-αβ, генерируемой путем альтернативного процессинга нового члена кластера генов рецепторов цитокинов. EMBO J. 14: 5100.

↵
Старк, Г. Р., И. М. Керр, Б. Р. Уильямс, Р. Х. Сильверман, Р. Д. Шрайбер. 1998. Как клетки реагируют на интерфероны.Анну. Rev. Biochem. 67: 227.

↵
Чо, С. С., К. М. Бэкон, К. Сударшан, Р. К. Рис, Д. Финблум, Р. Пайн, Дж. Дж. О’Ши. 1996. Активация STAT4 IL-12 и IFN-α: доказательства участия лиганд-индуцированного фосфорилирования тирозина и серина. J. Immunol. 157: 4781.

↵
Ю., К. Р., Дж. Х. Лин, Д. В. Финк, С. Акира, Э. Т. Блум, А. Ямаути. 1996. Дифференциальное использование активатора сигнального преобразователя киназы Janus сигнальных путей транскрипции при стимуляции естественных клеток-киллеров человека с помощью IL-2, IL-12 и IFN-α.J. Immunol. 157: 126.

↵
Матикайнен, С., Т. Саренева, Т. Ронни, А. Лехтонен, П. Дж. Коскинен, И. Юлкунен. 1999. Интерферон-α активирует множество белков STAT и активирует связанные с пролиферацией гены IL-2Rα , c- myc и pim-1 в Т-клетках человека. Кровь 93: 1980.

↵
Гупта, С., М. Цзян, А. Б. Пернис. 1999. IFN-α активирует Stat6 и приводит к образованию комплексов Stat2: Stat6 в B-клетках.J. Immunol. 163: 3834.

↵
Янг, К. Х., А. Мурти, С. Р. Пфеффер, Дж. Г. Ким, Д. Б. Доннер, Л. М. Пфеффер. 2001. Интерферон α / β способствует выживанию клеток путем активации ядерного фактора κB через фосфатидилинозитол-3-киназу и Akt. J. Biol. Chem. 276: 13756.9.

↵
Рани, М. Р., Л. Хибберт, Н. Сайзмор, Г. Р. Старк, Р. М. Рансохофф. 2002. Необходимость фосфоинозитид-3-киназы и Akt для опосредованной интерфероном-β индукции гена β- R1 ( SCYB11 ).J. Biol. Chem. 277: 38456.

↵
Го, К. К., С. Дж. Хак, Б. Р. Уильямс. 1999. Киназа p38 MAP необходима для фосфорилирования серина STAT1 и активации транскрипции, индуцированной интерферонами. EMBO J. 18: 5601.

↵
Уддин, С., Б. Майчжак, Дж. Вудсон, П. Арункумар, Ю. Алсайед, Р. Пайн, П. Р. Янг, Э. Н. Фиш, Л. К. Платаниас. 1999. Активация митоген-активируемой протеинкиназы p38 интерферонами I типа.J. Biol. Chem. 274: 30127.

↵
Уддин, С., Ф. Лекмине, Н. Шарма, Б. Майчжак, И. Майер, П. Р. Янг, Г. М. Бокоч, Э. Н. Фиш, Л. К. Платаниас. 2000. Путь митоген-активируемой протеинкиназы Rac1 / p38 необходим для интерферон α-зависимой транскрипционной активации, но не фосфорилирования серина белков Stat. J. Biol. Chem. 275: 27634.

↵
Дэвид М., Э.Петрикоин, III, К. Бенджамин, Р. Пайн, М. Дж. Вебер, А. К. Ларнер. 1995. Потребность в активности киназы MAP (ERK2) в экспрессии генов, стимулированной интерфероном α и β интерфероном, через белки STAT. Наука 269: 1721.

↵
Hiscott, J., K. Cantell, C. Weissmann. 1984. Дифференциальная экспрессия генов интерферона человека. Nucleic Acids Res. 12: 3727.

↵
Макдональд, Н. Дж., D. Kuhl, D. Maguire, D. Naf, P. Gallant, A. Goswamy, H. Hug, H. Bueler, M. Chaturvedi, J. de la Fuente, et al. 1990. Различные пути опосредуют индуцируемость вирусом гены IFN-α1 и IFN -β человека. Ячейка 60: 767.

↵
Мари И., Дж. Э. Дурбин, Д. Э. Леви. 1998. Дифференциальная вирусная индукция отдельных генов интерферона-α посредством положительной обратной связи через фактор регуляции интерферона-7. EMBO J. 17: 6660.

↵
Лин Р., П. Генин, Ю. Мамане, Дж. Хискотт. 2000. Селективное связывание ДНК и ассоциация с коактиватором связывающего белка CREB способствуют дифференциальной активации генов интерферона α / β факторами регуляции интерферона 3 и 7. Mol. Клетка. Биол. 20: 6342.

↵
Барнс, Б. Дж., П. А. Мур, П. М. Пита. 2001. Вирус-специфическая активация нового фактора, регулирующего интерферон, IRF-5, приводит к индукции различных генов интерферона α.J. Biol. Chem. 276: 23382.

↵
Реберг, Э., Б. Келдер, Э. Г. Хоул, С. Пестка. 1982. Удельная молекулярная активность рекомбинантных и гибридных лейкоцитарных интерферонов. J. Biol. Chem. 257: 11497.

↵
Белл, Д. М., Н. Дж. Робертс, младший, К. Б. Холл. 1983. Различные противовирусные спектры активности интерферона макрофагов человека. Природа 305: 319.

↵
Рыбка, Е.Н., К. Банерджи, Н. Стеббинг. 1983. Подтипы лейкоцитарного интерферона человека обладают различной антипролиферативной и противовирусной активностью в отношении клеток человека. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 112: 537.

↵
Фостер, Г. Р., О. Родригес, Ф. Гуз, Э. Шульте-Фролинде, Д. Теста, М. Дж. Ляо, Г. Р. Старк, Л. Ледбитер, Х. К. Томас. 1996. Различная относительная активность подтипов интерферона-α человеческого клеточного происхождения: IFN-α8 обладает очень высокой противовирусной активностью.J. Interferon Cytokine Res. 16: 1027.

↵
Йео, У. С., К. М. Лоусон, М. В. Бейльгарц. 1998. Противовирусная активность отдельных подтипов мышиного IFN-α in vivo: внутримышечная инъекция конструкций экспрессии IFN снижает репликацию цитомегаловируса. J. Immunol. 160: 2932.

↵
Хибберт, Л., Г. Р. Фостер. 1999. Человеческие интерфероны типа I сильно различаются по своему влиянию на пролиферацию первичных В-клеток.J. Interferon Cytokine Res. 19: 309.

↵
да Силва, А. Дж., М. Брикельмайер, Г. Р. Мажо, А. В. Лукашин, Дж. Пейман, А. Уитти, П. С. Хохман. 2002. Сравнение паттернов экспрессии генов, индуцированных обработкой эндотелиальных клеток пупочной вены человека IFN-α2b с IFN-β1a: понимание функциональной взаимосвязи между отдельными интерферонами типа I, которые действуют через общий рецептор. J. Interferon Cytokine Res. 22: 173.

↵
Калл, В.С., П. А. Тилбрук, Э. Дж. Бартлетт, Н. Л. Брекало, К. М. Джеймс. 2003. Дифференциальная терапия интерфероном I типа при эритролейкозе: специфичность активации STAT. Кровь 101: 2727.

↵
Йонехара, С., М. Йонехара-Такахаши, А. Исии, С. Нагата. 1983. Различное связывание человеческого интерферона α1 и α2 с общими рецепторами на человеческих и бычьих клетках: исследования с рекомбинационными интерферонами, продуцированными в Escherichia coli . J. Biol.Chem. 258: 9046.

↵
Ху, Р., Ю. Ган, Дж. Лю, Д. Миллер, К. С. Зун. 1993. Доказательства множественных сайтов связывания для нескольких компонентов человеческого лимфобластоидного интерферона-α. J. Biol. Chem. 268: 12591.

↵
Абрамович К., Л. М. Шульман, Э. Ратовицкий, С. Харроч, М. Тови, П. Эйд, М. Ревель. 1994. Дифференциальное фосфорилирование тирозина цепи IFNAR рецептора интерферона типа I и связанного поверхностного белка в ответ на IFN-α и IFN-β. EMBO J. 13: 5871.

↵
Платаниас, Л. К., С. Уддин, П. Домански, О. Р. Коламоничи. 1996. Различия в передаче сигналов интерферона α и β: интерферон β избирательно индуцирует взаимодействие субъединиц α и βL рецептора интерферона I типа. J. Biol. Chem. 271: 23630.

↵
Domanski, P., O. W. Nadeau, L. C. Platanias, E. Fish, M. Kellum, P. Pitha, O.R. Colamonici.1998. Дифференциальное использование субъединицы βL рецептора интерферона I типа (IFN) определяет специфичность передачи сигналов для IFNα2 и IFNβ. J. Biol. Chem. 273: 3144.

↵
Леверенц, М., К. Э. Могенсен, Г. Узе. 1998. Общие рецепторные компоненты, но отдельные комплексы для α- и β-интерферонов. J. Mol. Биол. 282: 585.

↵
Ху Р., Дж. Бекиш, М. Хейс, С. Одет, Дж. Билер, Э. Петрикоин, К.Зун. 1999. Дивергенция связывания, передачи сигналов и биологических ответов на рекомбинантный гибридный IFN человека. J. Immunol. 163: 854.

↵
Athie-Morales, V., H. Flotow, K. L. Hilyard, D. A. Cantrell. 2000. IL-12 избирательно регулирует STAT4 через фосфатидилинозитол-3-киназу и Ras-независимые пути передачи сигнала. Евро. J. Immunol. 30: 1425.

↵
Шлаак, Дж. Ф., К. М. Хилкенс, А.П. Коста-Перейра, Б. Штробл, Ф. Абергер, А. М. Фришауф, И. М. Керр. 2002. Типы клеток и специфичные для доноров транскрипционные ответы на интерферон-α: использование настроенных массивов генов. J. Biol. Chem. 277: 49428.

↵
Muller, M., C. Laxton, J. Briscoe, C. Schindler, T. Improta, J. E. Darnell, Jr, G.R. Stark, I.M. Kerr. 1993. Комплементация мутантной клеточной линии: центральная роль полипептида 91 кДа ISGF3 в путях передачи сигналов интерферона-α и -γ.EMBO J. 12: 4221.

↵
Лаллеманд, К., П. Лебон, П. Рицца, Б. Бланшар, М. Г. Тови. 1996. Конститутивная экспрессия определенных изотипов интерферона в лейкоцитах периферической крови здоровых людей и в промоноцитарных клетках U937. J. Leukocyte Biol. 60: 137.

↵
Поль Г., У. Хеллман, Э. Лундгрен, С. Лундберг. 1994. Пять доминирующих подтипов α-интерферона вируса Сендай стимулировали лейкоциты человека.J. Interferon Res. 14: S63.

↵
Фостер, Г. Р., Н. Б. Финтер. 1998. Все ли интерфероны человека I типа эквивалентны ?. J. Viral Hepat. 5: 143.

↵
Streuli, M., A. Hall, W. Boll, W. E. Stewart, II, S. Nagata, C. Weissmann. 1981. Специфичность клеток-мишеней двух видов человеческого интерферона-α, продуцируемого в Escherichia coli , и гибридных молекул, производных от них.Proc. Natl. Акад. Sci. США 78: 2848.

↵
Зун, К. К., Д. Миллер, Дж. Бекиш, Д. Цур Недден, Дж. К. Энтерлайн, Н. Ю. Нгуен, Р. К. Ху. 1992. Очистка и характеристика множества компонентов человеческого лимфобластоидного интерферона-α. J. Biol. Chem. 267: 15210.

↵
Омори Ю., Т. А. Гамильтон. 1995. Элемент ответа, стимулированный интерфероном, и сайт κB опосредуют синергетическую индукцию транскрипции мышиного гена IP-10 с помощью IFN-γ и TNF-α.J. Immunol. 154: 5235.

↵
Одзава К., Т. Масуджима, К. Икеда, Ю. Кодама, Ю. Нономура. 1996. С помощью светового микроскопа с видеоусилением выявлены различные пути ингибирующего действия вортманнина на экзоцитоз. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 222: 243.

↵
Lustre, A. D., J. C. Unkeless, J. V. Ravetch. 1985. γ-Интерферон транскрипционно регулирует ген раннего ответа, содержащий гомологию с белками тромбоцитов.Природа 315: 672.

↵
Хан, И. А., Дж. А. Маклин, Ф. С. Ли, Л. Кашотти, Э. ДеХаан, Дж. Д. Шварцман, А. Д. Ластер. 2000. IP-10 имеет решающее значение для доставки эффекторных Т-клеток и выживания хозяина при инфекции Toxoplasma gondii . Иммунитет 12: 483.

↵
Dufour, J. H., M. Dziejman, M. T. Liu, J. H. Leung, T. E. Lane, A. D. Luster. 2002. Мыши с дефицитом IFN-γ-индуцируемого белка 10 (IP-10; CXCL10) обнаруживают роль IP-10 в генерации и перемещении эффекторных Т-клеток.J. Immunol. 168: 3195.

↵
Ланде, Р., Э. Джакомини, Т. Грасси, М. Э. Ремоли, Э. Иона, М. Миеттинен, И. Юлкунен, Э. М. Кочча. 2003. IFN-αβ, высвобождаемый дендритными клетками человека, инфицированными Mycobacterium tuberculosis , индуцирует экспрессию CXCL10: селективное привлечение NK и активированных Т-клеток. J. Immunol. 170: 1174.

↵
Готтлиб А. Б., Ластер А.Д., Д.Н. Познетт, Д. М. Картер. 1988. Обнаружение индуцированного γ-интерфероном белка IP-10 в псориатических бляшках. J. Exp. Med. 168: 941.

↵
Балашов, К. Э., Дж. Б. Роттман, Х. Л. Вайнер, В. В. Хэнкок. 1999. CCR5 ⁺ и CXCR3 ⁺ Т-клетки увеличиваются при рассеянном склерозе, а их лиганды MIP-1α и IP-10 экспрессируются при демиелинизирующих поражениях головного мозга. Proc. Natl. Акад. Sci. США 96: 6873.

↵
Соренсен, Т.L., M. Tani, J. Jensen, V. Pierce, C. Lucchinetti, VA Folcik, S. Qin, J. Rottman, F. Sellebjerg, RM Strieter, et al. 1999. Экспрессия специфических хемокинов и хемокиновых рецепторов в центральная нервная система больных рассеянным склерозом. J. Clin. Вкладывать деньги. 103: 807.

↵
Патель, Д. Д., Дж. П. Захария, Л. П. Уичард. 2001. Лиганды CXCR3 и CCR5 в синовиальной оболочке ревматоидного артрита. Clin. Иммунол. 98:39.

↵
Шимада, А., Дж. Моримото, К. Кодама, Р. Судзуки, Ю. Оикава, О. Фунае, А. Касуга, Т. Сарута, С. Наруми. 2001. Повышенный уровень IP-10 в сыворотке крови наблюдается при диабете 1 типа. Уход за диабетом 24: 510.

↵
Лю М. Т., Х. С. Кейрстед, Т. Э. Лейн. 2001. Нейтрализация хемокина CXCL10 снижает инвазию воспалительных клеток и демиелинизацию и улучшает неврологическую функцию на вирусной модели рассеянного склероза. J. Immunol. 167: 4091.

↵
Саломон, И., Н. Нецер, Г. Вильдбаум, С. Шиф-Цук, Г. Маор, Н. Карин. 2002. Нацеливание на функцию IFN-γ-индуцируемого белка 10 подавляет продолжающийся адъювантный артрит. J. Immunol. 169: 2685.

↵
Роннблом, Л. Э., Г. В. Альм, К. Оберг. 1991. Аутоиммунные явления у пациентов со злокачественными карциноидными опухолями при лечении интерфероном-α. Acta Oncol. 30: 537.

↵
Бози Э., Минелли Р., Э.Баззигалуппи, М. Салви. 2001. Фульминантный аутоиммунный диабет 1 типа во время терапии интерфероном-α: случай Th2-опосредованного заболевания ?. Диабет. Med. 18: 329.

↵
Quesada, J. R., J. U. Gutterman. 1986. Псориаз и α-интерферон. Ланцет 1: 1466.

↵
Хокинс, М. Дж., Э. К. Борден, Дж. А. Мерритт, Б. С. Эдвардс, Л. А. Болл, Э. Гроссбард, К. Дж. Саймон. 1984. Сравнение биологических эффектов двух рекомбинантных человеческих интерферонов α (rA и rD) на человека.J. Clin. Онкол. 2: 221.

↵
Дер, С. Д., А. Чжоу, Б. Р. Уильямс, Р. Х. Сильверман. 1998. Идентификация генов, дифференциально регулируемых интерфероном α, β или γ с использованием массивов олигонуклеотидов. Proc. Natl. Акад. Sci. США 95: 15623.

↵
Маркус П. И., М. Дж. Секеллик. 1994. Индукция интерферона: регуляция вирусом и клеткой. Хоккайдо Игаку Засси 69: 1320.

↵
Танигучи, Т., А. Такаока. 2001. Слабый сигнал для сильных ответов: пересмотр интерферона-α / β. Nat. Преподобный Мол. Cell Biol. 2: 378.

↵
Sinigaglia, F., D. D’Ambrosio, P. Panina-Bordignon, L. Rogge. 1999. Регуляция оси IL-12 / IL-12R: критический этап дифференцировки Т-хелперных клеток и эффекторной функции. Иммунол. Откр.170: 65.

↵
Фрухт, Д. М., М. Аринджер, Дж. Галон, К. Даннинг, М.Браун, С. Фан, М. Чентола, К. Ю. Ву, Н. Ямада, Х. Эль-Габалави, Дж. Дж. О’Ши. 2000. Stat4 экспрессируется в активированных моноцитах периферической крови, дендритных клетках и макрофагах в местах Th2-опосредованного воспаления. J. Immunol. 164: 4659.

↵
Fukao, T. , D. M. Frucht, G. Yap, M. Gadina, J. J. O’Shea, S. Koyasu. 2001. Индуцируемая экспрессия Stat4 в дендритных клетках и макрофагах и его критическая роль в врожденных и адаптивных иммунных ответах.J. Immunol. 166: 4446.

Подтипы IFN атлантического лосося типа I демонстрируют различия в противовирусной активности и клеточно-зависимой экспрессии: доказательства высокого уровня продуцирующих IFNb / IFNc клеток в лимфоидных тканях рыб

Введение

IFN типа I являются цитокинами, которые играют решающую роль в противовирусный иммунитет позвоночных. ИФН индуцируются и секретируются при распознавании клеткой-хозяином вирусных нуклеиновых кислот и защищают другие клетки от инфекции, индуцируя противовирусные белки, такие как GTPase Mx, протеинкиназа R (PKR) и ген, стимулированный IFN (ISG) 15 (1, 2) .IFNs типа I млекопитающих составляют мультигенное семейство с преобладающими членами IFN-α и IFN-β. Высшие позвоночные животные также кодируют IFN типа III (IFN-λ), которые генетически отличаются от IFN типа I, но обладают схожими противовирусными свойствами (3).

В настоящее время точно установлено, что рыбы обладают IFN типа I, тогда как IFN типа III не были обнаружены у этой группы позвоночных (4–7). Наличие четырех интронов в генах IFN рыб и отсутствие интронов в генах IFN типа I высших позвоночных позволяет предположить, что последние семейства IFN произошли от ретротранспонированного гена IFN у предкового тетрапода амниот (5, 6, 8, 9).Таким образом, IFN-α и IFN-β млекопитающих не имеют истинных гомологов у рыб (5, 6, 8, 9). Тот факт, что ИФН типа I млекопитающих и рыб эволюционировали совершенно по-разному, поднимает интересные вопросы о том, обладают ли они схожей активностью, индуцируются ли они аналогичными путями и обладают ли рыбы специализированными клетками, суперпродуцирующими ИФН, такими как плазмацитоидные дендритные клетки (пДК). млекопитающих.

Семейство рыб IFN типа I намного больше, чем предполагалось первоначально, и содержит по крайней мере четыре подтипа IFNa, IFNb, IFNc и IFNd (8, 10).Самый большой кластер генов IFN был обнаружен у атлантического лосося, где 11 генов IFN были идентифицированы в одной геномной области, включая два IFNa (IFNa1 и IFNa3), четыре IFNb (IFNb1-b4) и пять IFNc (IFNc1-c5). гены (8). IFNa2 лосося (11) и IFNd (GenBank [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/BK008598], инвентарный номер BK008598) кодируются отдельными генами вне этого кластера. Однако IFNa1 и IFNa2 обладают 95% идентичностью последовательностей и очень похожими структурами промоторов (6, 11). У радужной форели были идентифицированы два IFNa, два IFNb и один IFNd, но не были идентифицированы гомологи IFNc (10, 12, 13).У рыбок данио есть кластер генов IFN, аналогичный лососевому на хромосоме 3, кодирующий один IFNa (IFNϕ1 / IFN1) и два гомолога IFNc (IFNϕ2 / IFN2 и IFNϕ3 / IFN3), но без гомологов IFNb (8, 14). Гомолог IFNd рыбок данио IFNϕ4 присутствует на хромосоме 12 (14). IFN типа I рыб можно разделить на две группы в зависимости от наличия двух или четырех цистеинов, образующих одну или две дисульфидные связи, соответственно (4, 13). IFNa и IFNd содержат два цистеина (2C IFN), тогда как IFNb и IFNc содержат четыре цистеина (4C IFN).Интересно, что недавно было обнаружено, что IFN 2C и 4C рыбок данио передают сигнал через два разных рецептора, тогда как все IFN типа I млекопитающих передают сигнал через общий рецептор (14). IFNa, IFNb и IFNc атлантического лосося имеют только 22–32% идентичности последовательностей и заметно различаются по своим промоторным структурам, что позволяет предположить, что они играют разные роли в противовирусной защите (8). О IFNd лосося известно немного.

В этой работе мы решили изучить функциональные различия между четырьмя подтипами IFN, а не различия между отдельными IFN, кодируемыми одним подтипом.Это связано с тем, что члены внутри каждого подтипа демонстрируют относительно небольшие различия в последовательностях (идентичность 90–99%) и, по-видимому, имеют схожие структуры промотора за некоторыми исключениями, такими как IFNa3, который является нетипичным членом IFNa в отношении структуры промотора и индукционных свойств (8 ).

Противовирусная активность гомологов IFNa была продемонстрирована на нескольких видах рыб, включая атлантического лосося, тогда как противовирусные свойства IFNb, IFNc и IFNd изучены меньше (7). Противовирусная активность IFNc и IFNd не была продемонстрирована у лососевых, но гомолог IFNb радужной форели обладал небольшой противовирусной активностью, если вообще имел вообще (13). У рыбок данио показана противовирусная активность IFNc-гомолога IFNϕ2, тогда как IFNϕ4-гомолог IFNd обладает небольшой противовирусной активностью, если вообще имеет вообще (14, 15). В настоящем исследовании мы демонстрируем, что IFNb и IFNc лосося, но не IFNd, индуцируют противовирусную активность в клетках против вируса инфекционного некроза поджелудочной железы (IPNV), патогенного лососем, и сравниваем индукцию антивирусных генов подтипами IFN.

Индукция и клеточно-зависимая экспрессия IFNa, IFNb, IFNc и IFNd в ответ на вирусную РНК, имитирующую полиинозин-полицитидиловую кислоту [поли (I: C)] и R848, также исследуются в этой работе.У млекопитающих большинство клеток распознают вирусную РНК цитоплазматическими рецепторами RIG-I и MDA5, что приводит к транскрипции гена IFN-β (2). В некоторых типах клеток IFN-β индуцируется посредством распознавания вирусной дцРНК с помощью TLR3, который присутствует на поверхности клетки или в эндосомах. пДК распознают вирусную оцРНК через TLR7 в эндосомах и в результате продуцируют особенно высокие уровни IFN-α в дополнение к IFN-β (2, 16). Поли (I: C) имитирует вирусную дцРНК и индуцирует IFN через MDA5 и TLR3 (17, 18), тогда как некоторые имидазохинолины (т.е.е., имиквимод и R848) имитируют вирусную оцРНК и индуцируют продукцию IFN-α через путь TLR7 (19, 20). R848 также является лигандом для TLR8, который экспрессируется в человеческих моноцитах и миелоидных дендритных клетках (DC) и контролирует индукцию провоспалительных цитокинов (21, 22). Рыбы, хотя и менее изучены, по-видимому, обладают такими же путями индукции IFN, как и млекопитающие. Таким образом, рыбы, в том числе лососевые, обладают RIG-I, MDA5, TLR3, TLR7, TLR8, а также ключевыми адапторными белками и регуляторными факторами IFN (IRF) (8, 23–29).Кроме того, рыбы обладают TLR22, который выполняет функции, аналогичные TLR3 (30). Чтобы выяснить пути индукции IFNa, IFNb, IFNc и IFNd, мы стимулировали клеточные линии и живых рыб поли (I: C) или R848 и изучили экспрессию IFN с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qPCR). Данные убедительно подтверждают, что IFNa1 / IFNa2 в основном индуцируется через путь RIG-I / MDA5, тогда как IFNb и IFNc являются основными IFN, индуцируемыми через путь TLR7.

Наконец, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) была использована для определения того, какие клетки экспрессируют различные подтипы IFN в органах атлантического лосося, стимулированного поли (I: C) и R848.Данные FISH и qPCR вместе предполагают, что лосось обладает специализированными клетками в головной почке и селезенке, которые продуцируют особенно высокие уровни IFNb и IFNc в ответ на R848.

Материалы и методы

Клеточные линии

TO-клетки атлантического лосося (31), клетки ASK атлантического лосося (ATCC-CRL-2747; Американская коллекция типовых культур) и клетки эмбриона чавычи (CHSE) (CHSE-214) ( 32) культивировали при 20 ° C в среде L-15, содержащей 1 × MEM раствор несущественной аминокислоты (Invitrogen), 100 Ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 8% (TO и CHSE) или 15% (ASK ) FBS Superior от Biochrom AG.Человеческие клетки HEK293 выращивали при 37 ° C в 5% CO ₂ в Eagle’s MEM, содержащем те же добавки и 10% FBS.

Вирус

IPNV серотипа Sp N1 (33) размножали в клетках CHSE-214, а титры вируса определяли в клетках CHSE-214 с помощью метода 50% тканевой культуры – инфекционной дозы (TCID ₅₀) (34). После заражения вирус абсорбировался в течение 2 часов, после чего среду заменяли на L-15 с добавками и 2% FBS.

Рыба

Здоровые предварительные пестики атлантического лосося стандартного штамма Aquagen (Aquagen) содержали на исследовательской станции аквакультуры Тромсё (Тромсё) в 300-литровых резервуарах, содержащих пресную воду при 10 ° C, и кормили коммерческим сухим кормом.Перед обработкой рыбу анестезировали 0,005% бензокаином (ACD Pharmaceuticals). Рыбы были убиты передозировкой бензокаина или ударом по голове перед извлечением органов. Все обращения с животными проводились в соответствии с норвежскими «Правилами проведения экспериментов на животных», а эксперимент in vivo был представлен и одобрен Норвежским управлением по исследованиям животных до начала.

Выделение первичных клеток

Четыре атлантических лосося (400–600 г) использовали для выделения первичных лейкоцитов почек головы (HKL) и лейкоцитов крови (BL).HKL выделяли, как описано ранее (8), за исключением того, что клетки помещали на 54% перколл (GE Healthcare), а не на градиент 25/54%. Для выделения BL из хвостовой вены брали 4 мл крови и разбавляли 1: 5 средой L-15, содержащей 2% FBS, 100 Ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 40 Ед / мл гепарина. Оставшаяся процедура выделения была такой же, как описано для HKL. Клетки культивировали при 14 ° C.

Производство рекомбинантных IFN

Плазмида, кодирующая открытую рамку считывания (ORF) IFNa1 атлантического лосося, pCR3.1SasaIFN-α1, был доступен из предыдущей работы (6). ORF IFNb лосося (GenBank [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JX524152] инвентарный номер JX524152), гена IFNc (GenBank [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore / JX524153], инвентарный номер JX524153) и IFNd (GenBank [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JX524151] инвентарный номер JX524151) клонировали из библиотеки кДНК головной почки, полученной из S-27609– стимулированный лосось (8) с использованием праймеров, показанных в таблице I, вставленных ниже промотора CMV pcDNA3.3-ТОПО вектор (Invitrogen). Последовательность IFNb показывает 97–99,5% идентичности последовательности с IFNb1 – b4 и наиболее сходна с IFNb2 (99,5%). Последовательность IFNc демонстрирует 96–99,5% идентичности последовательности с IFNc1 – c4 и 90% идентичности с IFNc5 и наиболее сходна с IFNc1 (99,5%). Для получения IFN субконфлюентные клетки HEK293 высевали в 24-луночные планшеты и трансфицировали плазмидой 500 нг IFN с использованием 7 мкл реагента для трансфекции FugeneHD (Roche Diagnostics) на лунку. Через 5 ч после трансфекции среду заменяли на MEM Игла с 10% FBS.Клеточные среды, содержащие IFN, собирали через 48 часов после трансфекции, центрифугировали в течение 5 минут при 3000 × g , фильтровали через фильтр 0,45 мкм и замораживали в аликвотах при -70 ° C до использования. Выходы IFNa, IFNb и IFNc в HEK293 составляли 640 000, 5 000 и 5 800 000 Ед / мл соответственно. IFNd не проявлял активности.

Рекомбинантный IFNd также экспрессировался в Escherichia coli . IFNd амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров с сайтами разрезания BamHI и HindIII (таблица I). Условиями ПЦР были 94 ° C в течение 2 минут, а затем 30 циклов: 94 ° C в течение 30 секунд, 64 ° C в течение 30 секунд и 72 ° C в течение 45 секунд, а затем 72 ° C в течение 7 минут. Продукты ПЦР разделяли на 1,2% агарозном геле, очищали с использованием набора для экстракции гелей Qiagen (Qiagen) и расщепляли рестрикционными ферментами BamHI и HindIII. Расщепленные фрагменты лигировали в вектор экспрессии pQE30 (Qiagen) и трансформировали в клеток E. coli M15 (Qiagen). Индукцию проводили с помощью 0,5 мМ изопропил-β-d-тиогалактозида при 37 ° C в течение 4 часов. Бактерии собирали и обрабатывали ультразвуком на льду в буфере для лизиса (50 мМ NaH ₂ PO ₄, 300 мМ NaCl и 10% глицерин [pH 8]).После центрифугирования осадка при 10000 × g в течение 30 мин, он был солюбилизирован в 8 М мочевине и рекомбинантные белки были очищены с использованием колонки со смолой Ni-NTA (Qiagen) в соответствии с руководством пользователя. Белок из телец включения подвергали рефолдингу по методу рефолдинга IFNa (35). Чистоту рекомбинантного IFNd подтверждали на 4–12% готовом геле SDS-PAGE (Invitrogen Life Technologies), окрашенном SimpleBlue (Invitrogen). Концентрации белка измеряли с использованием набора для анализа белка Pierce Bicinchoninic Acid (Thermo Scientific).

Анализ снижения цитопатического эффекта

Противовирусную активность рекомбинантных IFN определяли в клетках TO с использованием анализа снижения цитопатического эффекта (CPE). Протокол был в основном таким же, как описано ранее (36), за исключением того, что клетки культивировали в L-15 и были инфицированы IPNV при множественности инфицирования (MOI), равной 1. Одна единица IFN определялась как фактор разведения супернатанта HEK293, который индуцировал 50% максимальной защиты клеток ТО от IPNV-индуцированного CPE для каждого IFN.Противовирусную активность IFNd также исследовали путем трансфекции клеток CHSE. Клетки высевали в 96-луночные планшеты (40000 на лунку) и на следующий день трансфицировали экспрессионными плазмидами, кодирующими IFNd или IFNa (положительный контроль) или пустым вектором (pcDNA3.3), используя 100 нг ДНК и 0,25 мкл липофектамина 2000 (Invitrogen). за колодец. Через 72 часа после трансфекции клетки инфицировали IPNV (MOI = 1). Остающийся протокол был таким, как описано выше.

Анализ снижения выхода вируса

Субконфлюентные клетки TO оставляли необработанными (контроль) или обрабатывали 200 ед / мл IFNa, IFNb или IFNc в трех параллельных лунках.Через 24 часа клетки заражали IPNV при MOI, равном 1. Через три дня после инфицирования среды из трех параллельных лунок объединяли и определяли титр IPNV методом TCID ₅₀ (34).

Вестерн-блоттинг

Первичные антитела получали и использовали, как описано ранее (37). Вторичные антитела, козьи антикроличьи и козьи антимышиные HRP (Santa Cruz Biotechnology), использовали в разведениях 1: 20 000 и 1: 10 000, соответственно. Для изучения ингибирующего действия IFN против белка VP3 IPNV клетки TO высевали в 24-луночные планшеты в количестве 10 ⁵ / лунку, обрабатывали IFNa, IFNb или IFNc в концентрации 200, 20, 10 и 2 Ед / мл или оставили без лечения (контроль) и инфицировали через 24 часа IPNV при MOI 1. Клетки собирали через 24 часа после инфицирования в 60 мкл буфера для образцов SDS и подвергали SDS-PAGE в 4-12% NuPAGE Bis-Tris Gel (Invitrogen). Белки наносили на поливинилидендифторидные мембраны, блокировали 5% сухим молоком, инкубировали в течение ночи с анти-VP3 и анти-актиновыми Abs, после чего инкубировали в течение 1 часа со вторичными Abs. Блоты проявляли с использованием хемилюминесцентного субстрата SuperSignal West Pico от Pierce. Индукцию белка Mx изучали путем высева клеток ТО в 24-луночные планшеты (1.5 × 10 ⁵ / лунку) и стимулировали 20 или 200 Ед / мл каждого IFN или оставляли без обработки. Клетки собирали в 60 мкл буфера для образцов SDS через 24 и 48 часов после обработки и подвергали Вестерн-блот-анализу, как описано выше, с использованием поликлональных Ab против белка Mx1 лосося в качестве первичных Ab.

Экспрессия противовирусных генов в обработанных IFN клетках TO

клетки TO (1,5 × 10 ⁵ / лунка) высевали в 24-луночные планшеты и обрабатывали 200 ед. / Мл IFNa, IFNb или IFNc или оставляли без обработки ( контрольные клетки).Для каждой обработки использовали три параллельные лунки. Уровни транскриптов ISG15, ISG58, виперина и PKR определяли через 24 часа, а уровни транскриптов Mx определяли через 12, 24, 48 и 72 часа после обработки IFN. Клетки собирали в 600 мкл буфера RLT и выделяли РНК, как описано в RNeasy Mini Kit от Qiagen. Синтез кДНК и КПЦР проводили, как описано ниже.

Экспрессия IFN и TLR в TO-клетках и лейкоцитах

TO-клетки высевали в 24-луночные планшеты на 1.5 × 10 ⁵ клеток / лунку и стимулировали 1 мкг / мл R848 (InvivoGen) или 10 мкг / мл поли (I: C) (GE Healthcare) или трансфицировали 1 мкг поли (I: C) с использованием трансфекции FuGENE HD реагент при соотношении РНК / FuGENE HD 2: 3. Контрольные клетки инкубировали только с питательной средой. Для обработки использовали три лунки, и клетки собирали через 24 часа в 600 мкл буфера RLT (RNeasy Mini Kit). Выделяли РНК, и относительную количественную ПЦР использовали для определения индукции IFNa, IFNb, IFNc и IFNd. Первичные BL и HKL высевали в 96-луночные планшеты в количестве 1 × 10 ⁶ клеток / лунку и стимулировали 2 мкг / мл R848 или 20 мкг / мл поли (I: C) или оставляли без обработки (контроли) сразу после выделения.Клетки выделяли от четырех рыб, и обработки проводили в дублирующих лунках. Через 2 часа добавляли FBS до конечной концентрации 2%. Через 6 часов после обработки неприлипающие клетки собирали центрифугированием, и осадок лизировали в 200 мкл буфера RLT. Прилипшие клетки были непосредственно лизированы в 200 мкл RLT, и два образца были объединены перед переходом к выделению РНК. Индукцию IFNa, IFNb и IFNc определяли с помощью относительной количественной ПЦР. Базальные уровни транскриптов TLR3, TLR7, TLR8 и TLR22 определяли в нестимулированных клетках ТО, BL и HKL.

Стимуляция лосося поли (I: C) и R848

Рыбу (50–70 г) анестезировали и вводили внутрибрюшинно. с 0,5 мг / мл R848 или 1,0 мг / мл поли (I: C), разведенного в PBS в концентрации 10 мл / кг. Контрольной рыбе вводили только PBS. Через двенадцать часов после инъекции органы (головная почка, селезенка, жабры, печень, сердце, мозг, кожа и яичники) собирали у четырех рыб на обработку. Органы сохраняли в RNAlater (Ambion) для анализа экспрессии IFN методом КПЦР. Для экспериментов FISH образцы тканей (0.5 × 0,5 см) фиксировали в 4% PFA в течение ночи при 4 ° C и трижды промывали 70% этанолом. Образцы ткани хранили в этаноле до замачивания парафином.

Относительная количественная ПЦР транскриптов в клетках

кДНК синтезировали с помощью набора для обратной транскрипции QuantiTect (Qiagen), начиная с 200 нг общей РНК, в соответствии со стандартным протоколом. КПЦР выполняли с использованием 6,1 мкл разведения кДНК 1:10 (за исключением обнаружения 18S рРНК, которое выполняли с разведением 1: 1000) в 15-мкл реакционной смеси, содержащей 7.5 мкл 2 × SYBR green PCR Master Mix (Applied Biosystems) и 230 нМ прямого и обратного праймеров (таблица I). Каждый образец анализировали в трех лунках в системе 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Смеси инкубировали при 95 ° C в течение 20 с, после чего следовали 40 циклов при 95 ° C в течение 3 секунд и 60 ° C в течение 30 секунд. Отсутствие артефактов праймер-димер было подтверждено с помощью шага кривой плавления. Значения относительной экспрессии были нормализованы по уровням 18S рРНК и проанализированы, как описано ранее (38).Кратное увеличение репрезентативных генов рассчитывали путем сравнения экспрессии генов в обработанных и необработанных клетках.

КПЦР транскриптов IFN в органах

Экспрессия IFNa, IFNb и IFNc в органах атлантического лосося, стимулированного поли (I: C) и R848, определялась абсолютной количественной ПЦР. Образцы органов гомогенизировали с использованием гомогенизатора тканей Precellys24 (Bertin Technologies). РНК из органов выделяли с помощью набора E.Z.N.A Total RNA Kit I (Ω Bio-Tec). кДНК синтезировали, как описано для клеток.Для построения стандартных кривых плазмиды, содержащие ORF для IFNa, IFNb, IFNc и 18S рРНК, разводили в семи 10-кратных разведениях, начиная с 3 × 10 ⁶ копий / мкл, и включали в каждый цикл кПЦР. КПЦР выполняли, как описано для клеток. Транскрипты рассчитывали как количество копий на нанограмм РНК. Праймеры для количественной ПЦР приведены в Таблице I. Экспрессию IFNd в образцах тех же органов определяли с помощью относительной количественной ПЦР с использованием рыб, которым вводили PBS, в качестве калибратора.

Идентификация клеток, продуцирующих IFN, с использованием шаблонов FISH

для конструирования меченных дигоксигенином (DIG) и флуоресцеином РНК-зондов, специфичных для мРНК IFNa, IFNb, IFNc и IgM лосося, была получена с помощью ПЦР на экспрессионных плазмидах (IFN) и кДНК (IgM) с использованием праймеров с удлинениями Т3 и Т7 (Таблица I).Полученные ампликоны очищали и использовали в качестве матриц для транскрипции in vitro, которую выполняли с использованием набора для маркировки РНК DIG или смеси для маркировки флуоресцеиновой РНК (Roche Diagnostics) с соответствующими полимеразами Т3 и Т7 для создания меченых антисмысловых и таких же смысловых зондов РНК, соответственно. . Меченые зонды окончательно очищали с использованием микроколонок Illustra ProbeQuant G-50 (GE Healthcare). Первую часть процедуры гибридизации in situ проводили, как описано для гибридизации с одним зондом (39).Для обнаружения двух различных мРНК на одном предметном стекле ткани один зонд был мечен DIG, а другой зонд был мечен флуоресцеином. Зонд, меченный флуоресцеином, был обнаружен первым, и это было достигнуто с использованием HRP-конъюгированных Fab-фрагментов антифлуоресцеина (Roche Diagnostics) и TSA Plus Fluorescein System (PerkinElmer Life Sciences) в соответствии с инструкциями производителя. Затем инактивацию HRP проводили инкубацией в растворе 1% перекиси водорода в TBST в течение 45 мин.Обнаружение DIG-меченного зонда осуществляли с использованием HRP-конъюгированных фрагментов Fab против DIG (Roche Diagnostics), TSA Plus Biotin и Streptavidin-Texas Red Kit (Perkin Elmer Life Sciences). Ядра окрашивали DAPI, и срезы помещали в раствор 50% глицерина в PBS. Изображения были получены с использованием Leica DM 6000 B и конфокального микроскопа Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия). В качестве контроля специфичности окрашивания каждое дважды окрашенное слайд имело набор из двух контрольных слайдов; на одном слайде был меченный флуоресцеином антисмысловой зонд (мРНК 1) и смысловой зонд, меченный DIG (мРНК 2), а на другом слайде — меченный флуоресцеином смысловой зонд (мРНК 1) и антисмысловой зонд, меченный DIG (мРНК 2). ).Ткани рыб, которым вводили PBS, также были исследованы, и они были окрашены отрицательно для всех IFN.

Статистический анализ

Непарный тест Стьюдента t был использован для расчета статистики, где p ≤ 0,05 считалось статистически значимым различием.

Результаты

Противовирусная активность IFNa, IFNb, IFNc и IFNd

Рекомбинантные IFNa, IFNb, IFNc и IFNd атлантического лосося получали путем трансфекции клеток HEK293 соответствующими экспрессирующими плазмидами и сбора клеточной среды через 48 часов.Противовирусную активность IFNa, IFNb и IFNc измеряли по их способности защищать клетки TO лосося от индуцированного IPNV CPE, снижению вирусных титров и ингибированию вирусного белка VP3 (рис. 1). IFNa, IFNb и IFNc все ингибировали IPNV-индуцированный CPE в клетках TO атлантического лосося, но IFNb давал заметно более низкую максимальную защиту, чем IFNa и IFNc (фиг. 1A). Аналогичная защита наблюдалась в клетках ASK (данные не показаны). Максимальная защита против IPNV была хорошо достигнута при 200 Ед / мл для всех IFN, и эту концентрацию, таким образом, использовали для сравнения активности IFN в последующих исследованиях.Доза вируса MOI 1 вместо 0,1 была использована для обеспечения инфицирования большинства клеток. В результате максимальная защита не достигла 100%, как показано в предыдущей работе (36, 37).
РИСУНОК 1.
IFN-индуцированная противовирусная активность в клетках TO. ( A ) Анализ восстановления CPE. Клетки обрабатывали двукратными серийными разведениями супернатантов из HEK293, содержащих указанные IFN, в течение 24 ч перед инфицированием IPNV (MOI = 1). Когда в необработанных инфицированных клетках наблюдали полный CPE, клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым и измеряли OD при 550 нм. Процент выживаемости клеток рассчитывали на основе необработанных инфицированных клеток и необработанных неинфицированных клеток. Показаны два независимых эксперимента. ( B ) Анализ снижения выхода вирусов. Клетки обрабатывали 200 ед. / Мл IFNa, IFNb или IFNc или оставляли без обработки (контроль) в течение 24 ч перед инфицированием IPNV (MOI = 1). Через 72 часа три лунки, используемые для каждой обработки, были объединены, и выход вируса в культуральной среде был определен методом TCID ₅₀. Показаны средние значения ± стандартное отклонение от трех независимых титрований.Данные представляют два независимых эксперимента. ( C ) Клетки из эксперимента B окрашивали кристаллическим фиолетовым и рассчитывали выживаемость клеток, как описано выше. ( D ) Ингибирование экспрессии белка VP3 IPNV. Клетки обрабатывали различными количествами IFNa, IFNb и IFNc (0–200 Ед / мл) в течение 24 часов и инфицировали IPNV (MOI = 1). Для обнаружения VP3 через 24 часа после инфицирования использовали вестерн-блот-анализ. Данные представляют два независимых эксперимента. * р <0.05, ** р <0,005.

IFNa, IFNb и IFNc в дозе 200 Ед / мл снижали титры вирусов в клетках TO, инфицированных IPNV, в 27000, 80 и 43000 раз, соответственно (рис. 1B). Низкое снижение титров IPNV, наблюдаемое в клетках, обработанных IFNb, соответствовало более низкой выживаемости клеток (фиг. 1C). Все три IFN ингибировали продукцию белка VP3 IPNV дозозависимым образом, при этом IFNa и IFNc проявляли сходный и более сильный ингибирующий эффект, чем IFNb (фиг. 1D). При 200 Е / мл VP3 не обнаруживался в клетках, обработанных IFNa- и IFNc, тогда как VP3 был сильно снижен, но все же обнаруживался в обработанных IFNb клетках.Увеличение дозы IFNb до 2000 Ед / мл не приводило к дальнейшему снижению синтеза VP3 (данные не показаны).

В отличие от других IFN, IFNd не проявлял противовирусной активности против IPNV. Ген IFNd лосося был обнаружен связанным с CD79b в недавно опубликованной геномной последовательности (дополнительный рисунок 1). ORF для IFNd клонировали из библиотеки кДНК головной почки, и идентичность аминокислотной последовательности с IFNa1, IFNb и IFNc составляла 37, 30 и 26% соответственно (дополнительные рисунки 2A, 2B). Рекомбинантный IFNd продуцировался как в клетках HEK293, так и в E.coli и тестировали на противовирусную активность, но ни один из препаратов не мог ингибировать IPNV-индуцированный CPE в клетках TO (рис. 2A, 2B). Чтобы исключить, что отрицательные результаты были вызваны неправильной продукцией, секрецией или укладкой IFNd, использовали третий подход, при котором клетки CHSE-214 трансфицировали плазмидами экспрессии IFNd и IFNa перед инфицированием IPNV. Хотя плазмида IFNa индуцировала высокую защиту против IPNV-индуцированного CPE, как и ожидалось, никакой защиты не наблюдалось с плазмидой IFNd (фиг.2С).
РИСУНОК 2.
Противовирусная активность IFNd, измеренная с помощью анализа восстановления CPE. Клетки TO обрабатывали двукратными серийными разведениями IFNd, продуцированного в клетках HEK293 ( A ) или в E. coli ( B ) в течение 24 часов перед инфицированием IPNV (MOI = 1). □, необработанные IPNV-инфицированные контрольные клетки (+) или необработанные неинфицированные контрольные клетки (-). ( C ) Клетки CHSE высевали в 96-луночные планшеты и трансфицировали экспрессионными плазмидами, кодирующими IFNd, IFNa, или пустым вектором в количестве 100 нг / лунку.Через 72 часа клетки инфицировали IPNV (MOI = 1). Когда наблюдали полный CPE в необработанных инфицированных клетках, выживаемость клеток измеряли по окрашиванию кристаллическим фиолетовым (OD при 550 нм). Значения являются средними ± стандартное отклонение ( n = 4).

Индукция противовирусных генов IFNa, IFNb и IFNc

Способность IFNa, IFNb и IFNc индуцировать противовирусные гены сравнивали путем измерения их влияния на экспрессию Mx, ISG15, PKR, виперина и ISG58, которые являются типичные противовирусные ISG типа I у рыб и млекопитающих.Клетки ТО обрабатывали 200 ед. / Мл каждого IFN, и уровни мРНК измеряли с помощью относительной количественной ПЦР. Экспрессию Mx определяли во временном исследовании (фиг. 3A), тогда как экспрессию других ISG определяли через 24 часа после стимуляции (фиг. 3B). Кинетика экспрессии Mx была очень похожей в клетках, стимулированных IFNa и IFNc, с пиком через 24 часа. IFNb, напротив, давал задержанную экспрессию Mx с пиком через 48 часов. Подобно Mx, индукция ISG15, виперина, ISG58 и PKR была сопоставима в клетках, обработанных IFNa- и IFNc, тогда как индукция IFNb была в два-три раза ниже.Индукция Mx IFNs была подтверждена на уровне трансляции вестерн-блоттингом клеток TO, обработанных 20 и 200 U / ml IFN в течение 24 и 48 часов (рис. 4). Через 24 часа IFNa и IFNc индуцировали сильную экспрессию белка Mx при 200 ед. / Мл и более слабую экспрессию при 20 ед / мл, тогда как IFNb индуцировал заметно более низкую экспрессию Mx при обеих концентрациях. Увеличение времени инкубации до 48 ч приводило к более высокой индукции белка Mx при всех обработках IFN, а белок Mx, индуцированный IFNb, достиг уровней, аналогичных тем, которые наблюдались при использовании IFNa и IFNc. Эффект рекомбинантного IFNd на экспрессию белка Mx также изучался с помощью вестерн-блоттинга, но оказался отрицательным (данные не показаны).
РИСУНОК 3.
IFN-индуцированная активация антивирусных генов в клетках TO. Клетки обрабатывали 200 ед / мл IFNa, IFNb и IFNc, и уровни мРНК ISG измеряли с помощью относительной количественной ПЦР. ( A ) Уровни мРНК Mx определяли через 12, 24, 48 и 72 часа после обработки IFN. ( B ) Уровни мРНК ISG15, виперина, PKR и ISG58 определяли через 24 часа после обработки IFN.Увеличение кратности было рассчитано относительно нестимулированных клеток, и показаны средние значения из трех лунок ± стандартное отклонение. * p <0,05, ** p <0,005.
РИСУНОК 4.
IFN-индуцированная экспрессия белка Mx в клетках ТО. Клетки обрабатывали 20 или 200 ед / мл IFNa, IFNb или IFNc или оставляли без обработки (Ctrl). Лизаты клеток собирали через 24 и 48 ч и подвергали Вестерн-блоттингу с использованием анти-Mx и антиактин-специфических антител. Данные представляют два независимых эксперимента.

Индукция IFNa, IFNb, IFNc и IFNd в органах после обработки поли (I: C) и R848

Предварительно смолтам атлантического лосося вводили поли (I: C), R848 или PBS и органы (головная почка (селезенка, жабры, печень, сердце, мозг, кожа и яичники) собирали через 12 часов для измерения транскриптов IFNa, IFNb и IFNc с помощью абсолютной количественной ПЦР. Были использованы последовательности праймеров, консервативные для IFNa1 и IFNa2, для всех IFNb или всех генов IFNc, соответственно (таблица I). Первоначальные исследования показали, что 12 часов были самой ранней точкой времени для приблизительного пика экспрессии IFN для обоих стимуляторов (данные не показаны).Как видно на фиг. 5, IFNa и IFNc экспрессировались конститутивно во всех органах, в то время как очень мало транскриптов IFNb или их не было обнаружено, за исключением яичников, где все IFNs показали высокую базальную экспрессию. Три подтипа IFN показали поразительные различия в свойствах экспрессии в ответ на стимуляцию поли (I: C) и R848. IFNa индуцировался поли (I: C) во всех изученных органах с максимальной активацией в селезенке и печени и наивысшим уровнем транскриптов IFNa в селезенке, жабрах, яичниках и сердце.IFNa слегка индуцировался R848 в некоторых органах, но уровни транскриптов были низкими по сравнению с рыбами, стимулированными поли (I: C). В отличие от IFNa, IFNb показал слабый ответ на поли (I: C) в любом органе, тогда как стимуляция R848 вызвала сильное увеличение транскрипции IFNb в селезенке, головной почке и жабрах, что привело к относительно высоким уровням транскриптов. В отличие от IFNa и IFNb, IFNc индуцировался как поли (I: C), так и R848 в головной почке. У рыб, стимулированных поли (I: C), уровни транскрипта IFNc были выше, чем IFNa в головной почке, ниже в селезенке и жабрах и аналогичны IFNa в сердце.У рыб, стимулированных R848, уровни транскриптов IFNb и IFNc были одинаковыми в головной почке и селезенке. IFNc не показал значимой активации в других органах в ответ на R848.
Таблица I. Праймеры, использованные в этом исследовании РИСУНОК 5.
Экспрессия IFNa, IFNb и IFNc в органах атлантического лосося, инъецированных поли (I: C), R848 или PBS. Предварительно смолтам атлантического лосося вводили 10 мг / кг поли (I: C), 5 мг / кг R848 или PBS. Через 12 ч органы брали у четырех рыб на группу. Уровни мРНК IFNa, IFNb и IFNc определяли с помощью абсолютной количественной ПЦР.Каждый образец анализировали в трех лунках, и плазмиды, содержащие IFNa, IFNb, IFNc и 18s рРНК, использовали для построения стандартных кривых. Белые столбцы показывают экспрессию (число копий / нанограмм РНК) IFNa, IFNb и IFNc у контрольных рыб, которым вводили PBS, тогда как серые столбцы показывают экспрессию IFN у рыб, стимулированных R848 или поли (I: C). Цифры за пределами столбцов представляют собой кратковременную активацию по сравнению с рыбами, которым вводили PBS. Показаны средние значения для четырех рыб ± стандартное отклонение. HK, Головная почка.
Экспрессию
IFNd в органах измеряли с помощью относительной количественной ПЦР с использованием в качестве калибратора рыб, которым вводили PBS (рис. 6А, 6Б). Подобно IFNa и IFNc, IFNd демонстрировал относительно высокую конститутивную экспрессию с самыми высокими уровнями транскриптов в головных почках, селезенке и жабрах и самыми низкими в коже (фиг. 6A). Как показано на фиг. 6B, транскрипты IFNd в органах рыб, обработанных поли (I: C) — и R848, не показали увеличения или были слегка подавлены. Наконец, мы измерили экспрессию IFNd в клетках TO, стимулированных внеклеточно поли (I: C) или R848 или трансфицированных поли (I: C). Ни одна из обработок не привела к усилению регуляции транскриптов IFNd через 6 часов (данные не показаны) и через 24 часа после обработки (рис.6С). Чтобы гарантировать, что отсутствие положительной регуляции не было связано с проблемами праймера, относительные уровни экспрессии IFNd в клетках TO были исследованы с использованием трех различных пар праймеров, включая те, которые использовались в исследованиях другими (10). Все три пары праймеров дали аналогичные результаты. Таким образом, из этих экспериментов кажется, что IFNd не индуцируется поли (I: C) или R848 у атлантического лосося.
РИСУНОК 6.
Экспрессионные свойства IFNd. ( A ) Сравнение экспрессии IFNd в органах атлантического лосося, которому инъецировали PBS.Четырем рыбам вводили PBS, и через 12 часов ткани собирали для выделения РНК. Экспрессию генов нормализовали по отношению к 18S рРНК, и относительную экспрессию IFNd в каждом органе определяли относительно уровней транскриптов в коже (= 1). Показаны средние значения для четырех рыб ± стандартное отклонение. ( B ) Экспрессия IFNd в органах атлантического лосося, инъецированного поли (I: C) или R848. Предварительно смолтам атлантического лосося вводили 10 мг / кг поли (I: C), 5 мг / кг R848 или PBS. Через 12 ч органы брали у четырех рыб на группу.Уровни мРНК IFNd определяли с помощью относительной количественной ПЦР с использованием в качестве калибратора рыб, которым вводили PBS. Каждый образец анализировали в трех лунках. Показаны средние значения для четырех рыб ± стандартное отклонение. ( C ) Экспрессия IFNd в клетках TO, обработанных поли (I: C) или R848. Клетки TO стимулировали 1 мкг / мл R848 или 10 мкг / мл поли (I: C) в среде или трансфекцией 1 мкг / мл поли (I: C). РНК собирали через 24 часа, и экспрессию IFNd анализировали с помощью относительной количественной ПЦР с использованием необработанных клеток в качестве калибратора.Были использованы лунки в трех экземплярах, и средние значения ± стандартное отклонение нанесены на график. HK, Головная почка.

Индукция IFNa, IFNb и IFNc в клетках TO и первичных HKL и BL после обработки поли (I: C) и R848

В настоящей работе мы изучали, может ли поли (I: C) трансфекция клеточных линий индуцируют IFNb и IFNc, потому что это лечение активирует путь MDA5 и, как известно, сильно индуцирует IFNa в клетках лосося (17, 36). Изменения в транскриптах IFN измеряли через 6 и 24 часа после трансфекции, но поскольку увеличение количества транскриптов было самым высоким через 24 часа, показаны только эти данные.Хотя незначительное увеличение количества транскриптов IFNb и IFNc наблюдалось в клетках TO, трансфицированных поли (I: C), IFNα был индуцирован намного сильнее (фиг. 7A). Поскольку R848 сильно индуцировал IFNb и IFNc в головной почке и селезенке, мы хотели изучить его влияние на клеточные линии и первичные HKL и BL. Изменения в транскриптах IFN измеряли через 6 часов после добавления R848, поскольку в этот момент времени ранее наблюдалось максимальное увеличение транскриптов IFNb в HKL, обработанном лигандом TLR7 / TLR8 S-27609 (8). В HKL R848 индуцировал сильное увеличение транскриптов IFNb и небольшое увеличение транскриптов IFNa и IFNc (рис.7Б). В BL обработка R848 вызвала более умеренное увеличение транскриптов IFNb и еще меньшее увеличение транскриптов IFNa и IFNc (фиг. 7C). Внеклеточное добавление поли (I: C) к клеткам ТО и лейкоцитам дало увеличение транскриптов IFNa, как ожидалось, но небольшое увеличение транскриптов IFNb также наблюдалось в HKL и BL.
РИСУНОК 7.
Экспрессия IFNa, IFNb и IFNc в клетках TO, первичном HKL и первичном BL, обработанном R848 и поли (I: C). ( A ) Клетки TO стимулировали 1 мкг / мл R848 или 10 мкг / мл поли (I: C) или трансфицировали 1 мкг / мл поли (I: C). РНК собирали через 24 часа, и экспрессию IFN анализировали с помощью относительной количественной ПЦР с использованием необработанных клеток в качестве калибратора. Были использованы лунки в трех экземплярах, и средние значения ± стандартное отклонение нанесены на график. Лейкоциты выделяли из головной почки ( B ) или крови ( C ) четырех рыб и добавляли поли (I: C) (20 мкг / мл) или R-848 (2 мкг / мл). среда сразу после посева клеток. После 6 ч инкубации клетки собирали для выделения РНК и относительного анализа количественной ПЦР. Увеличение кратности рассчитывали с использованием необработанных клеток в качестве калибратора.Данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение для четырех рыб, выловленных в дублированных лунках. BL — лейкоциты крови; HKL, лейкоциты головной почки.

FISH IFN на ткани лосося, стимулированного поли (I: C) и R848

Чтобы выяснить, продуцируются ли IFNa, IFNb и IFNc одними и теми же или разными типами клеток в ответ на лиганды TLR7 / TLR8 и MDA5 / TLR3 / TLR22, мы выполнили FISH на срезах головной почки, селезенки, печени и жабр рыб, которым инъецировали R848 и поли (I: C), используя двойную FISH, нацеленную на два разных IFN-мРНК одновременно (рис. 8). Исследования, включающие зонд для H-цепи IgM, также были выполнены для окрашивания В-клеток, поскольку В-клетки млекопитающих экспрессируют TLR7 (21).
РИСУНОК 8.
FISH IFNa, IFNb и IFNc в головной почке, селезенке, жабрах и печени атлантического лосося через 12 часов после инъекции поли (I: C) или R848. ( A ) Изображения (A a ), (A d ), (A g ) и (A i ) показывают клетки, экспрессирующие IFNa, а изображения (A b ), ( A e ), (A h ) и (A k ) демонстрируют клетки, экспрессирующие IFNc, в органах рыб, стимулированных поли (I: C), с использованием отдельных зондов IFN.Клетки, экспрессирующие IFNb, не наблюдались в органах рыб, стимулированных поли (I: C). На изображениях (A) (A c ), (A f ), (A i ) и (A l ) показаны клетки, коэкспрессирующие IFNb (зеленый) и IFNc (красный) в органах. стимулированных R848 рыб с использованием двух зондов IFN. Совместная экспрессия IFNb и IFNc была подтверждена конфокальной микроскопией, как показано в ( B ). В ( C ) изображение (C n ) показывает окрашивание клеток в селезенке рыб, обработанных поли (I: C), после когибридизации с зондами IFNa (красный) и IgM (зеленый).На (C) изображение (C o ) показывает окрашивание клеток в селезенке рыб, обработанных R848, после когибридизации с зондами IFNb (красный) и IgM. ( D ) Изображения дают обзор окрашивания IFN в срезах почек головы рыб, стимулированных поли (I: C) и R848. Стрелки в (Aa) и (Ab) указывают на эндотелиальные клетки. Масштабные линейки, 25 мкм на изображениях (B m ); 100 мкм в остальных. Все изображения были получены в обычном флуоресцентном микроскопе, за исключением изображений (Bm), которые были получены в конфокальном микроскопе.Эксперименты проводились на тканях по крайней мере трех человек за один сеанс лечения. HK, Головная почка.

Как и ожидалось по результатам кПЦР, клетки, экспрессирующие IFNb, не наблюдались в тканях рыб, стимулированных поли (I: C) (данные не показаны). Напротив, клетки, экспрессирующие IFNa, наблюдались во всех исследованных тканях (фиг. 8Aa, 8Ad, 8Ag, 8Aj), тогда как клетки, экспрессирующие IFNc, наиболее легко наблюдались в головной почке и селезенке рыб, стимулированных поли (I: C). (Рис. 8Ab, 8Ae). В головной почке IFNa-положительные клетки были связаны с синусоидами и эндотелием кровеносных сосудов (рис.8Аа). IFNc-положительные клетки окрашивались более интенсивно, имели более удлиненную форму и, казалось, выстилали синусоиды, но не были обнаружены в эндотелиальных клетках (фиг. 8Ab). В селезенке многочисленные IFNa-положительные клетки присутствовали в разных областях (фиг. 8Ad). Экспрессирующие IFNc клетки в селезенке, по-видимому, связаны с синусоидами и, как правило, их количество меньше по сравнению с IFNa (фиг. 8Ae). Иногда наблюдали коэкспрессию IFNa и IFNc в клетках головной почки, селезенки и жабр (данные не показаны). В жабрах IFNa-положительные клетки присутствовали во вторичных ламеллах жабр, предположительно столбчатых клетках (фиг. 8Ag). IFNc демонстрировал экспрессию, аналогичную IFNa, в жабрах, но их было меньше (фиг. 8Ah). В печени IFNα сильно экспрессируется множеством клеток, разбросанных по ткани (фиг. 8Aj). IFNc-положительных клеток в печени было намного меньше по сравнению с IFNa-положительными клетками (фиг. 8Ak). Двойное окрашивание селезенки IFNa и IgM показало, что клетки, экспрессирующие IFNa и IgM, располагались в разных областях (рис.8Сн). Клетки, экспрессирующие IgM, не экспрессировали ни IFNa, ни IFNc (данные не показаны). Клетки, окрашенные IFNa- и IFNc, в кровеносных сосудах не обнаруживались. Меланомакрофаги легко наблюдались в головной почке и были интерпретированы как IFNa и IFNc отрицательные (данные не показаны). В целом, результаты FISH хорошо согласуются с результатами количественной ПЦР для рыбы, обработанной поли (I: C).

У лосося, стимулированного R848, FISH показал сильную экспрессию IFNb и IFNc в отдельных клетках головной почки и селезенки (фиг. 8Ac, 8Af).Большинство этих клеток показали коэкспрессию IFNb и IFNc (фиг. 8B). Этих клеток было относительно немного по сравнению с IFN- и IFNc-положительными клетками, обнаруженными в тех же органах рыб, стимулированных поли (I: C) (фиг. 8D). Паттерн экспрессии IFNb / c-положительных клеток в головной почке и селезенке заметно отличался от паттерна экспрессии IFNc у рыб, которым вводили поли (I: C). IFNb / IFNc-положительные клетки были распределены по паренхиме головной почки и иногда наблюдались группами по 10–20 клеток (рис.8Dr). Кластеры IFNb / c-положительных клеток также наблюдались в селезенке.

Меланомакрофаги были легко идентифицированы с помощью световой микроскопии, рассеяны по головной почке и, в меньшей степени, в селезенке, но не экспрессировали IFNb и IFNc на детектируемом уровне (данные не показаны). Двойное окрашивание на IFNb и C-область Н-цепи IgM показало, что IgM-положительные клетки не экспрессировали IFNb на детектируемом уровне. В селезенке IgM-положительные клетки были расположены в большие кластеры, а IFNb-положительные клетки часто располагались внутри или в непосредственной близости от этих кластеров (рис. 8Co). Эта картина не наблюдалась в головной почке, где IgM-положительные клетки были более равномерно распределены по паренхиме (данные не показаны). Только несколько IFNb-положительных клеток были обнаружены в жабрах, в основном в первичных ламеллах, и эти клетки иногда демонстрировали коэкспрессию IFNc (фиг. 8Ai). Окрашивание клеток на IFNb и IFNc редко наблюдалось в печени, как ожидалось из данных кПЦР (фиг. 8A1). Взятые вместе, результаты позволяют предположить, что IFNb и IFNc продуцируются разными клетками лимфоидных тканей в ответ на лиганд TLR7 / TLR8 R848.Однако количество IFNb / IFNc-положительных клеток в этих срезах было намного ниже, чем ожидалось по результатам количественной ПЦР.

Экспрессия TLR в органах и клетках

Поскольку индукция IFN поли (I: C) и R848 сильно зависит от распознавания лиганда TLR в клетках, мы измерили конститутивную экспрессию TLR3, TLR7, TLR8 и TLR22 в клетках ТО и BL и HKL лосося методом КПЦР (рис. 9). Клетки ТО показали более высокие уровни транскриптов TLR3, чем лейкоциты, тогда как уровень транскриптов TLR8 был заметно выше в HKL по сравнению с клетками ТО. TLR7 не обнаруживался в клетках ТО и присутствует в лейкоцитах на низком уровне. TLR22 не обнаруживался в клетках ТО, но умеренно экспрессировался в лейкоцитах.
РИСУНОК 9.
Экспрессия TLR3, 7, 8 и 22 в клетках TO и первичных BL и HKL, измеренная с помощью qPCR. Клетки ТО высевали в трехкратные лунки, и через 24 часа собирали РНК для выделения РНК и количественной ПЦР. Лейкоциты выделяли из крови или головных почек четырех атлантических лососей. Клетки от каждой рыбы высевали в двойные лунки и брали образцы для выделения РНК и количественной ПЦР через 6 часов.Столбики показывают значения среднего порогового цикла (Ct) ± стандартное отклонение для трех лунок (клетки TO) или двух лунок от четырех рыб (кровь и лейкоциты почки головы). ND, не обнаруживается в клетках ТО (Ct> 40). BL — лейкоциты крови; HKL, лейкоциты головной почки.

Обсуждение

Атлантический лосось обладает большим кластером генов IFN типа I в одной и той же геномной области, включая IFNa подтипа 2C IFNa и IFNb и IFNc подтипа 4C IFNc (8). Кроме того, ген IFNd подтипа 2C IFN расположен вне этого кластера (дополнительный рис.1) (8, 10). Хотя функции гомологов IFNa были изучены у нескольких видов рыб, включая атлантического лосося, функции других подтипов IFN изучены меньше. Эта работа демонстрирует, что IFNb и IFNc играют важную, но отличающуюся от IFNa роль в противовирусном иммунитете атлантического лосося, тогда как противовирусная роль IFNd не была подтверждена. Более того, FISH впервые продемонстрировал клеточно-зависимую экспрессию IFNa, IFNb и IFNc в тканях рыб.

IFNa и IFNc лосося проявляли сходную противовирусную активность против IPNV, индуцировали аналогичные уровни транскриптов противовирусных генов ISG15, Mx, виперина и PKR в клеточных линиях и демонстрировали сходную кинетику во времени индукции транскрипции Mx.IFNb также обладал противовирусной активностью, но максимальная полученная защита была ниже, чем с IFNa и IFNc. Соответственно, IFNb индуцировал более низкую экспрессию противовирусных генов, но кинетика индукции Mx предполагает, что IFNb вызывает замедленный ответ по сравнению с IFNa и IFNc. Связывание с разными рецепторами или различия во взаимодействии с одним и тем же рецептором могут объяснить, почему IFNb имеет меньшую противовирусную активность in vitro по сравнению с IFNa и IFNc. В отличие от других IFN, IFNd не проявлял противовирусной активности в клетках TO и CHSE, что позволяет предположить, что IFNd лосося либо не обладает противовирусной активностью, либо только определенные клетки обладают рецепторами IFNd.Исследования на рыбках данио показали, что 2C IFN и 4C IFN связываются с двумя разными рецепторами (14). Обладают ли лососевые двумя или более IFNR, пока неизвестно. Противовирусная активность IFNd, по-видимому, не была продемонстрирована на рыбах, но IFN Tetraodon nigroviridis , который является гомологом IFNd, индуцировал сильную экспрессию противовирусного гена Mx в первичных клетках головки почек (9). У личинок рыбок данио гомолог IFNd IFNϕ4 не проявлял противовирусной активности, тогда как гомолог IFNa IFNϕ1 и гомолог IFNc IFNϕ2 проявляли сильную противовирусную активность (14).

IFNa, IFNb, IFNc и IFNd показали заметные различия в индукции имитаторами вирусных нуклеиновых кислот поли (I: C) (MDA5, TLR3 и лиганд TLR22) и R848 (лиганд TLR7 / TLR8), что соответствует с их очень разными промоторными структурами (дополнительный рис. 3). Исследования экспрессии подтверждают, что IFNa1 / IFNa2 являются основными IFN, индуцируемыми посредством пути RIG-I / MDA5, поскольку IFNa сильно индуцировался в клеточных линиях, трансфицированных поли (I: C), тогда как IFNb и IFNc показали лишь незначительные ответы, а IFNd показал нет ответа.IFNa умеренно индуцировался в клеточных линиях внеклеточным добавлением поли (I: C), что указывает на индукцию через TLR3, поскольку TLR22 не экспрессируется в клетках TO или ASK. IFNb, IFNc и IFNd не показали ответа в клеточных линиях после добавления поли (I: C), что позволяет предположить, что они не индуцируются через TLR3. Предпочтительная индукция IFNa1 / IFNa2 через пути RIG-I / MDA5 и TLR3 согласуется с наличием одного сайта связывания NF-κB, фланкированного двумя сайтами связывания IRF в промоторе IFNa1 и IFNa2 (11), и очевидным отсутствием мотивов NF-κB в промоторах IFNb, IFNc и IFNd (дополнительный рис. 3). Активация NF-κB вместе с активацией IRF3 / IRF7 имеет решающее значение для индукции IFN-β млекопитающих через эти пути (40). Более того, промотор IFNa1 лосося активируется IPS-1, который является ключевым адаптерным белком пути RIG-I / MDA5 (29). Хотя поли (I: C) мало влиял на IFNc в клеточных линиях, было интересно увидеть, что инъекция поли (I: C) рыбам сильно индуцирует IFNc в головных почках, селезенке, жабрах и сердце. Это предполагает, что участвует путь индукции, отличный от пути RIG-I / MDA5 или TLR3.Участвует ли TLR22 в индукции IFNc — это предмет будущих исследований, поскольку TLR22 конститутивно экспрессируется в первичных лейкоцитах, но не в клеточных линиях лосося (Рис. 9). IFNb и IFNd не индуцировались в значительной степени поли (I: C) в тестируемых органах, что свидетельствует о том, что они не индуцируются через пути RIG-I / MDA5 или TLR3 / TLR22.

Исследования кПЦР in vivo с R848 показали, что IFNb и IFNc являются основными IFN, индуцируемыми посредством пути TLR7 / TLR8, и что этот путь действует в основном в лимфоидных органах и жабрах. Напротив, IFNa и IFNd не индуцировались в значительной степени R848 в головной почке, а IFNa проявлял лишь незначительный ответ в селезенке рыб, обработанных R848. Аналогичные результаты были ранее получены на головной почке лосося, получавшем имидазохинолин S-27609 (8). Ни один из IFN не индуцировался стимуляцией клеточных линий с помощью R848, что соответствует низкой экспрессии TLR8 и отсутствию экспрессии TLR7 в клетках TO (фиг. 9). У млекопитающих распознавание вируса через путь TLR7 в pDC приводит к индукции множества генов IFN-α (41).Передача сигналов по пути TLR7 происходит через белок MyD88 и опосредует активацию IRF7, который конститутивно экспрессируется в pDC (42). IFNb и IFNc лосося содержат IRF-связывающие мотивы в проксимальной части своих промоторов (Supplemental Fig. 3B), но какие IRFs, которые участвуют в активации, еще не известно.

Исследования количественной ПЦР на нестимулированных рыбах показали, что IFNa, IFNc и IFNd постоянно экспрессируются во всех органах, тогда как практически не наблюдается экспрессии IFNb, за исключением яичников. Отсутствие транскриптов IFNb у нестимулированных рыб означает, что важна жесткая регуляция этого IFN. Согласно исследованиям на радужной форели (12, 13), в яичниках наблюдалась высокая конститутивная экспрессия IFNa, IFNb и IFNc.

Исследования FISH IFNa, IFNb и IFNc в значительной степени подтвердили исследования qPCR, за исключением того, что относительно небольшое количество клеток в головной почке и селезенке интенсивно окрашивалось на IFNb и IFNc у рыб, обработанных R848, несмотря на относительно высокий уровень Уровни транскриптов IFNb и IFNc измеряли в этих органах.Это предполагает присутствие специализированных клеток с высоким содержанием IFNb / IFNc в двух основных лимфоидных органах лосося, что является одним из наиболее важных открытий в настоящей работе. Эти клетки обнаруживают много сходств с pDC млекопитающих, которые продуцируют большое количество IFN-α в ответ на лиганды TLR7, относительно немногочисленны и расположены преимущественно в костном мозге, селезенке и крови (16, 20, 43). У рыб отсутствует костный мозг и лимфатические узлы, но вместо этого головная почка имеет функциональное и морфологическое сходство с костным мозгом, а также является основным лимфоидным органом в дополнение к селезенке, тимусу и MALT (44).R848 индуцировал лишь незначительное увеличение транскриптов IFNb в BL лосося, что позволяет предположить, что клеток, продуцирующих высокий IFNb / IFNc, больше в головной почке и селезенке. Считается, что pDC играют важную роль в соединении врожденного и адаптивного иммунитета и важны для генерации плазматических клеток и ответов антител (45, 46), и поэтому было интересно наблюдать, что IFNb-экспрессирующие клетки в селезенке R848- обработанные рыбы в основном присутствовали вблизи В-клеток. Вопрос о том, важны ли клетки, продуцирующие IFNb / IFNc, для развития адаптивных иммунных ответов у рыб, является предметом будущих исследований, но интересно отметить, что и у рыб, и у млекопитающих, похоже, развились клетки, которые специализируются на продукции в больших количествах. специфических подтипов IFN в ответ на лиганды TLR7, IFN-α у млекопитающих и IFNb / IFNc у лосося.Хотя классические ДК недавно были идентифицированы как у рыбок данио, так и у радужной форели (47, 48), отсутствие АТ, специфичных как для классических, так и для плазмацитоидных ДК, затрудняет изучение их функции.

Даже если IFNa и IFNc широко экспрессировались в тканях рыб, стимулированных поли (I: C), интенсивная экспрессия этих IFN была ограничена определенными типами клеток. В головной почке и селезенке оба IFN экспрессируются в клетках, связанных с синусоидами. IFNa, но не IFNc, также экспрессировался эндотелиальными клетками головной почки.Жабры клеток, обработанных поли (I: C), показали выраженную экспрессию IFNa и менее частую экспрессию IFNc в отдельных клетках, интерпретируемых как столбчатые клетки, которые определяют кровяные пространства внутри вторичных ламелл (49). IFNa доминировал в ответе на поли (I: C) в печени. Взятые вместе, поли (I: C), по-видимому, в первую очередь индуцирует IFNa и IFNc в клетках, находящихся в непосредственной близости от кровотока.

В настоящей работе мы не наблюдали повышения регуляции IFNd лосося в ответ на поли (I: C) и R848 in vivo или в клеточных линиях.Наши данные несколько контрастируют с исследованиями на радужной форели, которые показали повышенную регуляцию транскриптов IFNd в клетках RTG-2 после стимуляции поли (I: C) путем добавления или трансфекции (10). Эти исследователи также сообщили о повышении регуляции IFNd лосося в клетках TO, инфицированных альфавирусом лососевых. Однако мы не смогли повторить эти результаты (неопубликованные данные). В настоящее время только один ген IFNd был обнаружен у атлантического лосося и форели, и они демонстрируют 91,6% идентичности последовательностей и имеют очень похожие промоторные области.Однако ген IFNd форели содержит два, а ген IFNd лосося содержит только один IRF-связывающий мотив в 500-нуклеотидной области перед ORF (дополнительный рис. 3B) (10), что может объяснить различия в экспрессии IFNd в два вида. Взятые вместе, настоящая работа предполагает незначительную важность IFNd в противовирусной защите атлантического лосося, потому что он не проявляет противовирусной активности и не активируется в ответ на вирусную РНК, имитирующую поли (I: C) и R848.

Подтип IFNd представляет интерес с эволюционной точки зрения, поскольку это единственный IFN типа I, идентифицированный у иглобрюхих ( T.nigroviridis и Takifugu rubribes ), медака, колюшка и морской окунь, относящиеся к надотряду Acanthopterygii (7, 8, 10). У этих рыб было идентифицировано от одного до трех генов IFNd. Рыбы, принадлежащие к надотрядам Ostariophysi (данио, карп и канальный сом) и Protacanthopterygii (лососевые), обладают подтипами IFNa и IFNc, тогда как подтип IFNb пока идентифицирован только в последнем надотряде.Недавний филогенетический анализ показывает, что Ostariophysi и Protacanthoptergyii являются сестринскими родами, отделившимися от Acanthopterygii 217 миллионов лет назад (50). IFN 4C, по-видимому, присутствовали у рыб, являющихся предками этих надотрядов, потому что они присутствуют у слоновых акул (10). Таким образом, рыба, принадлежащая к группе Acanthopterygii , могла потерять 4C IFN в ходе эволюции, тогда как карповые и лососевые сохранили и развили обе группы IFN. У атлантического лосося не было выявлено повышающей регуляции в ответ на поли (I: C) или R848 (эта работа) и незначительное усиление у рыбок данио в ответ на вирусную инфекцию (14). IFNd лосося не проявлял противовирусной активности, аналогичной IFNd рыбок данио (IFNϕ4) (14). Таким образом, очевидно, что, хотя IFNd стал основным IFN типа I у рыб Acanthopterygii , он стал менее важным во врожденной противовирусной защите лососевых и карповых. В этом контексте важно отметить, что ген IFNd связан с геном CD79b как у атлантического лосося, так и у рыбок данио и присутствует на хромосоме 12 у рыбок данио (дополнительный рис.1), тогда как кластер IFNa, b и c связан с геном гормона роста 1 и присутствует на хромосоме 3 у рыбок данио (8, 14). Соответственно, IFNd был отделен от основного кластера IFN типа I в течение миллионов лет и мог получить другие функции.

Об общем происхождении цепей IFNR типа I у позвоночных свидетельствует анализ последовательности и синтения генов (9, 14, 51). Это объясняет сходство между IFN типа I рыб и млекопитающих в способности индуцировать противовирусные гены, что происходит через путь Jak-STAT.В настоящей работе подчеркивается, что и у рыб, и у млекопитающих развились отдельные подтипы IFN типа I для индукции через пути RIG-I / MDA5 и TLR7 / TLR8, несмотря на отсутствие гомологии последовательностей между промоторами IFN типа I рыб и млекопитающих из-за их различной эволюционной истории. (11). Фактически, дупликация генов IFN-α и IFN-β у млекопитающих произошла после разделения птиц и млекопитающих (52). В целом это говорит о том, что гены IFN типа I млекопитающих адаптировались к путям распознавания вирусов, которые уже существовали у рыб.Сходство в экспрессии IFNa1 лосося с IFN-β млекопитающих и IFNb / IFNc лосося с IFN-α млекопитающих, таким образом, иллюстрирует конвергенцию функций IFN типа I у млекопитающих с таковыми у рыб. Дополнительные исследования могут дать ответ на вопрос, касается ли это также роли IFN типа I в pDC и стимуляции адаптивного иммунитета.

Различия в системе IFN типа I рыб и млекопитающих постепенно проявляются. Примечательно, что хотя IFN млекопитающих типа I передают сигнал через единственный рецептор, IFN типа I рыб передают сигнал через по крайней мере два рецептора (14).Другое важное отличие заключается в том, что IRF3 рыб, но не IRF3 млекопитающих, индуцируется IFN типа I (28, 53–55). Это может привести к различиям в экспрессии их IFN. У млекопитающих IRF3 конститутивно экспрессируется в большинстве клеток, тогда как IRF7 индуцируется IFN. Это объясняет, почему человеческий IFN-β индуцируется на ранней стадии вирусной инфекции, тогда как гены IFN-α индуцируются во второй волне из-за их предпочтения IRF7 (56, 57).

В заключение, подтипы IFNa, IFNb и IFNc лосося, по-видимому, важны для противовирусного иммунитета атлантического лосося, потому что все они обладают противовирусной активностью против IPNV и индуцируют типичные IFN-индуцированные гены.Кроме того, IFNa1 и IFNa2 являются основными IFN через путь RIG-I / MDA5, которые действуют в большинстве клеток, тогда как IFNb и IFNc являются основными IFN, индуцируемыми через путь TLR7 / TLR8, который действует в лимфоидных клетках. IFNc может индуцироваться еще одним путем, поскольку он индуцируется поли (I: C) in vivo, но не в клеточных линиях. Одним из наиболее ярких наблюдений в этой статье является сильная клеточно-зависимая экспрессия подтипов IFN, наблюдаемая при стимуляции поли (I: C) и R848. Клетки, которые наиболее сильно экспрессируют IFNa и IFNc у рыб, обработанных поли (I: C), по-видимому, подвергаются непосредственному воздействию кровотока, что позволяет предположить, что они имеют большое значение в защите от системной вирусной инфекции.Функция IFNb кажется более специализированной, поскольку in vivo IFNb сильно экспрессируется в ограниченном количестве клеток, присутствующих в лимфоидных органах после стимуляции R848. Эти отдельные клетки, экспрессирующие IFN I типа, имеют несколько общих черт с pDC млекопитающих. Взятые вместе, эти результаты предполагают, что подтипы IFNa, IFNb и IFNc играют разные роли в противовирусном иммунитете атлантического лосося, тогда как роль IFNd пока неясна.

Вирус Эпштейна-Барра LF2: антагонист интерферона I типа

РЕЗЮМЕ

При вирусной инфекции основной защитой иммунной системы хозяина является активация опосредованного интерфероном (IFN) противовирусного пути, который опосредуется IFN. регуляторные факторы (IRF).Для завершения своего жизненного цикла вирусы должны модулировать иммунные ответы хозяина, опосредованные IFN. Несмотря на связь со значительными проблемами со здоровьем человека, активность вируса Эпштейна-Барра (EBV), вызывающего опухоль человека герпесвируса, по ускользанию от IFN-опосредованного врожденного иммунитета хозяина, не была хорошо изучена. Для поиска генов EBV, которые блокируют передачу сигнала IFN, мы провели скрининг открытых рамок считывания EBV на их способность блокировать IFN-α / β-опосредованную экспрессию люциферазы при заражении вирусом Сендай.Этот скрининг демонстрирует, что белок-тегумент LF2 EBV специфически взаимодействует с центральным ингибирующим ассоциативным доменом IRF7, и это взаимодействие приводит к ингибированию димеризации IRF7, что подавляет продукцию IFN-α и опосредованный IFN иммунитет. Это демонстрирует новый механизм иммунного уклонения EBV LF2 при блокировании клеточного IRF7-опосредованного врожденного иммунитета.

Врожденный иммунный ответ — это передовая линия защиты хозяина от микробной инфекции (15). Центральное место в противовирусном ответе хозяина занимает выработка интерферона I типа (IFN), который тонко регулируется членами семейства регуляторных факторов IFN (IRF) (5, 15, 21-23).Это семейство участвует в противовирусной защите, иммунной регуляции, регуляции роста клеток и апоптозе (3, 18, 33). Отличительной особенностью этого семейства является высококонсервативный аминоконцевой ДНК-связывающий домен (DBD). Два близкородственных члена этого семейства, IRF3 и IRF7, по-видимому, являются основными трансдукторами вирусной передачи сигналов при индукции IFN типа I (19, 22, 23, 27, 35). Транскрипционная активность IRF3 и IRF7 зависит от С-концевого фосфорилирования, опосредованного IKK-родственными киназами TBK1 и IKKε (12, 16, 36).Фосфорилирование запускает серию изменений в IRF3 и IRF7, включая изменение конформации, димеризацию через уникальный C-концевой домен, известный как ингибиторный связанный домен (IAD), и ядерную транслокацию. Эти изменения приводят к связыванию ДНК с IRF3 и IRF7 через их экспонированные DBD, что в конечном итоге активирует транскрипцию IFN типа I (28, 30, 39).

В то время как IRF3 является повсеместным белком, IRF7 является IFN-индуцибельным и преимущественно существует в клетках лимфоидного происхождения (1, 2, 4).Считается, что при вирусной инфекции IFN-β, экспрессия которого в основном регулируется IRF3, продуцируется первым из-за его повсеместной экспрессии. IFN-β после связывания с рецептором IFN активирует сигнальный каскад, который в конечном итоге приводит к индукции транскрипции сотен критических противовирусных генов, включая IFN-индуцируемую протеинкиназу R, 2 ‘, 5’-олигоаденилатсинтетазы, TLR3, TLR7, и IRF7 (11, 35). Транскрипция IFN-α, которая в первую очередь регулируется IRF7, сильно активируется в результате усиления экспрессии гена IRF7.Впоследствии секретируемый IFN-α индуцирует еще один цикл передачи сигнала, опосредованного рецептором IFN, в качестве механизма положительной обратной связи.

Большинство вирусов разработали стратегии защиты от ответов хозяина IFN (13, 15). Эти стратегии включают ингибирование передачи сигналов IFN путем подавления базальных уровней сигнальной молекулы JAK-STAT, подавление определенных молекулярных модификаций и предотвращение молекулярной транслокации. Например, вирус Эбола VP35 отменяет продукцию IFN типа I, ингибируя активацию IRF3 (6, 7).В рамках вируса герпеса, ассоциированного с саркомой Капоши (KSHV), прототипа герпесвируса гамма-2, открытая рамка считывания 45 (ORF45) кодирует белок, блокирующий продукцию IFN типа I путем ингибирования фосфорилирования и ядерной локализации IRF7 (40). Кроме того, недавно сообщалось, что KSHV vIRF3, называемый латентно-ассоциированным ядерным антигеном 2 (LANA2), значительно снижает выработку IFN типа I путем физического связывания с IRF7 (24). Вирус простого герпеса, прототип альфа-герпесвируса, кодирует по меньшей мере два модулятора ответа IFN, US11 и ICP34.5, которые нацелены на аналогичный путь ответа IFN, путь к двухцепочечной РНК-зависимой протеинкиназе R (8-10, 31).

Вирус Эпштейна-Барра (ВЭБ) — это повсеместный ДНК-вирус: им инфицировано 90% населения (25). После заражения вирус остается с хозяином до конца своей жизни. Первичная инфекция ВЭБ приводит к инфекционному мононуклеозу, тогда как длительное воздействие ВЭБ не имеет явных симптомов у иммунокомпетентного хозяина. Кроме того, ВЭБ ассоциируется с множеством опухолей, включая иммунобластную лимфому, болезнь Ходжкина, носоглоточную карциному, лимфому Беркитта и карциному желудка у пациентов со СПИДом с ослабленным иммунитетом и реципиентов трансплантатов органов при иммуносупрессивном лечении (25, 26).Это указывает на то, что ВЭБ находится под жестким контролем иммунной системы хозяина. Описаны два белка EBV, которые значительно подавляют адаптивные иммунные ответы (20, 34). EBV BGLF5 помогает вирусу избежать распознавания Т-клетками-хозяевами и уничтожения инфицированной клетки за счет отключения экспрессии генов главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I и MHC класса II (34). BNLF2a, белок раннего литического цикла EBV, блокирует презентацию MHC класса I за счет инактивации пептидного транспортера TAP1 / TAP2, нарушая Т-клеточный ответ CD8 ⁺ (20).Недавно сообщалось, что EBV BZLF1 негативно регулирует IRF7, но механизм остается неясным (17). Несмотря на ее связь с различными проблемами со здоровьем человека, наши знания о стратегии уклонения от EBV против врожденного иммунитета хозяина, опосредованного IFN I типа, отсутствуют, особенно по сравнению с другими герпесвирусами.

Для поиска специфических генов EBV, которые блокируют передачу сигнала IFN, мы провели скрининг ORF для EBV на их способность блокировать IFN-α / β-опосредованную экспрессию люциферазы при вирусной инфекции.Для создания библиотеки экспрессии EBV 150 исходных клонов EBV были субклонированы в векторы-получатели pCR3-Flag-His ₆ с использованием системы Gateway. Каждый вирусный клон исследовали перевариванием рестриктазами и секвенированием ДНК, а экспрессию вирусного белка определяли с помощью иммуноблот-анализа (данные не показаны). Для идентификации белков EBV, которые ингибируют продукцию IFN типа I, клетки 293T трансфицировали IRF7, репортером люциферазы, управляемым промотором IFN-α6, и трансфекционным контрольным репортером люциферазы Renilla вместе с отдельными экспрессирующими клонами EBV, а затем инфицировали 50 гемагглютинирующими агентами. (НА) единицы вируса Сендай (SeV), мощный стимул выработки интерферона I типа.Через 24 часа после инфицирования клетки собирали для репортерных анализов. Вирус Эбола VP35, который, как было показано, блокирует передачу сигнала IFN (6, 7), был включен в качестве положительного контроля. Этот скрининг обнаружил, что EBV LF2 значительно ингибирует SeV-индуцированную активацию активности промотора IFN-α6. Чтобы определить, является ли ингибирующая способность LF2 общей или специфической для IRF7, мы проверили его влияние на активацию промоторов IFN-α1, -4 и -6, которые регулируются в первую очередь клеточным IRF7 (11, 19, 22, 23). , 27, 35).Результаты показали, что в зависимости от дозировки экспрессия LF2 надежно подавляла IRF7-индуцированную активацию промоторов IFN-α1, -4 и -6 активности (фиг. 1A). Чтобы дополнительно рассмотреть ингибирование активности промотора IFN с помощью LF2, мы измерили уровни мРНК IFN типа I в присутствии или в отсутствие экспрессии LF2. Через 24 часа после трансфекции с использованием IRF7, с EBV LF2 и без него, клетки 293T инфицировали SeV в течение 16 часов, а затем собирали для выделения общих РНК. ПЦР с обратной транскрипцией выполняли с равными количествами тотальной РНК для определения уровней мРНК IFN типа I.После инфицирования SeV заметное увеличение мРНК IFN-α1, IFN-α4 и IFN-α6 было обнаружено в клетках, трансфицированных вектором IRF7, тогда как увеличение было минимальным или не обнаруживалось в клетках, трансфицированных как IRF7, так и LF2 (рис. 1B). . Кроме того, иммуноферментный анализ показал, что подобно KSHV vIRF3, EBV LF2 эффективно подавлял секрецию IFN-α, вызванную инфекцией SeV (рис. 1C). Эти результаты показывают, что EBV LF2 эффективно блокирует опосредованную IRF7 активацию экспрессии IFN типа I.

В то время как IRF7 и IRF3 являются критическими регуляторами транскрипции экспрессии гена IFN типа I, IRF7 в первую очередь активирует активность промотора IFN-α1, -4, -6 и -14, а IRF3 индуцирует активность промотора ISRE (IFN-стимулированный чувствительный элемент) ( 11, 19, 22, 23, 35). Мы исследовали, отменяет ли экспрессия LF2 IRF3-индуцированную активацию активности промотора ISRE. Через 24 часа после трансфекции репортером люциферазы, управляемым промотором ISRE, с увеличивающимся количеством LF2, клетки 293T инфицировали SeV в течение 12 часов, а затем собирали для анализа люциферазы.Результаты показали, что, в отличие от своего надежного аннулирования транскрипционной активности IRF7, LF2 не обнаруживает эффекта на IRF3-индуцированную активацию активности промотора ISRE (Рис. 1D). Напротив, VP35 вируса Эбола значительно подавлял индуцированную вирусом активность промотора ISRE в тех же условиях (рис. 1D). Эти результаты предполагают, что EBV LF2 специфически ингибирует активность IRF7, но не IRF3.

Учитывая ингибирующий эффект EBV LF2 на IRF7-индуцированную транскрипцию, мы протестировали потенциальное взаимодействие LF2 с IRF7.Через 48 часов после трансфекции с помощью экспрессионных векторов IRF7 и Flag-tagged LF2 или Flag-tagged IRF7 и V5-меченных экспрессионных векторов LF2 клетки 293T использовали для иммунопреципитации (IP) с антителом против Flag с последующим иммуноблоттингом с анти-IRF7 или анти-IRF7. -V5 антитела соответственно. Co-IP показали эффективное взаимодействие между LF2 и IRF7 (рис. 2A и B). Несмотря на высокую степень сходства с IRF7, IRF3 не был способен связываться с LF2 в тех же условиях (Рис. 2C). Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что LF2 специфически взаимодействует с IRF7, но не с IRF3, и это взаимодействие, скорее всего, объясняет способность LF2 блокировать опосредованную IRF7 активацию экспрессии IFN типа I.

При вирусной инфекции IRF7 подвергается индуцированному инфекцией фосфорилированию серина в пределах своего карбоксиконцевого регуляторного домена. Эта модификация впоследствии стимулирует димеризацию белка, удержание в ядре и взаимодействие с транскрипционными коактиваторами, что приводит к активации устойчивого ответа, состоящего из широкого спектра изотипов IFN (28, 30). Как было показано ранее (12, 16, 36), экспрессия киназ TBK1 и IKKε, которые фосфорилируют карбокси-концевой регуляторный домен IRF7, приводит к активации транскрипционной активности IRF7, что приводит к резкому увеличению активности промотора IFN-α4 ( Инжир.3А). Однако коэкспрессия LF2 эффективно подавляла опосредованную TBK1 или IKKε киназу активацию транскрипционной активности IRF7 (фиг. 3A). В этих условиях коэкспрессия IKKε или TBK приводила к почти полному сдвигу IRF7 в его медленно мигрирующую фосфорилированную форму во время электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (Рис. 3B). Мы обнаружили, что LF2 не влияет на TBK- или IKKε-опосредованную задержку миграции IRF7 (фиг. 3B). Было показано, что мутация C-концевых 477 и 479 остатков серина IRF7 в отрицательно заряженную глутаминовую кислоту, называемая IRF7 S477D S479D, имитирует TBK- или IKKε-опосредованное фосфорилирование, что приводит к конститутивной активации транскрипционной активности IRF7 (28, 30, 39).LF2 подавлял зависимым от дозы образом транскрипционную активность IRF7 S477D S479D так же эффективно, как и активность IRF7 дикого типа (фиг. 3C). Более того, LF2 не влияет на ядерную транслокацию IR7, потому что LF2 также локализован в ядре (Рис. 4). Наконец, несмотря на то, что IRF7 подвергается протеосомному пути деградации (38), экспрессия LF2 не влияет на уровни белка IRF7 на детектируемом уровне (рис. 5). Эти результаты в совокупности показывают, что взаимодействие LF2 не влияет на фосфорилирование IRF7 и стабильность белка.

IRF7 состоит из N-концевого повтора триптофана, содержащего DBD, домен трансактивации, IAD и C-концевой регуляторный домен (RD) (28, 30, 39). Фосфорилирование IRF7, индуцированное вирусом, по-видимому, ослабляет внутримолекулярную ассоциацию между двумя аутоингибиторными доменами и демаскирует N-концевой DBD и C-концевой IAD, что приводит к образованию гомодимеров через IAD. Димеры IRF7 впоследствии перемещаются из цитоплазмы в ядро и стимулируют связывание ДНК и транскрипционную активность (28, 30, 39).Чтобы проверить, блокирует ли взаимодействие LF2 димеризацию IRF7, слияние глутатион S -трансфераза (GST) -IRF7 и белки Flag-IRF7 коэкспрессировали в клетках 293T вместе с увеличивающимися количествами V5-LF2. Анализ GST pull-down показал, что гомодимеризация GST-IRF7 и Flag-IRF7, по-видимому, уменьшалась при экспрессии LF2, тогда как взаимодействие GST-IRF7 и V5-LF2 увеличивалось в тех же условиях (фиг. 6A). Клетки трансфицировали вектором экспрессии V5-LF2 и слияниями GST-IRF7, содержащими DBD, домен активации (AD), IAD, RD или полноразмерный ген, с последующим удалением GST.Анализ методом pull-down показал, что LF2 с меткой V5 эффективно взаимодействует с полноразмерными GST-IRF7 и GST-IAD, но не с GST, GST-DBD, GST-AD и GST-RD (фиг. 6B). Эти результаты показывают, что LF2 эффективно ингибирует димеризацию IRF7, взаимодействуя с IAD IRF7, что может объяснять нарушение транскрипции, индуцированной IRF7.

IRF7 является главным регулятором врожденного иммунитета, а также играет важную роль в переходе от врожденного иммунитета к приобретенному (22). Благодаря своей важной роли в иммунитете хозяина, многие вирусы разработали различные стратегии подавления активации IRF7.ICP0, кодируемый вирусом простого герпеса и бычьим герпесвирусом 1, ингибирует фосфорилирование TBK1 и IKKε (29). В ответ на вирусную инфекцию, предранний литический белок KSHV, кодируемый ORF45, который представляет собой белок тегумента вириона, связывается с IRF7 и блокирует его фосфорилирование и накопление в ядре, что приводит к блокированию транскрипции IFN-α и IFN-β (40 ). Кроме того, ранний литический фактор ядерной транскрипции KSHV RTA действует как лигаза убиквитина E3, способствуя убиквитинизации и деградации белка IRF7 протеасомозависимым образом (38).Кроме того, недавно было показано, что KSHV vIRF3 связывает IRF7, что подавляет способность IRF7 связывать ДНК (24). Наше настоящее исследование добавляет EBV LF2 к расширяющемуся семейству вирусных белков, которые ингибируют клеточную транскрипционную активность IRF7 посредством белок-белковых взаимодействий.

Кодируемая EBV нуклеотидогидролаза dUTP (dUTPase), как недавно сообщалось, индуцирует иммунную дисрегуляцию in vivo у мышей (14). EBV LF1 (ORF10) и LF2 (ORF11) оба содержат dUTPase-подобный домен, предполагая потенциальную роль dUTPase-подобного домена для активности против IFN.Однако наше предварительное исследование показало, что dUTPase-подобный домен не требуется для ингибирования продукции IFN типа I LF2 (неопубликованные данные). Кроме того, EBV LF1 и LF2, по-видимому, не важны для репликации вируса в культуре клеток, поскольку геномная область, содержащая эти последовательности, удалена из штамма EBV B95-8, часто используемого для изучения репликации и иммортализации вирусов. Кроме того, мы также обнаружили, что ген LF2 лимфокриптовируса резуса, вируса, наиболее близкого к EBV (32, 37), эффективно подавляет индуцированную IRF7 транскрипцию IFN типа I, предполагая генетическую и функциональную консервацию LF2 в этих двух вирусах (неопубликованные данные). данные).Конструирование LF2-нокаутного лимфокриптовируса-резуса может быть полезным для выяснения функционального значения LF2 как антагониста IFN типа I, таким образом обеспечивая лучшее понимание того, вносит ли и как LF2 вклад в успешную инфекцию EBV и патогенез in vivo.
РИС. 1.
LF2 подавляет продукцию IFN типа I. Всего 150 начальных клонов EBV, сконструированных Юргеном Хассом, были субклонированы в целевой вектор, названный pCR3.1-flag / 6xhis-dest, для создания библиотеки экспрессии EBV с использованием Gateway LR Clonase (Invitrogen, San Diego, CA).Расщепление рестрикционным ферментом и секвенирование ДНК подтвердили все клоны EBV в pCR3.1-flag / 6xhis-dest. Экспрессию вирусного белка определяли иммуноблоттингом с антителом против Flag (Sigma, Saint Louis, MO). Затем последовательность EBV LF2 амплифицировали из входящего клона и субклонировали в вектор pCDNA5 / FRT / To (Invitrogen), меченный V5, между сайтами BamHI и XhoI. (A) LF2 ингибирует IRF7-индуцированную активность промоторов IFN типа I. Клетки 293T трансфецировали репортером люциферазы (luc), управляемым промотором IFN типа I (IFN-α1, IFN-α4 или IFN-α6), репортером люциферазы Renilla и векторами экспрессии IRF7 вместе с увеличивающимися количествами вектора экспрессии LF2. .Через 24 часа после трансфекции клетки инфицировали 50 единицами НА SeV в течение 12 часов. Через 24 часа после инфицирования активность люциферазы измеряли с помощью набора для анализа двойного люциферазы-репортера от Promega Biotech (Мэдисон, Висконсин) и нормализовали до активности люциферазы Renilla для стандартизации эффективности трансфекции. Результаты представляют собой средние значения четырех независимых экспериментов. Четыреста нанограммов вируса Эбола VP35 (крайняя правая полоса на панелях) использовали в качестве положительного контроля в эксперименте. (B) Подавление SeV-индуцированных мРНК IFN с помощью EBV LF2.Всего 1 × 10 ⁵ 293T клеток высевали в шестилуночные планшеты перед трансфекцией и затем трансфицировали с использованием IRF7 с LF2 или без него, с последующей стимуляцией 100 единиц HA SeV в течение 12 часов. Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени была проведена для определения уровней мРНК IFN типа I, как описано ранее (24). (C) Подавление SeV-индуцированной продукции IFN-α EBV LF2. Клетки 293T трансфицировали векторами экспрессии IRF7 с вектором экспрессии LF2 или без него. Через 24 часа после трансфекции клетки инфицировали 100 единицами НА SeV в течение дополнительных 12 часов.Для определения уровней IFN-α собирали среды для культивирования клеток для ELISA. KSHV vIRF3 был включен в качестве контроля. Результаты представляют собой среднее значение трех независимых экспериментов. (D) LF2 не влияет на вызванную IRF3 активацию активности промотора ISRE. Клетки 293T трансфицировали репортером люциферазы, управляемым промотором ISRE, и репортером люциферазы Renilla вместе с возрастающими количествами LF2. Затем клетки обрабатывали 100 единиц HA SeV в течение 12 часов. Люциферазную активность измеряли, как описано на рис.1А. Вирус Эбола VP35 был включен в качестве контроля (показано последней полосой на панели).
РИС. 2.
(A и B) LF2 взаимодействие с IRF7. Клетки 293T трансфицировали IRF7 и / или Flag-LF2 (A) или Flag-IRF7 и / или V5-LF2. Через 48 ч после трансфекции клетки собирали на IP с антителом против Flag с последующим вестерн-иммуноблоттингом (WB) с антителом против IRF7 (A) или антителом против V5 (B). (C) LF2 не взаимодействует с IRF3. Клетки 293T трансфицировали Flag-LF2 и либо V5-IRF7, либо V5-IRF3 для Co-IP, как описано выше.WCL, лизаты целых клеток.
РИС. 3. Экспрессия
LF2 не влияет на фосфорилирование IRF7. (A) LF2 подавляет опосредованную IKKε или TBK1 активацию транскрипционной активности IRF7. Клетки 293T трансфецировали репортером люциферазы (luc), управляемым промотором IFN-α4, репортером люциферазы Renilla , вектором IRF7 и вектором IKKε (верхняя панель) или TBK1 (нижняя панель) вместе с увеличивающимися количествами вектора LF2. Люциферазную активность измеряли, как описано на фиг. 1A. Уровень экспрессии IRF7 контролировали с помощью иммуноблоттинга (один пример показан ниже).(B) LF2 не ингибирует фосфорилирование IRF7, индуцированное IKKε или TBK1. Клетки 293T трансфицировали Flag-IKKε или Flag-TBK1 и IRF7 с Flag-LF2 или без него. Затем проводили вестерн-иммуноблоттинг (WB) с соответствующими антителами. (C) LF2 снижает активность промотора IFN типа I, индуцированного конститутивно активным мутантом IRF7 S477D S479D. Клетки 293T трансфицировали промотором IFN (IFN-α1, IFN-α4 или IFN-α6) -направленным репортером люциферазы, репортером люциферазы Renilla и IRF7 S477D S479D вместе с увеличивающимися количествами LF2.Люциферазную активность измеряли, как описано на фиг. 1. KSHV vIRF3 был включен в качестве контроля.
РИС. 4. Экспрессия
LF2 не влияет на ядерную транслокацию IRF7. Клетки 293T или клетки HeLa трансфицировали либо меченным флагом IRF7 отдельно, либо вместе с LF2, меченным V5. Затем клетки инфицировали SeV через 12 ч после трансфекции. Иммуноокрашивание проводили на фиксированных клетках через 6 часов после заражения, и для наблюдения флуоресценции использовали конфокальную микроскопию.
РИС. 5. Экспрессия
LF2 не влияет на уровень белка IRF7.Клетки 293T трансфицировали вектором IRF7 и увеличивающимся количеством вектора Flag-LF2. Клетки собирали для анализа вестерн-иммуноблоттингом (WB) для определения уровней экспрессии IRF7 и LF2 с использованием соответствующих антител.
РИС. 6.
LF2 блокирует димеризацию IRF7 путем связывания с IAD IRF7. (A) LF2 блокирует димеризацию IRF7. Клетки 293T трансфицировали GST-IRF7 и Flag-IRF7 вместе с возрастающими количествами V5-LF2. GST-pull-down (PD) выполняли через 36 часов после трансфекции с последующим вестерн-иммуноблоттингом (WB) с использованием антител против Flag или против V5.Лизаты цельных клеток (WCL) были включены в анализ иммуноблоттинга. (B) LF2 связывается с IAD IRF7. Домены IRF7 показаны на схематической диаграмме. Каждый домен IRF7 был слит в рамке считывания с GST млекопитающих. Через 36 часов после трансфекции вектором слияния GST-IRF7 и вектором V5-LF2 клетки 293T собирали для удаления GST с последующим иммуноблоттингом с антителом против V5.

БЛАГОДАРНОСТИ

Эта работа частично поддержана грантами Службы общественного здравоохранения США CA106156, CA82057, CA91819 и RR00168, а также грантом Корейского исследовательского фонда KRF-2004-037-C00104.

Мы благодарим П. Палезе и Дж. Хискотта за предоставленные реагенты.

СНОСКИ

Получено 18 марта 2008 г.

Принято 26 сентября 2008 г.

Copyright © 2009 Американское общество микробиологии

СПРАВОЧНИКИ

1.↵ , Д. В. ЛаФлер, Б. Томбал и П. М. Питха. 1998. Характеристика регуляторного фактора интерферона-7 и его потенциальной роли в активации транскрипции генов интерферона А.J. Biol. Chem. 273 : 29210-29217.

2.↵
Au, W. C., P. A. Moore, W. Lowther, Y. T. Juang и P. M. Pitha. 1995. Идентификация члена семейства факторов регуляции интерферона, который связывается с элементом ответа, стимулированным интерфероном, и активирует экспрессию индуцированных интерфероном генов. Proc. Natl. Акад. Sci. USA92 : 11657-11661.

3.↵
Барнс, Б. Дж., М. Дж. Келлум, К. Э. Пиндер, Дж.А. Фрисанчо и П. М. Пита. 2003. Интерферон регулирующий фактор 5, новый медиатор остановки клеточного цикла и гибели клеток. Cancer Res.63 : 6424-6431.

4.↵
Барнс, Б. Дж., П. А. Мур и П. М. Питха. 2001. Вирус-специфическая активация нового фактора регуляции интерферона, IRF-5, приводит к индукции различных генов интерферона альфа. J. Biol. Chem. 276 : 23382-23390.

5.↵
Барнс, Б.Дж., Дж. Ричардс, М. Манкл, С. Ханаш, Л. Беретта и П. М. Пита. 2004. Глобальные и отдельные мишени IRF-5 и IRF-7 во время врожденного ответа на вирусную инфекцию J. Biol. Chem. 279 : 45194-45207.

6.↵
Basler, C. F., A. Mikulasova, L. Martinez-Sobrido, J. Paragas, E. Mühlberger, M. Bray, H.-D. Кленк, П. Палезе и А. Гарсия-Састре. 2003. Белок VP35 вируса Эбола ингибирует активацию регуляторного фактора интерферона 3. J. Virol.77 : 7945-7956.

7.↵
Basler, C.F., X. Wang, E. Muhlberger, V. Volchkov, J. Paragas, H. D. Klenk, A. Garcia-Sastre и P. Palese. 2000. Белок VP35 вируса Эбола действует как антагонист интерферона I типа. Proc. Natl. Акад. Sci. USA97 : 12289-12294.

8.↵
Кэссиди, К. А., М. Гросс и Б. Ройзман. 1998. Белок вируса простого герпеса U _S 11 эффективно компенсирует γ ₁ 34.5, если он присутствует до активации протеинкиназы R за счет предотвращения его фосфорилирования и фосфорилирования α-субъединицы фактора инициации трансляции 2 эукариот. J. Virol.72 : 8620-8626.

9.
Cheng, G., M.-E. Бретт и Б. Он. 2002. Сигналы, которые диктуют ядерное, ядрышковое и цитоплазматическое перемещение белка γ ₁ 34,5 вируса простого герпеса типа 1. J. Virol.76 : 9434-9445.

10.↵
Чжоу, Дж., Дж. Дж. Чен, М. Гросс и Б. Ройзман. 1995. Ассоциация фосфопротеина M (r) 90 000 с протеинкиназой PKR в клетках, демонстрирующих повышенное фосфорилирование фактора инициации трансляции eIF-2 альфа и преждевременное прекращение синтеза белка после инфицирования гамма 134,5 ^— мутантов вируса простого герпеса 1. Proc . Natl. Акад. Sci. USA92 : 10516-10520.

11.↵
Civas, A., M. L. Island, P. Genin, P. Morin и S. Navarro. 2002. Регуляция вирус-индуцированных генов интерферона-А. Biochimie84 : 643-654.

12.
Фицджеральд, К. А., С. М. Мак-Уиртер, К. Л. Файя, Д. К. Роу, Э. Латц, Д. Т. Голенбок, А. Дж. Койл, С. М. Ляо и Т. Маниатис. 2003. IKKε и TBK1 являются важными компонентами пути передачи сигналов IRF3. Nat. Immunol.4 : 491-496.

13.↵
Гарсия-Састре, А. и К. А. Бирон. 2006. Интерфероны 1 типа и отношения вирус-хозяин: урок разрядки.Science312 : 879-882.

14.↵
Глейзер, Р., М. Л. Лицки, Д. А. Паджетт, Р. А. Байокки, Э. В. Янг, М. Чен, П. Э. Йе, К. Б. Грин-Черч, М. А. Калиджури и М. В. Уильямс. 2006. dUTPase, кодируемая EBV, вызывает нарушение регуляции иммунитета: значение для патофизиологии EBV-ассоциированного заболевания. Вирусология 346 : 205-218.

15.↵
Гудборн С., Л. Дидкок и Р. Э. Рэндалл. 2000 г.Интерфероны: иммунная модуляция клеточных сигналов, противовирусный ответ и меры противодействия вирусам. J. Gen. Virol. 81 : 2341-2364.

16.↵
Хакер, Х. и М. Карин. 2006. Регулирование и функция IKK и IKK-родственных киназ. Sci. STKE357 : re13.

17.↵
Hahn, A.M., L.E. Huye, S. Ning, J. Webster-Cyriaque и J. S. Pagano. 2005. Интерфероновый регуляторный фактор 7 отрицательно регулируется ранним геном вируса Эпштейна-Барра, BZLF-1 .J. Virol.79 : 10040-10052.

18.↵
Харада, Х., М. Китагава, Н. Танака, Х. Ямамото, К. Харада, М. Исихара и Т. Танигучи. 1993. Антионкогенные и онкогенные возможности факторов регуляции интерферона-1 и -2. Science 259 : 971-974.

19.↵
Hiscott, J. 2007. Запуск врожденного противовирусного ответа через активацию IRF-3. J. Biol. Chem.282 : 15325-15329.

20.↵
Хислоп, А. Д., М. Э. Рессинг, Д. ван-Леувен, В. А. Падни, Д. Хорст, Д. Копперс-Лалик, Н. П. Крофт, Дж. Дж. Нифьес, А. Б. Рикинсон и Э. Дж. Вирц. 2007. CD8 + Т-клеточный белок уклонения от иммунитета, специфичный для вируса Эпштейна-Барра и его близких родственников у приматов Старого Света. J. Exp. Med.204 : 1863-1873.

21.↵
Хонда, К. и Т. Танигучи. 2006. IRF: главные регуляторы передачи сигналов с помощью Toll-подобных рецепторов и рецепторов распознавания цитозольных образов.Nat. Rev. Immunol.6 : 644-658.

22.↵
Хонда, К., Х. Янаи, Х. Негиси, М. Асагири, М. Сато, Т. Мизутани, Н. Шимада, Я. Охба, А. Такаока, Н. Йошида , и Т. Танигучи. 2005. IRF-7 — главный регулятор интерферон-зависимых иммунных ответов типа I. Nature434 : 772-777.

23.↵
Хонда, К., Х. Янаи, А. Такаода и Т. Танигучи. 2005. Регулирование индукции IFN типа I: современный взгляд.Int. Immunol.17 : 1367-1378.

24.↵
Джу, К. Х., Ю. К. Шин, М. Гак, Л. Ву, Д. Леви и Дж. У. Юнг. 2007. Ингибирование опосредованной интерфероном регуляторного фактора 7 (IRF7) передачи сигнала интерферона гомологом IRF вируса герпеса Капоши vIRF3, ассоциированным с саркомой Капоши. J. Virol. 81 : 8282-8292.

25.↵
Кифф, Э., и А. Б. Рикинсон. 2001. Вирус Эпштейна-Барра и его репликация, с.2511–2573. В Д. М. Книп, П. М. Хоули, Д. Э. Гриффин, Р. А. Лэмб, М. А. Мартин, Б. Ройзман и С. Е. Штраус (ред.), Филдс-вирусология, 4-е изд. Липпинкотт Уильямс и Уилкинс, Филадельфия, Пенсильвания.

26.↵
Kutok, J. L., and F. Wang. 2006. Спектр заболеваний, связанных с вирусом Эпштейна-Барра. Анну. Rev. Pathol.1 : 375-404.

27.↵
Леви, Д. Э., И. Мари, Э. Смит и А. Пракаш. 2002 г.Усиление и диверсификация индукции IFN за счет положительной обратной связи, опосредованной IRF7. J. Interferon Cytokine Res. 22 : 87-93.

28.↵
Lin, R., Y. Mamane, and J. Hiscott. 2000. Множественные регуляторные домены контролируют активность IRF7 в ответ на вирусную инфекцию. J. Biol. Chem. 275 : 4320-4327.

29.↵
Лин Р., Р. С. Нойс, С. Э. Коллинз, Р. Д. Эверетт и К. Л. Моссман. 2004. RING-домен ICP0 вируса простого герпеса ингибирует опосредованную IRF3 и IRF7 активацию генов, стимулированных интерфероном.J. Virol.78 : 1675-1684.

30.↵
Марие И., Э. Смит, А. Пракаш и Д. Э. Леви. 2000. Димеризация регулирующего фактора интерферона 7, индуцированная фосфорилированием, демаскирует связывание ДНК и домен двусторонней трансактивации. Мол. Клетка. Биол.20 : 8803-8814.

31.↵
Попперс, Дж., М. Малви, Д. Кху и И. Мор. 2000. Ингибирование активации PKR богатым пролином РНК-связывающим доменом белка Us11 вируса простого герпеса 1 типа.J. Virol.74 : 11215-11221.

32.↵
Rivallier, P., H. Jiang, Y.-G. Чо, К. Куинк и Ф. Ван. 2002. Полная нуклеотидная последовательность лимфокриптовируса резуса: генетическая проверка модели вируса Эпштейна-Барра на животных. J. Virol.76 : 421-426.

33.↵
Romieu-Mourez, R., M. Solis, A. Nardin, D. Goubau, V. Baron-Bodo, R. Lin, B. Massie, M. Salcedo и J. Hiscott. 2006. Различная роль регуляторного фактора IFN (IRF) -3 и IRF-7 в активации противоопухолевых свойств макрофагов человека.Cancer Res.66 : 10576-10585.

34.↵
Роу, М., Б. Глаунсингер, Д. ван-Леувен, Дж. Зуо, Д. Свитман, Д. Ганем, Дж. Миддельдорп, Э. Дж. Вирц и М. Э. Рессинг. 2007. Отключение хозяина во время продуктивной инфекции вирусом Эпштейна-Барра опосредуется BGLF5 и может способствовать уклонению от иммунитета. Proc. Natl. Акад. Sci. USA104 : 3366-3371.

35.↵
Сато, М., Х. Суэмори, Н. Хата, М. Асагири, К. Огасавара, К.Накао, Т. Накая, М. Кацуки, С. Ногути, Н. Танака и Т. Танигучи. 2000. Отличительные и важные роли факторов транскрипции IRF3 и IRF7 в ответ на вирусы для индукции гена IFN-альфа / бета. Иммунитет13 : 539-548.

36.↵
Sharma, S., B.R. tenOever, N. Grandvaux, G.P. Zhou, R. Lin и J. Hiscott. 2003. Запуск противовирусного ответа интерферона через IKK-связанный путь. Science300 : 1148-1151.

37.↵
Ву, Л. и Л. М. Хатт-Флетчер. 2007. Совместимость гомологов gH вируса Эпштейна-Барра и родственных лимфокриптовирусов. J. Gen. Virol. 88, : , 2129-2136.

38.↵
Yu, Y., S. E. Wang, and G. S. Hayward. 2005. Фактор ранней транскрипции KSHV RTA кодирует активность лигазы убиквитина E3, которая нацелена на IRF7 для опосредованной протеосомами деградации. Иммунитет22 : 59-70.

39.↵
Zhang, L., and J. S. Pagano. 2002. Устройство и функции ИРФ-7. J. Interferon Cytokine Res.22 : 95-101.

40.↵
Чжу, Ф. X., С. М. Кинг, Э. Дж. Смит, Д. Э. Леви и Ю. Юань. 2002. Герпесвирусный белок, ассоциированный с саркомой Капоши, подавляет вирус-опосредованную индукцию интерферона I типа, блокируя фосфорилирование IRF-7 и накопление в ядрах. Proc. Natl. Акад. Sci. USA99 : 5573-5578.

Расширенные пароли для Check-Inn | Innsoft, Inc.
Функция Advanced Password * в Check-Inn позволяет создавать отдельные защищенные паролем учетные записи для каждого пользователя Check-Inn. Доступ к функциям программы контролируется путем создания групп пользователей с индивидуальными настройками разрешений для различных типов пользователей (дежурный, аудитор, ведение домашнего хозяйства, обслуживание и т. Д.). У каждого пользователя будет собственный вход в систему, и мы также предлагаем карты паролей сотрудников, которые будут разрешите сотрудникам отеля провести карту через считыватель магнитной полосы для входа в Check-Inn.С этой опцией вам не нужно беспокоиться о том, что сотрудники забудут свой пароль. Поскольку Advanced Passwords позволяет каждому пользователю входить в систему отдельно, это также позволяет Check-Inn расширять возможности отслеживания действий в программном обеспечении. Одним из наиболее полезных отчетов, доступных при настройке расширенных паролей, является расширенный отчет о смене. Расширенный отчет о сменах позволяет авторизованным пользователям Check-Inn создавать настраиваемые отчеты о сменах, которые можно «фильтровать», чтобы они содержали только нужные вам данные о сменах.Эти фильтры можно сохранить, что упрощает создание отчетов.
Одна из наиболее полезных функций Advanced Shift Report — возможность отслеживать гостя с момента создания бронирования. Это включает в себя любые изменения, внесенные в это бронирование, все, что происходит во время регистрации, экран гостя и даже информацию о действиях в ежедневном аудите и дебиторской задолженности, которые происходят после того, как гость выписался. Такая подробная информация может быть невероятно важной для отельеров.

Даже если вас не беспокоит ограничение доступа к областям программы, Advanced Passwords позволит вам просматривать отчеты с более высоким уровнем детализации, что может помочь, когда вам нужно провести аудит, отследить расходы, просмотреть историю программы , и больше. Если вам потребуется помощь, настройка расширенных паролей позволит службе поддержки Innsoft Support быстрее выполнять поиск в вашей истории и данных, чтобы восстановить нужную информацию или выполнить необходимые исправления в программе.
Журналы смен
могут храниться в течение более длительного периода времени с помощью расширенных паролей. При использовании базовых паролей данные отчета смены менеджера хранятся в течение 30 дней. С помощью расширенных паролей его можно хранить до 12 месяцев (в зависимости от ваших настроек).

Для получения дополнительной информации или помощи в установке расширенных паролей, пожалуйста, обратитесь в службу поддержки Innsoft . Если у вас нет действующего контракта на обслуживание, позвоните и позвоните в отдел продаж Innsoft Sales по номеру !

* Обратите внимание, что расширенные пароли заменяют базовые пароли.

Несколько фактов о Check-Inn
, которых вы могли не знать
Благодаря нашему длительному стажу работы у Innsoft есть как новые, так и постоянные клиенты с различным уровнем опыта использования Check-Inn. Некоторые свойства использовали Check-Inn в течение одного или двух месяцев, а другие использовали его в течение одного или двух десятилетий. Кроме того, у нас всегда есть объекты, которые все еще находятся в демонстрационном периоде и только начинают изучаться.

Независимо от того, где падает ваш уровень опыта работы с Check-Inn, могут быть некоторые варианты и функции, которыми вы не пользуетесь.Начнем с простых:

Электронная почта. Ваша собственность может отправлять клиентам подтверждения по электронной почте, а отчеты — менеджерам или владельцам. Тот же вариант позволяет выполнять копирование (cc) на любое количество адресов электронной почты. Большинство клиентов ожидают подтверждения по электронной почте, и их очень легко отправить из Check-Inn. Все, что угодно, включая отчеты о занятости, уборку номеров, отчеты о бронировании и т. Д., Также можно легко отправить по электронной почте через Check-Inn.

Горячая клавиша. Функция горячих клавиш в Check-Inn позволяет персоналу стойки регистрации быстро получить доступ к информации.В предыдущей статье в блоге я рекомендовал вести список важной контактной информации сотрудников стойки регистрации. Горячая клавиша — лучшее место для хранения этой информации. Например, горячая клавиша №1 или №2 может указывать направление к отелю или близлежащим ресторанам, контактную информацию для экстренных служб полиции / пожарных, специалистов по ремонту / обслуживанию и т.
Логотипы. Почти все объекты недвижимости имеют логотип. Вы можете улучшить внешний вид ваших фолио и отчетов, добавив в эти документы свой логотип.

Индивидуальные инструкции. В Check-Inn вы можете настроить выписки или регистрационные карточки. Вы также можете легко изменить набор слов в своих фолио и выписках по счетам. Это поможет гостям понять вашу собственность и повысит профессиональный вид ваших документов.

Это лишь несколько простых вещей, которые можно сделать в Check-Inn. Есть и другие варианты, которые помогут вам заработать больше денег и в целом улучшить свой бизнес.