П 2 ст 428 нк рф: НК РФ Статья 428. Дополнительные тарифы страховых взносов для отдельных категорий плательщиков

Нужно ли применять дополнительный тариф страховых взносов в случае, если сестра-хозяйка по совместительству дополнительно занята на работах, отнесенных к тяжелым (младший медицинский персонал, работающий в психиатрических и психоневрологических учреждениях и непосредственно обслуживающий психических больных; спецоценка проведена (класс 3.2))?

Статьей 428 НК РФ установлены дополнительные тарифы страховых взносов на обязательное пенсионное страхование для отдельных категорий плательщиков.

Взносы по дополнительным тарифам начисляются в отношении выплат и иных вознаграждений в пользу физических лиц, занятых на видах работ, выполняя которые они могут получить право на досрочное назначение трудовой пенсии.

Перечень таких работ указан в ч. 1 ст. 30 Закона N 400-ФЗ (пп. 1, 2 ст. 428 НК РФ).

Исходя из приведенных норм, страховые взносы на ОПС по дополнительным тарифам должны начисляться, если:

• выплата является объектом обложения страховыми взносами;
• физическое лицо занято на видах работ, указанных в ч. 1 ст. 30 Закона N 400-ФЗ (смотрите также письма Минфина России от 09.06.2017 N 03-15-06/36267, от 24.03.2017 N 03-15-06/17262, от 21.03.2017 N 03-15-06/16239 (п. 7)).

По ситуации частичной занятости на тяжелых работах и работах, не относящихся к таковым, в письме Минфина России от 01.04.2019 N 03-15-07/22333 (доведено до территориальных налоговых органов письмом ФНС от 04.04.2019 N БС-4-11/[email protected]) сообщается:

«…В случае частичной занятости работника, оформленной надлежащим образом, в течение месяца как на работах, поименованных в подпунктах 1-18 части 1 статьи 30 Федерального закона N 400-ФЗ, так и на работах, не поименованных в указанных подпунктах, если при этом в организации не ведется раздельный учет выплат работнику за работу во вредных, тяжелых и опасных условиях труда и за работу в нормальных условиях труда, исчисление страховых взносов по соответствующим дополнительным тарифам на ОПС осуществляется плательщиком со всех начисленных в этом месяце в пользу данного работника выплат и вознаграждений, пропорционально количеству фактически отработанных дней (часов) на соответствующих видах работ с вредными, тяжелыми и опасными условиями труда.

Если в организации ведется раздельный учет выплат работникам при их частичной занятости, оформленной надлежащим образом, на работах, поименованных в подпунктах 1-18 части 1 статьи 30 Федерального закона N 400-ФЗ, и на работах в нормальных условиях труда, то исчисление страховых взносов по соответствующему дополнительному тарифу производится в общеустановленном порядке с выплат и иных вознаграждений, начисленных в пользу работников за период работы во вредных, тяжелых и опасных условиях труда».

Иной подход, на наш взгляд, несет риск спора (в том числе гражданского). Поэтому рекомендуем для устранения сомнений обратиться за официальными разъяснениями в Минфин России.

Дополнительные страховые взносы в пользу работников, занятых на работах, дающих право на досрочное назначение трудовой пенсии по старости

Ответ подготовил:

Эксперт службы Правового консалтинга ГАРАНТ

аудитор, член РСА, профессиональный бухгалтер Макаренко Елена

Ответ прошел контроль качества

Как начислять дополнительный тариф для отдельных категорий плательщиков по Списку N 2 по работникам инфекционного госпиталя, развернутого в медицинской организации (Амурская область) на период действия новой коронавирусной инфекции COVID-19? Положено ли производить начисление дополнительного тарифа 6% на указанных работников?

По данному вопросу мы придерживаемся следующей позиции:

На выплаты работникам инфекционного госпиталя, развернутого в медицинской организации на период действия новой коронавирусной инфекции COVID-19, должности которых поименованы в Списке 2, необходимо начислять страховые взносы по дополнительному тарифу в размере 6%.

Для уточнения вопроса рекомендуем обратиться за официальными разъяснениями в Минтруд России и в Минфин России.

Обоснование позиции:

В соответствии с Федеральным законом от 15.12.2001 N 167-ФЗ Об обязательном пенсионном страховании в Российской Федерации работодатели обязаны уплачивать в ПФР дополнительные страховые взносы в пользу работников, занятых на работах, дающих право на досрочное назначение трудовой пенсии по старости.

Исходя из положений ст. 428 НК РФ, дополнительные тарифы страховых взносов на обязательное пенсионное страхование (далее — ОПС) применяются плательщиками страховых взносов в отношении выплат в пользу тех лиц, которые заняты на видах работ с «особыми условиями труда», указанных в п.п. 1-18 ч. 1 ст. 30 Федерального закона от 28.12.2013 N 400-ФЗ «О страховых пенсиях» (далее — Закон N 400-ФЗ).

При этом дополнительный тариф в размере 6 процентов обязаны применять организации, производящие выплаты и иные вознаграждения в пользу физлиц, занятых на видах работ, указанных в п.п. 2-18 ч. 1 ст. 30 Закона N 400-ФЗ (п. 2 ст. 418 НК РФ).

Списки соответствующих работ, производств, профессий, должностей, специальностей и учреждений (организаций), с учетом которых назначается страховая пенсия по старости в соответствии с ч. 1 ст. 30 Закона N 400-ФЗ, установлены постановлением Правительства РФ от 16.07.2014 N 665.

В свою очередь, пунктом 3 ст. 428 НК РФ для лиц, указанных в п.п. 1 и 2 ст. 428 НК РФ, предусмотрены дифференцированные дополнительные тарифы страховых взносов, установленные в зависимости от результатов специальной оценки условий труда (далее — СОУТ), проводимой в порядке, установленном законодательством РФ.

Если же работник не занят на работах с особыми условиями труда, то страховые взносы по дополнительным тарифам на выплаты и иные вознаграждения, производимые в пользу данного работника, не начисляются, независимо от класса условий труда, установленного в отношении его рабочего места по результатам специальной оценки условий труда (смотрите письма Минфина России от 27.09.2019 N 03-15-06/74288, от 25.09.2018 N 03-15-07/68350, от 24.05.2018 N 03-15-06/35161, от 23.10.2017 N 03-15-06/69113, от 24.03.2017 N 03-15-06/17278, N 03-15-06/17262).

Перечень работ и должностей работников с тяжелыми условиями труда, указанных в п.п. 2-18 ч. 1 ст. 30 ФЗ N 400-ФЗ, определены в Списке 2 производств, работ, профессий, должностей и показателей с вредными и тяжелыми условиями труда, занятость в которых дает право на пенсию по возрасту (по старости) на льготных условиях (далее — Список 2), утверждены постановлением Кабинета Министров СССР от 26.01.1991 N 10 (смотрите постановление Правительства РФ от 16.07.2014 N 665).

В частности, в разделе XXIV Списка 2 поименованы работники учреждений здравоохранения, в том числе непосредственно обслуживающие больных в инфекционных учреждениях, отделениях, кабинетах (младший и средний медицинский персонал).

Отметим, что мы не встретили официальных документов или разъяснений, прямо определяющих статус инфекционного госпиталя.

Вместе с тем, согласно п. 6.1 Временных методических рекомендаций «Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19)» Версия 3 (03.03.2020) (утверждены Министерством здравоохранения РФ) медицинская помощь пациентам с COVID-19 осуществляется в виде скорой, первичной медико-санитарной и специализированной медицинской помощи в медицинских организациях и их структурных подразделениях, осуществляющих свою деятельность в соответствии с приказами Минздравсоцразвития России от 31.01.2012 N 69н «Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи взрослым больным при инфекционных заболеваниях» и от 05.05.2012 N 521н «Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи детям с инфекционными заболеваниями» с проведением всех противоэпидемических мероприятий.

Согласно п. 2 и п. 5 Порядка оказания медицинской помощи больным при инфекционных заболеваниях (утвержден приказом Минздравсоцразвития России от 31.01.2012 N 69н) специализированная помощь больным инфекционными заболеваниями оказывается в медицинских организациях или их структурных подразделениях, оказывающих специализированную медицинскую помощь, в том числе в инфекционных отделениях многопрофильных больниц и инфекционных больницах.

Исходя из положений приказа Министерства здравоохранения РФ от 19.03.2020 N 198н и приказа Министерства здравоохранения Амурской области от 23.03.2020 N 256, регулирующих порядок организации работы медицинских организаций в целях реализации мер по профилактике и снижению рисков распространения новой коронавирусной инфекции COVID-19, можно сделать вывод, что статус инфекционного стационара (госпиталя) имеют инфекционные отделения медицинских организаций (в том числе перепрофилированные), предназначенные для госпитализации пациентов с COVID-19 или с подозрением на COVID-19.

В этой связи полагаем, что в рассматриваемой ситуации в отношении выплат работникам инфекционного госпиталя, должности которых поименованы в Списке 2, необходимо начислять страховые взносы по дополнительному тарифу.

При этом необходимо учитывать, что на основании абзаца 11 ч. 2 ст. 212 ТК РФ работодатель обязан обеспечить проведение специальной оценки условий труда в соответствии с законодательством о специальной оценке условий труда.

В случаях, если разворачивание инфекционного госпиталя предполагает ввод в эксплуатацию вновь организованных рабочих мест, изменение технологического процесса, замену производственного оборудования, которые способны оказать влияние на уровень воздействия вредных и (или) опасных производственных факторов на работников, и т.п., медицинская организация должна провести внеплановую СОУТ (ч. 1 ст. 17 Федерального закона от 28.12.2013 N 426-ФЗ «О специальной оценке условий труда»).

Внеплановая СОУТ проводится на соответствующих рабочих местах в течение двенадцати месяцев со дня наступления случаев, указанных в п.п. 1 и 3 ч. 1 настоящей статьи, и в течение шести месяцев со дня наступления случаев, указанных в п.п. 2, 4-7 ч. 1 настоящей статьи (ч. 2 ст. 17 Закона 426-ФЗ).

При таких обстоятельствах считаем, что на выплаты работникам инфекционного госпиталя, должности которых поименованы в Списке 2, необходимо начислять страховые взносы по дополнительному тарифу в размере 6%. Основания для применения дифференцированных тарифов по п. 3 ст. 428 НК РФ у организации отсутствуют до проведения СОУТ рабочих мест инфекционного госпиталя.

Обращаем внимание, что сказанное является нашим экспертным мнением. Учитывая наличие в свободном доступе не всех организационно-распорядительных документов, регулирующих деятельность медицинских организаций, рекомендуем организации обратиться за официальными разъяснениями по заданному вопросу в Минтруд России и в Минфин России.

ИНФОРМАЦИЯ о включении в стаж, дающий право на досрочное пенсионное обеспечение, периодов соответствующей работы, предусмотренной пунктами 1

       В соответствии с частью 6 статьи 30 Федерального закона от 28 декабря 2013 г. № 400-ФЗ «О страховых пенсиях» (далее – Федеральный закон         № 400-ФЗ) периоды работы, предусмотренной пунктами 1 — 18 части 1 статьи 30 Федерального закона № 400-ФЗ, имевшие место после 1 января 2013 г., засчитываются в стаж, дающий право на досрочное пенсионное обеспечение, при условии начисления и уплаты страхователем страховых взносов по соответствующим тарифам, установленным статьей 428 Налогового кодекса Российской Федерации, а после проведения СОУТ — наличия вредного или опасного класса условий труда на соответствующих рабочих местах.

       На основании части 8 статьи 35 Федерального закона № 400-ФЗ до установления на соответствующих рабочих местах класса условий труда в порядке, предусмотренном Федеральным законом от 28 декабря 2013 г. № 426-ФЗ «О специальной оценке условий труда», периоды указанной работы засчитываются в стаж, дающий право на досрочное назначение страховой пенсии, при условии начисления и уплаты страхователем страховых взносов по дополнительным тарифам. При этом размер дополнительного тарифа страховых взносов определяется по действительным до 31 декабря 2018 г. результатам аттестации рабочих мест по условиям труда в отношении работников, на рабочих местах которых условия труда признаны вредными или опасными, либо по основаниям назначения досрочной страховой пенсии по старости: пункт 1 части 1 статьи 30, пункты 2 — 18 части 1 статьи 30 Федерального закона № 400-ФЗ (статья 428 Налогового кодекса Российской Федерации).

        Таким образом, при отсутствии результатов СОУТ на отдельных рабочих местах по работам, указанным в пунктах 1-18 части 1 статьи 30 Федерального закона № 400-ФЗ, например, в случае проведения внеплановой СОУТ при вводе в эксплуатацию вновь организованных рабочих мест, периоды такой работы, в том числе после 31 декабря 2018 г., могут засчитываться в стаж на соответствующих видах работ при условии начисления (уплаты) страхователем страховых взносов по дополнительным тарифам.

ОПУБЛИКОВАНО 15.01.2021 12:43ОБНОВЛЕНО 15.01.2021 14:57

Налоговый календарь на октябрь 2021 года

CD3-отрицательных естественных клеток-киллеров экспрессируют ε TCR как часть нового молекулярного комплекса

Подавление путей NF-κB и NKRF с помощью терапии индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками у мышей с травмой легких, вызванной вентилятором

Абстрактные

Фон

Механическая вентиляция с высоким дыхательным объемом, используемая у пациентов с острым повреждением легких (ОПЛ), может вызывать высвобождение воспалительных цитокинов, таких как макрофагальный воспалительный белок-2 (MIP-2), рекрутирование нейтрофилов и нарушение альвеолярного эпителиального и эндотелиального барьеров .Было показано, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) улучшают ОПЛ у мышей, но механизмы, регулирующие взаимодействие между механической вентиляцией легких и ИПСК, полностью не выяснены. Ядерный фактор каппа B (NF-κB) и фактор репрессии NF-κB (NKRF) были предложены для модуляции активации нейтрофилов, участвующих в ALI. Таким образом, мы предположили, что внутривенная инъекция ИПСК или кондиционированной среды, полученной из ИПСК (ИПСК-КМ), снизит инфильтрацию нейтрофилов, вызванную вентиляцией с высоким дыхательным объемом, окислительный стресс и продукцию MIP-2 через пути NF-κB / NKRF.

Методы

Самцов мышей C57BL / 6 в возрасте от 6 до 8 недель и весом от 20 до 25 г подвергали механической вентиляции с высоким дыхательным объемом (30 мл / кг) комнатным воздухом в течение от 1 до 4 часов после 5 × 10 ⁷ клеток / кг мышиных ИПСК или ИПСК-КМ. В качестве контрольных групп использовали невентилируемых мышей.

Результаты

Механическая вентиляция с высоким дыхательным объемом индуцировала увеличение интеграции ИПСК в поврежденные легкие мышей, проницаемость микрососудов, инфильтрацию нейтрофилов, малоновый диальдегид, продукцию MIP-2 и активацию NF-κB и NKRF.Индексы повреждения легких, включая воспаление, отек легких, патологические изменения ультраструктуры и нарушение функционального газообмена, вызванные механической вентиляцией легких, ослаблялись при введении ИПСК или ИПСК-КМ, что имитировалось фармакологическим ингибированием активности NF-κB с помощью SN50 или экспрессии NKRF с помощью NKRF. короткая интерферирующая РНК.

Выводы

Наши данные свидетельствуют о том, что терапия на основе ИПСК ослабляет повреждение легких, вызванное механической вентиляцией с высоким дыхательным объемом, по крайней мере частично, за счет ингибирования путей NF-κB / NKRF.Примечательно, что кондиционированная среда ИПСК показала положительные эффекты, равные таковым ИПСК.

Образец цитирования: Лю И-И, Ли Л-Ф, Ян С-Т, Лу К-Х, Хуанг С-С, Као К-С и др. (2013) Подавление путей NF-κB и NKRF с помощью терапии индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками у мышей с повреждением легких, вызванным вентилятором. PLoS ONE 8 (6): e66760. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760

Редактор: Раджасинг Джонсон, Медицинский центр Канзасского университета, Соединенные Штаты Америки

Получено: 13 марта 2013 г .; Одобрена: 12 мая 2013 г .; Опубликовано: 26 июня 2013 г.

Авторские права: © 2013 Liu et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Работа поддержана Национальным научным советом, Тайвань 101-2314-B-182A-088-MY3. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Острое повреждение легких (ОПЛ) и его наиболее тяжелое проявление, острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), характеризуются повышенной проницаемостью микрососудов и утечкой капилляров из-за тяжелого повреждения эпителия и эндотелия [1], [2]. Патологическое чрезмерное растяжение легких может происходить в здоровых частях легких у пациентов с ОРДС, использующих аппарат искусственной вентиляции легких. Искусственная вентиляция легких с высокими дыхательными объемами (V _T ) вызывает вызванное вентилятором повреждение легких (VILI), характеризующееся некардиогенным отеком легких, выбросом цитокинов и хемокинов, приводящим к притоку нейтрофилов [3].Привлечение воспалительных клеток с высокой вентиляцией V _T инициируется усиленной выработкой медиаторов воспаления, таких как воспалительный белок-2 мышиного макрофага (MIP-2), который является функциональным гомологом человеческого интерлейкина-8 (IL-8). у грызунов. Известно, что MIP-2, мощный хемокин для нейтрофилов, вносит свой вклад в патогенез VILI за счет рекрутирования этих лейкоцитов в легкие [4] — [5]. Таким образом, нацеливание на MIP-2 является потенциальным терапевтическим преимуществом при ALI.

Ядерный фактор-κB (NF-κB) играет ключевую роль в патогенезе иммунных и воспалительных реакций [6] — [7]. Активация NF-κB может привести к экспрессии MIP-2, фактора некроза опухоли-α (TNF-α) и интерлейкина-1β (IL-1β), которые активируют воспалительные каскады в ALI [8] — [9 ]. Ранее мы продемонстрировали, что высокая вентиляция V _T вызывает зависящее от времени увеличение активации NF-κB в модели VILI у мышей [10]. NF-κB играет важную роль в передаче воспалительного сигнала, вызываемого высвобождением IL-8 за счет вентиляции с высокой вытяжкой in vitro и in vivo [11] — [12].Held et al. также показали, что гипервентиляция запускает активацию NF-κB и вызывает высвобождение хемокинов и цитокинов из перфузированных легких, аналогично таковому у LPS у мышей [13]. Тем не менее, активность NF-κB контролируется на других уровнях, включая индуцибельное фосфорилирование, связывание коактиваторов и репрессоров [14].

Фактор репрессии NF-κB (NKRF) — это белок-глушитель транскрипционного фактора, который специфически противодействует базовой активности нескольких NF-κB-зависимых промоторов интерлейкина-8, интерферона β (IFN-β) и индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS). ) гены путем прямого связывания со специфическими последовательностями ДНК [15] — [16].МРНК NKRF конститутивно экспрессируются во всех протестированных тканях человека. Эндогенный NKRF связывается с белками NF-κB посредством прямого межбелкового взаимодействия и участвует в ингибировании базальной активности NF-κB [17]. Интересно, что NKRF, как было показано, обладает двойной ролью регуляции транскрипции IL-8 [18] — [19]. NKRF связывается с негативными регуляторными элементами (NRE) промотора IL-8 и напрямую взаимодействует с NF-κB, подавляя экспрессию гена IL-8 в базальном (нестимулированном) состоянии, но, наоборот, превращается в коактивирование с NF-κB, чтобы индуцируют транскрипцию IL-8 при стимуляции IL-1.

Недавние исследования продемонстрировали, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) могут быть получены из эмбриональных фибробластов мыши (MEF), а также из фибробластов взрослого человека посредством ретровирусной трансфекции четырех факторов транскрипции, Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, и Klf4 [20] — [22]. Морфология, пролиферативные способности, поверхностные антигены, экспрессия генов, эпигенетический статус генов, специфичных для плюрипотентных клеток, и теломеразная активность между эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК) и ИПСК были сходными [21] — [22].В дополнение к особенностям самообновления и дифференцировки на три зародышевых листка, ИПСК могут быть получены из соматических клеток пациента и избежать этических противоречий и возможности иммунного отторжения после трансплантации, вызванного ESCs [23]. Таким образом, ИПСК считаются хорошим кандидатом для клеточной терапии и используются для аутотрансплантации без риска отторжения. Исследование in vivo на крысах с ишемией головного мозга показало, что ИПСК обладают способностью к множественной дифференцировке и дополнительно снижают тяжесть инфарктов головного мозга [24].Наше недавнее исследование индуцированного липополисахаридом (LPS) ALI у мышей продемонстрировало, что терапия ИПСК оказывает противовоспалительное действие [25]. Интересно, что Curley et al. показали, что терапия мезенхимальными стволовыми клетками (МСК) усиливает восстановление легких после ВИЛИ посредством паракринного механизма, зависимого от фактора роста кератиноцитов [26]. Однако роль ИПСК при ВИЛИ не полностью очерчена и требует дальнейшего изучения.

В этой модели ALI, вызванной сильным механическим растяжением, у мышей мы исследовали взаимосвязь между высокой вентиляцией V _T , ИПСК и производной ИПСК кондиционированной средой (ИПСК-КМ), производством MIP-2, внутриклеточным окислительным стрессом и активацией Передача сигналов NF-κB и NKRF с использованием фармакологического ингибирования с помощью SN-50, специфического ингибитора NF-κB и короткой интерферирующей РНК (siRNA), нацеленной на NKRF.Мы предположили, что внутривенные инъекции ИПСК или ИПСК-КМ снизят инфильтрацию нейтрофилов, окислительный стресс, отек легких и продукцию MIP-2 у мышей, подвергшихся вентиляции с высоким уровнем V _T , посредством модуляции путей NF-κB и NKRF.

Результаты

Характеристика ИПСК, полученных из MEF

В наших настоящих и предыдущих исследованиях [25], [27] мы установили плюрипотентные ИПСК мыши без c-Myc и исследовали молекулярные характеристики и потенциал самонаведения трансплантированных ИПСК в поврежденном легком у мышей с ALI (рис. 1 и рис. S1). ).Мы также исследовали лечебные эффекты ИПСК и ИПСК-КМ и обнаружили, что ИПСК и ИПСК-КМ имели сходные эффекты в улучшении состояния мышей с ALI (рис. S2). Подробности см. В файле вспомогательной информации Text S1.

Рисунок 1. Характеристика трехгенных ИПСК мыши.

(A) Слева: трехгенные ИПСК мыши были способны образовывать колонии, похожие по внешнему виду на колонии ЭСК. Справа: колонии мышиных ИПСК с тремя генами были положительными по окрашиванию щелочным фосфатом (синий). (B) По сравнению с MEF анализ RT-PCR показал, что iPSC экспрессировали маркеры генов стволовых клеток (GAPDH: внутренний контроль).(C) Эти колонии ИПСК были положительными на SSEA-1 при иммунофлуоресцентном окрашивании. (D) Анализ микроматрицы экспрессии генов показал, что схожие профили экспрессии среди ИПСК с тремя генами, ЭСК и ИПСК с четырьмя генами с использованием иерархической тепловой карты. DAPI = 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол; ESC = эмбриональные стволовые клетки; ИПСК = индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; iPSC-ALP = iPSC, окрашенный щелочным фосфатом; MEF = эмбриональные фибробласты мыши; mESC = эмбриональные стволовые клетки мыши; 3F miPSC = три фактора транскрипции без iPSC мыши c-Myc; 4F miPSC = четыре фактора транскрипции iPSC мыши; SSEA-1 = специфический для стадии эмбриональный антиген 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.g001

ИПСК или ИПСК-КМ, ослабленные ВИЛИ, индуцированные высоким дыхательным объемом

Мы также использовали вентиляцию с высоким дыхательным объемом (V _T 30 мл; обозначается как V _T 30) окружающим воздухом в течение 4 часов для индукции ВИЛИ у самцов мышей C57BL / 6 и исследовали лечебные эффекты внутривенно введенных ИПСК. или iPSC-CM. Физиологические условия в начале и в конце вентиляции представлены в таблице 1.Гистологические исследования показали, что легкие животных, поврежденные механической вентиляцией легких на V _T 30, демонстрировали картину альвеолярного застоя, кровотечения, утолщения альвеолярной стенки и инфильтрации нейтрофилов, которые в значительной степени были устранены введением ИПСК или ИПСК-КМ ( Рисунок 2А). Количественная оценка повреждения легких подтвердила тяжелое повреждение, вызванное V _T 30, и терапевтический потенциал ИПСК или ИПСК-КМ (рис. 2В). A V _T 30 также увеличивал содержание синего красителя Эванса (EBD) в легких и отношение влажного к сухому, что указывает на капиллярную утечку.Микроскопическая гиперемия легких и повышение проницаемости капилляров, вызванные V _T 30, не были затронуты обработкой эмбриональных фибробластов мыши (MEF), но были существенно подавлены обработкой либо iPSCs, либо iPSC-CM (Фигуры 2C, 1D). Таким образом, эти данные предполагают, что ИПСК или ИПСК-КМ улучшают микроваскулярную утечку, отек легких и полное повреждение легких в модели VILI у мышей, индуцированной V _T 30. Количественная оценка повреждения легких (контроль, PBS = 0,46 ± 0,07, Контроль, SN50 = 0.38 ± 0,12, контроль, миРНК NKRF = 0,42 ± 0,08, контроль, инактивированный нагреванием iPSC-CM = 0,5 ± 0,1, P = 0,51), уровни EBD (контроль, PBS = 24,6 ± 1,4 нг / мг веса легких, контроль, SN50 = 22,2 ± 1,3 нг / мг веса легких, контроль, миРНК NKRF = 23,0 ± 1,8 нг / мг веса легких, контроль, термоинактивированный iPSC-CM = 25,3 ± 1,7 нг / мг веса легких, P = 0,14), влажный- отношение массы к сухой массе (контроль, PBS = 4,2 ± 0,5, контроль, SN50 = 4,1 ± 0,3, контроль, siRNA NKRF = 4,2 ± 0,2, контроль, термоинактивированные iPSC-CM = 4,5 ± 0,4, P = 0,41). в контрольной группе мышей без вентиляции.

Рис. 2. ИПСК или иПСК-CM, SN50 или миРНК NKRF снижали отек и повреждение легких, вызванные растяжением легких.

(A) Гистологическое исследование и (B) количественная оценка структурного повреждения дыхательных путей, вызванного высоким дыхательным объемом, и восстанавливающего эффекта ИПСК, ИПСК-КМ, SN50 или миРНК NKRF. Влияние введения ИПСК, ИПСК-CM, SN-50 или миРНК NKRF на (C) EBD легких и (D) соотношение влажного и сухого состояния у мышей дикого типа, получающих механическую вентиляцию легких с высоким дыхательным объемом. (V _T 30) показаны.SN50 (2 мг / кг) вводился внутрибрюшинно за 30 мин до ИВЛ. NKRF siRNA, 6 мг / кг, вводили интратрахеально за 48 ч до механической вентиляции. Показанные здесь данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение пяти независимых экспериментов. На панелях B, C и D * P <0,05 по сравнению с невентилируемым контролем, получавшим PBS, † P <0,05 по сравнению с V _T 30-вентилируемых мышей, получавших мошенничество или MEF. Масштабные линейки соответствуют 20 мкм. CM = кондиционированная среда ИПСК; EBD = синий краситель Эванса; ИПСК = индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; MEF = эмбриональные фибробласты мыши; NKRF = фактор репрессии NF-κB; PBS = физиологический раствор с фосфатным буфером; Мошенничество = ненаправленная скремблированная миРНК; миРНК = короткая интерферирующая РНК.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.g002

Снижение воспалительной реакции, связанной с ВИЛИ, с помощью ИПСК или ИПСК-CM

Затем мы идентифицировали нейтрофилы, основные воспалительные клетки, участвующие в процессе ALI [25]. Подсчет нейтрофилов и анализ миелопероксидазы (МПО) показали, что нейтрофилы мигрировали в поврежденные участки легких у мышей после механической вентиляции при V _T 30 по сравнению с невентилируемыми мышами (Фигуры 3A, 3B).Между тем, уровень малонового диальдегида (MDA), который является вторичным альдегидным продуктом перекисного окисления липидов, продуцируемых нейтрофилами, и уровни белка MIP-2 были повышены в ответ на лечение V _T 30 (Фигуры 3C, 3D), что указывает на увеличение окислительного стресс и активация хемоаттрактантов для нейтрофилов в этой модели. Примечательно, что ИПСК или ИПСК-КМ улучшали миграцию нейтрофилов, MDA и повышение уровня белка MIP-2 (рисунки 3C, 3D). Эти данные демонстрируют, что ИПСК или ИПСК-КМ могут ослаблять нейтрофильную инфильтрацию и воспалительные реакции в ВИЛИ, индуцированных высоким дыхательным объемом.

Рис. 3. ИПСК или ИПСК-CM, SN50 или миРНК NKRF ослабляют инфильтрацию нейтрофилов, вызванную растяжением легких, и оксидантный стресс.

Влияние введения ИПСК, ИПСК-КМ, SN50 или миРНК NKRF на (A) инфильтрацию нейтрофилов, (B) активность MPO, (C) активность MDA и (D) секрецию MIP-2 в ЖБАЛ в естественных условиях: показаны мыши, получающие искусственную вентиляцию легких с высоким дыхательным объемом (V _T 30). Показанные здесь данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение пяти независимых экспериментов. * Р <0.05 по сравнению с невентилируемым контролем, получавшим PBS, † P <0,05 по сравнению с V _T 30-вентилируемых мышей, получавших мошенничество или MEF. БАЛ = жидкость бронхоальвеолярного лаважа; MDA = малоновый диальдегид; MIP-2 = воспалительный белок макрофага-2; МПО = миелопероксидаза.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.g003

Вентиляция с высоким дыхательным объемом вызвала повышенную проницаемость микрососудов, воспаление и повреждение легких за счет активации NF-κB и NKRF, которые ингибировались siRNA SN50 и NKRF соответственно

NF-κB и NKRF, как было показано, модулируют активацию нейтрофилов, участвующую в ALI [10], [18].Иммуногистохимия показала, что эпителий дыхательных путей окрашен положительно на NKRF и фосфо-NF-κB после механической вентиляции при V _T 30 (Фигуры 4A, 4B, 5A, 5B). Для дальнейшего изучения взаимосвязи между NF-κB и NKRF в этой модели VILI мы затем использовали миРНК NKRF или фармакологическое ингибирование NF-κB, чтобы идентифицировать участие пути NF-κB / NKRF в VILI, индуцированном высоким дыхательным объемом. В соответствии с иммуногистохимическими данными, анализ вестерн-блоттинга показал, что экспрессия NKRF и фосфорилирование фосфо-NF-κB были увеличены у мышей, получавших ИВЛ при V _T 30, и что нокдаун NKRF и ингибирование NF-κB с помощью SN50 устраняли V _T . 30-индуцированная активация NKRF и фосфо-NF-κB (Фигуры 5C, 5D, 6A, 6B).Нокдаун NKRF и ингибирование NF-κB также предотвращали активацию мРНК NKRF в ответ на V _T 30 (Фигуры 6C, 6D). Введение SN50 или миРНК NKRF также аннулировало баллы повреждения легких, проницаемость микрососудов, приток нейтрофилов и продукцию MDA и MIP-2 (Фигуры 2 и 3). В соответствии с предыдущими сообщениями в ALI [10], [18], наши данные показывают, что передача сигналов NF-κB / NKRF также необходима для индукции VILI.

Рисунок 4. ИПСК или иПСК-CM, SN50 или миРНК NKRF подавляли экспрессию NKRF, индуцированную растяжением легких, в эпителии дыхательных путей.

Иммуногистохимия (A, × 400) и количественная оценка (B) экспрессии NKRF были взяты из легких V _T 30 вентилируемых мышей дикого типа, получавших iPSC, iPSC-CM, SN50 или siRNA NKRF. Представленные здесь данные являются репрезентативными результатами пяти независимых экспериментов. Темно-коричневый сигнал диаминобензидина, обозначенный стрелками, указывает на положительное окрашивание на NKRF в эпителии легких или интерстициальном, тогда как оттенки голубовато-коричневого цвета обозначают нереактивные клетки. Показанные здесь данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение пяти независимых экспериментов.* P <0,05 по сравнению с невентилируемым контролем, получавшим мошенничество, † P <0,05 по сравнению с V _T 30-вентилируемых мышей, получавших мошенничество или MEF. Масштабные линейки соответствуют 20 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.g004

Рис. 5. ИПСК или ИПСК-CM, SN50 или миРНК NKRF подавляли фосфорилирование NF-κB, вызванное растяжением легких.

Фосфорилирование NF-κB из легких V _T 30 вентилируемых мышей дикого типа, получавших iPSC, iPSC-CM, SN50 или NKRF siRNA, как обнаружено с помощью иммуногистохимии (A, B) (× 400) и количественного определения, (C, D) Вестерн-блоттинг.Представленные здесь данные являются репрезентативными результатами пяти независимых экспериментов. Произвольные единицы выражали как отношение фосфо-NF-κB к NF-κB. Темно-коричневый сигнал диаминобензидина, обозначенный стрелками, указывает на положительное окрашивание на фосфо-NF-κB в эпителии легких или интерстициальном, тогда как оттенки голубовато-коричневого цвета означают нереактивные клетки. Показанные здесь данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение пяти независимых экспериментов. * P <0,05 по сравнению с невентилируемым контролем, получавшим мошенничество, † P <0,05 по сравнению с V _T 30-вентилируемых мышей, получавших мошенничество, PBS или MEF.Масштабные линейки соответствуют 20 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.g005

Рис. 6. ИПСК или ИПСК-CM, SN50 или миРНК NKRF подавляли экспрессию мРНК NKRF и NKRF, индуцированную растяжением легких.

Экспрессия NKRF в легких V _T 30 вентилируемых мышей дикого типа, получавших iPSC, iPSC-CM, SN50 или siRNA NKRF, была обнаружена с помощью вестерн-блоттинга (A, B). Продемонстрированы эффекты введения iPSC, iPSC-CM, SN50 или siRNA NKRF на экспрессию мРНК NKRF (C, D).Представленные здесь данные являются репрезентативными результатами пяти независимых экспериментов. Произвольные единицы выражали как отношение мРНК NKRF к GAPDH или мРНК NKRF к GAPDH. Показанные здесь данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение пяти независимых экспериментов. * P <0,05 по сравнению с невентилируемым контролем, получавшим PBS или мошенничеством, † P <0,05 по сравнению с V _T 30-вентилируемых мышей, получавших мошенничество, PBS или MEF.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.g006

Ингибирование путей NF-κB / NKRF, индуцированных высокой вытяжной вентиляцией, с помощью ИПСК или ИПСК-КМ, которое имитировалось фармакологическим ингибированием активности NF-κB с помощью SN50 или экспрессии NKRF с помощью миРНК NKRF

Затем мы исследовали, опосредованы ли положительные эффекты, обеспечиваемые ИПСК или ИПСК-КМ, через пути NF-κB / NKRF.Мы определили, что введение ИПСК или ИПСК-КМ отменяет индуцированную V _T 30 активацию мРНК NKRF и их продукцию белка, что измеряли с помощью экспрессии генов и анализа вестерн-блоттинга (Фигуры 6A, 6B, 6C, 6D). Кроме того, ИПСК или ИПСК-КМ снижали индуцированное V _T 30 фосфорилирование NF-κB, как измерено с помощью вестерн-блоттинга (рис. 5C, 5D). Кроме того, положительное иммуногистохимическое окрашивание на NKRF или фосфо-NF-κB в эпителии легких или интерстициальном у мышей при V _T 30 было значительно ослаблено обработкой ИПСК или ИПСК-КМ (рисунки 4A, 4B и 5A, 5B) .Эти результаты показывают, что как ИПСК, так и ИПСК-КМ обладают способностью подавлять индуцированный V _T 30 окислительный взрыв и воспалительные реакции посредством ингибирования путей NF-κB / NKRF, что имитируется фармакологическим ингибированием активности NF-κB с помощью Экспрессия SN-50 или NKRF с помощью миРНК NKRF, как указано выше.

Ультрамикроструктурное восстановление с помощью ИПСК, ИПСК-КМ, SN50 или миРНК NKRF

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) использовалась для определения эффектов механической вентиляции и терапии ИПСК на ультраструктуру бронхиального эпителия (рис. 7А).Введение V _T 30 привело к нарушению ультрамикроструктуры дыхательных путей: уменьшению и нечеткости микроворсинок, увеличению секреторных пузырьков и сокращению ядер. Введение ИПСК или ИПСК-КМ, подобных SN50 или миРНК NKRF, последовательно восстанавливало ультраструктурную целостность дыхательных путей у мышей, подвергшихся вентиляции с высоким уровнем V _T , что фактически было продемонстрировано с помощью ТЕМ. Кроме того, соотношение PaO2 / FiO2, показатель функционального газообмена, было значительно ухудшено с V _T 30 по сравнению с невентилируемыми мышами (Рисунок 7B).Примечательно, что снижение оксигенации с помощью V _T 30 было значительно улучшено при введении iPSC, iPSC-CM, а также siRNA SN50 или NKRF.

Рис. 7. Восстановление ультрамикроструктуры и оксигенация с помощью iPSCs или iPSC-CM, SN50 или NKRF siRNA.

(A) Изображение на просвечивающем электронном микроскопе, показывающее восстановление ультрамикроструктуры дыхательных путей с помощью iPSC, iPSC-CM, SN50 или NKRF siRNA. (B) Было показано восстановление оксигенации с помощью ИПСК, ИПСК-СМ, SN50 или миРНК NKRF у мышей дикого типа, получавших вентиляцию с высоким дыхательным объемом.Показанные здесь данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение пяти независимых экспериментов. * P <0,05 по сравнению с невентилируемым контролем, получавшим PBS, † P <0,05 по сравнению с V _T 30-вентилируемых мышей, получавших мошенничество или MEF. Масштабные линейки соответствуют 2 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.g007

Обсуждение

Вентиляция с высоким дыхательным объемом у здоровых мышей использовалась для имитации чрезмерного растяжения менее травмированных и, следовательно, более податливых областей легкого, обнаруженных при ОРДС.Предыдущие исследования показали, что гиперэкспансия легкого является механизмом волютравмы в VILI [1] — [3]. Изменения проницаемости микрососудов были связаны с тяжелым эпителиальным и эндотелиальным повреждением, вызванным рекрутированием воспалительных клеток и производством растворимых факторов, связанных с биотравмой легкого. Хотя стратегия вентиляции с защитой легких дает положительные результаты, смертность от ОРДС остается достаточно высокой [28]. Следовательно, необходимы новые методы лечения, включая клеточную терапию, для дальнейшего снижения заболеваемости и смертности от этого синдрома.Механизмы лечения ИПСК или их растворимых факторов до конца не изучены и требуют изучения в доклинических исследованиях и дальнейших клинических испытаниях. В нашем предыдущем исследовании мы наблюдали положительное влияние ИПСК или ИПСК-КМ на ЛПС-индуцированный ALI у мышей [25]. На этой мышиной модели VILI мы продемонстрировали, что высокая вентиляция V _T увеличивала отек легких, проницаемость микрососудов, инфильтрацию нейтрофилов, продукцию MIP-2 из БАЛ, внутриклеточный окислительный стресс и полное повреждение легких.Важно отметить, что ИПСК или ИПСК-КМ могут защитить мышей от повреждения легких, вызванного высокой вытяжной вентиляцией, и восстановить функциональный газообмен за счет улучшения оксигенации. Мы дополнительно исследовали роль NF-κB и NKRF в опосредовании положительных эффектов, обеспечиваемых iPSC или iPSC-CM в VILI, и обнаружили, что терапия на основе iPS-клеток снижает высокий уровень V _T , вызванный механической вентиляцией, окислительный стресс и воспалительный ответ за счет ингибирования NF. -κB / NKRF-MIP-2 (IL-8) передача сигналов.

Было установлено, что терапия стволовыми клетками с ИПСК демонстрирует эффективность при лечении церебрального инсульта, травмы спинного мозга и инфаркта миокарда [24], [29] — [30]; однако влияние ИПСК на ALI остается неизвестным.Повреждающий стимул в легких вызывает высвобождение фактора стромальных клеток (SDF) -1a, вторичного лимфоидного хемокина, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), цистеин-амино-цистеинового рецептора (CXCR) 4 и CXCR7, которые стимулируют Направление ИПСК в поврежденную ткань [31]. Благоприятные эффекты ИПСК обусловлены не только пластичностью приживления легких, но и их способностью секретировать паракринные факторы, которые регулируют проницаемость, воспаление и восстановление эндотелия и эпителия.В нашем предыдущем исследовании LPS-индуцированного ALI у мышей мы показали, что терапия ИПСК снижает приток нейтрофилов независимо от клеточного контакта [25]. Поскольку время, в течение которого ИПСК дифференцируются в мультипотентные предшественники легких и дыхательных путей, может составлять более одной недели [32], [33], а скорость приживления ИПСК в поврежденном легком у мышей с ALI составляет всего 4%, это последствия. растворимых факторов в iPSC-CM, которые модулируют процесс ослабления в независимом от клеточного контакта стиле [25].Накапливающиеся исследования LPS-индуцированного ALI у мышей, получавших мононуклеарные клетки костного мозга или МСК, продемонстрировали, что улучшение повреждения легких может быть связано с паракринными эффектами, несмотря на более низкий процент стволовых клеток, приживаемых в легкие [34] — [37]. Здесь мы продемонстрировали, что лечение ИПСК-КМ было столь же эффективным в обращении вспять воспаления легких, вызванного высоким дыхательным объемом, утечки микрососудов и патологического повреждения легких, как и ИПСК. Учитывая, что iPSC-CM, содержащие растворимые факторы, можно использовать для уменьшения VILI как iPSC за счет своего паракринного эффекта, а iPSC-CM считается заменой стволовых клеток для предотвращения высокого риска образования тератомы после трансплантации стволовых клеток.В противном случае в этом исследовании мы усовершенствовали нашу процедуру ИПСК для удаления онкогена путем создания эктопической трансфекции репрограммирующих факторов Oct4 / Sox2 / Klf4 без c-Myc, как описано ранее [27], и, таким образом, потенциал этих клеток в качестве клинического терапевтического средства. источник становится многообещающим.

В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что вентиляция с высоким уровнем V _T задействовала приток нейтрофилов, измеренный по инфильтрации нейтрофилов жидкости БАЛ и общей секвестрации нейтрофилов уровнями МПО в тканях легких, и увеличила концентрацию МДА, вторичного альдегидного продукта. перекисного окисления липидов, используемого в качестве маркера окислительного повреждения.Нейтрофилы, в основном хемоаттрактивные с помощью MIP-2, являются основными воспалительными клетками, участвующими в процессе VILI, и играют важную роль в генерации огромных активных форм кислорода (ROS) [38] — [40]. NF-κB может быть активирован как чувствительный к окислительному стрессу фактор транскрипции, необходимый для максимальной экспрессии многих цитокинов, участвующих в патогенезе ALI. Кроме того, связывающие элементы для NF-κB присутствуют в промоторных областях генов цитокинов, таких как MIP-2 (IL-8) [41]. Предыдущие исследования показали, что введение стероид-блокирующего NF-κB или специфического ингибитора NF-κB SN50 улучшает проницаемость микрососудов, приток нейтрофилов в альвеолярный просвет и провоспалительные цитокины во время VILI [10], [13].Здесь мы показали, что как ИПСК, так и ИПСК-КМ могут снижать индуцированную вентиляцией высокую активацию NF-κB V _T , тем самым предотвращая приток нейтрофилов в альвеолы, снижая количество MIP-2 и MDA, ослабляя альвеолярный эпителиальный капилляр. утечка и улучшила VILI. В соответствии с нашими результатами, Yang el al. описали, что трансплантация стромальных клеток костного мозга может защитить от вызванного паракватом острого повреждения легких за счет снижения активации NF-κB [42], а Yagi et al. продемонстрировали, что человеческие МСК обладают способностью ингибировать активацию NF-κB в условиях воспаления, стимулированного LPS [43].Вместе взятые, мы продемонстрировали, что ИПСК и ИПСК-КМ обладают антиоксидантной и противовоспалительной способностью уменьшать VILI за счет ослабления окислительного стресса и ингибирования активации NF-κB и его нижестоящих медиаторов воспаления.

Затем мы дополнительно исследовали, действует ли NKRF как коактиватор или репрессор, регулирующий NF-κB в условиях VILI. IL-8 действует как главный медиатор острого нейтрофил-опосредованного воспаления в ответ на механический клеточный стресс. Промотор гена IL-8 содержит элемент NF-κB, который необходим для активации во всех изученных типах клеток, но усиленная транскрипционная активность, индуцированная NF-κB, может дополнительно требовать фосфорилирования субъединиц, а также связывания коактиваторов [44].NKRF, повсеместно экспрессируемый фактор ядерной транскрипции, связывается с NRE промотора IL-8, специфически ингибируя транскрипционную активность белков NF-κB. Как уже отмечалось, в экспрессии гена IL-8 было обнаружено, что исключительно NKRF выполняет двойную функцию. Он подавляет базальную транскрипцию гена IL-8 в нестимулированных клетках. Вместе с NF-κB p65, NKRF действует как коактиватор, чтобы стимулировать экспрессию гена IL-8 в обработанных IL-1 эпителиальных клетках человека [15]. Поскольку IL-8 был всесторонне изучен как ген, контролируемый NKRF, мы поэтому изучили взаимодействие NKRF с NF-κB в регуляции продукции MIP-2 в VILI.Мы продемонстрировали, что как NKRF, так и NF-κB активировались при вентиляции с высоким растяжением по отдельности. Введение либо с использованием SN50, либо короткой интерферирующей РНК NKRF может ослабить высокий уровень V _T , вызванный вентиляцией ALI. Эти результаты показали, что взаимодействие NKRF с NF-κB, а не репрессия, вносит вклад в нижестоящие воспалительные каскады, индуцированные вентиляцией с высоким растяжением, и это открытие согласуется с двойной ролью NKRF в регуляции транскрипции IL-8. Вероятно, что NKRF может играть двойную роль в регуляции сигнального пути NF-κB, в зависимости от различных экспериментальных моделей e.g., хронические воспалительные заболевания дыхательных путей по сравнению с , острое повреждение легких, и различные типы клеток, например, гладкомышечные клетки дыхательных путей по сравнению с эпителиальными клетками дыхательных путей , расположение и время воздействия стимулов [45], [46]. В этом исследовании мы также продемонстрировали, что ИПСК или ИПСК-КМ могут снижать коактивацию NF-κB и NKRF, вызванную высоким дыхательным объемом, аналогично SN50 или РНК-интерференции NKRF, тем самым резко снижая последующий окислительный стресс и воспалительные реакции.

Поскольку ИПСК могут быть получены из собственных соматических клеток пациента, они обладают преимуществами, позволяющими избежать иммунного отторжения после трансплантации, а также этическими проблемами, вызываемыми ЭСК для целей будущего клинического использования [20] — [23].В отличие от ESC и iPS-клеток, MSC имеют ограниченную продолжительность жизни, стареют и имеют риск контаминации при культивировании in vitro [34]. Таким образом, ИПСК кажутся многообещающим источником стволовых клеток для трансплантации аутологичных клеток при определенных заболеваниях. Однако оптимальный путь доставки клеток еще предстоит определить. Предыдущие исследования терапии стволовыми клетками на мышах показали канцерогенность при прямом применении ЭСК человека [47] и замедлении применения ЭСК. Наши предыдущие исследования показали, что это безопасный способ доставки ИПСК внутривенно через хвостовую вену, и через 90 дней наблюдения не наблюдалось образования тератомы [25].Поскольку биотравма, вызванная сильной вытяжной вентиляцией, и последующее вовлечение нескольких органов могут сопровождаться VILI, внутривенный путь, используемый в этом исследовании, может быть предпочтительным подходом для оказания системного положительного эффекта, как отмечалось [48]. Тем не менее, риск образования тератомы по-прежнему вызывает беспокойство при терапии стволовыми клетками, и в будущем исследовании потребуется долгосрочное наблюдение за терапией ИПСК и изменение процедуры уточненных ИПСК.

У нашего исследования были ограничения. Стволовые клетки могут избежать клиренса иммунной системой хозяина с помощью механизмов, включающих низкую экспрессию белков главного комплекса гистосовместимости (MHC) I и II, а также отсутствие костимулирующих молекул Т-клеток, CD40, CD80 и CD86 [49].Однако недавние исследования показали, что MSC могут экспрессировать более высокие уровни белков класса MHC и могут вызывать ответ хозяина и приводить к отторжению трансплантата [50], [51]. Следует тщательно прояснить иммунологическую привилегию ИПСК. Во-вторых, МСК обладают мощными иммуносупрессивными эффектами, опосредованными зависимыми от контакта и независимыми от контакта механизмами посредством высвобождения растворимых факторов, включая IL-10, простагландин E2, фактор роста кератиноцитов, фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов, и антагонист рецептора IL-1. [35], [49] — [51].Наборы цитокинов и количественный анализ растворимых медиаторов ИПСК-КМ помогут нам идентифицировать эти полезные медиаторы в терапии стволовыми клетками. В-третьих, Lee et al. описали терапевтический потенциал МСК на двух человеческих моделях ALI, включая препарат ex vivo человеческого легкого и первичные культуры человеческих клеток альвеолярного эпителия типа II, поврежденных воспалительными инсультами [49]. Но применение персонализированной терапии ИПСК у критически больных пациентов с ОПЛ требует технологических инноваций, таких как быстрый сбор и быстрое распространение трансплантированных ИПСК.Клинические испытания будут необходимы для определения реалистичных эффектов терапии на основе ИПСК в острой и репаративной фазах у пациентов с ОРДС, использующих аппарат искусственной вентиляции легких в ближайшем будущем. Пути, участвующие в повреждении легких, вызванном эндотоксином и вентилятором, различаются. При индукции повреждения легких LPS увеличение количества повреждений легких LPS вызывает генерализованное воспаление, главным образом, в эндотелиальных клетках легкого; однако механическое растяжение, вызванное вентилятором, ведет к дестабилизации альвеолярно-эпителиального и капиллярно-эндотелиального барьеров, что приводит к увеличению проницаемости сосудов и отеку легких [52].

Выводы

Рабочая группа Национального института сердца, легких и крови по ОРДС определила для изучения молекулярной основы повреждения легких, вызванного механическим стрессом, плодотворную область будущих исследований, поскольку ВИЛИ может привести к системной транслокации цитокинов и полиорганной недостаточности в клинические условия [53]. Используя модель in vivo мыши VILI, мы продемонстрировали, что повреждение легких, вызванное высокой вентиляцией V _T , было связано с притоком нейтрофилов, окислительным стрессом, повреждением альвеолярного эпителия-капилляров и продукцией MIP-2.Это тяжелое воспаление, отек, патологическое разрушение и нарушение газообмена поврежденных легких ослаблялись либо внутривенными ИПСК, либо ИПСК-КМ, и, по крайней мере частично, опосредовались ингибированием путей NF-κB / NKRF. Примечательно, что ИПСК-КМ показал сопоставимые эффекты, аналогичные эффектам ИПСК, и кондиционированная среда, содержащая растворимые факторы, заслуживает дальнейших исследований. Понимание положительных эффектов терапии ИПСК, связанных с подавлением сигнального пути NF-κB / NKRF и воспалительными реакциями, может позволить прояснить биомолекулярные механизмы, регулирующие VILI, и дать представление о новом терапевтическом варианте для ALI / ARDS.

Материалы и методы

Этика экспериментальных животных

Самцов мышей C57BL / 6 в возрасте от 6 до 8 недель и весом от 20 до 25 г были получены из Национального центра лабораторных животных (Тайбэй, Тайвань). Исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здоровья. Протокол был одобрен Комитетом по уходу и использованию животных Мемориальной больницы Чанг Гун (номер разрешения: 2011093005).Все операции проводились под анестезией кетамином и ксилазином, и были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму страдания. Экспериментальная группа животных и процедуры, использованные в этом исследовании, приведены в таблице 2.

Протокол вентилятора

Мы использовали нашу установленную мышиную модель VILI, как описано ранее [5]. Вкратце, трахеостомия была выполнена под общей анестезией с внутрибрюшинным введением кетамина (90 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг), затем кетамина (0,1 мг / г / ч) и ксилазина (0.01 мг / г / ч) со скоростью 0,09 мл / 10 г / ч путем непрерывной внутрибрюшинной инфузии самцам мышей C57BL / 6. Мышей помещали в положение лежа на спине на обогревающее одеяло, а затем прикрепляли к аппарату искусственной вентиляции легких Гарвардского университета, модель 55-7058 (Harvard Apparatus, Холлистон, Массачусетс), который был запрограммирован на введение 30 мл / кг с частотой 65 вдохов за одно дыхание. мин, в течение 1–4 ч при дыхании окружающим воздухом с нулевым давлением в конце выдоха. Дыхательный объем, выдаваемый аппаратом ИВЛ, подтверждался вытеснением жидкости из перевернутого калибровочного цилиндра.Был проведен непрерывный мониторинг CO ₂ в конце выдоха с помощью микрокапнографа (Columbus Instruments, Columbus, OH), и была выбрана частота дыхания 135 вдохов в минуту для 6 мл / кг и 65 вдохов в минуту для 30 мл / кг. с CO ₂ в конце выдоха при 30-40 мм рт. Пиковое давление на вдохе в дыхательных путях измеряли с помощью усилителя датчика давления (Gould Instrument Systems, Valley View, OH), подключенного к трубке на проксимальном конце трахеостомы. Среднее артериальное давление контролировалось каждый час во время механической вентиляции с использованием того же усилителя датчика давления, подключенного к 0.Полиэтиленовый катетер диаметром 61 мм (внутренний диаметр 0,28 мм), оканчивающийся в общей сонной артерии. Один час механической вентиляции использовали для RT-PCR и вестерн-блоттинга, а 4 часа использовали для продукции MIP-2, подсчета клеток, воды в легких, синего красителя Эванса, миелопероксидазы, свободных радикалов, электронной микроскопии и гистопатологического окрашивания. на основании предыдущих исследований [5], [10]. Контрольных мышей без вентиляции подвергали анестезии и немедленно умерщвляли. В конце периода исследования гепаринизированную кровь отбирали из артериальной линии для анализа газов артериальной крови, а затем мышей умерщвляли.

Эмбриональные фибробласты мыши (MEF), ИПСК и кондиционированная среда

ИПСК мыши были получены из неперепрограммированных MEF, полученных от мышей C57BL / 6. ИПСК были перепрограммированы трансдукцией ретровирусных векторов, кодирующих четыре фактора транскрипции, Oct-4, Sox2 и Klf4, как описано ранее [25], [27]. MEF (5 × 10 ⁷ клеток / кг, суспендированных в фосфатно-солевом буфере (PBS)), ИПСК (5 × 10 ⁷ клеток / кг, суспендированных в PBS), кондиционированная среда (200 мкл) из ИПСК, или PBS (200 мкл) вводили через хвостовую вену за 1 час до механического растяжения, основываясь на наших настоящих и предыдущих исследованиях зависимости зависимости от дозы, которые показали, что 5 × 10 ⁷ клеток / кг ИПСК и 200 мкл ИПСК-КМ улучшили повреждение легких и улучшился приток нейтрофилов ([25] и рисунок S3).Для тепловой инактивации кондиционированные среды обрабатывали при 95 ° C в течение 15 мин [54]. Подробности приведены в файле вспомогательной информации Text S1.

Короткое введение интерферирующей РНК

Однократная доза 6 мкг / г направленной siRNA NKRF Stealth или не направленной siRNA Stealth (скремблированная siRNA, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) в липофектамин RNAiMAX вводилась интратрахеально за 48 ч до механической вентиляции. Дозировка была выбрана на основе наших исследований зависимости реакции от дозы, которые показали, что 6 мкг / г ингибируют активность NKRF.

Фармакологический ингибитор

Ингибитор NF-κB (SN-50, Calbiochem, Сан-Диего, Калифорния) 2 мкг / г в PBS вводили внутрибрюшинно за 30 мин до вентиляции на основании наших исследований зависимости реакции от дозы, которые показали, что 2 мкг / г ингибируют активность NF-κB [10 ].

Измерение малонового диальдегида

Легкие гомогенизировали в забуференном фосфатом физиологическом растворе, содержащем бутилированный гидрокситолуол. MDA в белковых экстрактах измеряли с использованием набора для анализа Oxiselect TBARS (Cell Biolabs, Сан-Диего, Калифорния), содержащего вещества, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой.Каждый образец анализировали в двух экземплярах и выражали в мкмоль / г белка в соответствии с инструкциями производителя.

Иммуноблот-анализ

Легкие гомогенизировали в 3 мл лизирующего буфера (20 мМ HEPES pH 7,4, 1% Triton X-100, 10% глицерин, 2 мМ этиленгликоль-бис (β-аминоэтиловый эфир) -N, N, N ‘, N ‘-Тетрауксусной кислоты, 50 мкМ β-глицерофосфата, 1 мМ ортованадата натрия, 1 мМ дитиотреитола, 400 мкМ апротинина и 400 мкМ фенилметилсульфонилфторида), переносили в пробирки эппендорфа и помещали на лед на 15 мин.Пробирки центрифугировали при 14000 об / мин в течение 10 минут при 4 ° C и супернатант мгновенно замораживали. Неочищенные клеточные лизаты подбирали по концентрации белка, разделяли на 10% бис-акриламидном геле и электропереносили на мембраны Immobilon-P (Millipore Corp., Бедфорд, Массачусетс). Для анализа фосфорилирования NF-κB и общей экспрессии белков NF-κB и NKRF проводили вестерн-блоттинг с антителами к фосфо-NF-κB, NF-κB и NKRF (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Калифорния). Блоты проявляли с помощью усиленной хемилюминесценции (NEN Life Science Products, Бостон, Массачусетс).

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

Для выделения общей РНК ткани легких гомогенизировали в реагентах TRIzol (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Общую РНК (1 мкг) подвергали обратной транскрипции с использованием системы ПЦР GeneAmp 9600 (PerkinElmer, Life Sciences, Inc., Бостон, Массачусетс), как описано ранее [3]. Для ПЦР использовали следующие праймеры: NKRF, прямой праймер 5′-GTTCTGCCAAACACTGGACC-3 ‘и обратный праймер 5′-CTGAGATAGGCTCCCGTATGCCC-3′ и GAPDH в качестве внутреннего контроля, прямой праймер 5’-AATGCATCCTGCA CCACCAA-3 ‘и обратный праймер -GTAGCCATATTCATTGTCATA-3 ‘(Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA) [14].

Иммуногистохимия

Легкие залили парафином, разрезали на 4 мкм, депарафинизировали, антиген демаскировали в 10 мМ цитрате натрия (pH 6,0), инкубировали с первичным антителом козьего NKRF или кроличьего фосфо-NF-κB (1 × 100; Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус. , CA) и биотинилированное вторичное антитело козы против кролика (1 × 100) в соответствии с инструкциями производителя для иммуногистохимического набора (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

Анализ микрочипов и биоинформатика

экстрагировали из клеток с использованием реагента Trizol (Life Technologies, Bethesda, MD, USA) и колонки Qiagen RNAeasy (Qiagen, Valencia, CA, USA) для очистки.Тотальную РНК подвергали обратной транскрипции с помощью Superscript II РНКаза H-обратная транскриптаза (Gibco BRL) для создания меченных Cy3 и Cy5 (Amersham Biosciences Co., Piscataway, NJ, USA) зондов кДНК для контрольного и обработанного образцов соответственно. Меченые зонды гибридизовали с микрочипом кДНК, содержащим 10000 фрагментов кДНК, иммобилизованных клонами гена. Интенсивность флуоресценции мишеней Cy3 и Cy5 измеряли и сканировали отдельно с использованием сканера массива GenePix 4000B (Axon Instruments, Burlingame, CA, USA).Анализ данных выполняли с использованием программ GenePix Pro 3.0.5.56 (Axon Instruments, США) и GeneSpring GX 7.3.1 (Agilent, Пало-Альто, Калифорния, США). Среднее расстояние сцепления использовалось для оценки сходства между двумя группами профилей экспрессии генов, как описано ниже. Разница в расстоянии между двумя группами выборочных профилей экспрессии до третьей оценивалась путем сравнения соответствующих средних расстояний сцепления (среднего значения всех парных связей между членами двух рассматриваемых групп).Ошибка такого сравнения была оценена путем объединения стандартных ошибок (стандартное отклонение парных связей, деленное на квадратный корень из числа связей) задействованных средних расстояний связи. Классическое многомерное масштабирование (MDS) было выполнено с использованием стандартной функции программы R, чтобы обеспечить визуальное представление о том, как связаны различные группы выборок.

Гистопатологическая классификация VILI

Ткани легких контрольных мышей без вентиляции и мышей, подвергшихся вентиляции с высоким дыхательным объемом в течение 4 ч при дыхании комнатным воздухом, были удалены en bloc и заполнены 10% нейтральным забуференным формалином (pH 6.С 8 по 7.2) при давлении H ₂ O 30 см через полиэтиленовую трубку, введенную в трахею. Легкие залили парафином, сделали срезы толщиной 4 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином и просматривали из 10 неперекрывающихся полей одним исследователем, не знающим терапевтическую категорию мышей. Повреждение легкого оценивалось с использованием среднего балла по следующим параметрам: альвеолярный застой, кровотечение, инфильтрация нейтрофилов в воздушное пространство или стенку сосуда и толщина альвеолярной стенки [3].Оценка 0 соответствует нормальным легким; 1, легкая, поражение легких <25%; 2, умеренное поражение легких от 25% до 50%; 3 - тяжелое поражение легких от 50% до 75%; и 4 - очень серьезное поражение легких> 75%.

Просвечивающая электронная микроскопия

Легкие фиксировали 3% глутаровым альдегидом в 0,1 М какодилатном буфере (pH 7,4) в течение 1 ч при 4 ° C. Затем легкие подвергали последующей фиксации в 1% тетроксиде осмия (pH 7,4), дегидратировали в этаноле с постепенным изменением дозы и заключали в EPON-812. Тонкие срезы (70 нм) вырезали, окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и исследовали на просвечивающем электронном микроскопе Hitachi H-7500 EM (Hitachi, Ltd., Токио, Япония).

Статистическая оценка

Вестерн-блоты и мРНК NKRF были количественно определены с использованием анализатора изображений Национального института здравоохранения (NIH), ImageJ 1.27z (Национальный институт здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США) и представлены в виде произвольных единиц. Значения были выражены как среднее значение ± стандартное отклонение по крайней мере для пяти экспериментов. Данные анализа синего красителя Эванса, соотношения влажной и сухой массы легких, MIP-2, MPO, иммуногистохимического анализа и MDA были получены с использованием Statview 5.0 (Abascus Concepts Inc.Кэри, Северная Каролина, США; SAS Institute, Inc.). Все результаты вестерн-блоттинга и мРНК NKRF были нормализованы для контрольных мышей без вентиляции с комнатным воздухом. ANOVA использовался для оценки статистической значимости различий с последующим множественным сравнением с тестом Шеффа, и значение P <0,05 считалось статистически значимым. Коэффициенты регрессии рассчитывались с помощью простого регрессионного теста в Statview.

Анализ воды в легких, подсчет клеток, анализ EBD, анализ MPO и измерения MIP-2 были выполнены, как описано ранее [3], [5].

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Вентиляция с высоким дыхательным объемом увеличила количество ИПСК, попадающих в легкие. Репрезентативные микрофотографии (× 400) с иммунофлуоресцентным окрашиванием Hoechst (синий) замороженных срезов легких были получены от (A) контрольных мышей, не вентилируемых, и (B) мышей, подвергнутых ИВЛ при V _T 30 мл / кг в течение 4 ч с комнатным воздухом. . (C) Рассеянная плотность встроенных ИПСК в легком была определена количественно как среднее количество ИПСК, меченных Hoechst, в 10 неперекрывающихся полях срезов легких.Положительное окрашивание эпителия легкого и интерстиция синим цветом указано стрелками. Положительное окрашивание Hoechst в срезах легких мышей увеличивалось после механической вентиляции на V _T 30 мл / кг в течение 4 часов по сравнению с контрольными мышами, не подвергавшимися вентиляции. Показанные здесь данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение четырех независимых экспериментов. * P <0,05 по сравнению с невентилируемым контролем, получавшим PBS. Масштабные линейки соответствуют 20 мкм. ИПСК = индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; PBS = физиологический раствор с фосфатным буфером.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.s001

(TIF)

Рисунок S2.

LPS-индуцированный ALI у мышей, получавших iPSC / iPSC-CM и MEF / MEF-CM. Мы использовали интратрахеальную инъекцию ЛПС мышам C57BL / 6, чтобы вызвать острое повреждение легких. Чтобы исследовать лечебный эффект ИПСК и кондиционированной среды, полученной из ИПСК, мы далее вводили ИПСК, MEF, iPSC-CM и MEF-CM мышам с LPS-индуцированным ALI через хвостовую вену. Наши результаты показали, что как ИПСК, так и ИПСК-КМ значительно улучшили повреждение легких при LPS-индуцированном ALI у мышей по сравнению с таковыми у мышей, получавших MEF или MEF-CM.Важно отметить, что результаты анализа микроматрицы показали, что как ИПСК, так и ИПСК-КМ могут модулировать сходную экспрессию кластера генов в поражениях легких у мышей с ALI, индуцированных LPS, предполагая, что существует общий признак биомолекулярных сигнатур в ответ на LPS-индуцированные повреждение легких между ИПСК и кондиционированной средой ИПСК. ALI = острое повреждение легких; ИПСК-КМ = кондиционированная среда ИПСК; ЛПС = липополисахарид; MEF = эмбриональные фибробласты мыши; MEF-CM: кондиционированная среда MEF.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.s002

(TIF)

Рисунок S3.

ИПСК или ИПСК-КМ дозозависимо ослабляли повреждение легких, вызванное высоким дыхательным объемом, и инфильтрацию нейтрофилов. Влияние введения ИПСК или ИПСК-КМ на (A) количественную оценку структурного повреждения дыхательных путей и (B) инфильтрацию нейтрофилов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа у мышей дикого типа, получающих искусственную вентиляцию легких с высоким дыхательным объемом (V _T 30) показаны.Показанные здесь данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение четырех независимых экспериментов. * P <0,05 по сравнению с V _T 30 мышей, подвергнутых ИВЛ, получавших PBS.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066760.s003

(TIF)

Благодарности

Мы благодарим Вэй-Хань Линя и лабораторию микроскопа, Мемориальную больницу Чанг Гун, Линкоу за их помощь в эксперименте.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: L-FL Y-YL S-HC. Проведены эксперименты: L-FL Y-YL K-HL.Проанализированы данные: L-FL Y-YL. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты для анализа: C-TY K-CK C-CH. Написал статью: L-FL Y-YL S-HC.

Список литературы

1. 1. Ricard JD, Dreyfuss D, Saumon G (2003) Повреждение легких, вызванное вентилятором. Eur Respir J 22: 2с – 9с.
2. 2. Тремблай Л.Н., Слуцкий А.С. (2006) Вентиляторное повреждение легких: от скамьи к постели. Intensive Care Med 32: 24–33.
3. 3. Ли Л.Ф., Хуанг С.К., Линь Х.С., Цай Ю.Х., Куинн Д.А. и др.(2009) Нефракционированный гепарин и эноксапарин уменьшают повреждение легких, вызванное высокой вытяжной вентиляцией, — предполагаемый контролируемый эксперимент на животных. Crit Care 13: R108.
4. 4. Ли Л.Ф., Оуян Б., Чукроун Дж., Матял Р., Маскаренхас М. и др. (2003) IL-8, индуцированный растяжением, зависит от c-Jun Nh3-концевых и ядерных факторов, индуцирующих kappaB-киназы. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 285: L464–475.
5. 5. Li LF, Yu L, Quinn DA (2004) Инфильтрация нейтрофилов, вызванная вентиляцией, зависит от N-концевой киназы c-Jun.Am J Respir Crit Care Med 169: 518–524.
6. 6. Abraham E (2000) Активация NF-каппа B. Crit Care Med 28: N100–104.
7. 7. Zingarelli B, Sheehan M, Wong HR (2003) Ядерный фактор-каппа B как терапевтическая цель в медицине интенсивной терапии. Crit Care Med 31: S105–111.
8. 8. Райт Дж. Г., Кристман Дж. В. (2003) Роль ядерного фактора каппа B в патогенезе легочных заболеваний: значение для терапии. Am J Respir Med 2: 211–219.
9. 9.Мойн П., Макинтайр Р., Шварц М.Д., Канеко Д., Шенкар Р. и др. (2000) Механизмы регуляции NF-каппа B в альвеолярных макрофагах у пациентов с острым респираторным дистресс-синдромом. Шок 13: 85–91.
10. 10. Лю YY, Liao SK, Huang CC, Tsai YH, Quinn DA и др. (2009) Роль ядерного фактора-каппа B в увеличенном повреждении легких из-за взаимодействия между гипероксией и вентиляцией с сильным растяжением. Перевод Рез. 154: 228–240.
11. 11. Ning Q, Wang X (2007) Роль Rel A и IkappaB ядерного фактора kappaB в высвобождении интерлейкина-8 циклической механической деформацией в эпителиальных клетках альвеолярного типа II человека A549.Респирология 12: 792–798.
12. 12. Улиг У., Хайцма Дж. Дж., Гольдманн Т., Поэльма Д.Л., Лахманн Б. и др. (2002) Вентиляция-индуцированная активация пути митоген-активируемой протеинкиназы. Eur Respir J 20: 946–956.
13. 13. Held HD, Boettcher S, Hamann L, Uhlig S (2001) Вызванное вентиляцией высвобождение хемокинов и цитокинов связано с активацией ядерного фактора-каппа B и блокируется стероидами. Am J Respir Crit Care Med 163: 711–716.
14. 14.Froese N, Schwarzer M, Niedick I., Frischmann U, Köster M, et al. (2006) Врожденные иммунные ответы у мышей с дефицитом фактора репрессии NF-каппа B. Mol Cell Biol 26: 293–302.
15. 15. Nourbakhsh M, Hauser H (1999) Конститутивное молчание промотора IFN-бета опосредуется NRF (фактор репрессии NF-каппа B), ядерным ингибитором NF-kappaB. EMBO J 18: 6415–6425.
16. 16. Feng X, Guo Z, Nourbakhsh M, Hauser H, Ganster R, et al. (2002) Идентификация элемента отрицательного ответа в промоторе индуцибельной синтазы оксида азота (hiNOS) человека: роль репрессирующего фактора NF-каппа B (NRF) в базальной репрессии гена hiNOS.Proc Natl Acad Sci USA 99: 14212–14217.
17. 17. Реболл М.Р., Шведа А.Т., Бартельс М., Франке Р., Франк Р. и др. (2011) Картирование NRF-связывающих мотивов субъединицы p65 NF-каппа B. J Biochem 150: 553–562.
18. 18. Нурбахш М., Калбл С., Дорри А., Хаузер Х., Реш К. и др. (2001) Фактор репрессии NF-каппа B вовлечен в базальную репрессию и индуцированную интерлейкином (IL) -1 активацию транскрипции IL-8 путем связывания с консервативным элементом B-фланкирующей последовательности NF-каппа.J Biol Chem 276: 4501–4508.
19. 19. Hoffmann E, Dittrich-Breiholz ​​O, Holtmann H, Kracht M (2002) Множественный контроль экспрессии гена интерлейкина-8. J Leukoc Biol 72: 847–855.
20. 20. Park IH, Zhao R, West JA, Yabuuchi A, Huo H и др. (2008) Перепрограммирование соматических клеток человека до плюрипотентности с помощью определенных факторов. Природа 451: 141–146.
21. 21. Такахаши К., Танабе К., Охнуки М., Нарита М., Ичисака Т. и др. (2007) Индукция плюрипотентных стволовых клеток из фибробластов взрослого человека определенными факторами.Ячейка 131: 861–872.
22. 22. Ю. Дж., Водяник М. А., Смуга-Отто К., Антосевич-Бурже Дж., Френ Дж. Л. и др. (2007) Индуцированные линии плюрипотентных стволовых клеток, полученные из соматических клеток человека. Наука 318: 1917–1920.
23. 23. Такахаши К., Яманака С. (2006) Индукция плюрипотентных стволовых клеток из культур эмбриональных и взрослых фибробластов мыши с помощью определенных факторов. Ячейка 126: 663–676.
24. 24. Chen SJ, Chang CM, Tsai SK, Chang YL, Huang SS и др. (2010) Функциональное улучшение очаговой церебральной ишемии путем субдуральной трансплантации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с фибриновым клеем.Стволовые клетки Dev 19: 1757–1767.
25. 25. Ян К.Ю., Ши Х.С., Хау СК, Чен С.Й., Хсу Х.С. и др. (2011) Внутривенная доставка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток ослабляет вызванное эндотоксином острое повреждение легких у мышей. Сундук 140: 1243–1253.
26. 26. Керли Г.Ф., Хейс М., Ансари Б., Шоу Г., Райан А. и др. (2012) Мезенхимальные стволовые клетки улучшают восстановление и восстановление после повреждения легких у крыс, вызванного вентилятором. Грудь 67: 496–501.
27. 27. Ли Х.Й., Чиен Ю., Чен Ю.Дж., Чен С.Ф., Чанг Ю.Л. и др.(2011) Репрограммирование индуцировало плюрипотентные стволовые клетки в отсутствие c-Myc для дифференцировки в гепатоцитоподобные клетки. Биоматериалы 32: 5994–6005.
28. 28. Фуа Дж., Бадиа Дж. Р., Адхикари Н. К., Фридрих Дж. О., Фаулер Р. А. и др. (2009) Снизилась ли смертность от острого респираторного дистресс-синдрома со временем ?: Систематический обзор. Am J Respir Crit Care Med 179: 220–227.
29. 29. Tsuji O, Miura K, Okada Y, Fujiyoshi K, Mukaino M и др. (2010) Терапевтический потенциал правильно оцененных безопасных плюрипотентных стволовых клеток при повреждении спинного мозга.Proc Natl Acad Sci USA 107: 12704–12709.
30. 30. Мики К., Уэнака Х., Сайто А., Миягава С., Сакагути Т. и др. (2012) Биоинженерный миокард, полученный из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, улучшает сердечную функцию и ослабляет сердечное ремоделирование после хронического инфаркта миокарда у крыс. Стволовые клетки Transl Med 1: 430–437.
31. 31. Abreu SC, Antunes MA, Pelosi P, Morales MM, Rocco PRM (2011) Механизмы клеточной терапии при респираторных заболеваниях. Intensive Care Med 37: 1421–1431.
32. 32. Mou H, Zhao R, Sherwood R, Ahfeldt T., Lapey A, et al. (2012) Создание мультипотентных предшественников легких и дыхательных путей из ЭСК мыши и ИПСК муковисцидоза, специфичных для пациента. Стволовая клетка клетки 10: 385–397.
33. 33. Кадзик Р.С., Морриси Е.Е. (2012) Направление дифференцировки энтодермы легких в плюрипотентных стволовых клетках. Стволовая клетка клетки 10: 355–361.
34. 34. Араужо И.М., Абреу С.К., Марон-Гутьеррес Т., Круз Ф., Фуджисаки Л. и др. (2010) Терапия мононуклеарными клетками костного мозга при экспериментальном легочном и внелегочном остром поражении легких.Crit Care Med 38: 1733–1741.
35. 35. Рохас М., Сюй Дж., Вудс С.Р., Мора А.Л., Спирс В. и др. (2005) Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга в восстановлении поврежденного легкого. Am J Respir Cell Mol Biol 33: 145–152.
36. 36. Гупта Н., Су X, Попов Б., Ли Дж. В., Сериков В. и др. (2007) Внутрилегочная доставка мезенхимальных стволовых клеток костного мозга улучшает выживаемость и ослабляет вызванное эндотоксином острое повреждение легких у мышей. J Immunol 179: 1855–1863.
37. 37.Lee JW, Fang X, Gupta N, Serikov V, Matthay MA (2009) Аллогенные мезенхимальные стволовые клетки человека для лечения острого повреждения легких, вызванного эндотоксином E. coli, в перфузируемом ex vivo легком человека. Proc Natl Acad Sci USA 106: 16357–16362.
38. 38. Abraham E (2003) Нейтрофилы и острое повреждение легких. Crit Care Med 31: S195–199.
39. 39. Park HS, Kim SR, Lee YC (2009) Влияние окислительного стресса на заболевания легких. Респирология 14: 27–38.
40. 40.Сыркина О., Джафари Б., Хейлс К.А., Куинн Д.А. (2008) Окислительный стресс опосредует воспаление и апоптоз при повреждении легких, вызванном вентилятором. Респирология 13: 333–340.
41. 41. Asehnoune K, Strassheim D, Mitra S, Kim JY, Abraham E (2004) Участие активных форм кислорода в Toll-подобном рецепторе 4-зависимой активации NF-каппа B. J Immunol 172: 2522–2529.
42. 42. Ян Х, Вэнь И, Бин Дж, Хоу-Ю И, Ю-Тонг В. (2011) Защита мезенхимальных стволовых клеток костного мозга от острого повреждения легких, вызванного отравлением паракватом.Clin Toxicol 49: 298–302.
43. 43. Яги Х., Сото-Гутьеррес А., Наварро-Альварес Н., Нахмиас Й., Гольдвассер Я. и др. (2010) Реактивные стромальные клетки костного мозга ослабляют системное воспаление с помощью sTNFR1. Мол Тер 18: 1857–1864.
44. 44. Schmitz ML, Bacher S, Kracht M (2001) I kappa B-независимый контроль активности NF-kappa B посредством модулирующего фосфорилирования. Тенденции Biochem Sci 26: 186–190.
45. 45. Хо С.К., Ли К.Й., Чан Ю.Ф., Куо Л.В., Ито К. и др.(2009) Нейтрофильная эластаза подавляет синтез IL-8 / CXCL8 в клетках гладких мышц дыхательных путей человека посредством индукции фактора репрессии NF-каппа B. J Immunol 183: 411–420.
46. 46. Ли К.Ю., Хо С.К., Чан Ю.Ф., Ван Ч., Хуанг С.Д. и др. (2012) Снижение репрессирующего фактора ядерного фактора-κB: связь с системным воспалением при ХОБЛ. Eur Respir J 40: 863–873.
47. 47. Nussbaum J, Minami E, Laflamme MA, Virag JA, Ware CB и др. (2007) Трансплантация недифференцированных эмбриональных стволовых клеток мыши в сердце: формирование тератомы и иммунный ответ.FASEB J 21: 1345–1357.
48. 48. Matthay MA, Thompson BT, Read EJ, McKenna DH, Liu KD, et al. (2010) Терапевтический потенциал мезенхимальных стволовых клеток при тяжелом остром повреждении легких. Сундук 138: 965–972.
49. 49. Lee JW, Gupta N, Serikov V, Matthay MA (2009) Возможное применение мезенхимальных клеток при остром повреждении легких. Мнение эксперта Biol Ther 9: 1259–1270.
50. 50. Aggarwal S, Pittenger MF (2005) Мезенхимальные стволовые клетки человека модулируют ответы аллогенных иммунных клеток.Кровь 105: 1815–1822.
51. 51. Stagg J (2007) Иммунная регуляция мезенхимальными стволовыми клетками: две стороны медали. Тканевые антигены 69: 1–9.
52. 52. Hegeman MA, Hennus MP, van Meurs M, Cobelens PM, Kavelaars A, et al. (2010) Лечение ангиопоэтином-1 уменьшает воспаление, но не предотвращает повреждение легких, вызванное вентилятором. PLoS ONE 5: e15653.
53. 53. Маттай М.А., Циммерман Г.А., Эсмон Ч., Бхаттачарья Дж., Коллер Б. и др. (2003) Будущие направления исследований в области острого повреждения легких: резюме рабочей группы Национального института сердца, легких и крови.Am J Respir Crit Care Med 167: 1027–1035.
54. 54. Отте JM, Mahjurian-Namari R, Brand S, Werner I, Schmidt WE, et al. (2009) Пробиотики регулируют экспрессию ЦОГ-2 в эпителиальных клетках кишечника. Nutr Cancer 61: 103–113.

(PDF) Внутренние сигнатуры транскрипции NK-клеток связаны с ответом на терапию IFNΑ + ривабирин у пациентов с вирусом гепатита C

, мы подтверждаем, что различные сигнатуры генов

лежат в основе ранее описанных фенотипических различий.

множественных регуляторов транскрипции вовлечены в это

разнообразия врожденных ответов NK-клеток с присущими

детерминантам, преобладающими над факторами окружающей среды (т. Е. HCV)

.

Дополнительные файлы

Дополнительные файлы 1: Таблица S1. T-тест Стьюдента: SVR по сравнению с NR (p <0,005; FC> 1,5).

Список из 4–16 транскриптов, регулируемых у пациентов с УВО. Стенограммы упорядочиваются по порядку

по убыванию Fold Change (FC).

Дополнительный файл 2: Таблица S2. УВО по критерию Стьюдента по сравнению с НР (p <0,005;

FC <-1,5). Список из 60 транскриптов с пониженной регуляцией у пациентов с УВО.

Стенограммы упорядочиваются по убыванию Fold Change (FC).

Дополнительный файл 3: Таблица S3. Тест Стьюдента CV-HCV по сравнению с HD (p <0,005;

FC> 1,5 или Fc <-1,5). Список из 165 генов с повышенной и пониженной регуляцией

при CV-HCV по сравнению с HD. Стенограммы упорядочены по убыванию

Fold Change (FC).

Дополнительный файл 4: Таблица S4. Скрининг полиморфизма

rs12979860 IL28B в обучающих и проверяющих группах пациентов с ВГС.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Вклад авторов

MLA, HA, FMM и ADM разработали исследования и зарегистрировали клинических пациентов;

CS, AP и SM внесли вклад в набор новых пациентов; MLA, ADM, EW, FB, KM

и FMM провели исследования и проанализировали данные; З.Ы. участвовал в статистическом анализе

; LM, FM, DB, VDG и MS внесли критические предложения; MLA,

HA и ADM написали статью.Все авторы одобрили рукопись.

Выражение признательности

Настоящая работа частично поддержана Итальянской ассоциацией по делам

Ricerca sul Cancro (AIRC), Проекты Ministero della Salute Grant RF2006;

Проект Ricerca Oncologica 2006–08 Грант RO стратегический 3/07; Istituto

Superiore di Sanita (ISS) Национальная программа по борьбе со СПИДом Гранты

40G.41, 45G.11, 40D61, 40H69 и 40h33; и грант министра делла салют

RF-2010-2316197, а также внутренняя поддержка NIH.

Сведения об авторе

1

Департамент медицинских наук, Университет Генуи, Генуя, Италия.

2

Отделение онкологии, Johns Hopkins Medicine, CRB II, Room 506, 1550

Orleans Street, Baltimore, MD 21231, США.

3

Экспериментальный факультет

Медицина, Университет Генуи, Генуя, Италия.

4

Sidra Medical and Research

Center, Доха, Катар.

5

Istituto Giannina Gaslin, Генуя, Италия.

6

Отделение

Трансфузионной медицины, Клиника, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд,

США.

7

IRCCS Az.Osp.Univ. Сан-Мартино-IST Istituto Nazionale Ricerca sul

Cancro, Генуя, Италия.

8

Отделение биометрических исследований, Отделение рака

Лечение и диагностика, Национальный институт рака, Национальные институты здравоохранения

, Бетесда, Мэриленд, США.

9

Universita’degli Studi di Genova, Largo R Benzi

10, 16132 Генуя, Италия.

Получено: 24 ноября 2014 г. Принято: 4 февраля 2015 г.

Ссылки

1. Кисслинг Р., Кляйн Э., Вигзелл Х. «Естественные» клетки-киллеры у мышей. I. Цитотоксические клетки

со специфичностью в отношении клеток лейкемии Молони мыши. Специфичность и распределение

по генотипу. Eur J Immunol. 1975. 5: 112–7.

2. Вивье Э., Раулет Д.Х., Моретта А., Калиджури М.А., Зитвогель Л., Ланье Л.Л. и др.

Врожденный или адаптивный иммунитет? Пример естественных клеток-киллеров.Наука.

2011; 331: 44–9.

3. Моретта А., Боттино С., Витале М., Пенде Д., Кантони С., Мингари М.С. и др. Активировать

рецепторов и корецепторов, участвующих в опосредованном человеческими естественными клетками-киллерами цитолизе

. Анну Рев Иммунол. 2001; 19: 197–223.

4. Моретта А., Боттино С., Витале М., Пенде Д., Биассони Р., Мингари М.С. и др.

Рецепторы для молекул HLA класса I в естественных киллерных клетках человека. Annu Rev

Immunol. 1996; 14: 619–48.

5.Horowitz A, Strauss-Albee DM, LeipoldM, KuboJ, Nemat-GorganiN, DoganOC,

et al. Генетические и экологические детерминанты разнообразия NK-клеток человека

, выявленные методом массовой цитометрии. Sci Transl Med. 2013; 5: 208ра145.

6. Fauriat C, Long EO, Ljunggren HG, Bryceson YT. Регулирование продукции цитокинов и хемокинов человеческими NK-клетками

путем распознавания клеток-мишеней. Кровь.

2010; 115: 2167–76.

7. Сивори С., Пенде Д., Боттино С., Марченаро Е., Пессино А., Биассони Р. и др.NKp46

является основным запускающим рецептором, участвующим в естественной цитотоксичности свежих

или культивированных NK-клеток человека. Корреляция между поверхностной плотностью NKp46

и естественной цитотоксичностью в отношении аутологичных, аллогенных или ксеногенных клеток-мишеней

. Eur J Immunol. 1999; 29: 1656–66.

8. Витале М., Боттино С., Сивори С., Сансеверино Л., Кастрикони Р., Марченаро Э. и др.

NKp44, новая запускающая поверхностная молекула, специфически экспрессируемая

активированными естественными клетками-киллерами, участвует в лизисе опухолевых клеток, ограниченном неосновной гистосовместимостью

комплексом.J Exp Med. 1998. 187: 2065–72.

9. Биассони Р., Кантони С., Пенде Д., Сивори С., Паролини С., Витале М. и др. Человеческие

рецепторов и корецепторов естественных клеток-киллеров. Immunol Rev.2001; 181: 203–14.

10. Пенде Д., Кантони С., Ривера П., Витале М., Кастрикони Р., Марченаро С. и др. Роль

NKG2D в лизисе опухолевых клеток, опосредованном человеческими NK-клетками: сотрудничество с

рецепторами естественной цитотоксичности и способность распознавать опухоли неэпителиального происхождения

.Eur J Immunol. 2001; 31: 1076–86.

11. Витале М., Делла Кьеза М., Карломаньо С., Пенде Д., Арико М., Моретта Л. и др.

NK-зависимое созревание DC опосредуется TNFalpha и IFNgamma

, высвобождаемыми при включении триггерного рецептора NKp30. Кровь.

2005; 106: 566–71.

12. Пенде Д., Кастрикони Р., Романьани П., Спаггиари Г.М., Марченаро С., Дондеро

А и др. Экспрессия лигандов DNAM-1, нектина-2 (CD112) и рецептора полиовируса

(CD155) на дендритных клетках: актуальность для взаимодействия естественных киллеров и дендритных клеток

.Кровь. 2006; 107: 2030–6.

13. Мавилио Д., Ломбардо Дж., Кинтер А., Фогли М., Ла Сала А., Ортолано С. и др.

Характеристика дефектного взаимодействия между подмножеством естественных

клеток-киллеров и дендритных клеток при ВИЧ-1-инфекции. J Exp Med. 2006; 203: 2339–50.

14. Фоли Б., Кули С., Вернерис М. Р., Питт М., Куртсингер Дж., Луо XH и др.

Реактивация цитомегаловируса после аллогенной трансплантации способствует длительному увеличению на

образованных естественных клеток-киллеров NKG2C (+) с мощной функцией

.Кровь. 2012; 119: 2665–74.

15. Петитдеманж С., Бекварт П., Вокье Н., Безиат В., Дебре П., Леруа Е.М. и др.

Нетрадиционный профиль репертуара отпечатывается во время острой инфекции чикунгунья

для поляризации естественных клеток-киллеров в сторону цитотоксичности. PLoS Pathog.

2011; 7: e1002268.

16. Бьоркстрем Н.К., Линдгрен Т., Штольц М., Фориат С., Браун М., Эвандер М. и др.

Быстрое распространение и длительное сохранение повышенного количества NK-клеток у

человек, инфицированных хантавирусом.J Exp Med. 2011; 208: 13–21.

17. Мандельбойм О., Либерман Н., Лев М., Пол Л., Арнон Т.И., Бушкин Ю. и др.

Распознавание гемагглютининов на инфицированных вирусом клетках с помощью NKp46 активирует лизис

человеческими NK-клетками. Природа. 2001; 409: 1055–60.

18. Драги М., Пашине А., Санджанвала Б., Гендзехадзе К., Кантони С., Косман Д.,

и др. Распознавание инфицированных дендритных клеток NKp46 и NKG2D необходимо

для активации NK-клеток в ответе человека на инфекцию гриппа.J Immunol.

2007; 178: 2688–98.

19. Газит Р., Груда Р., Эльбойм М., Арнон Т.И., Кац Г., Ахдаут Х. и др. Смертельная инфекция гриппа

в отсутствие гена рецептора естественных клеток-киллеров Ncr1. Nat

Immunol. 2006; 7: 517–23.

20. Маррас Ф., Боззано Ф., Де Мария А. Участие активирующих рецепторов NK-клеток

и их модуляция в иммунитете к патогенам. J Biomed Biotechnol.

2011 г .; 2011 г .: 152430.

21. Голден-Мейсон Л., Кокс А.Л., Рэндалл Д.А., Ченг Л., Розен Х.Р.Повышенная естественная цитотоксичность клеток-киллеров

и экспрессия NKp30 защищает от инфицирования вирусом гепатита C

у лиц с высоким риском и подавляет репликацию in vitro.

Гепатология. 2010; 52: 1581–9.

22. Ванкаялапати Р., Гарг А., Поргадор А., Гриффит Д.Э., Клукар П., Сафи Х. и др. Роль

рецепторов, активирующих NK-клетки, и их лигандов в лизисе мононуклеарных

фагоцитов, инфицированных внутриклеточной бактерией. J Immunol.2005; 175: 4611–7.

23. Боццано Ф., Наси М., Бертончелли Л., Немес Э., Прати Ф., Маррас Ф. и др. Фенотип NK-клеток

при прерывании лежит в основе широко расходящейся продолжительности прерывания антиретровирусной терапии под контролем CD4 +

. Int Immunol. 2011; 23: 109–18.

24. Маррас Ф., Никко Э., Боццано Ф., Ди Бьяджо А., Дентоне С, Понтали Э и др. Природные

киллерных клеток у ВИЧ-инфицированных пациентов экспрессируют активированный эффекторный фенотип

Ascierto et al.Журнал трансляционной медицины (2015) 13:77 Страница 10 из 11

Раки | Бесплатный полнотекстовый | Систематический обзор и метаанализ, сравнивающий резекцию печени с помощью устройства на основе радиочастотного излучения Habib ™ -4X с использованием метода зажима-раздавливания

1. Введение

Несмотря на наличие большого количества литературы по резекции печени, что интересно, поиск наилучшей техники и инструмента все еще продолжается. Настоящий метаанализ был предпринят для анализа имеющихся данных о клинической эффективности или исходах после резекции печени с помощью Habib ™ -4X по сравнению с техникой зажима-раздавливания.

4. Обсуждение

В условиях продолжающихся споров по поводу самого безопасного и наиболее эффективного метода резекции печени настоящий метаанализ объединяет и количественно оценивает прямые доказательства, имеющиеся в исследованиях, и обеспечивает систематическую оценку и статистический анализ всех доступных результатов с помощью RF резекция по сравнению с техникой резекции печени зажимом-раздавливанием. Насколько нам известно, это первый метаанализ, в котором сравниваются результаты резекции печени, выполненной аппаратом Habib ™ -4X на основе RF, с техникой зажима-раздавливания и красноречиво обрисовывается более широкая картина этой практики с упором на кровопотерю и переливание крови и последующие осложнения.Анализ данных был проведен с использованием строгой методологии, в результате которой размер выборки составил 543 пациента, которым была выполнена резекция печени методом CC, и 491 пациент с помощью устройства Habib ™ -4X на основе RF и продемонстрировали интригующие результаты. Кроме того, в ходе обсуждения мы осветили наши выводы и влияние обоих хирургических методов на резекцию печени.

Обзор доступной литературы в настоящем метаанализе показал отсутствие различий в отношении абдоминального абсцесса в сравниваемых группах. Анализ данных всех включенных в индексный метаанализ исследований показал утечку желчи; тем не менее, в настоящем метаанализе не наблюдалось статистически значимой разницы, что согласуется с данными о частоте утечки желчи ~ 10% в литературе.

Кроме того, анализ объединенных данных не выявил статистически значимых различий в отношении PHLF, плеврального выпота, пребывания в больнице, общей заболеваемости и смертности. Эффективность устройства Habib ™ -4X на основе RF была продемонстрирована в нескольких опубликованных статьях, и результаты были замечательными как для пациентов с циррозом, так и без него; правдоподобные объяснения этих наблюдаемых преимуществ вписаны в основные принципы, на которых было построено это устройство. RF-индуцированная коагуляция не только ограничивает кровопотерю и потребность в переливании крови, но также предотвращает любое ишемическое повреждение паренхимы печени.

Настоящий метаанализ имеет несколько ограничений, которые необходимо признать, и следует проявлять осторожность при интерпретации этих результатов, особенно из-за наблюдаемой клинической гетерогенности между включенными исследованиями. Модель случайных эффектов для анализа объединенных данных использовалась для ограничения тени неоднородности. Предвзятость публикации не могла быть исключена из-за ограниченного числа включенных исследований. Здесь мы смогли идентифицировать только четыре испытания, и, таким образом, дальнейшие крупномасштабные испытания предоставят столь необходимые данные, которые позволят сделать более твердые выводы и прояснить роль устройства Habib ™ -4X на основе RF в резекции печени.Несмотря на эти ограничения, этот метаанализ показал безопасность и преимущества устройства для резекции печени Habib ™ -4X с точки зрения снижения кровопотери и уменьшения потребности в переливании крови.

428 Parker St # 2, Нью-Бедфорд, Массачусетс 02740 | MLS # 71997784

• Полы: дерево, плитка, ламинат
• Деревянный пол, кафельный пол, ламинат

• Количество зон обогрева: 1
• Газовое отопление
• Центральное кондиционирование

• Парковочные функции: Выкл. -Улица
• Кол-во парковочных мест: 1
• Кол-во мест в гараже: 1
• Гараж: Пристроенный гараж

• Вода: Городская вода
• Канализация: Городская канализация
• Горячая вода: природный газ, Резервуар

• Год постройки Приблизительно
• Год постройки Источник: Public Record
• Внешний вид: Деревянный Внешний вид

• Лот: 217A
• Номер участка: M: 0062 L: 0217-A
• Зонирование: RB

• Кол-во комнат: 4
• Кол-во этажей: 1
• Уровень квартиры: 1
• кв.Фут .: 952.00
• кв. Ft. Источник: Field Card
• Без гарантии
• Имущество, подходящее для круглогодичного проживания

• Характеристики электроснабжения: автоматические выключатели
• Подключение газовой сети, подключение стиральной машины
• Автоматические выключатели

• Налоги: 1 949 долларов США
• Налоговый год: 2,016
• ИНН: 2893581

• Оценка: 118 200 долларов США
• Условия: Обычный фиксированный

• Направление: Rockdale Ave.West on Parker (выше Рокдейла)
• Карта: 0062
• UFFI: №
• Страница: 145
• Книга: 11362

• Ожидаемая дата продажи: среда, 31 августа 2016 г.

• Дата получения объявления: понедельник , 2 мая 2016 г. 9:56 AM
• Раскрытие информации
• Раскрытие информации: счетчик общей воды
• Дата истечения срока действия: суббота, 31 декабря 2016 г.
• Принадлежащий кредитору: №
• Требуется разрешение кредитора для короткой продажи: №

• Отображение инструкций: позвоните или отправьте текстовое сообщение (508) 989-4073 для быстрого ответа.Для предложений см. Инструкции по предложениям.
• Ведущий показывает: показы с сопровождением, требуется запись, другое (см. Примечания)
• Представитель покупателя показывает: показы с сопровождением, требуется назначение, другое (см. Примечания)
• Предлагается суб-агентство: №

Информация о собственности предоставлена ​​MLS PIN при последнем включении в список в 2016 году. Эти данные могут не совпадать с общедоступными записями. Учить больше.

Молекулярная визуализация pH внеклеточной опухоли для выявления влияния локорегиональной терапии на микросреду рака печени

Abstract

Цель: Установить парадигмы молекулярной визуализации на основе магнитного резонанса (MR) для неинвазивного мониторинга внеклеточного pH (pH _e ) в качестве функционального суррогатного биомаркера метаболических изменений, вызванных локорегиональной терапией рака печени.

Дизайн эксперимента: Тридцать два новозеландских белых кролика с опухолью VX2 прошли продольную визуализацию на клинических 3Т-МРТ и компьютерных томографах до и в течение 2 недель после полной традиционной трансартериальной химиоэмболизации (cTACE) с использованием этиодированного масла (липиодола) и доксорубицин. МР-спектроскопическая визуализация (MRSI) использовалась для картирования pH _и . Многопараметрическая МРТ и КТ были выполнены для количественной оценки увеличения опухоли, диффузии и покрытия липиодолом опухоли после терапии.Кроме того, неполный cTACE с уменьшенными дозами химиоэмболии применялся для имитации недостаточного лечения и использования картирования pH _и для обнаружения жизнеспособных остатков опухоли. Результаты визуализации коррелировали с гистопатологическими маркерами, указывающими на метаболическое состояние (HIF-1α, GLUT-1 и LAMP-2) и жизнеспособность (ядерный антиген пролиферирующих клеток и мечение ник-конца терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP).

Результаты: Необработанные опухоли VX2 продемонстрировали значительно более низкий pH _и (6.80 ± 0,09), чем паренхима печени (7,19 ± 0,03, P <0,001). Повышенная регуляция HIF-1α, GLUT-1 и LAMP-2 подтвердила фенотип гипергликолитической опухоли и ацидоз. Постепенное увеличение pH опухоли _и в направлении нормализации, аналогичное паренхиме, было обнаружено в течение 2 недель после полного cTACE, что коррелировало со снижением детектируемости метаболических маркеров. Напротив, картирование pH _и после неполного cTACE показало как кислые жизнеспособные остатки, так и увеличенное значение pH опухоли _и обработанных областей.Мультимодальная визуализация выявила стойкую деваскуляризацию опухоли сразу после завершения cTACE, постепенно увеличивающийся некроз и устойчивое покрытие опухоли липиодолом.

Выводы: Картирование pH _e на основе MRSI может служить инструментом продольного мониторинга жизнеспособных опухолей. Поскольку большинство опухолей печени являются гипергликолитическими, создавая ацидоз микроокружающей среды, нормализация pH опухоли _и , вызванная терапией, может использоваться в качестве функционального биомаркера для положительного терапевтического результата.

Трансляционная релевантность

Метаболический сдвиг раковых клеток в сторону гипергликолитического фенотипа представляет собой широко признанный принцип канцерогенеза. Последующее закисление микроокружения опухоли (TME) из-за выхода протонов и лактата связано с агрессивным ростом опухоли и потенциально способствует устойчивости к противоопухолевой терапии, например, за счет стимулирования иммуноэвазивных механизмов. В этом трансляционном исследовании использовалась многопараметрическая МРТ на клинических сканерах для установления неинвазивной количественной характеристики TME с особым акцентом на внеклеточный pH в модели ортотопической опухоли кролика для рака печени.Эта новая парадигма визуализации была использована для длительного мониторинга эффектов локорегиональной терапии и выявила частичную нормализацию ацидоза опухоли. Результаты показывают, что визуализация pH является функциональным суррогатным биомаркером, позволяющим неинвазивно обнаруживать и контролировать жизнеспособную и метаболически активную опухоль в контексте терапии рака. Результаты предполагают, что следует рассмотреть возможность проведения клинических испытаний по изучению применения pH-картирования у пациентов с раком печени.

Введение

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является четвертой по частоте причиной смерти от рака во всем мире, и уровень заболеваемости продолжает расти (1).Значительная часть пациентов с ГЦК не подходит для лечения (2, 3). В этих условиях широко применяются внутриартериальные методы лечения (IAT), такие как традиционная трансартериальная химиоэмболизация на масляной основе (cTACE), и одобренные руководящими принципами основные методы лечения с потенциалом снижения стадийности и перехода пациентов к резекции или трансплантации (4, 5). Однако эффективность таких нехирургических методов лечения остается ограниченной из-за индивидуальных вариаций биологических и физиологических характеристик микроокружения опухоли (TME), что, в свою очередь, приводит к очень вариабельной восприимчивости к стандартизированным противоопухолевым методам лечения (6).

Взаимные взаимодействия между раковыми клетками и TME являются всеобъемлющей темой в динамическом ходе канцерогенеза (6). В частности, подкисление TME, вызывающее метаболический сдвиг раковых клеток в гипергликолитический фенотип, считается основным признаком агрессивности опухоли и связано с плохой выживаемостью (6, 7). Синтез большого количества лактата и его перенос во внеклеточное пространство через протон-связанные переносчики монокарбоксилата приводят к низкому pH в окружающем TME, который был предложен в качестве метаболического индикатора жизнеспособности опухоли и биомаркера агрессивности при различных новообразованиях ( 8, 9).

«Эффект Варбурга» описывает повышенное поглощение глюкозы и кислородно-независимую скорость гликолиза в раковых клетках, в первую очередь для выработки энергии (7, 10). Однако дальнейшие исследования показали сохраняющуюся гибкость метаболических путей при большинстве видов рака, предполагая, что усиление гликолиза и последующего накопления протонов, а также лактата в интерстициальном пространстве в первую очередь служит цели создания и сохранения враждебной протуморигенной ниши (11, 12). Местный внеклеточный ацидоз способствует проангиогенной передаче сигналов и играет многогранную роль в уклонении от иммунитета раковых клеток, стимуляции протеолитических ферментов, управляющих опухолевой инвазией, и устойчивости к терапии и, таким образом, служит ранним индикатором прогрессирования заболевания (13-17).Таким образом, существует клиническая потребность в неинвазивных биомаркерах для количественной визуализации, которые могут обнаруживать эти неблагоприятные метаболические аномалии и отслеживать их в долгосрочном плане в ходе противоопухолевой терапии (18). Целью этого исследования было использование парадигм многопараметрической визуализации, включая картирование молекулярного внеклеточного pH (pH _и ) для мониторинга TME в солидных опухолях печени, леченных локорегиональной терапией. Трансляционная ортотопическая модель рака печени на животных была использована для облегчения клинической трансляции недавно разработанных биомаркеров визуализации на клинических МРТ / КТ-сканерах.

Материалы и методы

Модель опухоли печени кролика VX2

Самцов новозеландских белых кроликов (2,5–4 кг, Charles River Laboratories) использовали в соответствии с руководящими принципами учреждения и утвержденными протоколами Комитета по уходу за животными и их использованию. Животных содержали в комнатах с ламинарным потоком при постоянной температуре и влажности, с пищей и водой ad libitum . Тридцать два кролика подверглись имплантации опухолей VX2 в левую долю печени, как подробно объяснялось ранее (19, 20).Вкратце, фрагменты опухоли VX2 инъецировали в четырехглавую мышцу задней ноги кролика-донора, и опухоли позволяли расти в течение 3 недель. Куски опухоли собирали у животного-донора и приблизительно 0,4 мл вводили в левую долю печени кролика-реципиента посредством средней лапаротомии с использованием катетера 18G. Фасции брюшной полости и кожу ушили в два слоя рассасывающимися шовными материалами (хромовая кишка 3,0; викрил 4,0). Опухолям позволяли расти в течение 14 дней до образования хорошо очерченной одиночной опухоли (1-2.0 см в диаметре) можно было измерить на КТ или МРТ (21).

При всех хирургических вмешательствах животным сначала вводили седативные препараты ацепромазином внутримышечно 0,25–1 мг / кг и кетамина гидрохлоридом 30–45 мг / кг. Операции и МРТ проводились под общим наркозом с использованием изофлурана 1–3% в кислороде. Во время эксперимента была обеспечена дополнительная тепловая поддержка и физиологический мониторинг (насыщение кислородом, частота сердечных сокращений и температура тела). Обезболивающее мелоксикам (0,3 мг / кг) и бупренорфин (0.02–0,05 мг / кг) вводили подкожно до и после хирургических вмешательств.

План экспериментального исследования

Перед индукцией опухоли животных случайным образом распределили на следующие пять групп с разными заранее определенными конечными точками для картирования pH _и и последующей аутопсии и гистопатологической оценки (рис. 1). Следовательно, карты pH _и были получены: (i) до обработки (контрольная группа; n = 7), (ii) сразу (1-2 дня; n = 7), (iii) 1 неделя (5 –7 дней; n = 7) или (iv) 2 недели (14-15 дней; n = 8) после полного cTACE.Кроме того, анализ проводили на (v) намеренно недолеченных животных ( n = 3) с картированием pH _e через 2 недели (14 дней) после лечения, как описано ниже. Этот анализ был направлен на выяснение прогностической ценности изображений pH _и для обнаружения остатков опухоли в условиях неполного cTACE с уменьшенным количеством лекарства для имитации неудачного лечения.

Experimental in vivo . В горизонтальном направлении блок-схема иллюстрирует модель опухоли кролика VX2 и мультимодальную визуализацию в последовательные моменты времени.По вертикали изображение, выполненное в каждый момент времени, отображается в соответствии с соответствующей модальностью, включая спектроскопическое pH-картирование, mpMRI, включая визуализацию с усилением контраста и ADC-картирование, а также КТ с введением контрастного вещества или без него. Вкратце, 32 кролика-реципиента имплантировали в левую долю печени с кусочками опухоли, полученными от кроликов-доноров. Опухолям давали возможность расти в течение 2 недель, пока не было выполнено исходное изображение. Семь кроликов были умерщвлены после мультимодальной визуализации на исходном уровне и служили контролем.Остальным 25 кроликам вводили cTACE, и через 1 день они получали мультимодальную визуализацию. Семь кроликов были умерщвлены после каждой визуализации через 1 день и 1 неделю после cTACE, соответственно, а оставшиеся кролики перешли в следующий цикл визуализации. Всего 11 кроликов были доступны для мультимодальной визуализации через 2 недели после cTACE. После эвтаназии было выполнено вскрытие трупа, опухоль и ткань печени были взяты для радиологически-гистопатологического сравнения.

Для облегчения интерпретации созданных карт pH _и кроликам также проводилась многопараметрическая МРТ (mpMRI) в различные моменты времени.Перед лечением все животные прошли базовую визуализацию. Кролики в контрольной группе (группа i) имели картографирование pH _и на исходном уровне и впоследствии были умерщвлены без какой-либо обработки. Животных в группах II и III подвергали мультимодальной визуализации через 1 день или 1 неделю после cTACE, соответственно, включая визуализацию pH _и , и впоследствии их забивали для радиолого-гистопатологического анализа в соответствующей конечной точке исследования. Кроликам в группах iv и v были выполнены два контрольных МРТ-сканирования через 1 день или 1 неделю, а также через 2 недели после cTACE, включая картирование pH _и через 2 недели с последующей эвтаназией и забором тканей для гистопатологического анализа.Кроме того, компьютерная томография была сделана в те же моменты времени, когда выполнялась МРТ (рис. 1).

cTACE

Эмульсия липиодол-доксорубицин

Порошок доксорубицина HCl (RPI, Mount Prospect) восстанавливали стерильной водой непосредственно перед внутриартериальной инъекцией до конечной концентрации 1,25 мг / мл. Введенные дозы были ниже максимальных доз, эквивалентных животным, рассчитанных для общепринятой клинически используемой дозы доксорубицина, равной 50 мг, на основании рекомендаций FDA по трансляции доз в зависимости от площади поверхности тела (22, 23).Раствор доксорубицина тщательно перемешивали до получения однородного прозрачного красного раствора. Раствор смешивали в соотношении 1: 2 с липиодолом (Guerbet), используя метод выталкивания и вытягивания, с устойчивым к химиотерапии пластиковым запорным краном, и стабильное образование капель проверяли с помощью теста на падение (24).

Полная процедура трансартериальной химиоэмболизации

Доступ к правой общей бедренной артерии был получен путем тупого рассечения с последующим наложением 3-французского сосудистого интродьюсера (Cook, Inc.). 2-французский микрокатетер (катетер JB1; Cook, Inc.) продвигали в чревную ось, после чего была сделана чревная артериограмма для определения кровоснабжения печени. Опухоль визуализировалась на цифровой субтракционной ангиографии как область гиперваскулярного румянца в левой доле печени. Поскольку сосуды, питающие опухоль, происходили почти исключительно из левой печеночной артерии, эта артерия была выборочно катетеризована от общей печеночной артерии с помощью направляющей проволоки (0,014 дюйма, проволока Transcend; Boston Scientific).После подтверждения адекватного расположения катетера в непосредственной близости от опухоли, смесь липиодола и доксорубицина медленно вводили под рентгеноскопическим контролем. Вводимые объемы варьировались от 0,2 мл (доза доксорубицина 0,25 мг) до 0,6 мл (0,75 мг) в зависимости от размера опухоли и кровоснабжения. Катетер очищали физиологическим раствором, затем добавляли 0,3–0,4 мл гранул размером 100–300 мкм (Embospheres, Merit Medical), смешанные в соотношении 1: 4 с Omnipaque 350 (GE Healthcare) до тех пор, пока не наблюдалось отсутствие прямого потока в артерии, снабжающей опухоль. .Конечными точками эмболизации были полное введение суспензии липиодола / доксорубицина и эмбосфер или преждевременная стагнация кровотока, что подтверждено внутрипроцедурной рентгеноскопией. Кроме того, многофазные КТ-изображения с коническим пучком (CB) с контрастным усилением (C-arm; Allura Clarity FD20 8.2; Philips) были получены внутрипроцедурно перед cTACE, чтобы локализовать опухоль и подтвердить выборочное позиционирование катетера для улучшения планирования лечения и нацеливания. Неусиленная КЛКТ после эмболизации служила для оценки распределения липиодола в опухоли.Настройка для КЛКТ составляла 120 кВп, поле зрения 48 см (FOV) и 305 мАс. По завершении микрокатетер был удален, поддерживая мягкое всасывание, чтобы избежать изгнания микросфер, оставшихся в просвете катетера. Общую бедренную артерию перевязали и разрез зашили в два слоя рассасывающимся шовным материалом.

Неполная трансартериальная химиоэмболизация

В дополнение к полной cTACE, отдельная группа (v, n = 3) была намеренно пролечена неполной эмболизацией, чтобы имитировать неудачное лечение, и уточнить прогностическое значение pH _e изображений для обнаружения жизнеспособные остатки опухоли в этой обстановке.Неполный cTACE выполняли с использованием существенно уменьшенных доз эмульсии липиодол-доксорубицин (0,1 мл) и эмбосфер (0,1 мл). Конечные точки эмболизации для неполной ТАСЕ были определены с помощью интрапроцедурной КЛКТ с целью лишь частичного покрытия опухоли липиодолом. Предполагаемая цель вмешательства заключалась в доставке определенных доз агентов для уменьшения проходимости и перфузии сосудов, питающих опухоль, без достижения полного застоя, что подтверждается рентгеноскопией.

Мультимодальная визуализация и количественный анализ изображений

Многопараметрическая МРТ

Визуализация химического сдвига – pH

mpMRI было выполнено на аппарате 3T-MR (Magnetom Prisma; Siemens), продаваемом для клинического использования с коммерчески доступным 15 -канальная коленная катушка.Во время соответствующей определенной конечной точки исследования, биосенсорная визуализация избыточного отклонения в сдвигах (BIRDS) была выполнена в конце МРТ для измерения pH _и (8, 25). Было показано, что BIRDS в сочетании с введением парамагнитно-активного контрастного вещества тулия (III) 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетра (TmDOTP; Macrocyclics, Inc.) надежно отображает pH _{. e} путем измерения химического сдвига pH _e чувствительных групп контрастного вещества DOTP (8, 25).Вкратце, 15 мл TmDOTP ^5- (0,5 ммоль / кг) вводили со скоростью 0,5 мл / мин в течение приблизительно 30 минут. Данные BIRDS были получены с использованием последовательности трехмерной визуализации химического сдвига (CSI) с полем обзора 20 × 20 × 25 см, 13 × 13 × 13 = 2197 прямоугольных шагов кодирования, спектральным окном 50000 Гц, 256 комплексными точками со спектральным разрешение 195 Гц / точка, TR = 8 мс (ограничено удельной скоростью поглощения), время сбора данных 6 минут и реконструировано до 25 × 25 × 25 см с разрешением вокселей 8 × 8 × 10 мм.Было получено двадцать средних значений. Подавление воды было достигнуто с помощью двухдиапазонного радиочастотного импульса Шиннар-Ле Ру 640 мкс, который выборочно возбуждает интересующие пики (полоса пропускания 10 кГц) по обе стороны от воды. T ₁ -взвешенные изображения VIBE для регистрации были получены с использованием поля зрения 20 × 20 см, матрицы 384 × 384, 60 срезов, 2,5 мм, TR = 5,2 мс и TE = 2,5 мс.

Поскольку показания pH _и зависят от изменений химического сдвига сверхтонких смещенных протонных резонансов, их молекулярная чувствительность не зависит от концентрации TmDOTP ^5- без каких-либо фоновых перекрывающихся сигналов.Более того, на сигналы BIRDS не влияет присутствие контрастных веществ на основе гадолиния (26, 27).

Для постобработки пики CSI были наложены на изображения, взвешенные по T ₁ , для регистрации (рис. 2). pH _и оценивали для вокселей внутри всей опухоли, в краю опухоли, состоящем из вокселей, которые были смежными с опухолью или на 50% вне опухоли, и вне опухоли в паренхиме печени. Область интереса (ROI) нормальной ткани печени обычно выбиралась на расстоянии одного или двух срезов (≥10 мм) от опухоли, за исключением структур желчного пузыря и центральных ворот.PH _и для каждого вокселя рассчитывали из различных зависимостей химических сдвигов h3, h4 и H6 TmDOTP ^5- с использованием Matlab (MathWorks, Inc .; ссылки 25, 28).

Спектроскопическое неинвазивное картирование pH _и с использованием BIRDS. A, Axial T _{1 МР-изображения} VIBE использовали для определения границ печени (синий) и опухоли (красный) у репрезентативного необработанного кролика с опухолью VX2. B, Распределение TmDOTP ^5- пиков от ПТИЦ с CSI в опухоли и печени. C, Примеры спектров протонов h3, h4 и H6 TmDOTP ^5- из вокселя печени и опухоли (черные квадраты в B ), демонстрирующие химический сдвиг пиков каждого из них, зависящий от pH _e . протон. D, Соответствующая карта pH _e была рассчитана с использованием химических сдвигов протонов h3, h4 и H6 TmDOTP ^5- в каждой опухоли и вокселе печени, соответственно, и проиллюстрирована наложенной цветной картой.

Визуализация с контрастным усилением — усиление опухоли:

Улучшение опухоли оценивалось во все моменты времени визуализации на динамических контрастно-усиленных (DCE) T ₁ -взвешенных изображениях с использованием последовательности 3D VIBE с параллельной визуализацией CAIPIRINHA (2 × 2) ( 29).Параметры сканирования включали: TR / TE / θ = 3,45 мс / 1,28 мс / 9 °, матрица 192 × 100, частичный Фурье 6/8, полоса пропускания 500 Гц / пикс, FOV = 200 × 120 мм ² , 25–32 среза , 2–3 с / объем и 1 × 2 × 2,5 мм ³ . Восемьдесят многосрезовых объемов повторяли до, во время и после болюсной инъекции 0,1 ммоль / кг внутривенного гадолиния (Dotarem; Guerbet).

Объемные измерения на исходном уровне и пост-cTACE контрастное усиление T ₁ -взвешенное сканирование использовалось для определения степени увеличения опухоли.В частности, программное обеспечение для количественной 3D-сегментации (IntelliSpace Portalv8, Philips) применялось для сегментации общего объема опухоли (TTV) по артериальной фазе (15–20 секунд после введения контраста) на основе неевклидовой геометрии и теории радиальной базовой функции. как описано в предыдущей работе (30). Артериальная фаза была выбрана из-за известной гиперваскулярности опухолей, в основном снабжаемых ветвями печеночной артерии. Количественные критерии Европейской ассоциации по изучению печени были применены для расчета увеличивающегося объема опухоли (ETV в см ³ и% TTV), как подробно описано в другом месте (31).Вкратце, предварительное контрастное сканирование вычитали из изображений артериальной фазы с усиленным контрастом, чтобы удалить фоновую гиперинтенсивность ткани. ROI (1 см ³ ) помещали в однородную часть паренхимы печени в качестве предметного ориентира. ETV определяли как воксели, в которых усиление превышало два стандартных отклонения (SD) средней интенсивности эталонной области интереса (30).

Видимый коэффициент диффузии — клеточность опухоли:

Протокол mpMRI дополнительно включал респираторно-управляемые T ₂ -взвешенные спин-эхо-изображения, не усиленные и контрастные T ₁ -взвешенные изображения Диксона.Для реконструкции карт кажущегося коэффициента диффузии (ADC) использовались три различных значения b (50–800 с / мм ² ) в трех ортогональных направлениях с использованием четырех трасс сканирования. Параметры сканирования: TR / TE / θ / NSA = 2000 мс / 43 мс / 9 ° / 4, матрица: 112 × 112, частичный Фурье 6/8, 92 etl, 1654 Гц / пиксель, эхо-интервал = 0,71 мс, FOV = 200 × 160 мм ² , параллельное отображение с Граппа × 2, 20 срезов, толщина 2,5 мм, градиенты 80 мТл / м.Подавление жира применялось с восстановлением инверсии спектрального ослабления. Значения ADC, отражающие клеточность опухоли после cTACE, измеряли через последовательные интервалы с помощью областей интереса, размещенных в краю и сердцевине опухоли, и нормальной ткани печени с использованием программного обеспечения ImageJ (v1.52a, NIH).

КТ — покрытие липиодолом

Отложение липиодола в опухоли клинически используется в качестве качественного индикатора для оценки терапевтической эффективности и коррелирует с ответом опухоли (32). Мультидетекторные компьютерные томограммы получали с использованием гибридного 64-срезового сканера SPECT / CT размером с человека (Discovery 570c, GE Healthcare).До cTACE неусиленные и трехфазные (15 секунд артериальные, 70 секунд портально-венозные, 5 минут с задержкой) сканирование с контрастным усилением были получены после внутривенной инъекции 1 мл / кг Omnipaque 350 со скоростью 1 мл / с с последующей промывкой физиологическим раствором. Другие параметры изображения: 120 кВп, 305 мАс, толщина 0,5 мм и поле зрения 22 × 22 см.

КТ после ТАСЕ включала только неулучшенную визуализацию печени для оценки отложения липиодола. На этих снимках нативной компьютерной томографии липиодол выглядел как участки повышенной плотности из-за высокого содержания йода.Чтобы исследовать роль липиодола в качестве маркера визуализации опухоли, тот же метод, который использовался для оценки ETV, был применен для количественной оценки отложения липиодола и покрытия опухоли в различные моменты времени (33).

Гистопатология

Сбор и обработка тканей

Животных умерщвляли внутривенной инъекцией эвтазола (0,5 мл / кг) сразу после МРТ с ПТИЦЫ в конечной точке, необходимой для исследования. Опухоль и окружающая, а также контралатеральная печень были немедленно собраны, разрезаны на срезы 3–5 мм, зафиксированы в 10% забуференном формалине в течение ночи и залиты парафином для радиологической и гистопатологической корреляции.Кроме того, сердце, легкие, почки, тонкий кишечник, толстая кишка, желудок, селезенка и мышцы были исследованы на предмет отложения нецелевого липиодола и токсичности лечения у n = 3 животных в каждой группе.

Гистопатологическое и иммунохимическое окрашивание

Ткань разрезали на срезы размером 2 мкм, депарафинизировали с использованием ксилола и регидратировали с использованием серии нисходящих разбавлений этанолом. После промывки деионизированной водой образцы подвергали проницаемости в кипящем восстанавливающем растворе в течение 40 минут при 95 ° C.Сначала использовали окраску гематоксилином и эозином (H&E) в соответствии со стандартными протоколами для общей гистопатологии и количественной оценки жизнеспособности опухолей и некроза всех опухолей. Кроме того, ИГХ была проведена на образцах опухолей, собранных для каждой группы. Срезы опухоли оценивали по следующим мишеням: HIF-1α (каталог Thermo Fisher Scientific № MA1-16504, RRID: AB_568567; 1:20), GLUT-1 (каталог Thermo Fisher Scientific № PA1-46152, RRID: AB_2302087; 1: 200), ЛАМПА-2 (каталог Abcam No.ab13524, RRID: AB_2134736; 1: 100), и ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA, Thermo Fisher Scientific, каталог № MA5-11355, RRID: AB_10984046; 1: 400 в PBS). В частности, образцы инкубировали приблизительно с 100 мкл раствора для гашения пероксидазы в течение 5 минут и с блокирующим раствором (Invitrogen) в течение 20 минут. Инкубация с первичными антителами происходила при комнатной температуре в камерах для гидратации в течение 50 минут. Последующую инкубацию с биотинилированным вторичным антителом, стрептавидин-пероксидазой и 3,3-диаминобензидиновым хромогеном проводили, как описано ранее (34).Гематоксилин использовали в качестве контрастного красителя. Мечение на конце концов терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP (TUNEL) выполняли с использованием набора для обнаружения апоптоза TUNEL (каталог Millipore № 17-141) в соответствии с руководством производителя.

Гистологические образцы были оцифрованы и визуализированы с увеличением до 20 × с использованием программного обеспечения Aperio и ImageScope v12.3 (Leica Biosystems Imaging, Inc.).

Статистический анализ

Статистический расчет размера выборки в StatMate 2.0 (GraphPad) было выполнено превентивно и определено ( n = 7 / группа) как достаточное для обнаружения значимых (α, 5%) pH _e различий между средними значениями группы по второму десятичному знаку с высокой вероятностью (β, 80% власть). SD были оценены на основе предыдущих экспериментов с использованием BIRDS in vivo (8). Дополнительный анализ подгрупп неполного cTACE требовал n = 3, чтобы продемонстрировать воспроизводимость результатов.

Все эксперименты проводились независимо и повторялись не менее трех раз.Данные экспериментов были суммированы со средним значением ± стандартное отклонение. Для каждого анализа проводилась проверка нормальности. Статистические сравнения наборов данных оценивали с помощью непарного теста t или теста Манна-Уитни (сравнение двух групп) или теста ANOVA с апостериорным тестом Тьюки или теста Краскела-Уоллиса (сравнение> 2 групп). Продольные измерения оценивали с помощью парного теста Wilcoxon t . Статистический анализ выполнялся с использованием SPSS (IBM Corp., v24.0) и Prism (v7.0, GraphPad). Двусторонний P <0,05 считался статистически значимым.

Результаты

Неинвазивный pH

Рост опухоли (диаметр 1-2 см) подтвержден на исходном МРТ-сканировании у всех животных. В необработанной группе карты опухолей VX2 с pH _и показали значительно более низкий pH _и (6,80 ± 0,09) по сравнению с тканью печени (pH _e = 7.19 ± 0,03; P <0,001) при ацидозе опухоли. Воксели на краю опухоли, которые были частично за пределами (> 50%) 3D-маски опухоли на основе T ₁ , считались краем опухоли. pH _e на краю опухоли (pH _e = 6,88 ± 0,07) был немного выше, чем pH опухоли _e , но все же значительно ниже, чем паренхима печени ( P <0,001; рис. 3).

Эволюция pH _и при раке печени после cTACE. A, В горизонтальном направлении изображения располагаются в соответствии со временем получения по отношению к лечению cTACE. В первой строке пики CSI показаны красным для каждого воксела, наложенные на соответствующие анатомические изображения T ₁ VIBE MR. Среднее значение pH _и для примеров опухолей, показанных на этом рисунке, составляло 6,77 ± 0,03 (контроль), 6,85 ± 0,02 (1 день), 6,94 ± 0,01 (1 неделя), 7,05 ± 0,01 (2 недели), 6,81 ± 0,0 (недолеченные). ) и 6,95 ± 0,03 (лечение после неполного cTACE).Опухоли VX2 обведены красным контуром с наложенными на них цветными картами, показывающими pH опухоли _и . Результаты визуализации были подтверждены гистологией опухоли с использованием H&E, HIF-1α, GLUT-1 и LAMP-2. Контрольные опухоли демонстрировали некротическое ядро ​​и жизнеспособный край с плотно упакованными опухолевыми клетками и высокими уровнями экспрессии всех метаболических мишеней, в то время как они были почти не обнаруживаемы через 1 день и не обнаруживались через 1 и 2 недели после cTACE. pH _e Через 2 недели после неполного cTACE выявлен ацидоз недолеченных областей, определяемый как жизнеспособные остатки на анатомической визуализации и гистологии.Кроме того, в обработанных областях той же опухоли было обнаружено повышенное значение pH _и , что соответствовало исчезновению гистологических маркеров. B, Количественная оценка pH _e продемонстрировала значительно более низкий pH _e в опухоли и краю опухоли по сравнению с нормальной печенью у животных, которые не подвергались cTACE. Продольные измерения показали постепенное повышение до нормализации pH _и в опухоли и краю опухоли через 1 день, 1 неделю и 2 недели после cTACE, хотя полное восстановление до нормализованного pH _и не было достигнуто в течение этого периода времени. .В нормальной печени значения pH _и оставались стабильными во всех временных точках. Существенные различия обозначены * между разными временными точками (**, P <0,01; ***, P <0,001) и знаком # по сравнению с паренхимой печени в тот же соответствующий момент времени (#, P <0,05; ##, P <0,01; ###, P <0,001).

Продольный мониторинг pH

TACE был технически успешным у всех 25 животных, и конечные точки эмболизации были достигнуты у всех животных.Однако у одного животного наблюдали шунтирование легких и рефлюкс липиодола в более проксимальные ветви печеночной артерии во время процедуры cTACE. Неполная эмболизация была подтверждена явной питающей опухоль артерией, неполным покрытием опухоли липиодолом (<75%), неполным некрозом и остаточным усилением на постпроцедурных сканированиях mpMRI, а также гистологией.

Что касается длительного мониторинга терапевтических эффектов, то через 1 день наблюдалось устойчивое постепенное увеличение в направлении нормализации pH _e в опухоли и края опухоли (pH _e = 6.85 ± 0,04; P = 0,253), 1 неделя (pH _e = 6,91 ± 0,04; P = 0,002) и 2 недели (pH _e = 7,02 ± 0,04; P <0,001) после полного cTACE. Однако полного восстановления гомеостатического pH опухоли _e достичь не удалось, и pH опухоли _e оставался значительно ниже, чем pH печени _e во все моменты времени. Аналогичные результаты наблюдались на краю опухоли.

В отличие от полного cTACE, картирование pH _и через 2 недели после неполного cTACE показало области как кислого, так и повышенного, частично нейтрализованного pH _и внутри одной и той же опухоли.В частности, регистрация пространственных изображений и сравнение карт pH _и с CT и анатомическими последовательностями mpMRI выявили сходство пространственного распределения отложения липиодола (CT), деваскуляризации (T ₁ с контрастированием) и некроза (карты ADC). обработанных частей опухоли с повышенным pH опухоли _и (6,89 ± 0,06) по сравнению с необработанными контролями. Однако эта разница не была статистически значимой ( P = 0,158). Напротив, недостаточно обработанные области опухоли, в которых отсутствует отложение липиодола, выглядели как перфузируемые и жизнеспособные остатки на картах T _, и ADC с контрастным усилением, соответственно.Эти жизнеспособные части опухоли показали кислотный pH опухоли _и (6,82 ± 0,03) через 2 недели после неполного cTACE, аналогично необработанному контролю ( P = 0,667). Все существенные различия между временными точками показаны на рис. 3.

Гистопатологическая характеристика необработанных опухолей VX2 выявила в большинстве опухолей некротическое ядро ​​опухоли и жизнеспособный край опухоли с плотно упакованными опухолевыми клетками на окрашивании H&E.

Было обнаружено, что гистопатологические маркеры, указывающие на гликолиз (GLUT-1) и хронический ацидоз (LAMP-2), активируются в необработанных опухолях VX2 в соответствии с результатами pH _и .Сверхэкспрессия HIF-1α, представляющего гипоксию, в первую очередь была обнаружена в опухолевых клетках вблизи ядра опухоли. Однако уровни экспрессии снижались сразу после cTACE, и маркеры больше не определялись через 1 и 2 недели после cTACE вместе с началом и увеличением степени некроза опухоли. В отличие от обработанных областей опухоли, гистопатологический анализ недолеченных участков опухоли после неполного лечения выявил характерные жизнеспособные опухолевые особенности со сверхэкспрессией HIF-1α, GLUT-2 и LAMP-2.

Развитие биомаркеров многопараметрической визуализации указывает на деваскуляризацию, некроз и устойчивое покрытие липиодолом после cTACE

Чтобы помочь интерпретировать результаты pH _и , были изучены продольные терапевтические эффекты cTACE на увеличение и распространение опухоли, а также покрытие опухоли липиодолом. количественно определено на МРТ и КТ. Среднее значение ETV составляло 70,89% ± 17,41% на исходном уровне, что свидетельствует о гиперваскулярности необработанных опухолей VX2. Гиперконцентрация преобладала на краю опухоли и в основном отсутствовала в некротической сердцевине.ETV значительно снизился уже через 1 день после cTACE (1,18% ± 1,59%; P <0,001), что свидетельствует о деваскуляризации опухолей, которая сохранялась через 1 неделю (6,03 ± 13,36%; P <0,001) и 2 недели. после cTACE (2,76% ± 3,45%; P = 0,008). Объемный анализ всего поражения в целенаправленно недолеченных опухолях выявил остающееся усиление опухоли в недолеченной части опухоли через 2 недели после cTACE ( P = 0,006; рис. 4).

Эволюция мультимодальных мультипараметрических биомаркеров при раке печени после cTACE. A, На фигуре показаны характерные изменения опухолей печени на mpMRI и CT, индуцированные cTACE. В вертикальном направлении сканированные изображения располагаются в соответствии со временем получения. По горизонтали изображения расположены в соответствии с модальностью, включая предконтрастные T ₁ -взвешенные (T _1w ) изображения, изображения DCE в артериальной фазе (15–20 секунд после введения болюса контрастного вещества) и карты ADC, все в аксиальная плоскость, а также аксиальные и коронарные КТ-изображения с (исходным) и без (пост-cTACE) контрастным введением.Необработанные опухоли продемонстрировали усиление ободка на МРТ и КТ с контрастированием, а также жизнеспособный ободок опухоли (низкий ADC) и некротическое ядро ​​(высокое ADC). Соответствующая гистология края опухоли выявила сильное повсеместное окрашивание маркером пролиферации PCNA и низкий сигнал от окрашивания TUNEL о гибели клеток. Лечение cTACE обеспечило стойкую деваскуляризацию и начало некроза уже через 1 день после cTACE и устойчивое отложение липиодола во всех временных точках. Эти данные были гистологически подтверждены исчезновением сигнала PCNA и высокого сигнала TUNEL в опухолях после cTACE. B, Коробчатые диаграммы объемного количественного определения усиления артериальной опухоли (DCE), клеточности опухоли (ADC) и липиодола (CT) опухоли иллюстрируют продольные эффекты cTACE. Значимые различия обозначены * по сравнению с исходным уровнем (**, P <0,01; ***, P <0,001) и знаком # для сравнения неполного cTACE с полным cTACE через 2 недели после лечения (#, P <0,05; ##, P <0,01).

Что касается DWI, то нелеченные опухоли продемонстрировали более низкие значения ADC в жизнеспособном крае опухоли (857.3 ± 147,1 мм ² / с) по сравнению с паренхимой печени (1102 ± 76,42 мм ² / с), что отражает высокую клеточную плотность края опухоли ( P <0,001). Значения ADC, измеренные в ядрах некротической опухоли (1235,08 ± 239,77 мм ² / с), были значительно выше по сравнению с паренхимой ( P = 0,007) и краем опухоли ( P <0,001).

В полностью эмболизированных опухолях край и ядро ​​опухоли не были различимы как гистологически различные отдельные области.Значительное начало некроза стало очевидным сразу после cTACE по сравнению с исходным уровнем (1,659,74 ± 555,32 мм ² / с; P = 0,003 через 1 день). Степень некроза продолжала увеличиваться через 1 неделю (2087,47 ± 530,47 мм ² / с; P <0,001), оставаясь стабильной через 2 недели после кТАСЕ (2075,53 ± 349,86 мм ² / с; P <0,001 ), что свидетельствует о потере целостности опухолевых клеток. Клеточность паренхимы печени, на которую указывает ADC, не менялась с течением времени.

Недолеченные поражения продемонстрировали значительно более низкие значения ADC, чем полностью обработанные опухоли через 2 недели после TACE, что свидетельствует о неполном некрозе опухоли (1,625,04 ± 305,37 мм ² / с; P = 0,012; рис. 4).

Кроме того, покрытие опухолей липиодолом, выраженное в процентах от TTV, составляло> 80% через 1 день после полного cTACE. Устойчивое отложение липиодола в опухолях во все временные точки было измерено у 27 из 28 животных. Отложения липиодола в основном были видны на краю опухоли и в основном отсутствовали в ядре опухоли.Это наблюдение согласуется с паттерном улучшения и картами АЦП. Животное, у которого наблюдали липиодоловый рефлюкс во время процедуры cTACE, продемонстрировало заметное уменьшение липиодольного покрытия опухолью на контрольной КТ через 1 неделю. В паренхиме печени постепенное и в конечном итоге почти полное вымывание нецелевого отложения липиодола наблюдалось до 2 недель после cTACE. Недолеченные опухоли после неполного cTACE показали более низкий общий охват липиодолом (67,53% ± 26,37%) по сравнению с полностью пролеченными опухолями.

Результаты мультипараметрической визуализации были подтверждены гистопатологически с помощью H&E, а также окрашивания PCNA и TUNEL. Контрольная группа показала значительное окрашивание PCNA в жизнеспособном крае опухоли, тогда как внутреннее ядро ​​не окрашивалось PCNA, что указывало на некроз. TUNEL, как маркер апоптоза и гибели клеток, выделял внутреннее ядро ​​и не окрашивал жизнеспособный край опухоли в контрольной группе, дополняя отрицательное окрашивание PCNA. Окрашивание H&E после cTACE показало более широкий некроз, исходящий от ядра в обработанных опухолях через 1 день после cTACE по сравнению с контрольными опухолями, и увеличение степени некроза с течением времени.У животных, умерщвленных через 1 или 2 недели после cTACE, области некроза превышали границы опухоли, поражая окружающую ткань печени. Во все моменты времени после cTACE не наблюдалось отчетливого окрашивания PCNA внутри опухоли, а окрашивание TUNEL было видно по всей опухоли. Напротив, недолеченные опухоли после неполного cTACE продемонстрировали гистологические особенности контрольных опухолей в жизнеспособных остаточных областях опухоли, прилегающих к некротизированным обработанным участкам (рис. 4).

Обсуждение

Это исследование установило МР-спектроскопическое неинвазивное картирование pH _и , в дополнение к параметрам МРТ и КТ, в качестве стратегии мониторинга терапевтической эффективности локорегиональной терапии рака печени.Большинство опухолей печени проявляют фенотип гипергликолитического метаболизма, который приводит к внеклеточному накоплению лактата и протонов и, таким образом, к подкислению TME (35, 36). Таким образом, основной результат этого исследования демонстрирует экспериментальные доказательства того, что вызванное терапией прерывание метаболизма опухоли приводит к нормализации pH опухоли _и . Затем эту парадигму можно использовать в качестве функционального биомаркера молекулярной визуализации для длительного мониторинга терапевтического результата после нехирургического лечения рака печени.

Молекулярная визуализация на этой модели рака печени кролика выявила кислотный pH опухоли _и в жизнеспособных, необработанных опухолях, который был значительно ниже, чем pH _и , измеренный в паренхиме здоровой печени. Существует множество доказательств того, что кислотность внеклеточной опухоли и лактоацидоз являются важными внешними для опухоли компонентами образования и прогрессирования опухоли, поскольку они стимулируют неоангиогенез и способствуют локальному опухолевому поражению (13, 14). Низкое значение pH _и дополнительно способствует созданию иммуносупрессивной среды за счет прекращения клеточного противоопухолевого иммунного ответа и, таким образом, способствует иммуноубийству раковых клеток (9, 15, 16).Однако метаболизм опухоли и способ получения питательных веществ в раковых клетках должны адаптироваться к изменению микроокружения с низким содержанием питательных веществ и кислорода (37). Эти условия могут значительно различаться, что приводит к неоднородности метаболических фенотипов для разных типов опухолей, а также в разных регионах внутри одной и той же опухоли (38, 39). Таким образом, возможность неинвазивной визуализации закисления TME при pH _и может помочь в лучшем понимании лежащей в основе биологии опухоли и мониторинга индивидуальной метаболической активности для прогнозирования восприимчивости до противоопухолевой терапии и ответа опухоли после лечения.На молекулярном уровне низкий pH опухоли _и является результатом изменений уровней экспрессии метаболических белков, таких как GLUT-1, в необработанных опухолях (36). Кроме того, в этом исследовании использовался недавно установленный гистологический маркер LAMP-2 для патологической корреляции с картированием in vivo, pH _и , транслокация и экспрессия которого на клеточных мембранах связаны с хроническим ацидозом в раковых клетках (рис. 3) (40). ).

Мониторинг метаболической активности опухолей печени является особенно сложной задачей, учитывая высокую метаболическую активность паренхимы печени, которая может вызывать неспецифический фоновый сигнал, что часто наблюдается в позитронно-эмиссионной томографии с фтордезоксиглюкозой (41).В отличие от многих флуоресцентных, люминесцентных или радиоактивных зондов, МР-спектроскопическая визуализация представляет собой неинвазивный безрадиационный подход для количественной оценки функциональных характеристик рака, которые могут выходить за рамки оценки морфологических характеристик (18, 42–44). Подходы на основе МРТ, уже доступные для клинического использования, включают гиперполяризованную МРТ, измеряющую метаболический поток и передачу насыщения химического обмена (CEST). CEST — это pH-чувствительный метод, который измеряет химический обмен между эндогенными соединениями (т.е.е., белки, аминокислоты и сахара) и объемную воду (45). Хотя CEST обеспечивает возможность МРТ с немного более высоким разрешением, чем BIRDS, ему не хватает специфичности из-за перекрытия сигналов от взаимозаменяемых групп (т.е. –NH и –OH). Более того, CEST не является полностью количественным из-за нескольких мешающих факторов, таких как неоднородности температуры или магнитного поля, хотя некоторые из этих факторов могут быть учтены (46). Для сравнения, картирование pH _e с помощью BIRDS не зависит от температуры или концентрации агента.BIRDS был ранее подтвержден в головном мозге крыс при 9,4 т с использованием 31-фосфорного MRS. Однако, поскольку эти подтверждения основаны исключительно на химическом сдвиге независимо от амплитуды или частоты пиков TmDOTP ^5-, они не должны зависеть от напряженности магнитного поля и, таким образом, действительны также при 3Т. Быстрые расслабляющие MR-сигналы обеспечивают быстрый сбор данных с повышенным усреднением и, таким образом, улучшенным отношением сигнал / шум (SNR). Кроме того, из-за широких резонансов MR TMDOPT ^5-, BIRDS менее чувствителен к неоднородностям магнитного поля.

Это исследование демонстрирует возможность использования ПТИЦ на клинических 3Т-МРТ сканерах. Измерение pH _e на воксельной основе с присущей пространственной информацией позволяет учесть неоднородности в исследуемых тканях. Помимо возможности количественного определения pH _и в необработанных опухолях с высокой воспроизводимостью (низкое стандартное отклонение внутри групп), молекулярное картирование pH _и оказалось чувствительным к обнаружению небольших изменений pH опухоли _и после обработки cTACE.Локорегиональная терапия опухолей печени приводит к постепенному снижению опухолевого ацидоза при увеличении значений pH _и до значений pH _и нормальной паренхимы печени. После каждого картирования pH _и проводили сбор опухоли и гистопатологическую перекрестную проверку результатов визуализации. Более того, чтобы помочь установить pH опухоли _и в качестве нового биомаркера, была применена mpMRI для оценки эффективности лечения в полной мере с использованием клинически доступных последовательностей и информации для интерпретации измерений pH _и опухоли на той же модели.В то время как деваскуляризация и некроз опухоли стали видны на МРТ уже через 1 день после лечения и оставались в значительной степени неизменными с течением времени, эволюция функциональных изменений pH _и опухоли была явно измерена с помощью BIRDS, что отражает типичный постепенный патологический ответ на cTACE, который не было обнаружено с помощью обычного мпМРТ. Эти данные свидетельствуют о высокой чувствительности картирования pH _и для мониторинга продольных физиологических изменений с течением времени.

У клинических пациентов рецидив опухоли после cTACE довольно часто встречается из-за технических проблем, а также из-за неизвестной восприимчивости отдельных опухолей к определенному лечению (47).Следовательно, клинически желательно выявлять рецидив на ранней стадии после cTACE и улучшать ведение пациентов путем разработки индивидуальных стратегий лечения. Механизм cTACE — синергетический эффект химиотерапии и вызванного эмболизацией истощения кислорода и питательных веществ (4). Мы предполагаем, что cTACE первоначально приведет к снижению гликолиза и, таким образом, к уменьшению количества лактата и протонов, секретируемых во внеклеточное пространство в TME. Это «отключение» «эффекта Варбурга» станет измеримым по увеличению pH _и , как обнаружено BIRDS в этом исследовании.Эта гипотеза дополнительно подтверждается данными в группе неполного cTACE, которая имитирует клинический сценарий неэффективности лечения. Примечательно, что визуализация опухоли с pH _и после неполного cTACE выявила низкие значения pH _и через 2 недели после cTACE в областях опухоли без отложений липиодола, которые проявлялись в виде жизнеспособных остатков на картах МРТ и ADC с контрастированием, а также на гистологических данных. Рядом с этими жизнеспособными частями успешно обработанные области стали очевидны на МРТ, показав отсутствие усиления и высокие значения ADC, указывающие на некроз.Эти обработанные области опухоли соответствовали повышенному pH _и по сравнению с исходным уровнем. Эти результаты подчеркивают возможность использования изображений pH _и в качестве чувствительного индикатора жизнеспособности опухоли и суррогатного маркера чувствительности опухоли и ответа на противоопухолевую терапию, которая приводит к нормализации pH опухоли _и .

Недавно обнаруженная способность cTACE нейтрализовать ацидоз опухоли и восстановить гомеостаз pH _и в печени имеет значительный потенциал для расширения терапевтических возможностей путем комбинации с другими методами лечения рака печени.В частности, нацеливание на строму опухоли путем растворения кислотности опухоли может снизить барьер иммуносупрессии и способствовать как внутреннему противоопухолевому иммунному ответу, так и осуществлению иммунотерапии рака печени. Таким образом, этот набор инструментов для мониторинга pH _и может способствовать дальнейшему развитию целевых подходов к нарушению механизмов резистентности, которые в настоящее время препятствуют эффективности местного и комбинированного лечения с конечной целью улучшить клинический результат.

Одним из ограничений этого исследования было относительно низкое пространственное разрешение вокселей CSI, которое потенциально может быть улучшено в будущих исследованиях за счет увеличения отношения сигнал / шум с помощью более чувствительной катушки и более эффективных методов выборки в k-пространстве. Кроме того, в то время как стробирование у анестезированных кроликов может не потребоваться, учитывая относительно небольшое движение грудной клетки (<3 мм) по сравнению с размером вокселя, эксперименты в бодрствующем состоянии могут потребовать респираторного стробирования, но будут иметь цену меньшего временного разрешения.Кроме того, необходимо интегрировать коррекцию функции рассеяния точки, чтобы предотвратить искажение и неправильную реконструкцию полученных МР-данных. Несмотря на устойчивое постепенное увеличение pH _и с течением времени, в этом исследовании не было достигнуто полной нормализации pH опухоли _и . Следовательно, дальнейшие анализы могут включать более длительные периоды наблюдения для выяснения долгосрочных эффектов cTACE на pH опухоли _e и прогностическое значение возможного снижения pH _e с рецидивом опухоли.Однако результаты преднамеренной неполной эмболизации для имитации клинического сценария неэффективности лечения подчеркивают прогностическую ценность pH _и для обнаружения жизнеспособных остатков опухоли на основе кислотности опухоли. Кроме того, исследование проводилось на опухолях VX2 непеченочного происхождения в отсутствие цирротического фона печени. Однако опухоли VX2 являются общей моделью для изучения рака печени, и ранее опубликованные результаты с участием cTACE были скорее предсказуемыми для клинических исходов (48).Они демонстрируют структуру роста, напоминающую локально деструктивные и метастатические опухоли, которые использовались для моделирования различных форм рака, а гиперваскуляризация и относительно крупные сосуды имитируют визуализацию внешнего вида ГЦК и подходят для использования IAT, таких как cTACE (49). Наиболее важно то, что опухоли VX2 представляют собой гипергликолитический фенотип с выраженным «эффектом Варбурга», который используется для визуализации перитуморального закисления в данном исследовании (19, 50). Модель также преодолевает проблемы, присущие часто используемым моделям грызунов, и позволяет проводить терапию cTACE в соответствии с клиническими стандартами и универсально применимыми последовательностями изображений на современных сканерах 3T-MRI.Хотя фармакокинетические исследования на моделях крыс продемонстрировали почечный клиренс TmDOTP ^5-, они также выявили подчиненное медленное уравновешивающее пространство с медленным высвобождением TmDOTP ^5- предположительно из кости (51). Следовательно, будущие исследования должны включать специальные оценки безопасности для использования TmDOTP ^5- в модели опухоли кролика, чтобы проложить путь для клинической трансляции.

В заключение, это трансляционное исследование установило и подтвердило неинвазивную количественную визуализацию опухоли с pH _и как нового молекулярного суррогатного биомаркера опухолевого метаболизма и жизнеспособности при раке печени и реализовало картирование pH _и для выявления терапевтической эффективности cTACE.Поскольку подкисление TME нормализуется в ходе успешной терапии, результаты усиливают роль pH _и для функционального мониторинга ответа опухоли на cTACE. Эти результаты обеспечивают новую концептуальную основу для неинвазивного метаболического профилирования рака печени на основе изображений, которая может быть использована в качестве организующего принципа для индивидуализированных стратегий лечения.

Раскрытие информации о потенциальных конфликтах интересов

Авторы не раскрывали никаких потенциальных конфликтов интересов.

Вклад авторов

Концепция и дизайн: L.J. Savic, D. Peters, M. Lin, T. Schlachter, J.S. Дункан, Ф. Хайдер, Д. Коман, Дж. Чапиро

Разработка методологии: Л.Дж. Савич, Д. Петерс, Дж. Дж. Walsh, M. Lin, A. Sinusas, T. Schlachter, J.S. Дункан, Ф. Хайдер, Д. Коман, Дж. Чапиро

Сбор данных (предоставленные животные, приобретенные и обслуживаемые пациенты, предоставленные помещения и т. Д.): L.J. Savic, I.T. Шоберт, Д. Петерс, Дж.Дж. Уолш, Ф. Лааге-Гаупп, К.А. Hamm, N. Tritz, LA Doemel, M. Lin, A. Sinusas, F. Hyder, D. Coman, J. Chapiro

Анализ и интерпретация данных (например, статистический анализ, биостатистика, вычислительный анализ): LJ Савич, IT Schobert, D. Peters, C.A. Хамм, М. Линь, Дж. Дункан, Ф. Хайдер, Д. Коман, Дж. Чапиро

Написание, рецензирование и / или исправление рукописи: L.J. Savic, I.T. Шоберт, Д. Петерс, Дж. Дж. Уолш, К.А. Хамм, Н. Триц, М. Линь, А.Sinusas, T. Schlachter, J.S. Дункан, Ф. Хайдер, Д. Коман, Дж. Чапиро

Административная, техническая или материальная поддержка (т. Е. Отчетность или систематизация данных, построение баз данных): L.J. Savic, I.T. Шоберт, К.А. Хамм, Н. Триц, Л.А. Домель, М. Лин, Ф. Хайдер, Дж. Чапиро

Руководитель исследования: Л.Дж. Савич, Д. Петерс, Т. Шлахтер, Ф. Хайдер, Д. Коман, Дж. Чапиро

Благодарности

Это исследование финансировалось NIH (R01 CA206180 и R01 EB023366) и Обществом интервенционной онкологии (19-001324).Исследование, описанное в этой статье, также было поддержано Ядром микроскопии Йельского центра печени NIDDK под номером награды P30KD034989. Л.Дж. Савич сообщает о получении грантов от докторантуры Леопольдины помимо представленной работы. Дж. Чапиро сообщает о получении грантов от Немецко-израильского фонда научных исследований и разработок, Фонда радиологических исследований Рольфа В. Гюнтера, Boston Scientific / BTG, Philips Healthcare и Guerbet помимо представленных работ. М. Линь — сотрудник Visage Imaging.ЭТО. Шоберт сообщает о получении грантов от Программы биомедицинского образования помимо представленной работы. Авторы хотели бы поблагодарить Boston Scientific и Guerbet за предоставленные расходные материалы и материалы для экспериментальной части исследования. Мы также благодарим Кристи Хоули, Марину Маммариан, Стефани Торн, Лукаса Адама, Софи Антонию Старк, Паулу Остманн, Джонатана Теферу и Бинг Лю за их поддержку в уходе за животными и обращении с ними.

Расходы на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты страницы.Таким образом, данная статья должна быть помечена как реклама в соответствии с 18 U.S.C. Раздел 1734 исключительно для указания этого факта.

• Получено 30 мая 2019 г.
• Исправление получено 24 июля 2019 г.
• Принято 30 сентября 2019 г.
• Опубликовано впервые 3 октября 2019 г.

• © Американская ассоциация исследований рака, 2019 г.

% PDF-1.3 % 765 0 объект > эндобдж xref 765 58 0000000016 00000 н. 0000005549 00000 н. 0000005712 00000 н. 0000005841 00000 н. 0000005885 00000 н. 0000006294 00000 н. 0000006747 00000 н. 0000007385 00000 н. 0000017459 00000 п. 0000018482 00000 п. 0000019538 00000 п. 0000020417 00000 п. 0000021433 00000 п. 0000021989 00000 п. 0000029739 00000 п. 0000030419 00000 п. 0000030882 00000 п. 0000031470 00000 п. 0000034945 00000 п. 0000035685 00000 п. 0000036198 00000 п. 0000036619 00000 п. 0000043290 00000 н. 0000043816 00000 п. 0000044222 00000 п. 0000044617 00000 п. 0000044677 00000 п. 0000046938 00000 п. 0000047455 00000 п. 0000049085 00000 п. 0000049313 00000 п. 0000049634 00000 п. 0000049738 00000 п. 0000050019 00000 п. 0000050284 00000 п. 0000051471 00000 п. 0000051508 00000 п. 0000052554 00000 п. 0000053605 00000 п. 0000053873 00000 п. 0000053954 00000 п. 0000075879 00000 п. 0000078573 00000 п. 0000130279 00000 н. 0000194530 00000 н. 0000194601 00000 н. 0000194696 00000 н. 0000194769 00000 н. 0000194822 00000 н. 0000194913 00000 н. 0000194966 00000 н. 0000195055 00000 н. 0000195108 00000 н. 0000195222 00000 н. 0000195275 00000 н. 0000195364 00000 н. 0000195417 00000 н. 0000001456 00000 н. трейлер ] >> startxref 0 %% EOF 822 0 объект > поток xZ {\ Ww $ Eb @ `jWY * -X ۪ DQ» X \ & VmUtgm Պ Gl [_] + 3; w G- {9w΍21 (ƕazFˈ} (Rq ~ Ĕ3q 惺 bbUsEɷ \ ^ = \; K1z? {& 2I ث zcZKJoki ە, jc񚩌SDURZ󀝞YQ} Ko2U, A˙AkNRg.