Ип нк рф: НК РФ Статья 11. Институты, понятия и термины, используемые в настоящем Кодексе / КонсультантПлюс

Содержание

Ст. 346.11 НК РФ. Общие положения

1. Упрощенная система налогообложения организациями и индивидуальными предпринимателями применяется наряду с иными режимами налогообложения, предусмотренными законодательством Российской Федерации о налогах и сборах.

Переход к упрощенной системе налогообложения или возврат к иным режимам налогообложения осуществляется организациями и индивидуальными предпринимателями добровольно в порядке, предусмотренном настоящей главой.

2. Применение упрощенной системы налогообложения организациями предусматривает их освобождение от обязанности по уплате налога на прибыль организаций (за исключением налога, уплачиваемого с доходов, облагаемых по налоговым ставкам, предусмотренным пунктами 1.6, 3 и 4 статьи 284 настоящего Кодекса), налога на имущество организаций (за исключением налога, уплачиваемого в отношении объектов недвижимого имущества, налоговая база по которым определяется как их кадастровая стоимость в соответствии с настоящим Кодексом). Организации, применяющие упрощенную систему налогообложения, не признаются налогоплательщиками налога на добавленную стоимость, за исключением налога на добавленную стоимость, подлежащего уплате в соответствии с настоящим Кодексом при ввозе товаров на территорию Российской Федерации и иные территории, находящиеся под ее юрисдикцией (включая суммы налога, подлежащие уплате при завершении действия таможенной процедуры свободной таможенной зоны на территории Особой экономической зоны в Калининградской области), а также налога на добавленную стоимость, уплачиваемого в соответствии со статьями 161 и 174.1 настоящего Кодекса.

Абзац утратил силу с 1 января 2010 года. — Федеральный закон от 24.07.2009 N 213-ФЗ.

Иные налоги, сборы и страховые взносы уплачиваются организациями, применяющими упрощенную систему налогообложения, в соответствии с законодательством о налогах и сборах.

3. Применение упрощенной системы налогообложения индивидуальными предпринимателями предусматривает их освобождение от обязанности по уплате налога на доходы физических лиц (в отношении доходов, полученных от предпринимательской деятельности, за исключением налога, уплачиваемого с доходов в виде дивидендов, а также с доходов, облагаемых по налоговым ставкам, предусмотренным пунктами 2 и 5 статьи 224 настоящего Кодекса), налога на имущество физических лиц (в отношении имущества, используемого для предпринимательской деятельности, за исключением объектов налогообложения налогом на имущество физических лиц, включенных в перечень, определяемый в соответствии с пунктом 7 статьи 378.2 настоящего Кодекса с учетом особенностей, предусмотренных абзацем вторым пункта 10 статьи 378.2 настоящего Кодекса). Индивидуальные предприниматели, применяющие упрощенную систему налогообложения, не признаются налогоплательщиками налога на добавленную стоимость, за исключением налога на добавленную стоимость, подлежащего уплате в соответствии с настоящим Кодексом при ввозе товаров на территорию Российской Федерации и иные территории, находящиеся под ее юрисдикцией (включая суммы налога, подлежащие уплате при завершении действия таможенной процедуры свободной таможенной зоны на территории Особой экономической зоны в Калининградской области), а также налога на добавленную стоимость, уплачиваемого в соответствии со статьями 161 и 174.1 настоящего Кодекса.

Абзац утратил силу с 1 января 2010 года. — Федеральный закон от 24.07.2009 N 213-ФЗ.

Иные налоги, сборы и страховые взносы уплачиваются индивидуальными предпринимателями, применяющими упрощенную систему налогообложения, в соответствии с законодательством о налогах и сборах.

4. Для организаций и индивидуальных предпринимателей, применяющих упрощенную систему налогообложения, сохраняются действующие порядок ведения кассовых операций и порядок представления статистической отчетности.

5. Организации и индивидуальные предприниматели, применяющие упрощенную систему налогообложения, не освобождаются от исполнения обязанностей налоговых агентов, а также обязанностей контролирующих лиц контролируемых иностранных компаний, предусмотренных настоящим Кодексом.

Комментарий эксперта:

Общие положения об УСН, содержащиеся в ст. 346.11 НК РФ >>>

Упрощённая система налогообложения — специальный налоговый режим, который подходит для всех субъектов предпринимательской деятельности, которые не имеют большого штата, не планируют серьёзного расширения и не заинтересованы в ведении расширенной бухгалтерской отчётности.

См. все связанные документы >>>

Комментируемая статья регламентирует общие положения применения УСН.

Так абзаца 1 пункта 1 указанной статьи НК РФ устанавливает право индивидуальных предпринимателей и организаций применять УСН наряду с другими режимами налогообложения, предусмотренных НК РФ.

Абзац второй пункта 1 статьи 346.11 НК РФ устанавливает, что организации и индивидуальные предприниматели в добровольном порядке осуществляют переход на УСН, а также возврат к общей системе и иным режимам налогообложения.

Абзац 1 пункта 1 комментируемой статьи действует в редакции Федерального закона от 21.07.2005 N 101-ФЗ «О внесении изменений в главы 26.2 и 26.3 части второй Налогового кодекса Российской Федерации и некоторые законодательные акты Российской Федерации о налогах и сборах, а также о признании утратившими силу отдельных положений законодательных актов Российской Федерации».

Важно!

Нормами НК РФ не предусматривается возможность одновременно индивидуальными предпринимателями и организациями применять УСН и общий режим налогообложения. УСН, соответственно, может применяться одновременно только с иными специальными режимами налогообложения, что также подтверждается позицией официальных органов.

Официальная позиция.

В письме Минфина России от 22.01.2014 N 03-11-11/1897 разъясняется, что одновременное применение организациями и индивидуальными предпринимателями общего режима налогообложения и упрощенной системы налогообложения НК РФ не предусмотрено.

На основании пункта 2 комментируемой статьи если организация применяет УСН, то она освобождается от уплаты следующих налогов:

во-первых, налога на прибыль организации. При этом устанавливается исключение по налогу, уплачиваемого с доходов, облагаемых по налоговым ставкам, предусмотренным пунктами 3 и 4 статьи 284 НК РФ;

во-вторых, налога на имущество организации;

в-третьих, НДС за исключением налога на добавленную стоимость, подлежащего уплате в соответствии с НК РФ при ввозе товаров на территорию Российской Федерации и иные территории, находящиеся под ее юрисдикцией, а также налога на добавленную стоимость, уплачиваемого в соответствии со статьей 174.1 НК РФ.

Иные налоги организация, применяющая УСН, уплачивает в соответствии с НК РФ.

Важно!

Обращаем внимание, что с 1 января 2015 года вступают в силу изменения, вносимые в пункт 2 статьи 346.11 НК РФ. Абзац 1 указанной нормы будет действовать в новой редакции, а именно после слов «налога на имущество организаций» будет дополнено словами «(за исключением налога, уплачиваемого в отношении объектов недвижимого имущества, налоговая база по которым определяется как их кадастровая стоимость в соответствии с НК РФ)». Данные изменения внесены Федеральным законом от 02.04.2014 N 52-ФЗ «О внесении изменений в части первую и вторую Налогового кодекса Российской Федерации и отдельные законодательные акты Российской Федерации» (далее — Закон N 52-ФЗ).

Таким образом, с 1 января 2015 года организации, применяющие упрощенную систему налогообложения, должны будут платить налог на имущество организаций в отношении объектов недвижимого имущества, налоговая база по которым определяется как их кадастровая стоимость.

Официальная позиция.

В письме Минфина России от 31.12.2013 N 03-11-11/58497 разъясняется, что организация, совмещающая применение упрощенной системы налогообложения с системой налогообложения в виде единого налога на вмененный доход для отдельных видов деятельности, освобождается от уплаты налога на имущество организаций в отношении движимого и недвижимого имущества (в том числе имущества, переданного во временное владение, в пользование, распоряжение, доверительное управление, внесенного в совместную деятельность или полученного по концессионному соглашению), учитываемого на балансе в качестве объектов основных средств в порядке, установленном для ведения бухгалтерского учета, если иное не предусмотрено статьями 378 и 378.1 НК РФ (пункт 1 статьи 374 НК РФ).

Индивидуальный предприниматель, применяющий вышеназванные специальные налоговые режимы, не уплачивает налог на имущество физических лиц в отношении имущества, используемого для осуществления предпринимательской деятельности, облагаемой в рамках специальных налоговых режимов.

С 1 января 2010 года утратил силу абзац 2 пункта 2 статьи 346.11 НК РФ, который ранее устанавливал обязанность организации, применяющей упрощенную систему налогообложения, производить уплату страховых взносов на обязательное пенсионное страхование в соответствии с законодательством Российской Федерации.

На основании пункта 3 комментируемой статьи индивидуальный предприниматель, применяющий УСН, освобождается от уплаты следующих налогов:

во-первых, НДФЛ. Законодатель устанавливает следующее ограничение в отношении уплаты НДФЛ: в отношении доходов, полученных от предпринимательской деятельности, за исключением налога, уплачиваемого с доходов, облагаемых по налоговым ставкам, предусмотренным пунктами 2, 4 и 5 статьи 224 НК РФ;

во-вторых, налога на имущество физических лиц: только в отношении того имущества, которое используется для предпринимательских целей.

Официальная позиция.

В письме Минфина России от 28.03.2014 N 03-11-11/13850 разъясняется, что при реализации недвижимого имущества, используемого налогоплательщиком в предпринимательской деятельности, доходы от этой сделки подлежат налогообложению налогом, уплачиваемым при применении упрощенной системы налогообложения.

Также в письме Минфина России от 20.01.2014 N 03-11-11/1390 указывается, что в случае, когда в отношении доходов, полученных от осуществления предпринимательской деятельности, применяется упрощенная система налогообложения, такие доходы освобождаются от налогообложения налогом на доходы физических лиц на основании п. 3 ст. 346.11 НК РФ;

в-третьих, НДС. Исключение составляет НДС, подлежащий уплате в соответствии с НК РФ при ввозе товаров на территорию Российской Федерации и иные территории, находящиеся под ее юрисдикцией, а также налога на добавленную стоимость, уплачиваемого в соответствии со статьей 174.1 НК РФ.

Официальная позиция.

В письме Минфина России от 18.04.2014 N 03-11-11/18039 обращается внимание, что в законодательство Российской Федерации о налогах и сборах не вносилось изменение, предусматривающее обязанность индивидуального предпринимателя уплачивать налог на имущество физических лиц при применении специальных налоговых режимов.

Актуальная проблема.

На сегодняшний день на практике очень часто возникает вопрос о налогообложении налогом, уплачиваемым при применении упрощенной системы налогообложения, и НДФЛ доходов арбитражного управляющего, зарегистрированного в качестве ИП. Данный вопрос очень часто становится предметом рассмотрения арбитражных судов, также по указанному вопросу имеется множество разъяснений официальных органов.

Официальная позиция.

Так в письме Минфина России от 03.03.2014 N 03-11-11/8830 был рассмотрен вопрос о налогообложении налогом, уплачиваемым при применении упрощенной системы налогообложения, и НДФЛ доходов арбитражного управляющего, зарегистрированного в качестве ИП. По указанному вопросу Минфин России дал нижеследующие разъяснения.

Согласно пункту 1 статьи 20 Федерального закона от 26.10.2002 N 127-ФЗ «О несостоятельности (банкротстве)» арбитражным управляющим признается гражданин Российской Федерации, являющийся членом одной из саморегулируемых организаций арбитражных управляющих. Арбитражный управляющий является субъектом профессиональной деятельности и осуществляет регулируемую Федеральным законом профессиональную деятельность, занимаясь частной практикой. Арбитражный управляющий вправе заниматься иными видами профессиональной деятельности и предпринимательской деятельностью при условии, что такая деятельность не влияет на надлежащее исполнение им обязанностей, установленных законодательством о банкротстве.

Данной нормой разграничены профессиональная деятельность арбитражных управляющих и предпринимательская деятельность, тем самым указано на то, что регулируемая законодательством о банкротстве деятельность арбитражных управляющих не является предпринимательской деятельностью. При этом деятельность арбитражного управляющего в деле о банкротстве не требует регистрации в качестве индивидуального предпринимателя. Учитывая изложенное, в случае если гражданин зарегистрирован в качестве индивидуального предпринимателя и при этом не осуществляет иной деятельности, кроме деятельности, регулируемой Федеральным законом, то он не вправе применять упрощенную систему налогообложения.

Следовательно, доходы арбитражного управляющего, полученные от деятельности в качестве арбитражного управляющего, облагаются налогом на доходы физических лиц в порядке, установленном главой 23 «Налог на доходы физических лиц» НК РФ.

В случае если гражданин, являющийся арбитражным управляющим, также осуществляет предпринимательскую деятельность, то в отношении указанной предпринимательской деятельности он может применять упрощенную систему налогообложения в общеустановленном главой 26.2 НК РФ порядке.

Важно!

Аналогичная позиция также сложилась в судебной практике арбитражных судов. Рассмотрим конкретный пример.

Судебная практика.

Так Постановлением ФАС Центрального округа от 14.08.2013 N А09-5686/2012 было отказано в удовлетворении требований заявителя о признании незаконным решения налогового органа о приостановлении операций по счетам предпринимателя, переводов электронных денежных средств.

ФАС Центрального округа разъяснил, что НК РФ определен исчерпывающий перечень условий, при которых возможность применения УСН утрачивается. Запрет на применение УСН для арбитражных управляющих при проведении процедур банкротства и получении соответствующего вознаграждения отсутствует. Поскольку понятие «арбитражный управляющий» НК РФ не определено, он в НК РФ не рассматривается как отдельная категория налогоплательщиков.

Также суд признал неправомерной ссылку налогового органа на отсутствие у арбитражного управляющего обязанности зарегистрироваться в качестве индивидуального предпринимателя, которая не может быть принята во внимание, поскольку отсутствие такой обязанности не лишает арбитражного управляющего права сделать это.

Важно!

Таким образом, исходя из анализа норм НК РФ, разъяснений официальных органов и сложившейся практики арбитражных судов, следует, что действующим законодательством не установлен запрет на применение упрощенной системы налогообложения арбитражными управляющими, которые являются предпринимателями, при проведении процедур банкротства и получении соответствующего вознаграждения.

С 1 января 2010 года утратило силу положение, согласно которому ранее на предпринимателя, применяющего УСН, возлагалась обязанность по уплате страховых взносов на обязательное пенсионное страхование в соответствии с законодательством Российской Федерации.

Абзац 3 пункта 3 статьи 346.11 НК РФ регламентирует, что иные налоги подлежат уплате индивидуальным предпринимателем, применяющим УСН по правилам, установленным НК РФ.

Пункт 4 комментируемой статьи устанавливает очень важное положение, согласно которому для организаций и индивидуальных предпринимателей, применяющих упрощенную систему налогообложения, сохраняются действующие порядок ведения кассовых операций и порядок представления статистической отчетности. Обращаем внимание, что порядок предоставления первичных статистических данных и административных данных субъектам официального статистического учета регламентируется статьей 8 Федерального закона от 29.11.2007 N 282-ФЗ «Об официальном статистическом учете и системе государственной статистики в Российской Федерации» (далее — Закон N 282-ФЗ).

Также необходимо руководствоваться Порядком осуществления наличных денежных расчетов и (или) расчетов с использованием платежных карт без применения контрольно-кассовой техники, утвержденным Постановлением Правительства РФ от 06.05.2008 N 359.

Важно!

Также необходимо обратить внимание, что с 1 июня 2014 года действуют новые правила ведения кассовых операций в связи со вступлением в силу указания Банка России от 11.03.2014 N 3210-У «О порядке ведения кассовых операций юридическими лицами и упрощенном порядке ведения кассовых операций индивидуальными предпринимателями и субъектами малого предпринимательства». Напомним, что ранее действовало Положение о порядке ведения кассовых операций с банкнотами и монетой Банка России на территории Российской Федерации, утвержденное Банком России 12.10.2011 N 373-П.

Официальная работа.

В письме Минфина России от 30.10.2013 N 03-11-11/46198 в целях применения пункта 4 статьи 346.11 НК РФ рассмотрен вопрос о необходимости налогоплательщику, применяющему УСН с объектом налогообложения в виде «доходы», документально оформлять направление работников в командировку и подтверждать расходы на проезд работников, их размещение в гостинице, выплату суточных, иные расходы. По данному вопросу Минфин России указал нижеследующее.

Подотчетное лицо обязано в срок, не превышающий трех рабочих дней после дня истечения срока, на который выданы наличные деньги под отчет, или со дня выхода на работу, предъявить главному бухгалтеру или бухгалтеру, а при их отсутствии — руководителю авансовый отчет с прилагаемыми подтверждающими документами. Проверка авансового отчета главным бухгалтером или бухгалтером, а при их отсутствии — руководителем, его утверждение руководителем и окончательный расчет по авансовому отчету осуществляются в срок, установленный руководителем.

Организации либо индивидуальные предприниматели, применяющие упрощенную систему налогообложения с объектом налогообложения в виде доходов, оформление документов, подтверждающих направление работников в служебные командировки, и произведенные ими вышеуказанные расходы в служебных командировках, а также авансовых отчетов должны производить в общеустановленном порядке.

Пункт 5 статьи 346.11 НК РФ устанавливает, что индивидуальные предприниматели и организации, применяющие УСН, продолжают осуществлять функции и обязанности налоговых агентов.

В соответствии с пунктом 1 статьи 24 НК РФ налоговыми агентами признаются лица, на которых в соответствии с НК РФ возложены обязанности по исчислению, удержанию у налогоплательщика и перечислению налогов в бюджетную систему Российской Федерации.

Актуальная проблема.

На практике может возникнуть вопрос — осуществляет ли ИП или организация, применяющие УСН, функции налогового агента при применении норм международного права. Обращаем внимание, что пункт 5 статьи 346.11 НК РФ подлежит расширительному толкованию, поэтому в рассматриваемой ситуации на них также возложена обязанность по осуществлению функций налоговых агентов. В обоснование данного довода, рассмотрим позицию официальных органов.

Официальная позиция.

Так в письме ФНС России от 25.10.2013 N ОА-4-13/[email protected] разъясняется, что при применении положений международных договоров Российской Федерации налоговый агент не освобождается от обязанности представления в налоговые органы по окончании отчетного (налогового) периода налогового расчета (информации) о суммах выплаченных иностранным организациям доходов и удержанных налогов.

Официальная позиция.

В письме ФНС РФ от 17.05.2011 N АС-4-3/[email protected] «О порядке исполнения налогоплательщиком-организацией, применяющим УСН, обязанности налогового агента» дается следующее разъяснение по применению положений пункта 5 комментируемой статьи на основании конкретного примера.

В случае, когда учредителями юридического лица являются только физические лица, причитающиеся им суммы дивидендов облагаются налогом на доходы физических лиц. Соответственно, у организации — источника выплаты дивидендов, применяющей упрощенную систему налогообложения, обязанностей по удержанию и уплате налога на прибыль организаций и представлению в налоговые органы Расчета по данному налогу либо по заполнению каких-либо разделов (листов) налоговой декларации по налогу на прибыль организаций также не возникает.

Несмотря на то, что данное разъяснение было дано ФНС России еще в 2011 году, оно остается актуальным на сегодняшний день, так как правовое регулирование рассматриваемой ситуации не изменилось, поправки и изменения в пункт 5 статьи 346.11 НК РФ не вносились.

Важно!

За неисполнение обязанности налогового агента налогоплательщики, применяющие УСН, привлекаются к ответственности, предусмотренной статьей 119 НК РФ, что подтверждается позицией судов (см., например, Определение ВАС РФ от 21.03.2014 N ВАС-2475/14).

Статья 346.11 НК РФ. Общие положения

1. Упрощенная система налогообложения организациями и индивидуальными предпринимателями применяется наряду с иными режимами налогообложения, предусмотренными законодательством Российской Федерации о налогах и сборах.

Переход к упрощенной системе налогообложения или возврат к иным режимам налогообложения осуществляется организациями и индивидуальными предпринимателями добровольно в порядке, предусмотренном настоящей главой.

2. Применение упрощенной системы налогообложения организациями предусматривает их освобождение от обязанности по уплате налога на прибыль организаций (за исключением налога, уплачиваемого с доходов, облагаемых по налоговым ставкам, предусмотренным пунктами 1.6, 3 и 4 статьи 284 настоящего Кодекса), налога на имущество организаций (за исключением налога, уплачиваемого в отношении объектов недвижимого имущества, налоговая база по которым определяется как их кадастровая стоимость в соответствии с настоящим Кодексом). Организации, применяющие упрощенную систему налогообложения, не признаются налогоплательщиками налога на добавленную стоимость, за исключением налога на добавленную стоимость, подлежащего уплате в соответствии с настоящим Кодексом при ввозе товаров на территорию Российской Федерации и иные территории, находящиеся под ее юрисдикцией (включая суммы налога, подлежащие уплате при завершении действия таможенной процедуры свободной таможенной зоны на территории Особой экономической зоны в Калининградской области), а также налога на добавленную стоимость, уплачиваемого в соответствии со статьями 161 и 174.1 настоящего Кодекса.

Абзац утратил силу с 1 января 2010 года. — Федеральный закон от 24.07.2009 N 213-ФЗ.

Иные налоги, сборы и страховые взносы уплачиваются организациями, применяющими упрощенную систему налогообложения, в соответствии с законодательством о налогах и сборах.

3. Применение упрощенной системы налогообложения индивидуальными предпринимателями предусматривает их освобождение от обязанности по уплате налога на доходы физических лиц (в отношении доходов, полученных от предпринимательской деятельности, за исключением налога, уплачиваемого с доходов в виде дивидендов, а также с доходов, облагаемых по налоговым ставкам, предусмотренным пунктами 2 и 5 статьи 224 настоящего Кодекса), налога на имущество физических лиц (в отношении имущества, используемого для предпринимательской деятельности, за исключением объектов налогообложения налогом на имущество физических лиц, включенных в перечень, определяемый в соответствии с пунктом 7 статьи 378.2 настоящего Кодекса с учетом особенностей, предусмотренных абзацем вторым пункта 10 статьи 378.2 настоящего Кодекса). Индивидуальные предприниматели, применяющие упрощенную систему налогообложения, не признаются налогоплательщиками налога на добавленную стоимость, за исключением налога на добавленную стоимость, подлежащего уплате в соответствии с настоящим Кодексом при ввозе товаров на территорию Российской Федерации и иные территории, находящиеся под ее юрисдикцией (включая суммы налога, подлежащие уплате при завершении действия таможенной процедуры свободной таможенной зоны на территории Особой экономической зоны в Калининградской области), а также налога на добавленную стоимость, уплачиваемого в соответствии со статьями 161 и 174.1 настоящего Кодекса.

Абзац утратил силу с 1 января 2010 года. — Федеральный закон от 24.07.2009 N 213-ФЗ.

Иные налоги, сборы и страховые взносы уплачиваются индивидуальными предпринимателями, применяющими упрощенную систему налогообложения, в соответствии с законодательством о налогах и сборах.

4. Для организаций и индивидуальных предпринимателей, применяющих упрощенную систему налогообложения, сохраняются действующие порядок ведения кассовых операций и порядок представления статистической отчетности.

5. Организации и индивидуальные предприниматели, применяющие упрощенную систему налогообложения, не освобождаются от исполнения обязанностей налоговых агентов, а также обязанностей контролирующих лиц контролируемых иностранных компаний, предусмотренных настоящим Кодексом.

Существуют ли налоговые риски у ИП, который в течение года вновь регистрируется как ИП, но с использованием УСН?

ИП, который до 2017 года применял общую систему налогообложения, в течение года снимается с учета как ИП, а затем вновь регистрируется как ИП, но с использованием УСН.

Рассмотрев вопрос, мы пришли к следующему выводу:

В течение календарного года начать применять УСН может вновь зарегистрированный индивидуальный предприниматель.

В случае начала применения УСН при повторной регистрации в качестве индивидуального предпринимателя имеются существенные налоговые риски.

Обоснование вывода:

Согласно п. 1 ст. 346.13 НК РФ организации и индивидуальные предприниматели (далее — ИП), изъявившие желание перейти на УСН со следующего календарного года, уведомляют об этом налоговый орган по месту нахождения организации или месту жительства ИП не позднее 31 декабря календарного года, предшествующего календарному году, начиная с которого они переходят на УСН.

В рассматриваемом случае ИП до 31.12.2016 не уведомил налоговый орган по месту жительства о переходе на УСН. В этой связи он в силу прямой нормы пп. 19 п. 3 ст. 346.12 НК РФ не вправе применять УСН в 2017 году.

В то же время из положений п. 2 ст. 346.13 НК РФ следует, что не с начала календарного года могут начать применять УСН в том числе вновь зарегистрированные ИП, уведомив об этом налоговый орган не позднее 30 календарных дней с даты их постановки на налоговый учет, указанной в свидетельстве. В этом случае ИП признаются налогоплательщиками, применяющими УСН, с даты постановки их на учет в налоговом органе, указанной в свидетельстве о постановке на учет в налоговом органе.

В рассматриваемом случае ИП уже состоит на учете в налоговом органе. При этом глава 26.2 НК РФ не содержит такого понятия, как повторная регистрация в качестве ИП. В ст. 346.13 НК РФ речь идет о вновь зарегистрированном ИП. Очевидно, что таковым является и повторно зарегистрированный в налоговом органе ИП.

Таким образом, можно предположить, что повторно зарегистрированный после снятия с учета в налоговом органе ИП вправе применять УСН с даты постановки на учет в налоговом органе, уведомив об этом не позднее 30 календарных дней с даты его повторной постановки на налоговый учет.

Разъяснений уполномоченных органов применительно к анализируемой ситуации нам обнаружить не удалось. Вместе с тем в письме ФНС России от 28.02.2013 N ЕД-3-3/[email protected], посвященном снятию с учета и постановке на учет в налоговых органах ИП с целью смены объекта налогообложения при применении УСН, отметили, что под началом ведения предпринимательской деятельности понимается дата первой регистрации в качестве ИП.

Однако судьи в ряде случаев поддерживали лиц, повторно зарегистрированных в качестве ИП и начавших применять УСН.

Например, в постановлениях ФАС Поволжского округа от 16.05.2006 N А65-25496/2005-СА2-11, от 16.05.2006 N А65-33393/2005-СА2-34 судьи пришли к выводу, что повторно зарегистрированный ИП правомерно подал заявление о применении УСН. Доводы налогового органа был отклонены, поскольку глава 26.2 НК РФ не содержит такого понятия, как повторная регистрация в качестве предпринимателя.

В свою очередь, в постановлении ФАС Уральского округа от 23.03.2005 N Ф09-938/05АК указывается, что из смысла п. 2 ст. 346.13 НК РФ не следует, что УСН возможна только в том случае, если предприниматель зарегистрировался впервые, и выражение «вновь зарегистрированные» может включать в себя повторную регистрацию (смотрите также постановление ФАС Уральского округа от 11.05.2005 N Ф09-1898/05-С1).

В постановлении Девятого арбитражного апелляционного суда от 07.10.2015 N 09АП-38602/2015 по делу N А40-33553/15 отмечается, что действующим законодательством не запрещено и не ограничено право гражданина прекратить статус предпринимателя или зарегистрировать этот статус заново. Не существует и ограничений по количеству регистраций статуса ИП и его прекращения.

В то же время по данному вопросу судьями высказывалась и иная позиция.

Так, в постановлении ФАС Волго-Вятского округа от 16.07.2012 N Ф01-2618/12 по делу N А31-5701/2011 судьи в схожей ситуации пришли к выводу, что действия ИП по прекращению деятельности и регистрации вновь имели своей целью исключительно переход на УСН.

В определении ВС РФ от 30.06.2015 N 301-КГ15-6512 судьи посчитали, что доначисление единого налога, исходя из выбранного предпринимателем объекта налогообложения «доходы», было правомерным. При этом регистрация ИП прекращения предпринимательской деятельности и повторного ее осуществления в середине налогового периода преследовала целью замену объекта налогообложения.

Приведенная арбитражная практика свидетельствует о том, что в случае повторной регистрации гражданина в качестве ИП и начале применения УСН у него возникают существенные налоговые риски.

Если ИП примет решение продолжить применять общую систему налогообложения, следует учитывать, что согласно ст. 221 НК РФ у него есть возможность уменьшить полученные от предпринимательской деятельности доходы на сумму профессиональных налоговых вычетов.

Состав указанных расходов, принимаемых к вычету, определяется налогоплательщиком самостоятельно в порядке, аналогичном порядку определения расходов для целей налогообложения, установленному главой 25 НК РФ.

В случае, если ИП не в состоянии документально подтвердить свои расходы, связанные с деятельностью в качестве ИП, профессиональный налоговый вычет производится в размере 20% общей суммы доходов, полученной ИП от предпринимательской деятельности (п. 1 ст. 221 НК РФ).

Ответ подготовил:

Эксперт службы Правового консалтинга ГАРАНТ

аудитор Пивоварова Марина

Информационное правовое обеспечение ГАРАНТ

Многоканальный телефон: (347) 292-44-44

Единый налоговый платеж распространят на компании и ИП

Юрлица и индивидуальные предприниматели смогут уплачивать налоги, отдельные виды сборов и страховые взносы единым налоговым платежом. С января 2019 года работает механизм, по которому граждане могут уплачивать имущественный, транспортный и земельный налоги авансом. С 1 января 2020 года сюда же был включен и НДФЛ.

Механизм «единого налогового платежа» (ЕНП) позволяет перечислять обязательные платежи одним платежным поручением без уточнения вида платежа, срока его уплаты, принадлежности к бюджету бюджетной системы РФ. При этом налоговый орган на основе имеющейся информации самостоятельно производит зачет перечисленных средств в счет обязательств плательщика.

В этом сюжете
  • 19 марта, 8:53

  • 4 марта, 11:06

  • 18 февраля, 8:05

«Принятие таких изменений создаст для плательщиков более комфортные условия, сократит время оформления расчетных документов, а также позволит своевременно исполнять свои обязательства перед бюджетом», – прокомментировал ранее поправки министр финансов Антон Силуанов.

Сумма единого налогового платежа компании и ИП будет направляться на погашение недоимки. Если ее нет, то зачет суммы единого налогового платежа будет производиться в счет предстоящих платежей с наиболее ранним сроком уплаты, а в случае их отсутствия – в счет задолженности по уплате пеней, процентов и штрафов.

При этом налоговый орган будет обязан информировать плательщика о принятом решении о зачете денежных средств, перечисленных в бюджет в качестве единого налогового платежа, в течение пяти дней со дня принятия такого решения. У плательщика сохранится право уплачивать платежи по действующему порядку: направлять средства на соответствующие обязательствам коды бюджетной классификации.

В случае принятия закона поправки начнут действовать с 1 января 2022 года.

Законопроект № 1141868-7 О внесении изменений в часть первую Налогового кодекса Российской Федерации в связи с совершенствованием порядка уплаты (перечисления) налогов, сборов, страховых взносов

54. Нк рф возлагает на индивидуальных предпринимателей:

Ответ: 2) больший объем обязанностей по сравнению с физическими лицами без такого статуса.

Ключ: НК РФ возлагает на индивидуальных предпринимателей больший объем обязанностей по сравнению с физическими лицами без такого статуса (в т.ч. п. 2 ст. 23 НК РФ: индивидуальные предприниматели обязаны сообщать в налоговый орган по месту жительства об открытии или о закрытии счетов в банках). Кроме того, если индивидуальный предприниматель осуществляет предпринимательскую деятельность, у него может возникнуть обязанность по уплате налогов, не относящихся к физическим лицам без такого статуса (в т.ч. НДС, ЕНВД).

55. Филиалы российских юридических лиц:

Ответ: 3) не являются налогоплательщиками.

Ключ: В ст. 19 НК РФ филиалы российских организаций, поскольку они не обладают собственной гражданской правоспособностью, специально исключены из числа налогоплательщиков. В п. 9 Постановления Пленумов ВС РФ и ВАС РФ от 11.06.1999 N 41/9 разъяснено, что в соответствии с НК РФ филиалы и представительства российских юридических лиц не рассматриваются в качестве участников налоговых правоотношений.

56. В законе о некотором налоге, введенном в рф, в качестве налогоплательщиков установлены физические лица. Соответственно, обязанность по уплате этого налога может возникнуть:

Ответ: 3) у граждан РФ, у иностранных граждан, у лиц без гражданства.

Ключ: В ст. 19 НК РФ в качестве одного из видов налогоплательщиков названы физические лица. В п. 2 ст. 11 НК РФ дано специальное определение: физические лица — граждане РФ, иностранные граждане и лица без гражданства.

57. В ст. 143 нк рф в качестве налогоплательщиков ндс указаны в т.Ч. Организации. Следовательно:

Ответ: 2) все российские юридические лица обязаны уплачивать НДС при возникновении в их деятельности объекта налогообложения и отсутствии (недостаточности) освобождений (вычетов).

Ключ: Обязанность по уплате любого налога является следствием возникновения в деятельности налогоплательщика объекта налогообложения и отсутствия (недостаточности) освобождений (льгот, вычетов, расходов). Российские организации, не имеющие статуса юридического лица (например, учебная группа студентов, спортивная секция), не входят в объем понятия «организация» (ст. 11 НК РФ) и, следовательно, не могут являться налогоплательщиками (ст. 19 НК РФ) какого-либо налога.

58. В принципе не может выступать в качестве налогоплательщика:

Ответ: 3) субъект РФ.

Ключ: Публично-правовые образования (в т.ч. субъект РФ) не входят в объем понятия «организация» (ст. 11 НК РФ) и, следовательно, не могут являться налогоплательщиками (ст. 19 НК РФ) какого-либо налога. Налоговая инспекция и орган исполнительной власти субъекта РФ, зарегистрированные в качестве юридических лиц, являются налогоплательщиками на общих основаниях и, в частности, уплачивают налог на имущество организаций, транспортный налог при наличии облагаемого имущества и отсутствии (недостаточности) льгот (освобождений).

59. Налоговые инспекции могут являться:

Ответ: 2) как публичными, так и частными участниками налоговых правоотношений.

Ключ: Налоговые инспекции, являясь органами исполнительной власти и обладая полномочиями в сфере налогообложения, будучи зарегистрированными в качестве юридических лиц, одновременно являются налогоплательщиками (в т.ч. уплачивают транспортный налог при наличии облагаемого имущества и отсутствии (недостаточности) льгот), а также налоговыми агентами (удерживают и перечисляют НДФЛ с заработной платы сотрудников).

60. Российская Федерация, субъекты РФ, муниципальные образования могут являться:

Ответ: 1) только публичными участниками налоговых правоотношений.

Ключ: Законодательство о налогах, в т.ч. НК РФ, не предусматривает случаев участия публично-правового образования в каких-либо правоотношениях в качестве функционально подчиненной стороны. В частности, публично-правовые образования не уплачивают налогов, т.к. не входят в объем понятия «организация» (п. 2 ст. 11 НК РФ).

61. Существуют ли субъекты налогового права, не поименованные в ст. 9 НК РФ?

Ответ: 3) существуют, несмотря на то что перечень в ст. 9 НК РФ является закрытым.

Ключ: Налоговое законодательство в действительности предоставляет права и возлагает обязанности не только на тех лиц, которые прямо указаны в закрытом перечне в ст. 9 НК РФ. Пример: на банки, не указанные в ст. 9 НК РФ, возложен ряд обязанностей в ст. ст. 60, 86 НК РФ.

62. Директор организации, действующий на основании учредительных документов, является:

Ответ: 1) законным представителем организации в налоговых правоотношениях.

Ключ: Пункт 1 ст. 27 НК РФ: законными представителями налогоплательщика-организации признаются лица, уполномоченные представлять указанную организацию на основании закона или ее учредительных документов. Директор организации налоги за данную организацию уплачивать не может, поскольку налог является индивидуальным платежом (ст. 8 НК РФ), т.е. относящимся к самой организации-налогоплательщику.

63. Как можно исчерпывающим образом подразделить всех субъектов налогового права?

Ответ: 2) публичные субъекты, частные субъекты.

Ключ: Всех субъектов налогового права исчерпывающим образом можно подразделить только на публичных субъектов (публично-правовые образования и их органы, способные выступать в качестве властной управомоченной стороны) и частных субъектов (организации и физические лица, способные выступать в качестве функционально подчиненной стороны).

64. С какого момента возникает налоговая дееспособность у юридического лица?

Ответ: 1) с момента государственной регистрации в качестве юридического лица.

Ключ: НК РФ предусматривает практически все права и обязанности юридических лиц в сфере налогообложения вне зависимости от какого-либо момента от начала их существования. Следовательно, налоговая правоспособность и дееспособность возникают у юридического лица с момента государственной регистрации в этом качестве.

65. Может ли физическое лицо, не осуществляющее предпринимательской деятельности, являться налогоплательщиком НДФЛ?

Ответ: 1) может, при получении налогооблагаемого дохода и отсутствии (недостаточности) вычетов (льгот, расходов).

Ключ: Физическое лицо, не осуществляющее предпринимательской деятельности, в частности, является налогоплательщиком НДФЛ при получении налогооблагаемого дохода (например, от трудовой деятельности) и отсутствии (недостаточности) вычетов (гл. 23 НК РФ).

66. Может ли годовалый младенец стать налогоплательщиком?

Ответ: 2) может, если приобретет обязанность по уплате конкретного налога путем действий своих представителей.

Ключ: Исходя из ст. 19, п. 2 ст. 11 НК РФ для появления у физического лица статуса налогоплательщика возраст не имеет значения. Обязанность по уплате конкретного налога может быть приобретена младенцем путем действий его представителей (гл. 4 НК РФ). Так, если родители, действуя от имени ребенка, приобретут (приватизируют) на него квартиру или долю в праве собственности в квартире, то у ребенка может возникнуть обязанность по уплате налога на имущество физических лиц.

Индивидуальный предприниматель и налоги | Деловое обозрение

Предприниматели обязаны действовать в рамках закона, но зачастую стоят перед выбором: опираться на положения НК РФ, которые постоянно меняются, а нормы прописаны нечетко, или на требования налоговиков. Рассмотрим наиболее актуальные вопросы налогообложения предпринимателей, встречающиеся в их хозяйственной деятельности.

Специальные налоговые режимы

Может ли индивидуальный предприниматель, применяющий УСН, списать расходы на транспортировку со склада продавца покупных товаров, предназначенных для перепродажи?
Налогоплательщики, применяющие «упрощенку», при определении налоговой базы по единому налогу вправе учитывать расходы по оплате стоимости товаров, приобретенных для дальнейшей реализации, а также затраты на транспортировку этих товаров (пп. 23 п. 1 ст. 346.16 НК РФ). Расходы на приобретение товаров для перепродажи учитываются при налогообложении по мере их реализации (пп. 2 п. 2 ст. 346.17 НК РФ). Они признаются в составе стоимости приобретенных товаров и включаются в налоговую базу в части, относящейся к реализованным товарам. Услуги по транспортировке должны быть обязательно оплачены.

Относятся ли к расходам, учитываемым по УСН, суммы заработной платы, выплаченные самому ИП?
Плательщики «упрощенного» налога уменьшают базу на расходы по оплате труда. Об этом говорится в пп. 6 п. 1 ст. 346.16 НК. Согласно п. 2 той же статьи расходы «упрощенца» по оплате труда формируются на основании положений ст. 255 НК РФ.
Предприниматель вправе включить в расходы при исчислении налоговой базы все выплаты работникам, стимулирующие начисления и надбавки, компенсации за условия труда, премии и единовременные поощрения, а также суммы, предусмотренные законодательством, трудовыми и коллективными договорами.
Под зарплатой, которую «упрощенец» может учесть в расходах, подразумеваются выплаты работодателя своим работникам. По отношению к самому себе ИП таковым не является. Даже если он и установит себе заработную плату, учесть при исчислении единого налога эту сумму он не имеет права.

Учитывают ли суммы материальной выгоды по договорам беспроцентного займа предприниматели, применяющие УСН?
Нет, не учитывают. Правила определения доходов всеми плательщиками «упрощенного» налога (без исключения) идентичны правилам их определения согласно главе 25 НК РФ «Налог на прибыль организаций». В ст. 250 НК РФ включение в состав внереализационных доходов сумм материальной выгоды по договорам беспроцентного займа не предусмотрено. Следовательно, данное правило распространяется также на организации и индивидуальных предпринимателей, применяющих УСН (письмо Минфина от 14.05.2008 г. № 03-11-05/122).

Индивидуальный предприниматель занимается распространением рекламы при помощи мониторов в салонах маршрутных такси. Подлежит ли переводу на «вмененку» указанный вид предпринимательской деятельности?
Согласно пп. 11 п. 2 ст. 346.26 НК РФ на уплату ЕНВД может быть переведена предпринимательская деятельность по распространению и (или) размещению рекламы на автобусах любых типов, трамваях, троллейбусах, легковых и грузовых автомобилях, прицепах, полуприцепах и прицепах-роспусках, речных судах. При этом НК РФ не предусмотрен такой вид, как распространение и размещение рекламы внутри автотранспортных средств. Деятельность по распространению рекламы внутри автотранспорта не подлежит переводу на систему налогообложения в виде ЕНВД (письмо Минфина от 19.08.2008 г. № 03-11-05/199). Данный вид бизнеса должен облагаться в рамках общего режима либо УСН.

ИП переведен на уплату «вмененки». Вправе ли он применять имущественные и социальные налоговые вычеты по НДФЛ в отношении доходов, полученных от осуществления такой деятельности?
Предоставление имущественных налоговых вычетов, социальных налоговых вычетов на платное лечение и на обучение, вычетов на страхование имущества и на ремонт основных средств по деятельности, облагаемой ЕНВД, главой 26.3 НК не предусмотрено. Таковые применяются только к доходам налогоплательщика, подлежащим обложению налогом на доходы физических лиц по ставке 13%.
К доходам, по которым индивидуальный предприниматель уплачивает «вмененку», имущественные и социальные налоговые вычеты по НДФЛ не применяются (письмо Минфина от 30.06.2008 г. № 03-11-05/159).

Индивидуальный предприниматель сдает в аренду принадлежащие ему площади сразу нескольким арендаторам. При этом четкой разбивки на торговые места по данным техпаспорта нет. Конечное число квадратных метров определяется индивидуально, сами же арендаторы отделены друг от друга только торговыми витринами, стеллажами для товара или просто пластиковой перегородкой. Подпадает ли данная деятельность, с учетом перечисленных особенностей, под ЕНВД?
Ст. 346.26 НК РФ предусмотрено, что обложению в рамках «вмененного» спецрежима подлежит деятельность в сфере оказания услуг по передаче во временное владение и (или) в пользование торговых мест, расположенных в объектах стационарной торговой сети, не имеющих торговых залов, объектов нестационарной торговой сети, а также объектов организации общественного питания, не имеющих зала обслуживания посетителей.
Согласно ст. 346.27 НК РФ под торговым местом понимается место, используемое для совершения сделок розничной купли-продажи. Это здания, строения, сооружения (их часть) и (или) земельные участки, используемые для совершения сделок розничной купли-продажи.
К ним же причисляют объекты организации розничной торговли и общественного питания, не имеющие торговых залов и залов обслуживания посетителей, прилавки, столы, лотки, земельные участки, используемые для размещения объектов организации розничной торговли (общественного питания), не имеющих торговых залов.
В этой ситуации сдача в аренду площадей может подпадать под обложение ЕНВД при условии, что объект организации розничной торговли не имеет торговых залов. Если же организуемые на арендованной площади торговые объекты имеют торговые залы, то согласно ст. 346.27 НК РФ они относятся к категории магазинов и павильонов. Доходы от данной предпринимательской деятельности должны облагаться в рамках иного режима налогообложения (письмо Минфина от 22.08.2008 г. № 03-11-05/202).

Индивидуальный предприниматель, осуществляющий деятельность, подпадающую под обложение ЕНВД, предоставил заем другому предпринимателю под 10% годовых. Как должна будет облагаться налогом сумма полученного дохода в виде уплаченных заемщиком процентов?
Налогоплательщики — индивидуальные предприниматели в связи с осуществлением «вмененной» деятельности освобождаются от обязанности по уплате НДФЛ только в отношении доходов, полученных от данной предпринимательской деятельности (п. 4 ст. 346.26 НК РФ). При этом заключение «предпринимателем-вмененщиком» договора займа осуществляется вне рамок применения данного спецрежима. Следует помнить об обязанности вести раздельный учет операций, облагаемых согласно разным налоговым режимам.

Общая система налогообложения

ИП внес вклад в уставный капитал организации в виде недвижимого имущества. Впоследствии он планирует реализовать свою долю в уставном капитале. Сможет ли индивидуальный предприниматель уменьшить в целях исчисления НДФЛ полученный доход на сумму произведенных расходов?
На основании пп. 1 п. 1 ст. 220 НК при продаже доли (ее части) в уставном капитале организации налогоплательщик вправе уменьшить сумму своих облагаемых НДФЛ доходов на сумму фактически произведенных им и документально подтвержденных расходов, связанных с получением этих доходов.
Документально подтвержденные расходы по приобретению доли в уставном капитале организации относятся к расходам, связанным с получением дохода от продажи доли в уставном капитале. При реализации доли в уставном капитале предприниматель вправе уменьшить сумму полученного дохода на сумму документально подтвержденных расходов, связанных с приобретением указанной доли (письмо Минфина от 26.06.2008 г. № 03-04-05-01/224).

Индивидуальный предприниматель применяет систему налогообложения в виде ЕНВД. Облагаются ли НДФЛ зарплаты, которые он выплачивает своим наемным работникам? Должен ли предприниматель исполнять роль налогового агента?
Перевод на ЕНВД предусматривает отмену для индивидуального предпринимателя уплаты НДФЛ в отношении его собственных доходов, полученных в рамках «вмененной» деятельности. При этом от обязанностей налогового агента по НДФЛ предприниматель-«вмененщик» не освобождается. ИП исполняет обязанность налогового агента, то есть обязан исчислять и удерживать НДФЛ с доходов своих сотрудников.
Согласно п. 7 ст. 226 НК РФ совокупная сумма налога на доходы физических лиц, исчисленная и удержанная налоговым агентом у налогоплательщика, в отношении которого тот признается источником дохода, уплачивается по месту учета налогового агента в налоговом органе.

Должен ли индивидуальный предприниматель подавать в налоговую инспекцию декларацию по НДФЛ, если в отчетном периоде сумма налога к уплате в бюджет равна нулю?
Обязанность представить декларацию по налогу на доходы физических лиц индивидуальными предпринимателями предусмотрена п. 5 ст. 227 НК РФ. При этом декларация подается данной категорией налогоплательщиков независимо от результатов предпринимательской деятельности в сроки, установленные ст. 229 НК РФ.
При этом неважно, получены предпринимателем в отчетном периоде доходы или налоговая база принимается равной нулю. Исключение из этого правила — если предприниматель прекратил свою деятельность. Однако в этом случае он обязан в пятидневный срок со дня прекращения предпринимательской деятельности представить налоговую декларацию о фактически полученных доходах в текущем налоговом периоде.

Включается ли в базу по ЕСН сумма компенсации, полученная от партнера за задержку оплаты выполненных работ?
Объектом налогообложения ЕСН признаются доходы от предпринимательской либо иной профессиональной деятельности за вычетом расходов, связанных с их извлечением (п. 2 ст. 236 НК РФ). В ст. 41 НК РФ дается определение «дохода». Это экономическая выгода в денежной или натуральной форме. В последнем случае поступления учитываются, только если их можно оценить по правилам глав «Налог на доходы физических лиц», «Налог на прибыль организаций».
Глава 23 «НДФЛ» не содержит специальных положений в отношении сумм пеней за неисполнение или ненадлежащее исполнение договора, но и не устанавливает исчерпывающий перечень таких доходов.
Согласно гл. 25 «Налог на прибыль» доходом налогоплательщика признаются суммы штрафов, пеней и иных санкций за нарушение договорных обязательств (п. 3 ст. 250 НК РФ). Неустойка, полученная вследствие нарушения условий договора, должна включаться в базу по ЕСН у индивидуального предпринимателя (письмо Минфина от 4.04.2007 г. № 03-04-05-02/6).

Обязан ли предприниматель, который ведет свою деятельность без привлечения наемных работников, представлять сведения о среднесписочной численности работников?
Согласно ст. 80 НК сведения о среднесписочной численности работников за предшествующий календарный год представляются налогоплательщиками не позднее 20 января текущего года, а в случае создания (реорганизации) организации — не позднее 20-го числа месяца, следующего за месяцем, в котором организация была создана (реорганизована). Исключений, касающихся индивидуальных предпринимателей, законодательством не предусмотрено. Указанные сведения они обязаны подать, несмотря на отсутствие сотрудников. Форма для подачи этих данных утверждена приказом ФНС от 29.03.2007 г. № ММ-3-25/[email protected] «Сведения о среднесписочной численности работников за предшествующий календарный год» (письмо Минфина от 21.07.2008 г. № 03-02-08-13).

Предприниматель в рамках своей предпринимательской деятельности продает недвижимое имущество. Необходимо ли уплачивать НДС с данной операции?
На основании п. 1 ст. 143 НК РФ плательщиками НДС признаются индивидуальные предприниматели, зарегистрированные в таком качестве и осуществляющие предпринимательскую деятельность без образования юридического лица.
Согласно п. 1 ст. 2 ГК РФ предпринимательская деятельность — это самостоятельная, осуществляемая на свой риск деятельность, направленная на систематическое получение прибыли от пользования имуществом, продажи товаров, выполнения работ или оказания услуг лицами, зарегистрированными в этом качестве в установленном законом порядке.
Если предприниматель реализует недвижимое имущество в рамках предпринимательской деятельности, то такая операция облагается НДС в общеустановленном порядке. Пп. 22 п. 3 ст. 149 НК РФ предусмотрено освобождение от уплаты НДС продажи жилых домов, жилых помещений, а также долей в них.

В каком порядке индивидуальный предприниматель должен уплачивать транспортный налог, если автомобиль используется в предпринимательской деятельности?
На основании ст. 357 Налогового кодекса плательщиками транспортного налога признаются лица, на которых в соответствии с законодательством РФ зарегистрированы транспортные средства, признаваемые объектом налогообложения. В п. 2 ст. 358 НК РФ установлен закрытый перечень транспортных средств, не являющихся объектом налогообложения.
Если автомобиль, находящийся в собственности индивидуального предпринимателя, не включен в перечень транспортных средств, которые не признаются объектом налогообложения, и по нему не предоставлены какие-либо льготы, ИП обязан уплачивать транспортный налог в общеустановленном порядке.

Индивидуальный предприниматель ведет деятельность, доход по которой облагается по упрощенной системе налогообложения. Может ли он со своего расчетного счета, используемого в рамках этой деятельности, уплатить транспортный налог за свой личный автомобиль?
В письме Минфина России от 18.05.2007 г. № 03-11-05/110 указано, что если уплата «упрощенного» налога предпринимателем осуществляется по ставке 6% (применяет объект налогообложения «Доходы»), он может осуществлять с расчетного счета любые платежи в рамках законодательства, в том числе производить уплату транспортного налога за личный автомобиль.

Эльмира Багаутдинова
эксперт — налоговый консультант,
член Палаты налоговых консультантов России

Выпуск Legislative Tracking | «Делойт», СНГ

Тема Краткие выводы

Прослеживаемость товаров, произведенных на территории России из иностранных комплектующих

Письмо ФНС России от 26 июля 2021 года № СД-4-15/[email protected]

Если товар произведен из прослеживаемых товаров (запчастей), которые были переданы в переработку для создания нового товара, то новый товар не подлежит прослеживаемости.

При этом, когда товары, предназначенные для переработки, списываются, то они «выводятся» из режима прослеживаемости через отчет об операциях.

Представление уведомления об остатках в отношении подлежащих прослеживаемости товаров, переданных для реализации в розничный магазин

Письмо ФНС России от 9 сентября 2021 года № ЕА-4-15/[email protected]

Если товар, подлежащий прослеживаемости, по состоянию на 8 июля 2021 года находится в торговом зале розничного магазина и планируемый срок его реализации — до 1 января 2022 года, то в отношении него представлять уведомление об остатках не нужно. 

 

Заполнение строки 18 «Стоимость товара» уведомления об имеющихся остатках товаров, подлежащих прослеживаемости

Письмо ФНС России от 1 сентября 2021 № ЕА-4-15/12338

Строка 18 «Стоимость товара» уведомления обязательна для заполнения, незаполнение строки либо указание в ней прочерка
(«—») недопустимо.

Остаточная балансовая стоимость основного средства, являющегося товаром, подлежащим прослеживаемости, должна быть отражена в строке 18 в размере по состоянию на дату оформления первичного учетного документа.

Если основное средство полностью самортизировано, в строке 18 указывается ноль («0»).

В случае включения прослеживаемых товаров в комплекты, где они являются составной частью основного средства либо малоценного имущества, в строке 18 указывается пропорциональная часть стоимости всего основного средства либо малоценного имущества.

При отражении в уведомлении малоценного имущества, находящегося в собственности организации и учитываемого за балансом, в строке 18 может отражаться стоимость указанного имущества по оценке, применяемой для организации контроля и учета движения на забалансовых счетах.

Порядок заполнения граф книги покупок в случае приобретения подлежащих прослеживаемости товаров, используемых одновременно в облагаемых и не облагаемых НДС операциях

Письмо ФНС России от 30 сентября 2021 года № ЕА-4-15/13856

При регистрации счета-фактуры, полученного при приобретении товаров, подлежащих прослеживаемости, в графы 16–19 книги покупок переносятся реквизиты прослеживаемости и стоимость товара из счета-фактуры независимо от суммы налога, право на вычет которой было заявлено.

Такой порядок применяется и в случае принятия к вычету НДС частями в разных налоговых периодах в течение трех лет после принятия товаров на учет в качестве подлежащих прослеживаемости.

Если налогоплательщик не регистрирует в книге покупок счета-фактуры на приобретенные товары, подлежащие прослеживаемости, и не использует право на вычет НДС или не имеет такого права, то он не обязан отражать сведения из счетов-фактур в отчете об операциях с товарами, подлежащими прослеживаемости.

При совершении операций с указанными товарами, в отношении которых отсутствует обязанность по выставлению счетов-фактур, сведения о таких товарах отражаются в отчете.

Если товары, подлежащие прослеживаемости, используются для проведения операций, облагаемых НДС, то сведения из счетов-фактур отражаются в книге продаж с указанием реквизитов прослеживаемости.

Отражение операций по замене запасных частей, подлежащих прослеживаемости на территории РФ, при ремонте оборудования в отчете об операциях с прослеживаемыми товарами

Письмо ФНС России от 1 октября 2021 года № ЕА-4-15/13953

Операции по гарантийному и постгарантийному ремонту оборудования, в результате которого товар, подлежащий прослеживаемости, становится неотъемлемой частью оборудования, отражаются в отчете с кодом операции 01 «Передача товара, подлежащего прослеживаемости, в производство и (или) на переработку». 

 

Планы по введению административной ответственности за нарушение законодательства о прослеживаемости

Письмо ФНС России от 4 октября 2021 года № ЕА-4-15/14005

Непредставление отчета и документов, содержащих реквизиты прослеживаемости, не является налоговым правонарушением.

В этой связи нормы, устанавливающие ответственность в соответствии со статьями 126 и 126.1 НК РФ, не распространяются на правонарушения в части непредставления отчета и документов, содержащих реквизиты прослеживаемости.

Подготовлен законопроект о внесении в КоАП РФ изменений, предусматривающих административную ответственность за такие правонарушения.

В отношении норм, устанавливающих ответственность за нарушение законодательства о национальной системе прослеживаемости, установлен переходный период — один год с момента вступления в силу основных положений законодательства о национальной системе прослеживаемости.

Иными словами, указанные нормы будут распространяться на правоотношения, возникшие с 1 июля 2022 года.

Сроки и порядок представления отчетов об операциях с товарами, подлежащими прослеживаемости, за период с 8 июля по 30 сентября 2021 года

Письмо ФНС России от 29 сентября 2021 года № ЕА-4-15/[email protected]

Отчеты об операциях с товарами, подлежащими прослеживаемости, сдается в электронной форме по ТКС через оператора ЭДО в налоговый орган по месту нахождения организации (по месту учета организации в качестве крупнейшего налогоплательщика/по месту жительства ИП).

Срок представления отчета — не позднее 25-го числа месяца, следующего за истекшим отчетным периодом, при наличии в отчетном периоде операций с товарами, подлежащими прослеживаемости.

С III квартала 2021 года операции по реализации прослеживаемых товаров физическим лицам для личных, семейных и домашних нужд, самозанятым, а также по вывозу прослеживаемых товаров в государства — члены ЕАЭС, отражаются в книге продаж на основании первичных учетных документов; документов, содержащих сводные данные по операциям за месяц или квартал, либо на основании бумажных счетов-фактур с указанием реквизитов прослеживаемости.

репрессирующий фактор NF-κB подавляет базальную экспрессию и индуцированный микобактериями туберкулез синтез IP-10 и IL-8 через вмешательство в NF-κB в моноцитах | Журнал биомедицинских наук

  • 1.

    Мерри Дж. Ф .: Век туберкулеза. Am J Respir Crit Care Med. 2004, 169: 1181-1186. 10.1164 / rccm.200402-140OE.

    Артикул Google ученый

  • 2.

    Гупта Р., Эспиналь М.А., Равильоне М.С.: Туберкулез как серьезная глобальная проблема здравоохранения в 21 веке: взгляд ВОЗ.Semin Respir Crit Care Med. 2004, 25: 245-253. 10.1055 / с-2004-829520.

    Артикул PubMed Google ученый

  • 3.

    Frieden TR, Sterling TR, Munsiff SS, Watt CJ, Dye C: Tuberculosis. Ланцет. 2003, 362: 887-899. 10.1016 / S0140-6736 (03) 14333-4.

    Артикул PubMed Google ученый

  • 4.

    Сондерс Б.М., Купер А.М.: Сдерживание микобактерий: роль гранулем в микобактериальных инфекциях.Immunol Cell Biol. 2000, 78: 334-341. 10.1046 / j.1440-1711.2000.00933.x.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 5.

    Флинн Дж. Л., Чан Дж .: Иммунология туберкулеза. Анну Рев Иммунол. 2001, 19 (1): 93-129. 10.1146 / annurev.immunol.19.1.93.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 6.

    Орм И.М., Купер А.М.: Цитокиновые / хемокиновые каскады в иммунитете к туберкулезу.Иммунол сегодня. 1999, 20: 307-312. 10.1016 / S0167-5699 (98) 01438-8.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 7.

    Садек М.И., Сада Э., Туси З., Швандер С.К., Рич Э.А.: Хемокины, индуцированные инфекцией мононуклеарных фагоцитов микобактериями и присутствующие в альвеолах легких во время активного туберкулеза легких. Am J Respir Cell Mol Biol. 1998, 19: 513-521. 10.1165 / ajrcmb.19.3.2815.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 8.

    Ридель Д.Д., Кауфманн SHE: Секреция хемокинов полиморфно-ядерными гранулоцитами человека после стимуляции микобактериями туберкулеза и липоарабиноманнаном. Заражение иммунной. 1997, 65: 4620-4623.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 9.

    Куаршима К., Мукаида Н., Фуджимура М., Ясуи М., Накадзуми Ю., Мацуда Т., Мацусима К.: Повышенные уровни хемокинов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа больных туберкулезом.Am J Resp Crit Care Med. 1997, 155: 1474-1477. 10.1164 / ajrccm.155.4.97.

    Артикул Google ученый

  • 10.

    Каплан Г., Блеск А.Д., Хэнкок Г., Кон З.А.: Экспрессия индуцированного гамма-интерфероном белка (IP-10) в замедленных иммунных ответах в коже человека. J Exp Med. 1987, 166: 1098-1108. 10.1084 / jem.166.4.1098.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 11.

    Gangur V, Simons FE, Hayglass KT: человеческий IP-10 избирательно способствует преобладанию поликлонально активированного и управляемого антигеном окружающей среды IFN-гамма над ответами на IL-4. FASEB J. 1998, 12: 705-713.

    CAS PubMed Google ученый

  • 12.

    Фарбер JM: Mig и IP-10: хемокины CXC, нацеленные на лимфоциты. J Leukoc Biol. 1997, 61: 246-257.

    CAS PubMed Google ученый

  • 13.

    Хуанг К.Х., Ван С.Х., Ли К.Ю., Лин С.М., Линь С.Х., Куо HP: репрессирующий фактор NF-κB ингибирует синтез хемокинов мононуклеарными клетками периферической крови и альвеолярными макрофагами при активном туберкулезе легких. PLoS One. 2013, 8: e77789-10.1371 / journal.pone.0077789.

    PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

  • 14.

    Juffermans NP, Verbon A, Van Deventer SJH, Van Deutekom H, Belisle JT, Ellis ME, Speelman P, Van Der Poll T: Повышенные концентрации хемокинов в сыворотках серопозитивных и ВИЧ-отрицательных к вирусу иммунодефицита человека Пациенты с туберкулезом: возможная роль микобактериального липоарабиноманнана.Заражение иммунной. 1999, 67: 4295-4297.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 15.

    Sauty A, Dziejman M, Taha RA, Larossi AS, Neote K, Garcia-Zepeda EA, Hamid Q, Lustre AD: Специфичные для Т-клеток хемокины CXC IP-10, Mig и I-TAC представляют собой экспрессируется активированными эпителиальными клетками бронхов человека. J Immunol. 1999, 162: 3549-3558.

    CAS PubMed Google ученый

  • 16.

    Keane MP, Arenberg DA, Lynch JP, Whyte RI, Iannettoni MD, Burdick MD, Wilke CA, Morris SB, Glass MC, DiGiovine B, Kunkel SL, Strieter RM: хемокины CXC, IL-8 и IP-10, регулируют ангиогенная активность при идиопатическом фиброзе легких. J Immunol. 1997, 159: 1437-1443.

    CAS PubMed Google ученый

  • 17.

    Фридланд Дж. С., Ремик Д. Г., Шатток Р., Гриффин Г. Е.: Секреция интерлейкина-8 после фагоцитоза микобактерий туберкулеза клеточными линиями моноцитов человека.Eur J Immunol. 1992, 22: 1373-1378. 10.1002 / eji.1830220607.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 18.

    Zhang Y, Broser M, Cohen H, Bodkin M, Law K, Reibman J, Rom WN: Повышенное высвобождение интерлейкина-8 и экспрессия гена в макрофагах после воздействия микобактерий туберкулеза и его компонентов. J Clin Invest. 1995, 95: 586-592. 10.1172 / JCI117702.

    PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

  • 19.

    Ма X, Райх Р.А., Райт Дж. А., Тукер Х. Р., Титер Л. Д., Массер Дж. М., Гравис Е. А.: Ассоциация между аллелями гена интерлейкина-8 и восприимчивостью человека к туберкулезу. J Infect Dis. 2003, 188: 349-355. 10.1086 / 376559.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 20.

    Law KF, Jagirdar J, Weiden MD, Bodkin M, Rom WN: Туберкулез у ВИЧ-инфицированных пациентов: клеточный ответ и активация иммунной системы в легких. Am J Respir Crit Care Med.1996, 153: 1377-1384. 10.1164 / ajrccm.153.4.8616569.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 21.

    Ларсен К.Г., Томсен М.К., Гессер Б., Томсен П.Д., Делеуран Б.В., Новак Дж., Скодт В., Томсен Х.К., Делеуран М., Теструо-Педерсен К. Реакция гиперчувствительности замедленного типа зависит от IL-8. . Подавление туберкулиновой кожной реакции моноклональным антителом против ИЛ-8. J Immunol. 1995, 155: 2151-2157.

    CAS PubMed Google ученый

  • 22.

    O’Kane CM, Boyle JJ, Horncastle DE, Elkington PT, Friedland JS: Моноцит-зависимая секреция CXCL8 фибробластами происходит при туберкулезе и ограничивает выживание микобактерий в макрофагах. J Immunol. 2007, 178: 3767-3776. 10.4049 / jimmunol.178.6.3767.

    Артикул PubMed Google ученый

  • 23.

    Мелисса И.В., Линетт ХТ, Джон С.Ф .: Эпителиальные клетки легких являются источником IL-8 в ответ на Mycobacterium tuberculosis : существенная роль IL-1 из инфицированных моноцитов в NF-κB-зависимом сеть.J Immunol. 1999, 163: 3936-3947.

    Google ученый

  • 24.

    Тан Н.Л., Фан Х.П., Чанг К.С., Чинг Дж.К., Конг К.П., Ю В.В., Кам К.М., Леунг С.К., Там С.М., Блэквелл Дж., Чан С.Ю.: Генетическая ассоциация между геном хемокина CXCL-10 (IP -10, интерферон-гамма-индуцируемый белок 10) и предрасположенность к туберкулезу. Clin Chim Acta. 2009, 406: 98-102. 10.1016 / j.cca.2009.06.006.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 25.

    Фенг X, Го З., Нурбахш М.: Идентификация элемента отрицательного ответа в промоторе индуцибельной синтазы оксида азота (hiNOS) человека: роль репрессирующего фактора NF-каппа B (NRF) в базальной репрессии гена hiNOS. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2002, 99: 14212-14217. 10.1073 / pnas.212306199.

    PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

  • 26.

    Нурбахш М., Хаузер Х: Конститутивное молчание промотора IFN-бета опосредуется NRF (фактор репрессии NF-kappaB), ядерным ингибитором NF-kappaB.Эмбо Дж. 1999, 18: 6415-6425. 10.1093 / emboj / 18.22.6415.

    PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

  • 27.

    Lee KY, Ito K, Hayashi R, Jazrawi EPI, Barnes PJ, Adcock IM: элементы ответа NF-κB и активаторного белка 1 и роль модификаций гистонов в индуцированной IL-1β транскрипции гена TGF-β1 . J Immunol. 2006, 176: 603-615. 10.4049 / jimmunol.176.1.603.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 28.

    Nourbakhsh M, Kalble S, Dorrie A, Hauser H, Resch K, Kracht M: Фактор репрессии NF-κB участвует в базальной репрессии и индуцированной интерлейкином (IL) -1 активации транскрипции IL-8 путем связывания с консервативным NF-κB-фланкирующий элемент последовательности. J Biol Chem. 2001, 276: 4501-4508. 10.1074 / jbc.M007532200.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 29.

    Баггиолини М., Девальд Б., Мозер Б.: Человеческие хемокины: обновленная информация.Анну Рев Иммунол. 1997, 15: 675-705. 10.1146 / annurev.immunol.15.1.675.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 30.

    Невилл LF, Mathiak G, Bagasra O: Иммунобиология интерферон-гамма-индуцибельного белка 10 кДа (IP-10): нового плейотропного члена суперсемейства хемокинов C-X-C. Cytokine Growth Factor Rev.1997, 8: 207-219. 10.1016 / S1359-6101 (97) 00015-4.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 31.

    Dufour JH, Dziejman M, Liu MT, Leung JH, Lane TE, Lustre AD: Мыши с дефицитом IFN-гамма-индуцируемого белка 10 (IP-10; CXCL10) демонстрируют роль IP-10 в генерации и перемещении эффекторных Т-клеток . J Immunol. 2002, 168: 3195-3204. 10.4049 / jimmunol.168.7.3195.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 32.

    Broug HE, Toews GB, Van IJF, Strieter RM, Kunkel SL, Paine R, Standiford TJ: Альвеолярные макрофаги необходимы для защитной защиты легких у мышей Klebsiella pneumonia: устранение альвеолярных макрофагов увеличивает рекрутирование нейтрофилов, но снижает количество нейтрофилов. оформление и выживание.Заражение иммунной. 1997, 65: 1139-1146.

    Google ученый

  • 33.

    Tsai WC, Strieter RM, Mehrad B, Newstead MW, Zeng X, Standiford TJ: Хемокиновый рецептор CXC CXCR2 необходим для защитной врожденной реакции хозяина при пневмонии pseudomonas aeruginosa у мышей. Заражение иммунной. 2000, 68: 4289-4296. 10.1128 / IAI.68.7.4289-4296.2000.

    PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

  • 34.

    Gerszten RE, Garcia ZEA, Lim YC: MCP-1 и IL-8 вызывают прочную адгезию моноцитов к эндотелию сосудов в условиях потока. Природа. 1999, 398: 718-723. 10.1038 / 19546.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 35.

    Алгуд Х.М., Чан Дж., Флинн Дж. Л.: Хемокины и туберкулез. Cytokine Growth Factor Rev.2003, 14: 467-477. 10.1016 / S1359-6101 (03) 00054-6.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 36.

    Ho SC, Lee KY, Chan YF, Kuo LW, Ito K, Adcock IM, Chen BC, Sheu JR, Lin CH, Kuo HP: эластаза нейтрофилов подавляет синтез IL-8 / CXCL8 в гладкомышечных клетках дыхательных путей человека посредством индукции NF -каппа B подавляющий фактор. J Immunol. 2009, 183: 411-420. 10.4049 / jimmunol.0803729.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 37.

    Toossi Z, Hamilton BD, Phillips MH, Averill LE, Ellner JJ, Salvekar A: Регулирование ядерного фактора-каппа B и его ингибитора I каппа B-альфа / MAD-3 в моноцитах с помощью Mycobacterium tuberculosis и во время туберкулез человека.J Immunol. 1997, 159: 4109-4116.

    CAS PubMed Google ученый

  • 38.

    Lee KY, Ho SC, Tseng YH, Wang CH, Huang CD, Lin SM, Lo YL, Kuo HP: Пониженный фактор репрессии NF-κB: связь с системным воспалением при ХОБЛ. Eur Respir J. 2012, 40: 863-873. 10.1183 / 0
    36.00146811.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 39.

    Kunsch C, Rosen CA: субъединица NF-κB регуляции промотора интерлейкина-8.Mol Cell Biol. 1993, 13: 6137-6146.

    PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

  • 40.

    Кунш К., Ланг Р.К., Розен К.А., Шеннон М.Ф .: Синергическая транскрипционная активация гена IL-8 с помощью NF-κB p65 (RelA) и NF-IL-6. J Immunol. 1994, 153: 153-164.

    CAS PubMed Google ученый

  • 41.

    Majumder S, Zhou LZ, Chaturvedi P, Babcock G, Aras S, Ransohoff RM: Регулирование экспрессии человеческого гена IP-10 в клетках астроцитомы воспалительными цитокинами.J Neurosci Res. 1998, 54: 169-180. 10.1002 / (SICI) 1097-4547 (19981015) 54: 2 <169 :: AID-JNR5> 3.0.CO; 2-C.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • NKRF Фактор репрессии NFKB [Homo sapiens (человек)] — Ген

    НОВЫЙ Попробуйте новую таблицу расшифровок

    RefSeqs поддерживается независимо от аннотированных Геномы

    Эти эталонные последовательности существуют независимо от построения генома.Объясните

    Эти эталонные последовательности курируются независимо от генома. цикл аннотаций, поэтому их версии могут не совпадать с версиями RefSeq в текущем построение генома. Определите несоответствие версий, сравнив версию RefSeq в этот раздел к разделу, указанному в геномных регионах, стенограммы и продукты, указанные выше.

    Геномный
    1. НГ_016800.1 RefSeqGene

      Диапазон
      5001..22547
      Скачать
      GenBank, FASTA, Sequence Viewer (графика)
    мРНК и белок (белки)
    1. NM_017544.5 → NP_060014.3 NF-каппа-B-репрессивный фактор

      Статус: ПЕРЕСМОТРЕН

      Исходная последовательность (и)
      AA845622, AY208891, LPVO02000272
      Консервированные домены (4) сводка
      cd02640
      Расположение: 697 → 756
      R3H_NRF; R3H-домен фактора репрессии NF-kappaB (NRF).NRF является ядерным ингибитором белков NF-kappaB, который может заглушить промотор IFNbeta посредством связывания с негативным регуляторным элементом (NRE). Помимо R3H NRF также содержит домен G-patch. Имя …
      smart00443
      Расположение: 643 → 686
      G_patch; богатый глицином нуклеиновый связывающий домен
      pfam11952
      Расположение: 38 → 105
      XTBD; Связывающий домен XRN-Two, XTBD
      cl00054
      Расположение: 543 → 605
      DSRM_SF; суперсемейство двухцепочечных РНК-связывающих мотивов (DSRM)
    РНК
    1. НР_163972.1 последовательность РНК

      Статус: ПЕРЕСМОТРЕН

      Исходная последовательность (и)
      AA845622, AL539002, AY208891, BC047878, LPVO02000272
      Связанные
      ENST00000542113.3

    RefSeqs of Annotated Genomes: Homo sapiens Обновленная аннотация, выпуск 109.20210514

    Следующие разделы содержат ссылочные последовательности, принадлежащие специфическая конструкция генома.Объясните

    Этот раздел включает геномную ссылку Последовательности (RefSeqs) из всех сборок, на которых аннотирован этот ген, например RefSeqs для хромосом и каркасов (контигов) как из эталонных, так и из альтернативных сборки. Здесь также представлены модельные РНК и белки.

    Ссылка ГРЧ48.р13 Первичная сборка

    Геномный
    1. NC_000023.11 Ссылка ГРЧ48.p13 Первичная сборка

      Диапазон
      119588337..119606424 дополнение
      Скачать
      GenBank, FASTA, Sequence Viewer (графика)

    Подавленная эталонная последовательность (и)

    Следующие ссылочные последовательности были подавлены. Объясните

    Эти RefSeq были подавлены для процитированная причина (ы).Подавленные RefSeq не отображаются в базах данных BLAST, связанных с ссылки последовательности или ссылки BLAST (мигание), но их все еще можно получить, нажав на их присоединение. версия ниже.

    1. NM_001173487.1: Подавленная последовательность

      Описание
      NM_001173487.1: этот RefSeq был удален, поскольку в настоящее время для белка недостаточно поддержки.
    2. NM_001173488.1: Подавленная последовательность

      Описание
      NM_001173488.1: этот RefSeq был удален, поскольку в настоящее время нет достаточной поддержки для транскрипта и белка.

    антитело против NKRF (ab168829) | Abcam

    Обзор

    • Название продукта

    • Описание

      Кролик поликлональный по НКРФ

    • Вид-хозяин

      Кролик

    • Протестированные приложения

    • Реактивность видов

      Реагирует с: Человек
      Предназначен для работы с: Кролик, Лошадь, Собака, Свинья, Шимпанзе, Хорек, Обезьяна Cynomolgus, Обезьяна-резус, Горилла, Орангутанг
    • Иммуноген

      Синтетический пептид, соответствующий участку в пределах 50-100 аминокислот человеческого NKRF (NP_001166959.1).

    • Положительный контроль

    • Общие примечания

      Отрасль наук о жизни уже несколько лет находится в тисках кризиса воспроизводимости. Abcam лидирует в решении этой проблемы с нашим ассортиментом рекомбинантных моноклональных антител и нокаут-отредактированными клеточными линиями для проверки на золотой стандарт. Перед покупкой убедитесь, что этот продукт соответствует вашим потребностям.

      Если у вас есть какие-либо вопросы, особые требования или проблемы, отправьте нам запрос и / или свяжитесь с нашей службой поддержки перед покупкой. Ниже приведены рекомендуемые альтернативы для этого продукта вместе с публикациями, отзывами клиентов и вопросами и ответами

      .

    Недвижимость

    • Форма

      Жидкость

    • Инструкция по хранению

      Поставляется при 4 ° C.Хранить при + 4 ° C кратковременно (1-2 недели). При доставке аликвота. Хранить при -20 ° C в течение длительного времени.

    • Буфер для хранения

      pH: 7
      Консервант: 0,09% азид натрия
      Состав: 99% трисцитрат / фосфат

      pH от 7 до 8

    • Загрузка информации о концентрации …
    • Чистота

      Аффинно очищенный иммуноген

    • Указания по очистке

      ab168829 очищали аффинно с использованием эпитопа, специфичного к NKRF, иммобилизованного на твердой подложке.

    • Клональность

      Поликлональный

    • Изотип

      IgG

    • Направления исследований

    Сопутствующие товары

    • Совместимые вторичные компоненты

    • Изотипический контроль

    • Положительные контроли

    • Рекомбинантный белок

    • Сопутствующие товары

    Приложения

    Гарантия Abpromise

    Наша гарантия Abpromise распространяется на использование ab168829 в следующих протестированных приложениях.

    Примечания по применению включают рекомендуемые начальные разведения; Оптимальные разведения / концентрации должны определяться конечным пользователем.

    Приложение Отзывы Банкноты
    IHC-P

    1/500 — 1/2000. Выполните опосредованное нагреванием извлечение антигена с цитратным буфером pH 6, прежде чем приступить к протоколу окрашивания ИГХ.

    WB

    1/2000 — 1/10000. Расчетная молекулярная масса: 78 кДа.

    IP

    Используйте 2-10 мкг / мг лизата.

    Примечания

    IHC-P
    1/500 — 1/2000.Выполните опосредованное нагреванием извлечение антигена с цитратным буфером pH 6, прежде чем приступить к протоколу окрашивания ИГХ.

    WB
    1/2000 — 1/10000. Расчетная молекулярная масса: 78 кДа.

    IP
    Используйте при 2-10 мкг / мг лизата.

    Цель

    • Актуальность

      NKRF представляет собой фактор транскрипции, который взаимодействует со специфическими негативными регуляторными элементами (NRE), опосредуя репрессию транскрипции определенных генов, отвечающих за NK-каппа-B.NKRF локализуется преимущественно в ядрышке с небольшой долей в нуклеоплазме и цитоплазме. o участвует в регуляции транскрипции IL-8.

    • Сотовая локализация

      Ядерная

    • Ссылки на базу данных

    • Альтернативные названия

      • Антитело ITBA4
      • Антитело к репрессирующему фактору каппа B NF
      • Антитело к фактору репрессии NFKB
      • Антитело к NRF
      • Антитело к фактору транскрипции NRF

      посмотреть все

    Изображения

    • Вестерн-блот — антитело против NKRF (ab168829)

      Все дорожки: антитело против NKRF (ab168829) на 0.1 мкг / мл

      Дорожка 1: Лизат целых клеток HeLa
      Дорожка 2: Лизат цельных клеток 293T
      Дорожка 3: Лизат цельных клеток Jurkat

      Лизаты / белки по 50 мкг на дорожку.

      Разработано с использованием метода ECL.

      Прогнозируемый размер полосы: 78 кДа

      Время воздействия: 30 секунд

    • Иммунопреципитация — антитело против NKRF (ab168829)

      ab168829, иммунопреципитирующий NKRF в лизате цельных клеток HeLa человека.1 мг лизата цельных клеток инкубировали с первичным антителом (лизат 6 мкг / мл) для иммунопреципитации. Для блоттинга использовали иммунопреципитированный NKRF ab168829 в концентрации 1 мкг / мл. Детектирование осуществлялось хемилюминесценцией при времени экспозиции 10 секунд.

      Все дорожки:

      Все дорожки: HeLa (эпителиальные клетки аденокарциномы шейки матки человека) лизат цельных клеток (1 мг для IP; 20% IP-нагрузки)

    • Иммуногистохимия (срезы, фиксированные формалином / PFA, залитые парафином) — Антитело против NKRF (ab168829)

      Иммуногистохимический анализ фиксированной формалином, залитой парафином ткани немелкоклеточного рака легкого человека, мечения NKRF с помощью ab168829 в разведении 1/1000.

    Список литературы (4)

    ab168829 упоминается в 4 публикациях.

    • Li J et al. Взаимодействие вируса с хозяином и протеомное исследование выявили потенциальные факторы вирулентности, влияющие на патогенез SARS-CoV-2. Med (N Y) 2: 99-112.e7 (2021). PubMed: 32838362
    • Xu X et al. Повышающая регуляция miRNA-301a-3p способствует прогрессированию опухоли при раке желудка путем подавления NKRF и активации передачи сигналов NF-? B. Int J Oncol 57: 522-532 (2020). PubMed: 32468020
    • Hu G et al. Ингибирование микроРНК-124-3p защищает от острого инфаркта миокарда, подавляя апоптоз кардиомиоцитов. Mol Med Rep 20: 3379-3387 (2019). PubMed: 31432169
    • Li X и др. miR-301a способствует онкогенезу легких путем подавления Runx3. Молочный рак 18:99 (2019). PubMed: 31122259

    Отзывы и ответы клиентов

    антител к NKRF | Технология сотовой сигнализации

    Ограниченное использование

    Если иное прямо не согласовано в письменной форме, подписанной законным представителем CST, следующие условия: применяются к Продуктам, предоставляемым CST, ее аффилированными лицами или ее дистрибьюторами. Любые условия и положения Заказчика, указанные в дополняют или отличаются от содержащихся в настоящем документе, если иное не принято в письменной форме юридически уполномоченным представитель CST, отклоняются и не имеют силы.

    Продукты имеют маркировку «Только для исследовательских целей» или аналогичное заявление о маркировке и не были одобрены, одобрены или лицензированы. FDA или другой регулирующей иностранной или отечественной организацией для любых целей. Заказчик не должен использовать какой-либо Продукт для диагностики. или в терапевтических целях, или иным образом любым способом, который противоречит заявлению на этикетке. Продукты, продаваемые или лицензируемые CST предоставляются Заказчику как конечному пользователю и исключительно для использования в исследованиях и разработках.Любое использование Продукта для диагностики, в профилактических или терапевтических целях, или любая покупка Продукта для перепродажи (отдельно или в качестве компонента) или в других коммерческих целях, требуется отдельная лицензия от CST. Клиент обязуется (а) не продавать, лицензировать, ссужать, жертвовать или иным образом передавать или предоставлять любой Продукт для любой третьей стороны, отдельно или в сочетании с другими материалами, или использовать Продукты для производства любых коммерческие продукты, (б) не копировать, изменять, реконструировать, декомпилировать, дизассемблировать или иным образом пытаться обнаружить лежащие в основе структуру или технологию Продуктов, или использовать Продукты с целью разработки любых продуктов или услуг, которые конкурировать с продуктами или услугами CST, (c) не изменять и не удалять из Продуктов какие-либо товарные знаки, торговые наименования, логотипы, патенты или уведомления об авторских правах или маркировка, (d) использовать Продукты исключительно в соответствии с Условия продажи продуктов CST и любые применимые документации, и (e) соблюдать любую лицензию, условия обслуживания или аналогичное соглашение в отношении любых сторонних продуктов или услуги, используемые Клиентом в связи с Продуктами.

    Cell Signaling Technology является товарным знаком Cell Signaling Technology, Inc.

    Tween является зарегистрированным товарным знаком ICI Americas, Inc.

    miR-301a регулирует воспалительный ответ на инфекцию вирусом японского энцефалита посредством подавления активности NKRF

    Ключевые моменты

    • Инфекция JEV вызывает активацию miR-301a в микроглиальных клетках.

    • Повышающая регуляция miR-301a снижает количество NKRF, тем самым усиливая передачу сигналов NF-κB.

    • Ингибирование miR-301a снижает опосредованную микроглией гибель нейронов сторонним наблюдателем.

    Visual Abstract

    Abstract

    Микроглия, являющаяся резидентным макрофагом головного мозга, обеспечивает нейрозащиту после различных микробных инфекций. Вирус японского энцефалита (ЯЭ) проникает в ЦНС, вызывая нейровоспаление, которое превращает нейропротекторную роль микроглии во вред, поскольку она характеризуется повышенной активацией микроглии и гибелью нейронов.Несколько факторов хозяина, включая микроРНК, играют жизненно важную роль в регуляции воспаления, вызванного вирусом. В текущем исследовании мы демонстрируем, что экспрессия miR-301a повышена в инфицированных JEV микроглиальных клетках и головном мозге человека. Избыточная экспрессия miR-301a усиливает индуцированный JEV воспалительный ответ, тогда как ингибирование miR-301a полностью отменяет эффекты. Механически фактор репрессии NF-κB (NKRF), функционирующий как ингибитор активации NF-κB, идентифицируется как потенциальная мишень для miR-301a при инфекции JEV.Следовательно, miR-301a-опосредованное ингибирование NKRF усиливает ядерную транслокацию NF-κB, что, в свою очередь, приводит к усилению воспалительной реакции. Напротив, избыточная экспрессия NKRF в условиях ингибирования miR-301a восстанавливает ядерное накопление NF-κB до базального уровня. Мы также наблюдали, что инфекция JEV вызывает классическую активацию (M1) микроглии, которая стимулирует выработку провоспалительных цитокинов, подавляя альтернативную активацию (M2), которая может служить для ослабления воспалительной реакции.Кроме того, нейтрализация in vivo miR-301a в мозге мыши восстанавливает экспрессию NKRF, тем самым снижая воспалительный ответ, активацию микроглии и апоптоз нейронов. Таким образом, наше исследование предполагает, что JEV-индуцированная экспрессия miR-301a положительно регулирует воспалительный ответ, подавляя продукцию NKRF, что может быть нацелено на управление вызванным вирусами нейровоспалением.

    Введение

    Воспалительный ответ, вызванный активацией врожденного звена иммунной системы, обеспечивает первую линию защиты от вторжения хозяина микробными патогенами (1).Хотя этот защитный ответ, вызываемый организмом, обеспечивает устранение вредных стимулов, чрезмерный воспалительный ответ против патогенов может вызвать патологические состояния (2, 3). Однако гибель нейронов в результате чрезмерного воспаления микроглии является серьезной характеристикой большинства нейротропных флавивирусных инфекций, включая вирус японского энцефалита (JEV) (4). JEV — это переносимый комарами ssRNA вирус, который принадлежит к семейству Flaviviridae, в которое также входят денге, вирус Зика и Западный Нил.После попадания в организм JEV проникает в ЦНС, что приводит к развитию таких признаков и симптомов, как лихорадка, головная боль и рвота. Около трети пациентов умирают, и почти половина выживших страдает стойкими когнитивными нарушениями (5). Несмотря на то, что энцефалит, вызванный ЯЭ, считается наиболее распространенным вирусным энцефалитом в Азиатско-Тихоокеанском регионе, в настоящее время сообщается о таких же случаях в районах, где угроза ранее была неизвестна и стала причиной пандемий во всем мире (6).

    В ходе инфекции проникновение JEV в ЦНС приводит к массивной воспалительной реакции в спинномозговой жидкости (7). Хотя этот ответ, по-видимому, играет защитную роль против вируса, неконтролируемый воспалительный ответ на вирусную инфекцию играет важную роль в запуске гибели нейронов в качестве побочного эффекта (4, 8). Будучи резидентным макрофагом, микроглия считается основным эффектором воспаления ЦНС, а продукция различных провоспалительных медиаторов при инфекции ЯЭВ участвует в процессе активации микроглии (9–12).

    МикроРНК (миРНК) представляют собой небольшие молекулы РНК длиной 21–22 нуклеотида, которые действуют как важные регуляторы экспрессии генов (13). Они действуют на посттранскрипционном уровне, нацеливаясь на 3ʹ нетранслируемую область (UTR) мРНК, что приводит к репрессии трансляции или деградации мишени. Помимо разнообразных физиологических процессов, исследования демонстрируют, что миРНК играют жизненно важную роль в развитии различных патологических состояний (14, 15). Накапливающиеся данные свидетельствуют о решающей роли miRNA при различных нейровоспалительных заболеваниях (16, 17), включая вирусный энцефалит (18, 19).Недавно сообщалось, что две miRNA, miR-15b и miR-19b-3p, участвуют в опосредованном астроцитами нейровоспалении при инфекции JEV (20, 21). Ранее наша группа оценила влияние инфекции JEV на профиль микроглиальных miRNA, которые, как сообщается, играют важную роль в регуляции воспалительного ответа (19). Среди miRNA, экспрессия которых модулируется при инфицировании JEV, мы уже сообщали о регуляторном механизме двух miRNA-хозяев, miR-29b и miR-155, при воспалении микроглии, вызванном JEV (18, 19).В текущем исследовании miR-301a, которая, как было обнаружено, увеличена в предыдущих данных профилирования miRNA, была подвергнута дальнейшему исследованию для расшифровки ее роли в нейровоспалении, вызванном JEV. Сообщалось, что miR-301a регулирует дифференцировку Th-клеток и Th27 при аутоиммунной демиелинизации (22). При раке поджелудочной железы miR-301a, как обнаружено, индуцирует активацию NF-κB путем репрессии фактора репрессии NF-κB (NKRF) (23). Мы также определили решающую роль miR-301a в регуляции противовирусного ответа IFN-β при инфекции JEV путем подавления продукции регуляторного фактора 1 IFN (IRF1) и супрессора выработки передачи сигналов цитокинов 5 (SOCS5) (24).В этом исследовании мы демонстрируем, что усиленная экспрессия miR-301a в микроглии, инфицированной JEV, усиливает воспалительный ответ за счет воздействия на NKRF, негативный регулятор активности NF-κB. Кроме того, ингибирование in vivo miR-301a у мышей, инфицированных JEV, снижает общее нейровоспаление и гибель нейрональных клеток.

    Материалы и методы

    Мыши

    Мышей BALB / c любого пола содержали вместе с их соответствующими матерями при цикле 12 часов темноты / 12 часов света при постоянной температуре и влажности.Все эксперименты проводились после получения одобрения Институционального комитета по этике животных Национального центра исследования мозга (NBRC) (номер одобрения NBRC / IAEC / 2014/96 и NBRC / IAEC / 2018/139). Животные содержались в строгом соответствии с надлежащей практикой в ​​отношении животных в соответствии с руководящими принципами Комитета по контролю и надзору за экспериментами на животных Министерства окружающей среды и лесного хозяйства правительства Индии.

    Клеточная культура

    Линия клеток человека фетальной микроглии CHME3 и линия микроглиальных клеток мыши BV2 являются подарками от S.Левисона (Центр исследования рака Университета Рутгерса, Ньюарк, штат Нью-Джерси) и стабильные клетки почек свиньи, подарок от GR Medigeshi (Научно-технологический институт трансляционного здравоохранения, Фаридабад, Индия), культивировали при 37 ° C в среде DMEM с добавлением 10% FBS. , пенициллин (100 Ед / мл) и стрептомицин (100 мкг / мл). Все реагенты для клеточных культур были получены от Sigma-Aldrich, если не указано иное.

    Первичная культура микроглии

    Первичные клетки микроглии были выделены у детенышей мышей BALB / c в постнатальные дни 0–2 (P0 – P2) согласно ранее описанному методу (10).Кору головного мозга целиком отделяли от детенышей мышей BALB / c с последующим удалением мозговых оболочек из коры под препарирующим микроскопом. Затем ткань превращали в одноклеточную суспензию посредством обработки трипсином / ДНКазой-I при 37 ° C вместе с механической диссоциацией. Суспензию единичных клеток пропускали через клеточный фильтр с размером пор 130 мкм с последующим центрифугированием фильтрата при 800 об / мин в течение 10 мин. Образовавшийся осадок клеток использовали для посева клеток в 75 см колбу для культивирования клеток 2 при плотности 2 × 10 5 клеток / см 2 в полной MEM (с добавлением 10% FBS, 100 Ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 0.6% глюкозы и 2 мМ глутамина). Израсходованную среду меняли каждые 2 дня до тех пор, пока колба для культивирования клеток, содержащая смешанную глиальную популяцию, не достигла полного слияния. По прошествии 12–14 дней колбы для культур клеток подвергали горизонтальному встряхиванию на орбитальном шейкере Excella E25 (New Brunswick Scientific, Эдисон, Нью-Джерси) при 250 об / мин в течение 90 минут при 37 ° C для удаления клеток микроглии. Полученные непривязанные клетки помещали в бактериологические чашки Петри на 90 мин, чтобы позволить клеткам микроглии прикрепиться к ним.После этого неприкрепленные клетки отбрасывали, а клетки микроглии соскабливали, центрифугировали и высевали на предметные стекла с плотностью 8 × 10 4 клеток / см 2 . Затем клетки инкубировали при 37 ° C и использовали для дальнейших экспериментов.

    Размножение и титрование вируса

    Штамм GP78 JEV был размножен на сосущих мышах BALB / c (постнатальный день 2) любого пола. После появления симптомов мышей умерщвляли для сбора инфицированного мозга.Суспензию вируса готовили, как сообщалось ранее (18), и хранили при -80 ° C до использования. Титры вирусов в культуральной среде клеточных линий и образцах головного мозга оценивали с помощью анализа бляшек. Образование бляшек проводили на монослоях стабильных клеток почек свиней, как упоминалось ранее (24).

    Вирусная инфекция клеток

    Все клетки высевали с желаемой плотностью в культуральные планшеты в соответствии с требованиями для различных экспериментов. После того, как клетки достигли 80% слияния, их дополнительно инкубировали в течение 2 часов в бессывороточной среде и инфицировали JEV (штамм GP78) при множественности инфицирования (MOI) 5.Клетки собирали в разное время для исследования временного курса. Для дозозависимого исследования клетки инфицировали в течение 24 часов отдельно JEV при MOI 1, 5 или 10. Мнимая инфекция (MI) заключалась в добавлении того же количества среды, что и среда, содержащая инокулят JEV, но без вируса.

    Комбинированная гибридизация in situ и иммуногистохимический анализ

    Фиксированные в формалине, залитые парафином (FFPE) срезы неинфицированного (MI) и инфицированного вирусом JEV человеческого мозга депарафинизировали ксилолом, гидратировали с использованием ряда спиртов и обрабатывали для гибридизации in situ (ISH) с помощью набора для оптимизации ISH microRNA miRCURY LNA (Exiqon), как описано ранее (24).Срезы FFPE области гиппокампа вскрытого человеческого мозга, инфицированного вирусом JEV (CSF-положительный для JEV-IgM), и неинфицированного мозга человека (субъекты, попавшие в дорожно-транспортные происшествия с минимальной травмой мозга) были получены из архивов Human Brain Bank Национального института. психического здоровья и неврологии, Бангалор, в соответствии с институциональной этикой и конфиденциальностью субъектов. Для исследования использовались срезы головного мозга двух незараженных голов (мужчины 28 и 25 лет) и мозга двух пациентов, инфицированных вирусом JEV (мужчины 14 и 10 лет).Все ткани собираются с письменного информированного согласия близких родственников умершего. Неинфицированные ткани головного мозга берут из относительно нормальных зон, вдали от места травмы. Вкратце, срезы были гибридизированы с 60 нМ двойной дигоксигенин (DIG)-меченой заблокированной нуклеиновой кислотой (LNA) зондом miR-301a (5ʹ-GCTTTGACAATACTATTGCACTG-3ʹ; Exiqon) или 5 нМ 5ʹ-DIG-меченной LNA U6 малой ядерной РНК (мяРНК ) зонд (5ʹ-CACGAATTTGCGTGTCATCCTT-3ʹ; Exiqon) с последующей инкубацией в течение 1 ч с антителами овцы к DIG / щелочной фосфатазе (разведение 1: 400; Roche Life Science).Затем добавляли хромоген BCIP / NBT (Roche Life Science) для получения синего цвета. После тщательной промывки водой к этим срезам добавляли блокирующий раствор (5% BSA в PBS) в течение 20 минут перед инкубацией в течение ночи с антителами кролика против TMEM119 (специфическими для микроглии) (1: 100; Abcam) Ab при 4 ° C. После обширной промывки PBS предметные стекла инкубировали с биотинилированным анти-кроличьим Ig G (1: 200; Vector Laboratories), а затем заставляли его взаимодействовать с HRP-конъюгированным стрептавидином (1: 250; Vector Laboratories), таким образом развивая серо-черный продукт реакции при действии набора субстратов DAB (SK-4100; Vector Laboratories).Слайды закрепляли с помощью DPX (Qualigens Fine Chemicals) и наблюдали с помощью инвертированного микроскопа Nikon Eclipse T i -S при соответствующем увеличении.

    Трансфекция клеток миметиками и ингибиторами miRNA

    Для сверхэкспрессии или ингибирования miR-301a трансфекцию клеток проводили с помощью имитаторов miR-301a человека или мыши (dsRNAs, которые имитируют зрелые эндогенные miR-301a) или ингибиторами miR-301a. (модифицированные оцРНК, которые специфически ингибируют эндогенную активность miR-301a) (Qiagen), соответственно, с использованием реагента для трансфекции HiPerFect (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя.Через 24 часа после трансфекции клетки собирали или инфицировали JEV в течение определенного времени, а затем анализировали количество микроРНК, мРНК и белков. Отрицательные контроли миметика или ингибитора (Ambion) использовали при трансфекциях в качестве согласованных контролей. Равный объем реагента HiPerFect без какой-либо нуклеиновой кислоты обрабатывали, чтобы имитировать трансфекционные клетки.

    Конструирование плазмиды

    Сегмент кДНК длиной 1015 п.н., кодирующий 3ʹ UTR человеческого NKRF, содержащий предполагаемый сайт связывания miR-301a, амплифицировали с помощью ПЦР из кДНК CHME3 с праймерами NKRF Luc (прямая и обратная) (дополнительная таблица I) .Фрагмент ДНК был клонирован в сайты Spe I и Mlu I ниже гена люциферазы светлячка в плазмиде pMIR-REPORT. Сайт-направленный мутагенез в сайте связывания miR-301a был создан с помощью мутантных праймеров NKRF Luc (прямой и обратный; дополнительная таблица I), как упоминалось ранее (24). Праймеры cds NKRF (прямой и обратный; дополнительная таблица I) использовали для амплификации кодирующей области размером 2084 п.о. для NKRF из кДНК человека. Этот продукт ПЦР расщепляли Hind III и BamHI, а затем клонировали в pcDNA 3.1 (+) плазмида (предоставлена ​​D. Chattopadhyay, Amity University, Kolkata, India). Однако все конструкции были коммерчески секвенированы в Invitrogen BioServices India, Гургаон, Индия.

    Трансфекция клеток малой интерферирующей РНК, приготовленной с помощью эндорибонуклеазы, и плазмидами

    Малая интерферирующая РНК, приготовленная с помощью эндорибонуклеазы (esiRNA), специфичная для NKRF человека (EHU132691), а также отрицательный контрольный esiRNA (Con-esiRNAGACGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCCGCTGGCGCCGCTGGCGCCGCTGCGCCGCCGGTGCGCGCGCGCC -3ʹ) были приобретены у Sigma-Aldrich.Клетки CHME3 трансфицировали либо esiRNA, либо плазмидами, кодирующими NKRF, с помощью Lipofectamine 2000 (Invitrogen), как описано ранее (24). Через 24 часа клетки инфицировали JEV (MOI, 5) в течение 24 часов, а затем клетки или среду для культивирования клеток подвергали анализу мРНК или белка. Эффективность трансфекции оценивали путем измерения количества представляющих интерес белков.

    Анализы с люциферазным репортером

    клеток CHME3 (2 × 10 4 ) высевали в 24-луночный планшет на 16–18 часов, а затем временно трансфицировали репортерными конструкциями люциферазы светлячка вместе с миметиком miR-301a (Mimic –MiR-301a) или ингибитор и их соответствующие контроли с использованием Lipofectamine 2000.Клетки также котрансфицировали вектором люциферазы Renilla (pRL-TK, подарок от E. Sen, NBRC) для нормализации эффективности трансфекции. Через двадцать четыре часа клетки собирали и измеряли люциферазную активность каждого образца, как показано ранее (24). В другой серии экспериментов клетки котрансфицировали конструкциями ингибитора и репортера. Через 24 часа клетки инфицировали JEV, и люминесценцию измеряли через 24 часа заражения.Для анализа активности NF-κB клетки CHME3 котрансфицировали различными комбинациями репортерной конструкции люциферазы NF-κB (любезный подарок от E. Sen, NBRC), ингибитора miR-301a, esiRNA, специфичной для NKRF (NKRF esiRNA), и плазмиды, кодирующей НКРФ. Через 24 часа трансфекции клетки инфицировали JEV в течение 24 часов и измеряли люминесценцию.

    Измерение NO

    Нитрит, стабильный окисленный продукт NO, измеряли с использованием реактива Грисса (Sigma-Aldrich), как описано ранее (12).Среды для культивирования клеток неинфицированных и обработанных клеток собирали и центрифугировали при 2000 об / мин в течение 5 минут для удаления клеточного дебриса. Затем среду (50 мкл) подвергали взаимодействию с равным объемом реагента Грисса в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте, и измеряли оптическую плотность при 540 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов (Bio-Rad Laboratories). Концентрации нитрита определяли с использованием стандартных растворов нитрита натрия, приготовленных в той же среде, которая использовалась для выращивания клеток.

    Цитометрический набор шариков

    Экспрессию цитокинов в культуральной среде, полученной из контрольных и обработанных клеток CHME3, измеряли с использованием набора цитометрических шариков (CBA) для воспалительных цитокинов человека (CBA) (BD Biosciences, Сан-Диего, Калифорния), тогда как набор CBA для мышиного воспаления был использовали для анализа содержания цитокинов в культуральной среде клеток BV2 и лизате мозга мыши в соответствии с инструкциями производителя.Вкратце, 30 мкл смеси цитокинов в виде гранул смешивали с тестируемыми образцами или стандартами, к которым добавляли флуоресцентный краситель. После 2 ч инкубации в темноте шарики промывали и ресуспендировали в 300 мкл промывочного буфера и собирали с использованием программного обеспечения BD FACSuite в системе FACSVerse (Becton Dickinson, San Diego, CA). Данные анализировали с использованием программного обеспечения FCAP Array v3.0 (Becton Dickinson), и концентрации различных цитокинов выражали в пикограммах на миллилитр.

    ОТ-ПЦР и количественная ОТ-ПЦР

    Для определения экспрессии вирусной РНК общую РНК выделяли из инфицированных JEV клеток CHME3 и BV2 с помощью Tri Reagent (Sigma-Aldrich), и 250 нг РНК подвергали обратной транскрипции с помощью набор для синтеза кДНК Verso (Thermo Fisher Scientific).Затем 5 мкл реакционной смеси кДНК подвергали амплификации ПЦР (95 ° C 30 с, 54 ° C 45 с и 68 ° C 1 мин в течение 35 циклов) с использованием пар праймеров, специфичных для JEV и GAPDH (дополнительная таблица I ). Продукты ПЦР визуализировали после электрофореза на 1% агарозном геле, содержащем бромид этидия. Для количественного определения содержания зрелой мРНК и миРНК был проведен количественный анализ ОТ-ПЦР (qRT-PCR). Выделение общей РНК из обработанных клеток и мозга мыши с последующим синтезом кДНК выполняли, как указано выше.мРНК из срезов мозга человека выделяли в соответствии с ранее указанным протоколом (9). Анализ qRT-PCR генов человека и мыши выполняли с использованием Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) вместе с специфичными для генов праймерами (дополнительная таблица I). Относительное количество интересующей мРНК определяли путем нормализации к количеству мРНК GAPDH с помощью метода 2 -∆∆ Ct (C t относится к пороговому значению). Выделение миРНК и препарат кДНК проводили, как описано ранее (24).Праймеры miR-301a человека, 5ʹ-CAGUGCAAUAGUAUUGUCAAAGC-3ʹ и мышиные miR-301a, 5ʹ-CAGUGCAAUAGUAUUGUCAAAGC-3ʹ использовали в качестве прямых праймеров в анализе qRT-PCR, как указано ранее (24). Процедура подготовки ткани для выделения miRNA из срезов мозга человека была аналогична таковой для мРНК. SnRNA SNORD68 использовали в качестве контроля для нормализации. Для qRT-PCR использовали термоциклер ViiA 7 Real-Time PCR (Applied Biosystems), а данные анализировали с помощью программного обеспечения iCycler Thermal Cycler (Applied Biosystems).

    Вестерн-блоттинг

    Белок выделяли из клеток и ткани мыши, как описано ранее (24), и концентрацию каждого образца оценивали с использованием реагента BCA (Sigma-Aldrich). Равные количества белков разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану и инкубировали с первичными антителами, специфичными для NKRF (1: 1000; OriGene), индуцибельной NO-синтазой (iNOS) (1: 1000; Abcam), циклооксигеназой-2 ( COX-2) (1: 1000; MilliporeSigma), NF-κB / p65 (1: 10 000; технология передачи сигналов клеток), p – NF-κB / p65 (1: 1000; технология передачи сигналов клеток), SOCS5 (1: 1000; Abcam), IRF1 (1: 1000; Cell Signaling Technology), NeuN (1: 1000; MilliporeSigma), Iba1 (1: 1000; Wako Chemicals), ядерный Ag пролиферирующих клеток (PCNA) (1: 2000; Cell Signaling Technology), или β-актин (1: 10 000; Sigma-Aldrich).β-актин использовался в качестве внутреннего контроля, за исключением образцов, содержащих ядерные белки, для которых PCNA действовал как внутренний контроль. Вторичные антитела, используемые для обнаружения, представляли собой конъюгированные с HRP козьи антимышиные и козьи антикроличьи IgG (1: 5000; Vector Laboratories). Блоты проявляли экспонированием в системе UVITEC Chemiluminescence (Cleaver Scientific) с программным обеспечением NineAlliance.

    Иммунофлуоресценция

    Срезы головного мозга мыши были проницаемы с 0,1% Triton X-100 в PBS, а затем инкубировались с блокирующим буфером в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего следовала инкубация в течение ночи с любым анти-TMEM119 (1: 100; Abcam) и анти-NKRF (1: 100; OriGene) Abs, или анти-TMEM119 и анти-CD68 (1: 150; Abcam), или анти-TMEM119 и анти-CD86 (1: 200; BD Pharmingen), или анти-TMEM119 и анти-CD206 (1: 400; Abcam) при 4 ° C.После тщательной промывки срезы инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с Alexa Fluor 488– или Alexa Fluor 594 (1: 1500; Molecular Probes) или флуоресцеином (1: 250; Vector Laboratories), в течение 1 часа. Наконец, срезы закрепляли с помощью DAPI (Vector Laboratories) и наблюдали с помощью микроскопа Zeiss ApoTome при указанном увеличении. Срезы мозга FFPE депарафинизировали путем трехкратного добавления ксилола по 15 мин каждый. Эти срезы затем дегидратировали в этаноле и после промывки PBS подвергали иммунофлуоресцентному анализу с использованием антител против TMEM119 (1: 100; Abcam) и против NKRF (1: 100; OriGene) Abs.Апоптоз нейронов оценивали с помощью анализа TUNEL с использованием набора для обнаружения гибели клеток in situ (Roche Life Science). Срезы мозга мышей инкубировали со смесью TUNEL, конъюгированной с TMR красным, с последующим окрашиванием анти-NeuN (1: 250; MilliporeSigma) с использованием вторичных антител, конъюгированных с Alexa Fluor 488, и остальная часть процедуры была такой же, как упомянуто выше.

    Инфекция JEV и лечение мышей Vivo-Morpholino

    Для экспериментов in vivo мышей P10 любого пола случайным образом распределяли на три группы.Среди них группа 1 была группой MI и получала только PBS, тогда как мышам из двух других групп вводили внутрибрюшинно. с JEV (3 × 10 5 БОЕ). Через 24 ч заражения мышей в группах 2 и 3 вводили внутричерепно однократной дозой Vivo-Morpholino (Gene Tools), отрицательного контроля Vivo-Morpholino (VM-NC; 18 мг / кг) и miR-301a Vivo- Морфолино (miR-301a – VM; 18 мг / кг) соответственно. Через 3 и 7 дней заражения мышей умерщвляли и собирали образцы мозга для анализа qRT-PCR, CBA и вестерн-блоттинга.Образцы мозга, собранные после 7 дней заражения, использовали для иммунофлуоресцентного анализа.

    Статистический анализ

    Все эксперименты проводили в трех экземплярах, если не указано иное. Двусторонний непарный тест ученика t был проведен для анализа статистической разницы между двумя группами. Сравнения с участием нескольких групп оценивались с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Бонферрони, тогда как двухфакторный дисперсионный анализ с последующим методом Холма-Сидака использовался для оценки различий между несколькими группами, на которые влияли два фактора.Статистически значимым считалось любое значение p <0,05. Результаты выражены в виде средних значений ± стандартное отклонение, а графики были подготовлены с помощью KyPlot (версия 2.0 β 13) и SigmaPlot 11.0.

    Результаты

    Экспрессия miR-301a усиливается во время заражения микроглией JEV

    Более ранняя работа с использованием массива miRNA на основе ПЦР для определения профиля экспрессии miRNA при заражении JEV сообщила об изобилии группы miRNA по сравнению с неинфицированными клетками (19) . В этом исследовании мы провели qRT-PCR для анализа зависимого от времени профиля экспрессии miR-301a в CHME3, линии клеток микроглии человеческого происхождения.Значительное увеличение численности miR-301a было обнаружено до 48 часов, тогда как умеренно снижающаяся картина наблюдалась после 24 часов (рис. 1A). Кроме того, в клетках CHME3 также обнаруживается дозозависимое увеличение miR-301a при инфицировании различными концентрациями вирусов в течение 24 часов (рис. 1B). В образцах мозга аутопсии, инфицированных JEV, также обнаружено повышенное содержание miR-301a при анализе qRT-PCR (рис. 1C). Чтобы оценить экспрессию miR-301a в микроглии мозга человека, мы выполнили как анализ ISH для miR-301a или U6 snRNA (в качестве положительного контроля), так и иммуногистохимический анализ специфического маркера микроглии TMEM119 (25) из неинфицированных и инфицированных JEV срезов мозга.Хотя было обнаружено, что экспрессия мяРНК U6 сходна в обоих случаях, повышенная экспрессия miR-301a наблюдалась в инфицированных JEV срезах мозга человека по сравнению с неинфицированными срезами (фиг. 1D). Экспрессия miR-301a была дополнительно подтверждена в клетках BV2, инфицированных JEV, и анализ qRT-PCR показал как зависимое от времени, так и дозозависимое увеличение его численности при инфицировании JEV (рис. 1E, 1F). Подобное зависящее от времени усиление экспрессии miR-301a наблюдалось в инфицированных JEV первичных микроглиальных клетках (рис.1G). Вместе эти результаты показывают, что экспрессия miR-301a в микроглии усиливается при инфекции JEV.

    РИСУНОК 1. Экспрессия

    miR-301a индуцируется в микроглии, инфицированной JEV. ( A и B ) Клетки CHME3 были инфицированы JEV с MOI 5 в течение указанного времени (A) или инфицированы указанными MOI в течение 24 часов (B). Относительное содержание miR-301a по сравнению с неинфицированным (MI) было определено с помощью анализа qRT-PCR и нормализовано по отношению к snRNA SNORD68. ОТ-ПЦР выполняли для определения инфекции JEV (нижние панели).Экспрессия GAPDH была проверена как контроль загрузки. * p <0,05, *** p <0,001. ( C ) miRNA выделяли из неинфицированных (MI) и JEV-инфицированных срезов мозга человека, а экспрессию miR-301a определяли с помощью qRT-PCR. Данные представляют два разных мозга в каждой группе. * p <0,05 по тесту Стьюдента t по сравнению с неинфицированным человеческим мозгом. ( D ) ISH miR-301a (фиолетовый хромоген) в микроглиальных клетках (серо-черный хромоген) из головного мозга человека.Неинфицированные (MI) и JEV-инфицированные срезы мозга гибридизовали с зондом miRCURY LNA miR-301a или зондом LNA U6 snRNA, после чего проводили иммуногистохимический анализ микроглии с 3,3ʹ-диаминобензидином (DAB). Масштабная линейка 20 мкм; оригинальное увеличение × 40. Повсеместно экспрессируемую мяРНК U6 (фиолетовый хромоген) использовали в качестве положительного контроля. Количественную оценку выполняли путем расчета процента ISH + от общего количества клеток TMEM119 + (микроглиальный маркер) (правая панель).Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение для пяти полей на раздел (два раздела на мозг человека в каждой группе). ** p <0,01 по тесту Student t по сравнению с неинфицированным человеческим мозгом (MI). ( E и F ) Клетки BV2 подвергались воздействию JEV в течение указанного времени (E) или были инфицированы указанными MOI JEV в течение 24 часов (F), а численность miR-301a оценивалась с помощью qRT-PCR. анализ. Инфекцию JEV оценивали с помощью ОТ-ПЦР (нижние панели), и GAPDH использовали в качестве внутреннего контроля.* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, по сравнению с неинфицированными клетками (MI). ( G ) Первичные клетки микроглии выделяли от детенышей мышей в постнатальный день 0 (P0) до P2 BALB / c, культивировали в течение 12–14 дней и инфицировали JEV в течение указанного времени. Обилие miR-301a количественно оценивали с помощью анализа qRT-PCR, и результаты выражали как кратное изменение по сравнению с таковым в неинфицированных клетках (MI). Все данные на гистограммах представляют собой средние значения ± стандартное отклонение трех биологических повторов.Значения p рассчитывают с помощью дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Бонферрони. * p <0,05, *** p <0,001. л.с., часы после заражения.

    miR-301a регулирует индуцированный JEV воспалительный ответ

    Активация микроглии во время инфекции JEV связана с повышенной секрецией провоспалительных цитокинов. Чтобы оценить роль miR-301a в воспалительной реакции, запускаемой JEV, были проведены исследования сверхэкспрессии и подавления miR-301a.Мы трансфицировали клетки CHME3 и BV2 либо Mimic-miR-301a, либо ингибитором (anti-miR-301a) в течение 24 часов, прежде чем клетки оставались неинфицированными или инфицированными JEV. Через 24 часа после инфицирования трансфекция клеток CHME3 и BV2 с помощью Mimic-miR-301a продемонстрировала повышенное содержание miR-301a как в неинфицированных, так и в инфицированных JEV клетках по сравнению с контрольным миметиком. Напротив, трансфекция анти-miR-301a привела к снижению количества miR-301a по сравнению с контролем с ингибитором (контроль анти-miR [анти-miR-Con]) (рис.2А, 2Б). Повышенная экспрессия множества провоспалительных факторов, включая NO, iNOS и COX-2, наблюдалась после инфицирования JEV в клетках CHME3 и BV2, трансфицированных Mimic-miR-301a (Fig. 2C, 2D). Напротив, ингибирование miR-301a с помощью анти-miR-301a привело к значительному снижению экспрессии этих маркеров при инфекции JEV (Fig. 2C, 2D). Мы далее исследовали роль miR-301a в продукции провоспалительных цитокинов, индуцированных JEV. Количество IL-1β, IL-12, TNF-α, IL-6 и IL-8, секретируемых JEV-инфицированным CHME3 (рис.2E) или количество IL-6, CC-мотива CCL2, TNF-α, IL-12 и IFN-γ, секретируемых JEV-инфицированным BV2 (рис. 2F), увеличивалось при трансфекции Mimic – miR-301a по сравнению с таковой при трансфекции. контрольные клетки, трансфицированные миметиком, как определено анализом CBA. Мы наблюдали противоположный результат после трансфекции анти-miR-301a, поскольку она снижала экспрессию цитокинов как в JEV-инфицированных CHME3, так и в BV2 по сравнению с таковой в клетках, трансфицированных анти-miR-Con (рис. 2E, 2F). В дополнение к анализу секретома мы измерили экспрессию мРНК некоторых дополнительных провоспалительных маркеров как в клетках CHME3, инфицированных JEV (CCL2, CCL5 и IFN-γ), так и в клетках BV2 (IL-1β и CCL5), трансфицированных либо Mimic – miR- 301a или анти-miR-301a.В обоих случаях сверхэкспрессия miR-301a увеличивала экспрессию этих маркеров по сравнению с отрицательным контролем, тогда как ингибирование miR-301a снижало их экспрессию (рис. 2G, 2H). Эта модуляция воспалительного ответа микроглии не зависела от распространения вируса, что продемонстрировано анализом титра вируса, который не показал значительных различий в репликации вируса в клетках Mimic-miR-301a и клетках CHME3 и BV2, трансфицированных ингибитором, по сравнению с трансфицированными отрицательным контролем. клетки (рис.2I, дополнительный рисунок 1A).

    РИСУНОК 2.

    miR-301a регулирует JEV-опосредованное воспаление микроглии. Клетки ( A ) CHME3 и ( B ) BV2, трансфицированные Mimic – miR-301a или отрицательный контроль (контрольный миметик [Mimic-Con]) и ингибитор miR-301a (anti – miR-301a) или отрицательный контроль. (anti-miR-Con) не были инфицированы (MI) или были инфицированы JEV в течение 24 часов. Затем определяли относительную численность miR-301a с помощью анализа qRT-PCR. Значения p были рассчитаны с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с последующим применением метода Холма – Сидака.* p <0,05, ** p <0,01, по сравнению с соответствующим отрицательным контролем. ( C и D ) После 24 часов трансфекции, как в (A) и (B), клетки CHME3 (C) или клетки BV2 (D) инфицировали JEV в течение еще 24 часов перед тем, как подвергнуть среду для культивирования клеток. к спектрофотометрическому анализу продукции NO. Иммуноблоттинг был проведен для определения экспрессии белков iNOS и COX2 (нижние панели). β-Актин служил контролем нагрузки. Вестерн-блоттинг представляет три независимых эксперимента.* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, по сравнению с соответствующим отрицательным контролем. ( E H ) Обе клетки обрабатывали, как в (C) и (D). Культуральная среда клеток CHME3 была проанализирована с помощью CBA для определения количества секретируемых IL-1β, IL-12, TNF-α, IL-6 и IL-8 (E), тогда как секретирующие уровни IL-6, CCL2, TNF -α, IL-12 и IFN-γ оценивали с помощью CBA в клетках BV2 (F). Клетки CHME3 также подвергали анализу qRT-PCR для определения относительного содержания мРНК CCL2, CCL5 и IFN-γ (G).Относительную экспрессию мРНК IL-1β и CCL5 в клетках BV2 определяли с помощью анализа qRT-PCR (H). * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, по сравнению с отрицательным контролем. ( I ) Трансфицированные клетки CHME3 инфицировали JEV в течение 24 часов, и титры вирусов в культуральных супернатантах определяли с помощью анализа бляшек. Все данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение трех биологических повторов. Значения p вычисляли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Бонферрони.

    NKRF является потенциальной мишенью для miR-301a

    Чтобы получить представление о механизме, лежащем в основе функции miR-301a, мы проанализировали гены-мишени, которые могут играть роль в усилении воспаления в нашей модели инфекции JEV. Более ранние сообщения указывают на роль NKRF как потенциального гена-мишени для miR-301a (23, 26). Выравнивание последовательности miR-301a с последовательностью ее сайта-мишени в области 3ʹ UTR NKRF обозначало консервативную комплементарность последовательностей у разных видов (фиг. 3A). Для проведения анализа комплементарности использовали ряд баз данных прогнозирования мишеней miRNA, включая RNAhybrid (27), Miranda (28), TargetScan (29) и Pictar (30).Чтобы проверить взаимодействия miRNA / mRNA, предсказанные вышеупомянутым программным обеспечением, мы клонировали 3ʹ UTR человеческого NKRF в репортерный вектор люциферазы светлячка. Затем мы сгенерировали мутации с девятью основаниями в сайте соответствия семян в 3ʹ UTR NKRF (рис. 3B) для дальнейшего тестирования взаимодействия miRNA / мишень. Затем клетки CHME3 трансфицировали индивидуальными репортерами, содержащими дикого типа (WT) или мутантную UTR вместе с ингибитором Mimic – miR-301a или miR-301a вместе с их отрицательными контролями. Mimic-miR-301a эффективно снижал люциферазную активность репортера WT UTR по сравнению с таковой в клетках, трансфицированных мимическим контролем, тогда как miR-301a-зависимое снижение активности люциферазы было нарушено мутацией сайта связывания 3ʹ UTR в NKRF ( Инжир.3С). Напротив, анти-miR-301a значительно увеличивает люциферазную активность репортера UTR WT по сравнению с таковой в клетках, трансфицированных анти-miR-Con, а мутация в UTR почти устраняет эффект (Рис. 3C). Далее мы проанализировали влияние трансфекции Mimic – miR-301a и ингибитора на мРНК и содержание белка NKRF. Трансфекция клеток CHME3 и BV2 с помощью Mimic – miR-301a приводила к снижению как мРНК NKRF, так и количества белка (рис. 3D, 3E). Напротив, клетки CHME3 и BV2 при трансфекции анти-miR-301a демонстрируют повышенное количество мРНК и белка NKRF (рис.3F, 3G). Дальнейшая трансфекция первичной микроглии с помощью Mimic-miR-301a существенно увеличивает количество miR-301a и впоследствии снижает продукцию мРНК NKRF (рис. 3H) и белка (рис. 3I). В отличие от описанного в нашем предыдущем исследовании, было продемонстрировано, что экспрессия SOCS5 и IRF1 не изменяется в ответ на модуляцию активности miR-301a, следовательно, усиливается нейтральный эффект miRNA на размножение микроглии вируса (Supplemental Fig. 2A, 2B).

    РИСУНОК 3.

    NKRF является функциональной мишенью miR-301a.( A ) Предсказанный сайт связывания miR-301a в 3ʹ UTR мРНК NKRF. Идеальные совпадения в исходных регионах обозначены оранжевым цветом. ( B ) Схема конструкции, содержащей 3ʹ UTR NKRF ниже репортера люциферазы. WT 3ʹ UTR (WT UTR) содержит внутренний сайт связывания miR-301a, тогда как мутантный 3ʹ UTR (Mut UTR) содержит мутации, которые исключают совпадение семян с miR-301a. Мутации (пурпурный) в 3ʹ UTR NKRF были созданы для анализов репортерного гена. ( C ) Был проведен двойной анализ люциферазы клеток CHME3, трансфицированных конструкциями люциферазы WT или Mut NKRF 3ʹ UTR вместе с ингибитором Mimic – miR-301a или miR-301a (анти – miR-301a) или их отрицательным контролем.Активность люциферазы светлячка была нормализована до активности люциферазы Renilla . Данные представлены как относительная активность люциферазы клеток, трансфицированных ингибитором Mimic – miR-301a или miR-301a, по сравнению с таковой клеток, трансфицированных их отрицательным контролем. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение девяти экспериментов с тремя независимыми трансфекциями. ** p <0,01, *** p <0,001, по критерию Стьюдента t . ( D и E ) Через 24 часа трансфекции Mimic – miR-301a или контрольным миметиком клетки CHME3 (D) и клетки BV2 (E) подвергали Вестерн-блоттингу и qRT-PCR анализу содержания NKRF. белки (слева) и мРНК (справа).( F и G ) Клетки CHME3 (F) и клетки BV2 (G) трансфицировали ингибитором miR-301a или его отрицательным контролем. Через 24 часа были выполнены вестерн-блоттинг и анализ qRT-PCR для оценки содержания белков NKRF (слева) и мРНК (справа). β-Актин служил контролем нагрузки. Все блоты представляют три эксперимента с аналогичными результатами. Относительное количество miR-301a, определенное анализом qRT-PCR для каждого набора клеток, показано ниже блотов для подтверждения эффективной трансфекции.( H ) Первичную микроглию, выделенную из P2 BALB / c, трансфицировали Mimic – miR-301a или контрольным миметиком в течение 24 часов, а экспрессию NKRF оценивали с помощью анализа qRT-PCR. Мимическую трансфекцию оценивали путем анализа экспрессии miR-301a с помощью qRT-PCR (нижние панели). Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. ( I ) Через 24 часа трансфекции первичные микроглиальные клетки дополнительно оценивали на экспрессию белка NKRF с помощью исследования коиммунофлуоресценции с микроглиальным белком Iba1.Масштабная линейка 50 мкм; оригинальное увеличение × 20. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Бонферрони. МТ, имитация трансфекции.

    JEV снижает экспрессию NKRF в микроглии

    Поскольку NKRF является функциональной мишенью miR-301a, была исследована экспрессия NKRF в инфицированных JEV клетках CHME3 и BV2. Мы наблюдали, что инфекция JEV привела к увеличению количества miR-301a и снижению уровней мРНК и белка NKRF как в зависимости от дозы, так и в зависимости от времени (рис.4A – D). Анализ первичной микроглии, инфицированной JEV, также показал снижение экспрессии мРНК и белка NKRF (фиг. 4E, 4F). Мы также подтвердили снижение количества мРНК и белка NKRF в микроглии головного мозга человека, инфицированного JEV (рис. 4G, 4H).

    РИСУНОК 4. Экспрессия

    NKRF снижается при инфекции JEV. ( A и B ) Клетки CHME3 были инфицированы JEV с MOI 5 в течение указанного времени (A) или инфицированы указанными MOI в течение 24 часов (B). Относительное содержание мРНК NKRF определяли с помощью анализа qRT-PCR.Вестерн-блоттинг выполняли для обнаружения экспрессии белка NKRF (нижние панели). ( C и D ) Относительные экспрессии мРНК и белка NKRF в клетках BV2, инфицированных JEV с MOI 5 в течение указанного времени (C) или инфицированных указанными MOI в течение 24 часов (D), оценивали с помощью qRT. -ПЦР и Вестерн-блоттинг (нижние панели) соответственно. β-Актин использовали в качестве контроля нагрузки. Вестерн-блоттинг представляет три независимых эксперимента. Относительное количество miR-301a в каждом наборе клеток определяли с помощью анализа qRT-PCR, и оно показано под блотами.( E ) После инфицирования JEV (MOI, 5) в течение указанного времени относительное количество мРНК NKRF в первичной микроглии определяли с помощью анализа qRT-PCR. Была обеспечена экспрессия miR-301a в каждом наборе клеток (нижняя панель). Результаты выражены как среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. Значения p были получены с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующими множественными сравнениями Бонферрони. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0.001 по сравнению с неинфицированными клетками (MI). ( F ) Экспрессию белка NKRF в первичных микроглиальных клетках, инфицированных MI и JEV (JEV), как в (E), дополнительно оценивали с помощью исследования коиммунофлуоресценции с микроглией Iba1. Масштабная линейка 50 мкм; оригинальное увеличение × 20. ( G ) Относительное количество мРНК NKRF оценивали в неинфицированных (MI) и JEV срезах мозга человека с помощью анализа qRT-PCR. Данные представляют два разных мозга в каждой группе. * p <0,05, по тесту Стьюдента t , по сравнению с неинфицированным человеческим мозгом.( H ) Срезы неинфицированного (MI) и JEV человеческого мозга оценивали на экспрессию белка NKRF с помощью исследования коиммунофлуоресценции с микроглиальным белком TMEM119. Масштабная линейка 50 мкм; оригинальное увеличение × 20. л.с., часы после заражения.

    JEV-опосредованное увеличение miR-301a ингибирует экспрессию NKRF

    Для дополнительной проверки того, действительно ли индуцированная JEV индукция miR-301a нацелена на NKRF, мы котрансфицировали клетки CHME3 с помощью ингибитора miR-301a или контроля ингибитора вместе с WT или мутантным NKRF Репортерные конструкции 3ʹ UTR с последующей инфекцией JEV в течение 24 часов.Выраженная активность люциферазы наблюдалась в клетках, инфицированных JEV, которые были трансфицированы конструкцией против miR-301a и WT UTR, по сравнению с клетками, котрансфицированными конструкцией WT UTR и контролем ингибитора (фиг. 5A). Напротив, мутация 3ʹ UTR NKRF блокирует опосредованное анти-miR-301a увеличение активности люциферазы в клетках CHME3 (Fig. 5A). Чтобы представить прямые доказательства того, что JEV-индуцированная miR-301a подавляет продукцию белка NKRF, мы исследовали количество NKRF в клетках CHME3, инфицированных JEV в разное время, а также в клетках, инфицированных в течение фиксированного времени различными вирусными концентрациями, в которых miR -301a был подавлен.Мы наблюдали, что ингибирование miR-301a восстанавливает продукцию белка NKRF в JEV-инфицированных клетках по сравнению с таковым в контрольных клетках, трансфицированных ингибитором (фиг. 5B, 5C). Экспрессия NKRF в клетках BV2, инфицированных JEV, аналогичным образом восстанавливалась после трансфекции анти-miR-301a по сравнению с таковой в клетках, трансфицированных анти-miR-Con, инфицированных JEV (фиг. 5D, 5E). Чтобы проверить эффективность miR-301a в нацеливании на NKRF in vivo, мы подавили экспрессию miR-301a у мышей BALB / c путем введения miR-301a-VM или VM-NC через 24 часа после инфицирования JEV.Существенное снижение экспрессии белка NKRF у мышей, получавших VM-NC, было значительно восстановлено у мышей, получавших miR-301a-VM, как было проанализировано иммунофлуоресцентным исследованием со специфическим для микроглии TMEM119 (25) (Fig. 5F).

    РИСУНОК 5.

    JEV-индуцированная miR-301a подавляет продукцию белка NKRF. ( A ) Клетки CHME3 котрансфицировали либо ингибитором miR-301a (анти-miR-301a), либо отрицательным контролем (анти-miR-Con) вместе с плазмидой-репортером люциферазы светлячка, кодирующей WT или мутантные 3ʹ UTRs NKRF. .Спустя 24 часа клетки инфицировали JEV в течение 24 часов перед тем, как активность люциферазы измеряли с помощью набора для двойного анализа люциферазы и нормализовали до уровня люциферазы Renilla . Данные выражены как относительная активность люциферазы клеток, трансфицированных анти-miR-301a, по сравнению с таковой у клеток, трансфицированных анти-miR-Con. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение девяти экспериментов с тремя независимыми трансфекциями. ** p <0,01, по тесту Стьюдента t . ( B и C ) Клетки CHME3 трансфицировали либо ингибитором miR-301a, либо отрицательным контролем (анти-miR-Con), а затем либо инфицировали JEV с MOI 5 в течение указанного времени (B), либо инфицировали. в течение 24 часов с JEV при указанных MOI (C).Клетки анализировали вестерн-блоттингом для определения относительного содержания белка NKRF. ( D и E ) После трансфекции либо ингибитором miR-301a, либо отрицательным контролем клетки BV2 инфицировали JEV, как в (B и C). Экспрессию белка NKRF в зависимости от времени (D) и дозировки (E) анализировали с помощью вестерн-блоттинга. β-Актин использовали в качестве контроля нагрузки. Кляксы представляют три независимых эксперимента. Относительное количество miR-301a в каждом наборе клеток определяли с помощью анализа qRT-PCR и показано ниже блотов для подтверждения эффективной трансфекции.Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение трех отдельных экспериментов. ( F ) Постнатальный день 10 (P10) Мышей BALB / c лечили PBS (MI) или инфицировали JEV (3 × 10 5 БОЕ) и обрабатывали либо miR-301a-VM, которая нацелена на зрелые miR. -301a (JEV с miR-301a-VM [JEV + miR-301a-VM]) или скремблированный Vivo-Morpholino, который был разработан в качестве отрицательного контроля (JEV с VM-NC [JEV + VM-NC]). Мозг собирали на 7 день для оценки экспрессии белка NKRF с помощью исследования коиммунофлуоресценции с микроглиальным белком TMEM119.Масштабная линейка 50 мкм; оригинальное увеличение × 20. Данные являются репрезентативными для четырех мышей на группу. л.с., часы после заражения.

    miR-301a усиливает индуцированный JEV воспалительный ответ путем подавления изобилия NKRF

    Чтобы подтвердить роль NKRF в индукции провоспалительного состояния при повышении регуляции miR-301a, мы провели эксперименты, в которых экспрессия NKRF подвергалась нокдауну и сверхэкспрессии. . Мы котрансфицировали клетки CHME3 с Con-esiRNA или NKRF esiRNA и анти-miR-301a или контрольным ингибитором в течение 24 часов до инфицирования JEV в течение 24 часов.Было обнаружено производство NO, количество iNOS, COX-2 и нескольких провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-12, TNF-α, IL-6, IL-8, CCL2, CCL5 и IFN-γ) при инфекции JEV. увеличиваться в молчании NKRF (Fig. 6A – C). Кроме того, снижение экспрессии этих провоспалительных маркеров с помощью ингибитора miR-301a нарушается за счет нокдауна NKRF (Fig. 6A-C). Напротив, сверхэкспрессия NKRF снижает продукцию NO, содержание белков iNOS и COX-2, а также экспрессию провоспалительных цитокинов в CHME3, инфицированном JEV (рис.6D – F). Трансфекция обработанных ингибитором miR-301a клеток CHME3 конструкцией NKRF с последующей инфекцией JEV снижала экспрессию этих провоспалительных маркеров по сравнению с клетками, котрансфицированными контрольным вектором (фиг. 6D-F).

    РИСУНОК 6.

    miR-301a индуцирует воспаление, запускаемое JEV, репрессируя NKRF. ( A C ) Клетки CHME3 трансфицировали либо анти-miR-Con, либо анти-miR-301a вместе с Con-esiRNA или NKRF esiRNA в течение 24 часов перед инфицированием JEV при MOI 5.Через двадцать четыре часа после инфицирования (A) продукцию NO оценивали спектрофотометрическим анализом. Вестерн-блот клеточных экстрактов был проведен для анализа содержания белков NKRF, iNOS и COX2 (нижние панели). β-Актин служил контролем нагрузки. Культуральную среду также подвергали анализу CBA для определения количества секретируемого IL-1β, IL-12, TNF-α, IL-6 и IL-8 (B). Относительное содержание мРНК CCL2, CCL5 и IFN-γ количественно определяли с помощью анализа qRT-PCR (C). Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов.* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, по данным одностороннего дисперсионного анализа с последующими множественными сравнениями Бонферрони. ( D F ) Клетки CHME3 трансфицировали либо анти-miR-Con, либо анти-miR-301a, вместе с указанными комбинациями плазмидных конструкций. Через 24 часа клетки инфицировали JEV с MOI, равным 5. Через 24 часа после инфицирования продукцию NO в культуральной среде и экспрессию белков NKRF, iNOS и COX2 в клетках (нижние панели) оценивали спектрофотометрически и иммуноблот-анализ соответственно (D).β-Актин используется в качестве контроля нагрузки. Все блоты представляют три независимых эксперимента. Культуральную среду также анализировали с помощью CBA для определения количества секретируемого IL-1β, IL-12, TNF-α, IL-6 и IL-8 (E). Анализ qRT-PCR был выполнен для измерения относительного содержания мРНК CCL2, CCL5 и IFN-γ (F). Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, как рассчитано с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Бонферрони.в.д., часы после заражения; нс, не имеет значения.

    miR-301a индуцирует активацию NF-κB путем нацеливания на NKRF в JEV-инфицированной микроглии

    NKRF, который, как ранее было продемонстрировано, взаимодействует со специфическими негативными регуляторными элементами для ингибирования транскрипционной активности NF-κB, также сообщается, что напрямую взаимодействует с субъединицей p65 NF-κB и, в свою очередь, негативно регулирует трансактивационную активность NF-κB (31, 32). Во-первых, мы исследовали зависящую от времени активацию NF-κB и обнаружили, что инфекция JEV увеличивает количество фосфорилированной формы p65 (p-p65) как в клетках CHME3, так и в клетках BV2 (рис.7А, 7Б). В соответствии с зависящей от времени активацией NF-κB, экспрессия miR-301a в обеих этих клетках, как было обнаружено, значительно возрастает после инфицирования JEV (фиг. 7A, 7B). Для дальнейшей проверки клетки CHME3 либо оставляли нетрансфицированными, либо трансфицировали одним из Mimic – miR-301a и ингибитором перед инфицированием JEV в течение 24 часов. Транслокация p-p65 в ядро ​​увеличивалась при трансфекции Mimic-miR-301a по сравнению с таковой при трансфекции контрольной миметической трансфекции (фиг. 7C).Напротив, трансфекция против miR-301a снижает накопление в ядре p-p65 по сравнению с инфицированными JEV клетками CHME3, трансфицированными контрольным ингибитором (фиг. 7D). Однако было обнаружено, что содержание p65 в общем клеточном белке не изменяется в ответ на трансфекцию имитатором или ингибитором (фиг. 7C, 7D). Чтобы подтвердить, что miR-301a участвует в регуляции передачи сигналов NF-κB через NKRF, клетки CHME3 трансфицировали ингибитором miR-301a, или esiRNA NKRF, или в комбинации перед инфицированием JEV в течение 24 часов.Ингибирование ядерной транслокации p-p65 ингибитором miR-301a было устранено путем нокдауна NKRF (фиг. 7E). Напротив, котрансфекция клеток CHME3 ингибитором miR-301a и плазмидой, кодирующей NKRF, до инфицирования JEV в течение 24 часов уменьшала ядерную транслокацию p-p65 по сравнению с инфицированными JEV клетками, обработанными только анти-miR-301a (рис. 7F). ). Как NKRF esiRNA, так и плазмида, экспрессирующая NKRF, не влияли на содержание общего p65 (фиг. 7E, 7F). Чтобы предоставить прямые доказательства ингибирования NF-κB с помощью NKRF, мы выполнили анализ репортерной люциферазы NF-κB в ответ на трансфекцию esiRNA NKRF и плазмиды, кодирующей NKRF.Снижение активности NF-κB под действием ингибитора miR-301a, наблюдаемое в JEV-инфицированных клетках CHME3, усиливается за счет нокдауна NKRF (фиг. 7G). Напротив, клетки, трансфицированные ингибитором miR-301a плазмидой, кодирующей NKRF, снижали активность NF-κB при инфекции JEV по сравнению с клетками, котрансфицированными контрольным вектором (фиг. 7G). Следовательно, наши результаты ясно показывают, что JEV-индуцированная повышающая регуляция miR-301a способствует активности NF-κB посредством подавления NKRF.

    РИСУНОК 7.

    JEV-индуцированная miR-301a активирует передачу сигналов NF-κB посредством нацеливания на NKRF.( A и B ) Клетки были оставлены неинфицированными (MI) или были инфицированы JEV при MOI 5 в течение указанного времени. Ядерные экстракты выделяли для оценки экспрессии белка p65 в клетках CHME3 (A) и BV2 (B) с помощью вестерн-блоттинга. PCNA использовали в качестве контроля загрузки. Относительное количество miR-301a в каждом наборе клеток определяли с помощью анализа qRT-PCR, и оно показано под блотами. ( C и D ) Трансфекцию клеток CHME3 выполняли с помощью Mimic – miR-301a, ингибитора, или их отрицательного контроля в течение 24 часов с последующей инфекцией JEV при 5 MOI в течение 24 часов.Нетрансфицированные клетки CHME3 были оставлены неинфицированными в качестве контрольных исследований. Затем выделяли ядерные и цитоплазматические фракции клеток и анализировали Вестерн-блоттингом с использованием Ат, специфичных для указанных белков. В другом наборе клеток с аналогичной обработкой был выделен общий клеточный белок и проверена экспрессия белка p65 с помощью иммуноблоттинга. В ядерных экстрактах PCNA служил контролем нагрузки, тогда как β-актин служил в цитоплазматических и общих белковых экстрактах. ( E и F ) Трансфекцию плазмидной конструкции NKRF esiRNA или NKRF указанными комбинациями ингибитора miR-301a проводили в течение 24 часов перед инфицированием JEV при MOI 5 в течение 24 часов.Затем выделяли ядерные и цитоплазматические фракции клеток и анализировали Вестерн-блоттингом с использованием Ат, специфичных для указанных белков. В другой серии экспериментов с параллельными условиями трансфекции экспрессию р65 в общих клеточных экстрактах оценивали иммуноблоттингом. В то время как β-актин служил в качестве контроля загрузки для цитоплазматических и общих клеточных экстрактов, PCNA использовался в качестве внутреннего контроля для ядерных экстрактов. Все блоты являются представителями трех независимых экспериментов с аналогичными результатами.( G ) Клетки CHME3 трансфицировали только репортерной конструкцией люциферазы NF-κB (MI, JEV) и вместе с указанными комбинациями esiRNA / анти-miR-301a или плазмидами / анти-miR-301a. Спустя 24 часа клетки оставляли неинфицированными или инфицировали JEV при MOI 5 в течение 24 часов, а активность люциферазы измеряли с помощью набора для двойного анализа люциферазы и нормализовали до активности люциферазы Renilla . Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение девяти экспериментов с тремя независимыми трансфекциями.* p <0,05, ** p <0,01, с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Бонферрони. л.с., часы после заражения.

    Ингибирование miR-301a индуцирует поляризацию M1 в M2 в микроглии, инфицированной JEV

    Микроглия имеет тенденцию поляризоваться либо в фенотип M1, либо в M2, в зависимости от комбинации различных стимулов (33). Сообщается, что фенотип M1 способствует провоспалительному состоянию, секретируя множество воспалительных цитокинов и хемокинов. Напротив, микроглия M2, как было замечено, вызывает противовоспалительную реакцию, высвобождая многочисленные защитные факторы.Чтобы проанализировать роль miR-301a в поляризации микроглии M1 / ​​M2, клетки CHEM3 и BV2 подвергали трансфекции против miR-301a перед заражением JEV в течение 24 часов с последующей оценкой экспрессии маркеров M1 / ​​M2 с помощью qRT- ПЦР-анализ. Было обнаружено, что JEV-индуцированное увеличение количества микроглиальных маркеров M1 в контрольных трансфицированных ингибитором CHME3 (CD68, CD86, IL-1β и TNF-α) и BV2 (CD68, IL-1β и TNF-α) значительно нарушено в клетках, трансфицированных ингибитором miR-301a (рис. 8A, 8B).Напротив, изобилие микроглиальных маркеров M2 в клетках CHME3 (IL-4, IL-10, аргиназа-1 и CD206) и BV2 (IL-4, IL-10 и аргиназа-1) в miR-301a-ингибированном наблюдалось повышение регуляции состояния по сравнению с контрольной трансфекцией ингибитором (фиг. 8C, 8D). Чтобы дополнительно подтвердить роль miR-301a в поляризации маркеров M1 / ​​M2 in vivo, мы подавили экспрессию miR-301a у мышей BALB / c путем введения miR-301a-VM или VM-NC после 24 часов инфекции JEV. JEV-индуцированная экспрессия маркеров микроглии M1, таких как CD68 и CD86, была снижена при лечении miR-301a-VM по сравнению с введением VM-NC (рис.8E, 8F). Одновременно ингибирование miR-301a у мышей, инфицированных JEV, увеличивало количество маркера M2 CD206 по сравнению с таковым у мышей, обработанных VM-NC, по оценке с помощью иммунофлуоресцентного анализа (фиг. 8G).

    РИСУНОК 8.

    Ингибирование miR-301a индуцирует поляризацию M1 в M2 в микроглии, инфицированной JEV. ( A и B ) Клетки CHME3 (A) и BV2 (B) были оставлены неинфицированными (MI) или инфицированными в течение 24 часов после 24 часов трансфекции анти-miR-Con или анти-miR-301a, а Экспрессию мРНК маркеров M1 определяли с помощью анализа qRT-PCR.( C и D ) При такой же обработке экспрессию мРНК маркеров M2 анализировали с помощью исследования qRT-PCR в клетках CHME3 (C) и BV2 (D). Все данные являются средними значениями ± стандартное отклонение трех экспериментов. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, однофакторный дисперсионный анализ с последующим апостериорным тестом Бонферрони. ( E G ) Мышей BALB / c инфицировали JEV (3 × 10 5 БОЕ) и лечили либо miR-301a-VM, которая нацелена на зрелую miR-301a (JEV с miR-301a-VM). [JEV + miR-301a – VM]) или JEV с VM-NC (JEV + VM-NC).Мозг собирали на 7 день для оценки экспрессии маркера M1 CD68 (E) и CD86 (F), а также маркера M2 CD206 (G) с помощью исследования коиммунофлуоресценции с микроглиальным белком TMEM119. Масштабная линейка 50 мкм; оригинальное увеличение × 20. Данные являются репрезентативными для четырех мышей на группу.

    Ингибирование miR-301a in vivo ослабляет нейровоспаление и ингибирует гибель нейронов

    Патологические изменения, такие как активация микроглии, повышенная экспрессия провоспалительных цитокинов и гибель нейронов, считаются кардинальными особенностями инфекции JEV in vivo.Чтобы оценить эффект ингибирования miR-301a на нейровоспаление in vivo, мы использовали Vivo-морфолино-опосредованную доставку анти-miR-301a в мозг мыши. Уже сообщалось, что система Vivo-Morpholino приводит к очень эффективной доставке антисмысловых олигомеров в различные ткани экспериментальных мышей (34). Как упоминалось в нашем предыдущем исследовании (24), упакованные в Vivo-морфолино анти-miR-301a специфически нацелены на затравочную последовательность miR-301a (miR-301a-VM) и соответствующий отрицательный контроль (VM-NC), обладающий 5-нуклеотидными нуклеотидами. мутации в посевной последовательности были использованы для дальнейших исследований.Мышей BALB / c оставили неинфицированными или инфицировали JEV и обработали VM-NC или miR-301a-VM через 24 часа после инфицирования (фиг. 9A). Образцы головного мозга мышей собирали через 3 и 7 дней после заражения. Хотя JEV-инфицированные мыши, которым вводили VM-NC, демонстрировали увеличение численности miR-301a по сравнению с неинфицированным образцом мозга, обработка miR-301a-VM приводила к нарушению активации miR-301a (фиг. 9B). Степень потери массы тела была значительно снижена у мышей, получавших miR-301a-VM, по сравнению с мышами, получавшими VM-NC (дополнительный рис.3А). Снижение содержания белка NKRF и мРНК у мышей, обработанных VM-NC, инфицированных JEV, значительно восстановилось у мышей, инфицированных JEV, обработанных miR-301a-VM (фиг. 9C, 9D). Кроме того, мыши, обработанные miR-301a-VM, демонстрировали сниженную экспрессию Iba1 и повышенное содержание белка NeuN по сравнению с обработанными VM-NC, инфицированными JEV мышами (фиг. 9C). Чтобы определить, оказывает ли спасение NKRF какое-либо влияние на концентрацию провоспалительных цитокинов, мы оценили экспрессию IL-6, TNF-α, IL-12, IFN-γ и CCL2 с помощью анализа CBA.Было обнаружено, что все эти цитокины существенно уменьшились у мышей, получавших miR-301a-VM, по сравнению с мышами, обработанными VM-NC (фиг. 9E). Кроме того, апоптоз нейронов анализировали с помощью анализа TUNEL в сочетании с иммунофлуоресцентным исследованием нейронального маркера NeuN. Анализ TUNEL характеризуется обнаружением фрагментации ДНК путем мечения 3′-гидроксильных концов в разрывах дцДНК, образовавшихся во время апоптоза. Наблюдалось значительное количество нейронных клеток, подвергшихся апоптозу при инфекции JEV, что отражалось в увеличении количества NeuN- и TUNEL-положительных клеток у мышей, обработанных VM-NC, тогда как нокдаун miR-301a значительно снижал гибель нейронов у мышей, инфицированных JEV ( Инжир.9F). Хотя было обнаружено, что повышенное количество вирусной РНК и вирусный титр в JEV с головным мозгом мышей, обработанных VM-NC, снижается при ингибировании miR-301a (дополнительный рис. 3B, 3C), обработка miR-301a-VM не оказывала влияния на вирусная нагрузка в микроглии (рис. 9G).

    РИСУНОК 9.

    Ингибирование miR-301a in vivo ослабляет воспаление микроглии и ингибирует гибель нейронов. ( A ) Мышей BALB / c лечили PBS (MI) или инфицировали JEV (3 × 10 5 PFU) и вводили внутричерепно либо miR-301a-VM, которая нацелена на зрелые miR-301a (JEV с miR -301a – VM [JEV + miR-301a – VM]) или JEV с VM-NC (JEV + VM-NC).Образцы головного мозга собирали на 3 и 7 день заражения JEV. ( B ) Количество miR-301a в образцах мозга определяли количественно с помощью анализа qRT-PCR. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение для четырех мышей из каждой группы. ( C и D ) Образцы мозга мышей, описанных в (A), анализировали с помощью вестерн-блоттинга (C) с Ab, специфичными для NKRF, NeuN и Iba1. β-Актин служил контролем нагрузки. Блоты представляют четырех мышей из каждой группы. Относительное количество мРНК NKRF также оценивали с помощью анализа qRT-PCR (D).( E ) Образцы мозга также подвергали анализу CBA для определения содержания белка IL-6, TNF-α, IL-12, IFN-γ и CCL2. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение для четырех мышей из каждой группы. ( F и G ) Мышей BALB / c лечили, как в (A), и образцы мозга собирали на 7 день для оценки экспрессии TUNEL с помощью исследования коиммунофлуоресценции с нейрональным белком NeuN. Масштабная линейка 50 мкм; оригинальное увеличение × 20. (G) Коиммунофлуоресценция белка NS3 JEV с микроглиальным маркером TMEM119 также была проведена в собранных образцах головного мозга.Масштабная линейка 50 мкм; оригинальное увеличение × 20. Данные являются репрезентативными для четырех мышей в каждой группе. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, как рассчитано с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующими множественными сравнениями Бонферрони. д.п.и., дни после заражения.

    Обсуждение

    Микроглия играет ключевую роль в инициировании как врожденных, так и адаптивных иммунных ответов ЦНС при патогенной инвазии (35). Активация микроглии считается основным признаком нейровоспаления и характеризуется ее морфологическим изменением до фенотипа M1, а также секрецией ряда провоспалительных медиаторов.Активация микроглии M1 с последующим нейровоспалением — обычная черта японского энцефалита (36). После инвазии JEV глиальные клетки вызывают иммунный ответ против патогенов; однако репликация вируса в микроглии приводит к смерти нейронов-свидетелей из-за секреции медиаторов воспаления (4). Помимо JEV, нейротропные вирусы, такие как денге (37), Зика (38), Chandipura (8), грипп (39), ВИЧ-1 (40), HSV (41) и вирус везикулярного стоматита (42), сообщалось, что они заражают микроглию, тем самым способствуя нейропатогенезу.

    miRNA появились как ключевой игрок в посттранскрипционной регуляции генов при вирус-индуцированном воспалении, формируя, таким образом, противовирусный иммунный ответ хозяина. Несколько микроРНК, которые обогащены в головном мозге, играют решающую роль в воспалении микроглии. miR-155 повышается в M1-поляризованной микроглии и регулирует их провоспалительные ответы (43). Недавно было продемонстрировано, что miR-9 способствует активации микроглии путем нацеливания на белок-1, индуцированный хемотаксическим белком моноцитов (44). Однако измененное количество клеточных miRNAs при вирусной инфекции может изменить экспрессию клеточных генов, что может быть вредным для хозяина.Несколько генов, связанных с воспалительным путем, включая TNF-α-индуцированный белок 3 (TNFAIP3) (19), SH-2, содержащий инозитол-5ʹ -полифосфатазу 1 (SHIP1) (18), белок безымянного пальца 125 (RNF125) (21) и безымянный палец. Сообщалось, что белок 11 (RNF11) (20) нацелен на разные миРНК, таким образом регулируя нейровоспалительный ответ во время инфекции JEV. В этом исследовании мы наблюдали значительное усиление экспрессии микроглии miR-301a после инфекции JEV, что привело нас к исследованию его модулирующего действия на воспалительный ответ, вызванный JEV.На сегодняшний день нет таких сообщений, демонстрирующих роль miR-301a в контексте какой-либо вирусной воспалительной реакции. Хотя экспрессия miR-301a не была обнаружена в недавнем исследовании с участием массива miRNA микроглиальных клеток человека, инфицированных JEV (45), в текущем исследовании мы обнаружили, что miR-301a активируется в инфицированных JEV микроглиальных клетках человека и мыши. , что приводит к выработке различных провоспалительных медиаторов и цитокинов.

    Поскольку обнаружено, что miR-301a сверхэкспрессируется во время инфекции JEV, а miR-301a действует как положительный регулятор воспалительного ответа, мы предположили, что miR-301a может ингибировать важные супрессоры воспалительной передачи сигналов.В соответствии с предыдущим сообщением (23) мы обнаружили, что miR-301a непосредственно нацелен на NKRF, который является негативным регулятором активации NF-κB. JEV-инфицированные клетки микроглии и человеческий мозг демонстрировали снижение экспрессии NKRF. Кроме того, сверхэкспрессия miR-301a в микроглиальных клетках приводила к снижению количества белка NKRF и мРНК, тогда как нокдаун miR-301a в инфицированных JEV микроглиальных клетках существенно спасал экспрессию NKRF, демонстрируя роль JEV-индуцированной miR-301a в подавлении NKRF. .

    NKRF действует как репрессор транскрипции, который противодействует базовой активности нескольких воспалительных молекул, управляемых NF-κB. NKRF проявляет свой эффект либо путем связывания с негативными регуляторными элементами в соответствующих промоторах (IL-8, IFN-β и iNOS) (46, 47), либо путем прямого взаимодействия с белком NF-κB / p65, который может связываться с промотором. некоторых генов (матриксная металлопротеиназа 2 [MMP-2] и COX-2) (23). Кроме того, NKRF ингибирует активацию NF-κB за счет прямого взаимодействия белок / белок с субъединицей NF-κB (31).Недавнее исследование продемонстрировало, что подавление NKRF связано с системным воспалением у пациентов, страдающих хронической обструктивной болезнью легких (48). Нокдаун NKRF в микроглии, инфицированной JEV, в нашем настоящем исследовании значительно увеличивал продукцию провоспалительных цитокинов. Более того, подавление NKRF устраняет ингибирующий эффект ингибитора miR-301a на количество провоспалительных молекул, индуцированных JEV. Напротив, эктопическая экспрессия NKRF в микроглии, инфицированной JEV, подавляет экспрессию провоспалительных цитокинов наряду с дальнейшим усилением ингибирующего действия ингибитора miR-301a на продукцию индуцированных JEV провоспалительных молекул.Вместе эти наблюдения указывают на роль miR-301a в вкладе в неконтролируемое воспаление через его эффекты на NKRF. В нашем предыдущем исследовании (24) роль miR-301a в стимулировании репликации вируса в нейроне путем нацеливания на SOCS5 и IRF1 дополнительно побудила нас проверить, опосредуется ли вклад микроглии miR-301a в регуляцию воспалительного ответа через влияние на репликацию вируса. Мы измерили титр вируса в супернатанте клеток микроглии, обработанных Mimic – miR-301a или ингибитором, с последующей инфекцией JEV.Отсутствие изменений в титре вируса ни с Mimic – miR-301a, ни с ингибитором позволяет предположить, что miR-301a ответственна за усиленный воспалительный ответ микроглии независимо от репликации вируса. Напротив, значительное снижение вирусной репликации в головном мозге мышей, получавших miR-301a-VM, дополнительно побудило нас проверить вирусную нагрузку в микроглии мозга мышей. Неизмененная экспрессия вирусного белка в микроглии мышей, получавших miR-301a-VM, по сравнению с мышами, получавшими VM-NC, свидетельствует о том, что наблюдаемое снижение вирусной нагрузки может быть связано со снижением репликации вируса в нейрональных клетках.Отсутствие изменений в содержании SOCS5 и IRF1 в ответ на сверхэкспрессию mir-301a в микроглии дополнительно усиливает отсутствие взаимосвязи между размножением вируса в микроглии и воспалительным ответом, регулируемым miR-301a. Вероятные причины неизменного титра вируса в ответ на изменения продукции цитокинов могут быть связаны с тем, что уровень экспрессии цитокинов и хемокинов может быть недостаточным для подавления репликации JEV в микроглии. В дополнение к этому, JEV может модулировать нижестоящие сигнальные эффекторы цитокинов, что приводит к подавлению ожидаемого иммунного ответа и нарушению распространения вируса.

    Поскольку оптимальная активность NF-κB считается необходимой для выживания периферических иммунных клеток, соответствующая регуляция передачи сигналов NF-κB остается критической для управления нормальным иммунным процессом (49). Известно, что стойкая активация передачи сигналов NF-κB способствует воспалению в различных клетках, включая микроглию (50). Убийство нейрональных клеток за счет воспаления микроглии также опосредуется активацией NF-κB (51). Дополнительные доказательства предполагают роль ряда miRNA, включая miR-301a, в регуляции передачи сигналов NF-κB (23, 52).Следовательно, представляло интерес оценить влияние miR-301a на регуляцию JEV-индуцированной активности NF-κB в микроглии. Мы наблюдали, что обработка клеток Mimic-miR-301a усиливает активацию NF-κB, тогда как ингибитор препятствует накоплению в ядре фосфорилированного NF-κB при инфекции JEV. Кроме того, подавление NKRF нарушает ингибирующий эффект ингибитора miR-301a на накопление NF-κB в ядре в микроглии, инфицированной JEV. Напротив, опосредуемое ингибитором miR-301a снижение ядерной транслокации NF-κB из цитоплазмы усиливается эктопической экспрессией NKRF.Кроме того, было обнаружено, что эффект ингибирования miR-301a на активность NF-κB в микроглии, инфицированной JEV, в значительной степени регулируется экспрессией NKRF. Таким образом, эти находки иллюстрируют роль JEV-индуцированного miR-301a в усилении передачи сигналов NF-κB посредством супрессии NKRF.

    Поляризацию микроглии иногда подразделяют на классическую (M1) и альтернативную (M2) активацию в ответ на различные стимулы. Фенотип M1 характеризуется секрецией различных провоспалительных медиаторов и вызывает невропатологию, тогда как микроглия M2 имеет тенденцию уменьшать воспаление и может иметь нейропротекторную роль (53).Инфекция JEV приводит к поляризации микроглии до фенотипа M1, который секретирует повышенное количество провоспалительных цитокинов. Доказательства демонстрируют решающую роль miRNAs в поляризации M1 / ​​M2 микроглии. В то время как некоторые из них способствуют фенотипу M2, некоторые другие miRNA, включая miR-125b, miR-155 и miR-29b, нацелены на активацию NF-κB негативных регуляторов и тем самым способствуют поляризации макрофагов M1 (19, 43, 54). Мы обнаружили, что нокдаун miR-301a при инфекции JEV подавлял экспрессию маркеров клеточной поверхности микроглии M1 (CD86 и CD68), а также продукцию провоспалительных цитокинов in vivo и in vitro.Более того, экспрессия поверхностного маркера микроглии M2 (CD206) и продукция противовоспалительных цитокинов увеличиваются при молчании miR-301a, таким образом предполагая, что JEV-индуцированная miR-301a положительно регулирует поляризацию M1 микроглии.

    Мы дополнительно исследовали in vivo эффект miR-301a на модели мыши, инфицированной JEV, с miR-301a-VM. Ранее мы сообщали, что miR-301a-VM выполняет нейропротекторную роль и блокирует репликацию вируса в головном мозге мышей, индуцируя противовирусный ответ IFN-β (24).В этом исследовании мы вводили miR-301a-VM мышам, чтобы продемонстрировать его потенциальное применение против воспалительного ответа, вызванного JEV. Ингибирование miR-301a восстанавливает количество мРНК и белка NKRF и эффективно приводит к значительному снижению экспрессии провоспалительных цитокинов. Кроме того, нокдаун in vivo miR-301a ингибирует активацию микроглии и снижает гибель нейронов. Оценка вирусной РНК-нагрузки выявила значительное снижение в головном мозге мышей, получавших miR-301a-VM, но неизменную экспрессию вирусного белка в микроглии головного мозга, подтверждая результаты нашего предыдущего исследования (24) и предполагая, что miR-301a-VM опосредовано нарушение функции Таким образом, распространение JEV в нейронах может объяснить снижение вирусной нагрузки.

    Таким образом, мы идентифицировали специфическое для микроглии взаимодействие хозяин / вирус, демонстрируя роль miR-301a в стимулировании JEV-опосредованного нейровоспаления. Увеличение экспрессии miR-301a оказывает свой эффект за счет подавления экспрессии NKRF, что приводит к опосредованной активацией NF-κB увеличению продукции провоспалительных цитокинов. Ингибирование JEV-индуцированной экспрессии miR-301a, наоборот, нарушает этот молекулярный путь, тем самым уменьшая поляризацию M1 микроглии и последующую воспалительную реакцию.Обширный глиоз является признаком инфекции JEV, что приводит к резкому производству воспалительных цитокинов и, следовательно, к повреждению нейрональных клеток (4). Следовательно, подавление чрезмерного воспалительного ответа может потенциально остановить развитие событий, ведущих к гибели нейронов, и, по-видимому, является многообещающим средством против инфекции JEV. В предыдущем исследовании мы обнаружили, что повышенная экспрессия miR-301a в нейроне, инфицированном JEV, подавляла IFN типа I, воздействуя на IRF1 и SOCS5.Нейтрализация JEV-индуцированной miR-301a усиливала врожденный иммунитет хозяина за счет восстановления экспрессии IFN-β и ограничения вирусного размножения. Ингибирование miR-301a, таким образом, имеет потенциал действовать как палка о двух концах, усиливая IFN-опосредованный врожденный иммунитет типа I, а также предотвращая случайное повреждение нейронов за счет снижения сверхактивации микроглии. Таким образом, нацеливание на miR-301a может действительно дать новое понимание для разработки эффективной противовирусной стратегии в борьбе с инфекцией JEV.

    Раскрытие информации

    У авторов нет финансового конфликта интересов.

    Благодарности

    Мы благодарны С. Левисону (Университет Рутгерса), Г. Р. Медигеши (Институт трансляционных медицинских наук и технологий), Э. Сену (NBRC) и Д. Чаттопадхая (Университет Эмити) за предоставленные клеточные линии и плазмиды. Мы также признательны Распределенному информационному центру NBRC за помощь в технической и инфраструктурной поддержке, связанной с компьютерами. Мы благодарны К. Л. Кумавату за помощь в проведении всех экспериментов на животных. Также благодарим М. Догра за техническую помощь.

    Сноски

    • Эта работа была поддержана исследовательскими грантами Департамента биотехнологии (BT / PR22341 / MED / 122/55/2016) и стипендией Tata Innovation Fellowship (BT / HRD / 35/01/02/2014) в AB

    • Онлайн-версия статьи содержит дополнительные материалы.

    • Сокращения, использованные в этой статье:

      anti-miR-Con
      anti-miR control
      CBA
      цитометрическая матрица шариков
      Con-esiRNA
      esiRNA control 9027- 2 cycloxygen 9027- 2 2
      DIG
      дигоксигенин
      esiRNA
      приготовленная эндорибонуклеазой малая интерферирующая РНК
      FFPE
      фиксированная формалином, заделанная парафином
      iNOS
      IRF2
      9027 регуляторный фактор 1 IRF2 9027 NO709
      гибридизация in situ
      JEV
      Вирус японского энцефалита
      LNA
      заблокированная нуклеиновая кислота
      MI
      фиктивная инфекция, фиктивная инфекция
      miR-301a – VM
      miR-30170 miR-30170 miR-30170 miR-30170 miR-30170 miR-301
      микроРНК
      MOI
      множественность инфекции
      NBRC
      National Brain Исследовательский центр
      NKRF
      Фактор репрессии NF-κB
      NKRF esiRNA
      esiRNA, специфичная для NKRF
      PCNA
      ядерный Ag пролиферирующих клеток
      qRT-PCR
      qRT-PCR 9027 РНК
      SOCS5
      супрессор передачи сигналов цитокинов 5
      UTR
      нетранслируемая область
      VM-NC
      Vivo-Morpholino отрицательный контроль
      WT
      дикого типа.
    • Получено 3 января 2019 г.
    • Принято 20 августа 2019 г.
    • Авторские права © 2019 Американской ассоциации иммунологов, Inc.

    Ген — NKRF

    NKRF имеет 4124 функциональных ассоциации с биологическими объектами, охватывающими 8 категорий (молекулярный профиль, организм, химический состав, функциональный термин, фраза или ссылка, заболевание, фенотип или признак, структурный признак, линия клеток, тип клеток или ткань, ген, белок или микроРНК). из 72 наборов данных.

    Нажмите кнопки +, чтобы просмотреть ассоциации для NKRF из наборов данных ниже.

    Набор данных Резюме
    Атлас мозга взрослого человека Профили экспрессии генов в тканях мозга ткани с высокой или низкой экспрессией гена NKRF по сравнению с другими тканями из набора данных «Профили экспрессии генов в тканях мозга взрослых человека» Аллена.
    Allen Brain Atlas Профили экспрессии генов в тканях мозга взрослых мышей ткани с высокой или низкой экспрессией гена NKRF по сравнению с другими тканями из набора данных «Профили экспрессии генов в тканях мозга взрослых мышей Аллена».
    Атлас мозга Аллена по разработке профилей экспрессии генов в тканях человеческого мозга с помощью микрочипов образцы тканей с высокой или низкой экспрессией гена NKRF по сравнению с образцами других тканей из Атласа мозга по разработке профилей экспрессии генов тканей мозга человека с помощью набора данных микрочипов.
    Атлас мозга Аллена по разработке профилей экспрессии генов в тканях человеческого мозга с помощью RNA-seq образцы тканей с высокой или низкой экспрессией гена NKRF по сравнению с образцами других тканей из Атласа мозга по разработке профилей экспрессии генов тканей мозга человека по набору данных RNA-seq.
    Атлас мозга Аллена Профили экспрессии генов в тканях человеческого мозга в пренатальном периоде ткани с высокой или низкой экспрессией гена NKRF по сравнению с другими тканями из набора данных Профилей экспрессии генов тканей головного мозга человека Allen Brain Atlas.
    Профили экспрессии генов клеточной линии BioGPS линии клеток с высокой или низкой экспрессией гена NKRF по сравнению с другими линиями клеток из набора данных профилей экспрессии генов клеточной линии BioGPS.
    Типы клеток человека BioGPS и профили экспрессии тканевых генов типы клеток и ткани с высокой или низкой экспрессией гена NKRF по сравнению с другими типами клеток и тканями из набора данных BioGPS Human Cell Type and Tissue Gene Expression Profiles.
    Типы клеток мыши BioGPS и профили экспрессии тканевых генов типы клеток и ткани с высокой или низкой экспрессией гена NKRF по сравнению с другими типами клеток и тканями из набора данных BioGPS Mouse Cell Type and Tissue Gene Expression Profiles.
    Профили CNV гена клеточной линии CCLE линии клеток с высоким или низким числом копий гена NKRF по сравнению с другими линиями клеток из набора данных CNV Profiles гена CCLE Cell Line.
    Профили экспрессии генов клеточной линии CCLE линии клеток с высокой или низкой экспрессией гена NKRF по сравнению с другими линиями клеток из набора данных профилей экспрессии генов клеточной линии CCLE.
    Профили сайтов связывания фактора транскрипции CHEA профили сайтов связывания факторов транскрипции с доказательствами связывания факторов транскрипции на промоторе гена NKRF из набора данных профилей сайтов связывания факторов транскрипции CHEA.
    Цели фактора транскрипции CHEA факторы транскрипции, связывающие промотор гена NKRF, в функциональных исследованиях факторов транскрипции с низкой или высокой пропускной способностью из набора данных мишеней для факторов транскрипции CHEA.
    Сигнатуры CMAP дифференциально экспрессируемых генов малых молекул мелкомолекулярные возмущения, изменяющие экспрессию гена NKRF из набора данных CMAP Signatures of Differenically Expression Genes for Small Molecules.
    ОТСЕКИ Кураторские баллы доказательств локализации белка клеточные компоненты, содержащие белок NKRF из набора данных COMPARTMENTS Curated Protein Localization Evidence Scores.
    ОТДЕЛЕНИЯ Анализ текста Результаты локализации белков клеточные компоненты, совместно встречающиеся с белком NKRF, в отрывках из биомедицинских публикаций из набора данных: Анализ текста. Результаты локализации белков.
    Профили CNV генов клеточной линии COSMIC линии клеток с высоким или низким числом копий гена NKRF по сравнению с другими линиями клеток из набора данных CNV Profiles COSMIC Cell Line Gene Gene.
    Профили мутации генов клеточной линии COSMIC линии клеток с мутациями гена NKRF из набора данных профилей мутаций генов линии клеток COSMIC.
    CTD генно-химические взаимодействия химические вещества, взаимодействующие с геном / белком NKRF из тщательно отобранного набора данных CTD Gene-Chemical Interactions.
    CTD ассоциации генов и болезней заболевания, связанные с геном / белком NKRF из тщательно подобранного набора данных CTD Gene-Disease Association.
    Ассоциации генов и признаков dbGAP признаки, связанные с геном NKRF в GWAS и других наборах данных генетических ассоциаций из набора данных dbGAP Gene-Trait Associations.
    ЗАБОЛЕВАНИЯ Поиск доказательств связи гена и заболевания с помощью интеллектуального анализа текста заболевания, сопутствующие гену NKRF, в отрывках из биомедицинских публикаций из набора данных DISEASES Text-Mining Gene-Disease Assocation Evidence Scores.
    КОДИРОВАТЬ профили сайтов модификации гистонов профили сайтов модификации гистонов с высоким содержанием модификаций гистонов в гене NKRF из набора данных профилей сайтов модификации гистонов ENCODE.
    ENCODE профили сайтов связывания факторов транскрипции профили сайтов связывания факторов транскрипции с доказательствами связывания факторов транскрипции на промоторе гена NKRF из набора данных профилей сайтов связывания факторов транскрипции ENCODE.
    ENCODE Мишени факторов транскрипции факторы транскрипции, связывающие промотор гена NKRF в наборах данных ChIP-seq из набора данных ENCODE Transcription Factor Targets.
    ESCAPE Omics Сигнатуры генов и белков для стволовых клеток PubMedID публикаций, сообщающих о сигнатурах генов, содержащих NKRF, из набора данных ESCAPE Omics Signatures of Genes and Proteins for Stem Cells.
    Ассоциации генов, вызывающих ГТР заболевания, связанные с геном NKRF в GWAS и других наборах данных генетических ассоциаций из набора данных GAD Gene-Disease Associations.
    Профили экспрессии генов клеточной линии GDSC клеточные линии с высокой или низкой экспрессией гена NKRF по сравнению с другими клеточными линиями из набора данных GDSC Cell Line Expression Profiles.
    Аннотации биологических терминов GeneRIF биологические термины, встречающиеся с геном NKRF в подтвержденных литературой утверждениях, описывающих функции генов из набора данных GeneRIF Biological Term Annotations.
    GeneSigDB опубликовал генные подписи PubMedID публикаций, сообщающих о генных сигнатурах, содержащих NKRF, из набора данных опубликованных генных сигнатур GeneSigDB.
    ГЕО-сигнатуры дифференциально экспрессируемых генов болезней нарушения, вызывающие заболевание, изменяющие экспрессию гена NKRF из набора данных GEO Signatures of Differenically Expression Genes for Diseases.
    GEO-сигнатуры дифференциально экспрессируемых генов для генных нарушений генные пертурбации, изменяющие экспрессию гена NKRF из набора данных GEO Signatures of Differenically Expression Genes for Gene Perturbations.
    GEO-сигнатуры дифференциально экспрессируемых генов киназных возмущений киназные пертурбации, изменяющие экспрессию гена NKRF из набора данных GEO Signatures of Differenically Expression Genes for Kinase Perturbations.
    ГЕО-сигнатуры дифференциально экспрессируемых генов малых молекул мелкомолекулярные возмущения, изменяющие экспрессию гена NKRF из набора данных GEO Signatures of Differenically Expression Genes for Small Molecules.
    GEO-сигнатуры дифференциально экспрессируемых генов нарушений транскрипционного фактора возмущения фактора транскрипции, изменяющие экспрессию гена NKRF из набора данных GEO Signatures of Differenically Expression Genes for Transcription Factor Perturbations.
    Сигнатуры GEO дифференциально экспрессируемых генов вирусных инфекций вирусные возмущения, изменяющие экспрессию гена NKRF из набора данных GEO Signatures of Differenically Expression Genes for Viral Infections.
    Аннотации биологических процессов GO биологические процессы с участием гена NKRF из кураторского набора данных GO Biological Process Annotations.
    Аннотации к сотовым компонентам GO клеточные компоненты, содержащие белок NKRF из тщательно подобранного набора данных GO Cellular Component Annotations.
    Аннотации молекулярных функций GO молекулярные функции, выполняемые геном NKRF из тщательно подобранного набора данных GO Molecular Function Annotations.
    Профили экспрессии тканевых генов GTEx ткани с высокой или низкой экспрессией гена NKRF по сравнению с другими тканями из набора данных GTEx Tissue Gene Expression Profiles.
    Профили экспрессии генов в образцах ткани GTEx образцы тканей с высокой или низкой экспрессией гена NKRF по сравнению с образцами других тканей из набора данных GTEx Tissue Sample Gene Expression Profiles.
    GWASdb SNP-болезни ассоциации заболевания, связанные с геном NKRF в GWAS и других наборах данных генетических ассоциаций из набора данных GWASdb SNP-Disease Associations.
    Ассоциации SNP-фенотипов GWASdb фенотипы, связанные с геном NKRF в наборах данных GWAS из набора данных GWASdb SNP-Phenotype Associations.
    Heiser et al., PNAS, 2011 Профили экспрессии генов клеточной линии линии клеток с высокой или низкой экспрессией гена NKRF по сравнению с другими линиями клеток из Heiser et al., PNAS, 2011 набор данных профилей экспрессии генов клеточной линии.
    Профили экспрессии генов клеточной линии HPA линии клеток с высокой или низкой экспрессией гена NKRF по сравнению с другими линиями клеток из набора данных профилей экспрессии генов линий клеток HPA.
    Профили экспрессии гена ткани HPA ткани с высокой или низкой экспрессией гена NKRF по сравнению с другими тканями из набора данных профилей экспрессии гена ткани HPA.
    Профили экспрессии генов образца ткани HPA образцы тканей с высокой или низкой экспрессией гена NKRF по сравнению с образцами других тканей из набора данных профилей экспрессии гена образца ткани HPA.
    Типы клеток HPM и профили экспрессии белков в тканях типы клеток и ткани с высокой или низкой экспрессией белка NKRF по сравнению с другими типами клеток и тканями из набора данных HPM Cell Type and Tissue Protein Expression Profiles.
    Белки-концентраторы белок-белковые взаимодействия взаимодействующие хаб-белки для NKRF из тщательно подобранного набора данных Hub Proteins Protein-Protein Interactions.
    Аннотации доменов белка, предсказанные InterPro белковые домены, предсказанные для белка NKRF из набора данных InterPro Predicted Protein Domain Annotations.
    Предсказанные JASPAR мишени для факторов транскрипции факторы транскрипции, регулирующие экспрессию гена NKRF, предсказанные с использованием известных мотивов сайтов связывания факторов транскрипции из набора данных JASPAR Predicted Transcription Factor Targets.
    Klijn et al., Nat. Biotechnol., 2015 Профили CNV гена клеточной линии клеточные линии с высоким или низким числом копий гена NKRF по сравнению с другими клеточными линиями из Klijn et al., Nat. Biotechnol., 2015 Набор данных CNV-профилей гена клеточной линии.
    Klijn et al., Nat. Biotechnol., 2015 Профили экспрессии генов клеточной линии клеточные линии с высокой или низкой экспрессией гена NKRF по сравнению с другими клеточными линиями из Klijn et al., Nat. Biotechnol., 2015 Набор данных профилей экспрессии генов клеточной линии.
    Klijn et al., Nat. Biotechnol., 2015 Профили мутации генов клеточной линии клеточные линии с мутациями гена NKRF от Klijn et al., Nat. Biotechnol., 2015 Набор данных профилей мутации генов клеточной линии.
    LOCATE Curated Protein Localization Annotations клеточные компоненты, содержащие белок NKRF, в анализах локализации белка с низкой или высокой пропускной способностью из набора данных LOCATE Curated Protein Localization Annotations.
    LOCATE Прогнозируемые аннотации локализации белка клеточные компоненты, предположительно содержащие белок NKRF из набора данных LOCATE Predicted Protein Localization Annotations.
    Мишени микроРНК MiRTarBase микроРНК, нацеленные на ген NKRF, в исследованиях нацеливания на микроРНК с низкой или высокой пропускной способностью из набора данных MiRTarBase microRNA Targets.
    Предсказанные цели факторов транскрипции в MotifMap факторы транскрипции, регулирующие экспрессию гена NKRF, предсказанные с использованием известных мотивов сайта связывания факторов транскрипции из набора данных MotifMap Predicted Transcription Factor Targets.
    Ассоциации ген-фенотип MPO фенотипы трансгенных мышей, вызванные мутациями гена NKRF из набора данных ассоциаций генов-фенотипов MPO.
    Модули коэкспрессии раковых генов MSigDB коэкспрессируемые гены для NKRF из набора данных модулей коэкспрессии раковых генов MSigDB.
    Белковые комплексы NURSA белковые комплексы, содержащие белок NKRF, полученные с помощью IP-MS из набора данных NURSA Protein Complexes.
    Белок-белковые взаимодействия Pathway Commons взаимодействующие белки для NKRF из набора данных Pathway Commons Protein-Protein Interactions.
    Дорожная карта Эпигеномика Профили экспрессии клеточных и тканевых генов типы клеток и ткани с высокой или низкой экспрессией гена NKRF по сравнению с другими типами клеток и тканями из набора данных профилей экспрессии клеток и тканевых генов Roadmap Epigenomics.
    Дорожная карта Эпигеномика Профили сайтов модификации гистонов профили сайтов модификации гистонов с высоким содержанием модификаций гистонов в гене NKRF из набора данных профилей сайтов модификации гистонов Roadmap Epigenomics.
    Сигнатуры SILAC Phosphoproteomics дифференциально фосфорилированных белков для белковых лигандов лиганд (белок) пертурбации, изменяющий фосфорилирование белка NKRF из набора данных SILAC Phosphoproteomics Signatures of Differenically Phosphorylated Proteins for Protein Ligands.
    TargetScan предсказал консервативные мишени микроРНК микроРНК, регулирующие экспрессию гена NKRF, предсказанные с использованием консервативных посевных последовательностей миРНК из набора данных TargetScan Predicted Conserved microRNA Targets.
    TargetScan предсказал неконсервативные мишени микроРНК микроРНК, регулирующие экспрессию гена NKRF, прогнозируемые с использованием неконсервативных посевных последовательностей миРНК из набора данных TargetScan Predicted Nonconserved microRNA Targets.
    Сигнатуры TCGA дифференциально экспрессируемых генов опухолей образцы тканей с высокой или низкой экспрессией гена NKRF по сравнению с образцами других тканей из набора данных TCGA Signatures of Differenically Expression Genes for Tumors.
    Оценки доказательств экспрессии тканевого белка TISSUES ткани с высокой экспрессией белка NKRF из набора данных TISSUES Curated Tissue Protein Expression Evidence Scores.
    TISSUES Экспериментальные оценки экспрессии белков в тканях ткани с высокой экспрессией белка NKRF в наборах данных протеомики из набора данных TISSUES Experimental Tissue Protein Expression Evidence Scores.
    TISSUES Текстовый анализ данных по выражению тканевого белка. ткани, совместно встречающиеся с белком NKRF, в отрывках из биомедицинских публикаций из набора данных TISSUES Text-mining Tissue Protein Expression Evidence Scores.
    Курируемые TRANSFAC мишени факторов транскрипции факторы транскрипции, связывающие промотор гена NKRF, в функциональных исследованиях факторов транскрипции с низкой или высокой пропускной способностью из набора данных TRANSFAC Curated Transcription Factor Targets.
    Предсказанные TRANSFAC мишени по факторам транскрипции факторы транскрипции, регулирующие экспрессию гена NKRF, предсказанные с использованием известных мотивов сайта связывания факторов транскрипции из набора данных TRANSFAC Predicted Transcription Factor Targets.

    Антитело NKRF (NBP2-15041): Novus Biologicals

    Резюме антител к NKRF

    Иммуноген

    Рекомбинантный белок, содержащий последовательность в центральной области человеческого NKRF. Точная последовательность запатентована.

    Прогнозируемые виды

    Мышь (97%), КРС (98%), Обезьяна (99%).Имеет 100% гарантию.

    Изотип

    IgG

    Клональность

    Поликлональные

    Хост

    Кролик

    Ген

    НКРФ

    Чистота

    Очищенный сродством иммуногена

    Награда новатора

    Применения / разбавления

    Разведения
    • Вестерн-блот 1: 500-1: 3000
    Теоретическая молекулярная масса

    78 кДа.
    Примечание об отказе от ответственности: наблюдаемая молекулярная масса белка может отличаться от указанной в списке прогнозируемой молекулярной массы из-за посттрансляционных модификаций, посттрансляционных расщеплений, относительных зарядов и других экспериментальных факторов.

    Примечания по реакционной способности

    Обезьяна-резус (99%), курица (84%).

    Упаковка, хранение и составы

    Хранение

    Отберите аликвоты и храните при -20 ° C или -80 ° C.Избегайте циклов замораживания-оттаивания.

    Буфер

    PBS (pH 7), 20% глицерин, 1% BSA

    Консервант

    0,01% тимеросал

    Чистота

    Очищенный сродством иммуногена

    Альтернативные названия антитела NKRF

    • Фактор репрессии ITBA4NFkB
    • Фактор репрессии NF-kappaB
    • Фактор репрессии NFKB
    • Фактор репрессии NRFNF-каппа-B
    • Белок ITBA4
    • Фактор транскрипции 90 NRF
    • Фон

      Этот ген кодирует фактор транскрипции, который взаимодействует со специфическими негативными регуляторными элементами (NRE), опосредуя репрессию транскрипции определенных NK-каппа-B-чувствительных генов.Белок локализуется преимущественно в ядрышке, небольшая часть которого находится в нуклеоплазме и цитоплазме. [предоставлено RefSeq]

      Ограничения

      Этот продукт предназначен только для исследовательского использования и не одобрен для использования на людях или для клинической диагностики. Гарантия на первичные антитела составляет 1 год с даты получения.

      Покупатели, которые просматривали этот товар, также просматривали …

      Виды: Al, Av, Bv, Hu, Mu, Pl, Rt

      Применения: ChIP, ICC / IF, IHC, IHC-P, IP, KD, WB

      Виды: Hu, Mu

      Применения: ICC / IF, IHC, IHC-P, KD, WB

      Виды: Hu, Mu, Rt

      Применения: ICC / IF, IHC, IHC-P, WB

      Виды: Hu

      Приложения: ELISA, ICC / IF, IP, WB

      Виды: Hu, Rb, Rt

      Применения: Flow, IHC, IHC-P, KO, WB

      Виды: Hu, Mu, Rt

      Приложения: ICC / IF, IHC, IHC-P, KD, KO, Simple Western, WB

      Виды: Hu, Pm, Mu, Rt

      Приложения: ELISA, ICC / IF, IHC, IHC-P, KO, S-ELISA, WB

      Виды: Hu

      Приложения: CyTOF-ready, ELISA (Cap), ELISA (Det), ELISA (Sta), ICC, ICFlow, Neut, Simple Western, WB

      Виды: Dr, Hu, Mu, Rb, Rt

      Применения: Flow-CS, Flow-IC, Flow, IB, ICC / IF, IHC, IHC-P, Simple Western, WB

      Виды: Hu, Mu, Po, Rt

      Применения: Flow, IB, ICC / IF, IHC, IHC-P, In vitro, WB

      Виды: Mu

      Приложения: CyTOF-ready, Flow, IHC, IP, Simple Western, WB

      Виды: Hu, Mu, Rt

      Применения: ICC / IF, IHC, IHC-P, WB

      Виды: Hu

      Применения: ICC / IF, IHC, IHC-P, WB

      ⚠ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: Этот продукт может подвергнуть вас воздействию химических веществ, включая ртуть, которая, как известно в штате Калифорния, вызывает репродуктивную токсичность с последствиями для развития.Для получения дополнительной информации посетите сайт www.P65Warnings.ca.gov.

      Публикации антител к NKRF (NBP2-15041) (0)

      Публикаций по антителу NKRF (NBP2-15041) нет.

      Отправляя информацию о публикации, зарабатывайте подарочные карты и скидки для будущих покупок.

      Обзоры на антитела NKRF (NBP2-15041) (0)

      Нет обзоров для NKRF Antibody (NBP2-15041).Отправив отзыв, вы получите электронную подарочную карту Amazon или скидку на продукцию Novus.
      • Обзор без изображения — 10 долларов / 7 евро / 6 фунтов стерлингов / 10 канадских долларов / 70 юаней / 1110 йен
      • Обзор с изображением — 25 долларов / 18 евро / 15 фунтов стерлингов / 25 канадских долларов / 150 юаней / 2500 йен

      Общие протоколы продукта

      Найдите общую поддержку по приложениям, включая протоколы, устранение неполадок, иллюстрированные анализы, видео и вебинары.

      Видео протоколы

      Часто задаваемые вопросы об антителе NKRF (NBP2-15041) (0)

      Другие доступные форматы

      Дополнительные продукты НКРФ

      Инструмент биоинформатики для антител NKRF (NBP2-15041)

      Откройте для себя пути, заболевания и гены, связанные с антителом NKRF (NBP2-15041).Нужна помощь? Прочтите Руководство по использованию инструмента биоинформатики для получения инструкций по использованию этого инструмента.

      PTM для антитела NKRF (NBP2-15041)

      Узнайте больше о PTM, связанных с антителом к ​​NKRF (NBP2-15041).

      Добавить комментарий

      Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

      OrbitalWars Copyright © 2019. Наши партнеры GoldPride | Free-kassa

      Карта сайта