П 5 ст 427 нк: последние изменения и поправки, судебная практика

Содержание

Пониженные тарифы по страховым взносам в 2020 году для МСП

Выбрать журналАктуальные вопросы бухгалтерского учета и налогообложенияАктуальные вопросы бухгалтерского учета и налогообложения: учет в сельском хозяйствеБухгалтер Крыма: учет в унитарных предприятияхБухгалтер Крыма: учет в сельском хозяйствеБухгалтер КрымаАптека: бухгалтерский учет и налогообложениеЖилищно-коммунальное хозяйство: бухгалтерский учет и налогообложениеНалог на прибыльНДС: проблемы и решенияОплата труда: бухгалтерский учет и налогообложениеСтроительство: акты и комментарии для бухгалтераСтроительство: бухгалтерский учет и налогообложениеТуристические и гостиничные услуги: бухгалтерский учет и налогообложениеУпрощенная система налогообложения: бухгалтерский учет и налогообложениеУслуги связи: бухгалтерский учет и налогообложениеОплата труда в государственном (муниципальном) учреждении: бухгалтерский учет и налогообложениеАвтономные учреждения: акты и комментарии для бухгалтераАвтономные учреждения: бухгалтерский учет и налогообложениеБюджетные организации: акты и комментарии для бухгалтераБюджетные организации: бухгалтерский учет и налогообложениеКазенные учреждения: акты и комментарии для бухгалтераКазенные учреждения: бухгалтерский учет и налогообложениеОплата труда в государственном (муниципальном) учреждении: акты и комментарии для бухгалтераОтдел кадров государственного (муниципального) учрежденияРазъяснения органов исполнительной власти по ведению финансово-хозяйственной деятельности в бюджетной сфереРевизии и проверки финансово-хозяйственной деятельности государственных (муниципальных) учрежденийРуководитель автономного учрежденияРуководитель бюджетной организацииСиловые министерства и ведомства: бухгалтерский учет и налогообложениеУчреждения здравоохранения: бухгалтерский учет и налогообложениеУчреждения культуры и искусства: бухгалтерский учет и налогообложениеУчреждения образования: бухгалтерский учет и налогообложениеУчреждения физической культуры и спорта: бухгалтерский учет и налогообложение

20192020

НомерЛюбой

Электронная версия

База знаний

17Ноября2017

Налоговое право: Учебник / Под ред. С.Г. Пепеляева. — М.: Пепеляев Групп, 2020 На основе обобщения и анализа российского и зарубежного опыта налогообложения рассматриваются основные понятия, принципы, институты налогового права. Теоретические положения иллюстрированы примерами из судебно-арбитражной практики. Изучение курса облегчают приведенные в учебнике схемы, контрольные вопросы и тесты, списки рекомендуемой литературы.

27Ноября2017

Двухтомник «Налоговое право»

1) Налоговое право: Учебник / Под ред. С.Г. Пепеляева. — М.: 2020 
2) Налоговое право. Особенная часть / Под общ. ред. С.Г. Пепеляева. — М.: 2017

05Марта2021

Проведение внутренних расследований по фактам корпоративного мошенничества и коррупции

Примерное время чтения: 1 мин.

Корпоративное мошенничество является серьезной проблемой для российских компаний. Уязвимы для мошеннических рисков и крупные международные компании. Как своевременно выявить корпоративное мошенничество? Каковы рекомендации по его предотвращению и проведению внутренних расследований Ответы на эти вопросы — в статье
эксперта «Пепеляев Групп» Сергея Таута
.

04Марта2021

Согласие на обработку персональных данных работника

Примерное время чтения: 3 мин.

Работодателю не нужно согласие работников на обработку персональных данных, если информация будет использована только в рамках внутренних рабочих процессов. Однако если надо оформить полис ДМС или отдать функции по расчету и начислению зарплаты на аутсорсинг, то персональные данные придется передать третьему лицу. Значит, без отдельного согласия работников не обойтись. Что учесть при составлении такого документа, рассказал в статье
Дмитрий Зыков, руководитель практики правовой защиты информации «Пепеляев Групп»
.

04Марта2021

Обзор изменений законодательства и практики за 25 февраля – 3 марта 2021 г.

Примерное время чтения: 1 мин.

Знакомим с новой порцией законодательных новостей. В этом выпуске: пакет изменений в НК РФ, поправки о совершенствовании правового регулирования отношений с участием потребителей, льготная кредитная программа для бизнеса из наиболее пострадавших отраслей.

03Марта2021

Дайджест – «Телекоммуникации, медиа, IT» за 16-28 февраля 2021 г. В РФ разрешено заключать государственные контракты жизненного цикла для IT-систем; Подписан закон об административной ответственности за неисполнение закона «об устойчивом Рунете», за цензуру в соцсетях и за нарушения обработки ПД; Минцифры опубликовало сценарии использования цифрового профиля гражданина; Первое чтение прошел законопроект о налогообложении криптовалют; Для размещения объектов связи следует разрешить использование публичного сервитута – законопроект Минцифры.

03Марта2021

Банкротство: MustRead, выпуск 58

Примерное время чтения: 5 мин.

В новом дайджесте по банкротству:
  • Страхование ответственности топ-менеджеров: быть или не быть?
  • Кто должен доказать наличие активов у должника?
  • Правовая неопределенность спасла от взыскания убытков
  • Восстановленный НДС в банкротстве оплачивается «после всех»?

02Марта2021

В России разворачивается латентный кризис «плохих долгов»

Примерное время чтения: менее минуты

Судя по официальной статистике, Россия проходит кризис, вызванный пандемией, достойно. Банкротств компаний стало меньше на 20%, просроченные долги почти не растут. Но эксперты и сам бизнес говорят о кризисе «плохих долгов» и предсказывают вал исков о банкротстве с января 2021 года. «Учитывая, что кредиторы тоже оказались в непростых условиях, очевидно, что по завершении моратория они предпримут активные меры по взысканию задолженности с использованием механизма банкротства должников. В некоторых отраслях и сферах деятельности число банкротов, судя по проведенным опросам, может превысить 30%», — говорит
Юлия Литовцева, партнер «Пепеляев Групп»
.

01Марта2021

Запрет для адвокатов и новые персональные данные: что вступает в силу в марте

Примерное время чтения: 2 мин.

С марта компании должны будут по-новому обрабатывать персональные данные – вступают в силу изменения в соответствующий закон. Законодатели стремились исключить бесконтрольное использование персональных данных, опубликованных на веб-сайтах. Почти из всех статей закона о персональных данных исключают понятие «общедоступных данных», но закрепляется новое: «персональные данные, разрешенные субъектом для распространения». Под ним понимают доступ к данным для неограниченного круга лиц. Определяются особенности обработки таких персональных данных. Тему прокомментировал
Дмитрий Зыков, руководитель практики правовой защиты информации «Пепеляев Групп»
.

01Марта2021

Налоговые споры в округах: важные для практики выводы (январь 2021 г.)

Примерное время чтения: 19 мин.

Некоторые важные выводы: несогласие налогоплательщика с мерами, принимаемыми налоговым органом при проведении проверочных мероприятий, при условии соответствия этих мер налоговому законодательству и иным нормативным актам, не свидетельствует о нарушении прав и законных интересов налогоплательщика и не может расцениваться как давление на налогоплательщика; формальное нарушение налоговым органом срока направления требования об уплате задолженности и срока принудительного взыскания не может являться основанием для освобождения налогоплательщика от уплаты законно доначисленных налогов и санкций; если дебиторская задолженность отвечает понятию безнадежного долга, закрепленному в п. 2 ст. 266 НК РФ, и имеются документы, подтверждающие правомерность списания долга, указанная задолженность включается в состав внереализационных расходов: с учетом НДС, если принято решение восстановить налог; без учета НДС, если налог не восстанавливается.

01Марта2021

Конкуренция и право: события недели. Выпуск № 7, за 21–28 февраля 2021 г.

Примерное время чтения: 4 мин.

Встречайте первый весенний обзор новостей в сфере защиты конкуренции. В центре внимания: в Госдуму внесен законопроект об унификации требований к банковским гарантиям при закупках госкомпаний; бизнес хочет регламентировать правила недискриминационного доступа к услугам онлайн-агрегаторов.

01Марта2021

Вместе весело шагать или все в САР?

Примерное время чтения: 3 мин.

Юридическая компания «Пепеляев Групп» сообщает о принятии закона, который вносит изменения в регулирование специальных административных районов, расположенных на островах Русский и Октябрьский.

01Марта2021

Обзор налоговых событий за 22 – 28 февраля 2021 г.

Примерное время чтения: 8 мин.

Главные новости: подготовлен законопроект о перечне товаров, подлежащих прослеживаемости; утвержден План деятельности ФНС в 2021 году; ФТС: итоги прошлого года и планы на текущий год; спецсервис для хранения электронных чеков от ФНС; Правительство заявило о жесткой позиции в переговорах с Нидерландами.

26Февраля2021

Уголовно-правовые риски: ловушка для бизнеса

Примерное время чтения: 1 мин.

Новости о громких задержаниях бизнесменов и возбуждении уголовных дел в отношении руководителей юридических департаментов заставляют беспокоиться юристов компаний. Чтобы ответить на вопросы о том, где они видят основные уголовно- правовые риски для бизнеса, журнал Legal Insight провел анонимный опрос среди 80 руководителей юридических департаментов ведущих российских и иностранных компаний и попросил прокомментировать результаты ведущих экспертов. Выводы о налоговых уголовно-правовых рисках проанализировал управляющий партнер юридической фирмы «Пепеляев Групп» Сергей Пепеляев.

26Февраля2021

Обзор судебной практики. Топ антимонопольных споров. Выпуск № 3/2021.

Примерное время чтения: 5 мин.

В новом дайджесте судебной практики по антимонопольным спорам изучены позиции судов по вопросам включения в РНП сведений о подрядчике, который нарушил срок исполнения контракта из-за форс-мажорных обстоятельств; трактовки как акта недобросовестной конкуренции совпадения словесных элементов в средствах индивидуализации; квалификации в качестве антимонопольного нарушения доминирующим на рынке хозсубъектом требований гражданского или иного законодательства. Для подготовки обзора изучены материалы 175 судебных дел.

Для получения доступа к Обзорам судебной практики по налоговым спорам необходимо оформить подписку.

Я уже подписчик

Необходимо авторизоваться чтобы получить доступ

Авторизоваться

По вопросам подписки обращайтесь, пожалуйста, к Маргарите Завязочниковой
E-mail: [email protected]
Nел. +7 (495) 767 00 07

Страховые взносы IT-компании: считаем долю доходов от деятельности в области информационных технологий при получении дивидендов

В соответствии с пп.3 п.1 и пп.1.1 п.2 ст.427 НК РФ для российских организаций, которые осуществляют деятельность в области информационных технологий, разрабатывают и реализуют разработанные ими программы для ЭВМ, базы данных на материальном носителе или в форме электронного документа по каналам связи независимо от вида договора и (или) оказывают услуги (выполняют работы) по разработке, адаптации, модификации программ для ЭВМ, баз данных (программных средств и информационных продуктов вычислительной техники), устанавливают, тестируют и сопровождают программы для ЭВМ, баз данных, на период 2017 — 2023 годов предусмотрены пониженные тарифы страховых взносов в размере 14%.

Пунктом 5 ст. 427 НК РФ для организаций установлены условия применения пониженных тарифов страховых взносов:

  • получение документа о государственной аккредитации организации, осуществляющей деятельность в области информационных технологий, в порядке, установленном Правительством РФ, или свидетельства, удостоверяющего регистрацию организации в качестве резидента технико-внедренческой особой экономической зоны или промышленно-производственной особой экономической зоны;
  • доля доходов от реализации экземпляров программ для ЭВМ, баз данных, передачи исключительных прав на программы для ЭВМ, базы данных, предоставления прав использования программ для ЭВМ, баз данных по лицензионным договорам, от оказания услуг (выполнения работ) по разработке, адаптации и модификации программ для ЭВМ, баз данных (программных средств и информационных продуктов вычислительной техники), а также услуг (работ) по установке, тестированию и сопровождению указанных программ для ЭВМ, баз данных по итогам девяти месяцев года, предшествующего году перехода организации на уплату страховых взносов по пониженным тарифам (для вновь созданных организаций — по итогам расчетного (отчетного) периода) составляет не менее 90 процентов в сумме всех доходов организации за указанный период;
  • средняя численность работников, определяемая в порядке, устанавливаемом федеральным органом исполнительной власти, уполномоченным в области статистики, за девять месяцев года, предшествующего году перехода организации на уплату страховых взносов по пониженным тарифам (для вновь созданных организаций — среднесписочная численность работников по итогам расчетного (отчетного) периода) составляет не менее семи человек.

Организация, осуществляющая деятельность в области информационных технологий, вправе применять пониженные тарифы страховых взносов при одновременном выполнении всех трех перечисленных в п. 5 ст. 427 НК РФ условий.

В случае если по итогам расчетного (отчетного) периода организация не выполняет хотя бы одно из вышеупомянутых условий, а также в случае лишения ее государственной аккредитации такая организация лишается права применять тарифы страховых взносов, предусмотренные пп. 1.1 п. 2 ст. 427 НК РФ, с начала расчетного периода, в котором допущено несоответствие установленным условиям, либо такая организация лишена государственной аккредитации.

Как разъясняют Минфин РФ и ФНС России, с целью применения пониженных тарифов страховых взносов в доле доходов от осуществления деятельности в области информационных технологий организация вправе учесть:

  • доходы от реализации программного обеспечения собственной разработки;
  • доходы от оказания услуг (выполнения работ) по разработке, адаптации и модификации программного обеспечения, в том числе программного обеспечения организаций-партнеров;
  • доходы от оказания услуг (выполнения работ) по установке, тестированию и сопровождению того программного обеспечения, разработку или адаптацию, или модификацию которого она осуществляла (см. письма Минфина РФ от 21.02.2020 N 03-15-06/12789, Письмо ФНС России от 26.02.2020).

Что касается определения доли доходов от осуществления деятельности в области информационных технологий, то согласно п 5. ст. 427 НК РФ в целях данного пункта сумма доходов определяется по данным налогового учета организации в соответствии со ст. 248 НК РФ, при этом в нее не включаются доходы, указанные в п. 2 и п. 11 ст. 250 НК РФ. Таким образом, не участвуют в расчетах внереализационные доходы налогоплательщика в виде:

  • курсовых разниц, образующихся при продаже иностранной валюты (п. 2 ст. 250);
  • курсовых разниц, образующихся от дооценки валютных ценностей, требований, выраженных в иностранной валюте или при уценке обязательств выраженных в иностранной валюте ( п. 11 ст. 250).

Исключение суммы дивидендов, полученных организацией в виде доходов от долевого участия в других организациях (п. 1 ст. 250 НК РФ) из общей суммы доходов организации (т.е. из суммы доходов от реализации товаров, работ, услуг и внереализационных доходов) при расчете доли доходов от осуществления деятельности в области информационных технологий нормой п. 5 ст. 427 НК РФ не предусмотрено.

Таким образом, дивиденды, полученные организацией, должны быть учтены в общей сумме доходов при расчете доли доходов от осуществления деятельности в области информационных технологий. При этом датой получения внереализационных доходов в виде дивидендов от долевого участия в деятельности других организаций признается дата поступления денежных средств на расчетный счет (в кассу) налогоплательщика (пп.2 п.4 ст. 271 НК РФ).

Ответы на вопросы слушателей Единого онлайн-семинара 1С (8 апреля 2020). Часть 2.

Согласно п. 3 постановления Правительства РФ от 02.04.2020 №409, срок представления бухгалтерской (финансовой) отчетности за 2019 год переносится на 3 месяца — до 30 июня 2020 года.

В совместном письме Минфина и ФНС России от 07.04.2020 №07-04-07/27289/ ВД-4-1/5878 @ приведены следующие разъяснения.

По мнению финансового ведомства, продление срока представления бухгалтерской (финансовой) отчетности за 2019 год распространяется только на налогоплательщиков, которые обязаны представлять свою годовую бухгалтерскую отчетность в налоговые органы в соответствии с подп. 5.1 п. 1 ст. 23 НК РФ.

Такими налогоплательщиками являются организации, у которых отсутствует обязанность представлять годовую бухгалтерскую (финансовую) отчетность, составляющую государственный информационный ресурс бухгалтерской (финансовой) отчетности в соответствии с Федеральным законом «О бухгалтерском учете», в налоговый орган. Это организации, годовая бухгалтерская (финансовая) отчетность которых содержит сведения, отнесенные к государственной тайне в соответствии с законодательством РФ, а также организации в случаях, установленных постановлением Правительства Российской Федерации от 22 января 2020 г. N 35.

Для этих организаций днем окончания срока представления обязательного экземпляра отчетности в налоговый орган в 2020 г. является 30 июня 2020 г.

На все остальные организации данный перенос сроков представления бухгалтерской отчетности не распространяется. Они должны ориентироваться на сроки, установленные для представления обязательного экземпляра годовой бухгалтерской отчетности за 2019 год в государственный информационный ресурс бухгалтерской (финансовой) отчетности.

Согласно п. 5 ст. 18 Федерального закона от 06.12.2011 №402-ФЗ «О бухгалтерском учете», в целях формирования государственного информационного ресурса бухгалтерской (финансовой) отчетности экономический субъект обязан представлять один экземпляр составленной годовой бухгалтерской (финансовой) отчетности в налоговый орган по месту нахождения экономического субъекта. Обязательный экземпляр отчетности представляется не позднее трех месяцев после окончания отчетного периода.

Согласно пункту 47 Положения по бухгалтерскому учету ПБУ 4/99 «Бухгалтерская отчетность организации», утвержденного приказом Минфина России от 06.07.1999 №43н, если дата представления бухгалтерской отчетности приходится на нерабочий (выходной) день, то сроком представления бухгалтерской отчетности считается первый следующий за ним рабочий день.

Указом Президента Российской Федерации от 02.04.2020 №239 установлены нерабочие дни с 4 апреля по 30 апреля 2020 г.

В связи с этим днем окончания срока представления обязательного экземпляра годовой бухгалтерской отчетности за 2019 год в налоговые органы в 2020 г. является первый рабочий день, следующий за 31 марта 2020 г., определяемый с учетом нерабочих дней, а также переноса выходных дней, предусмотренного постановлением Правительства РФ от 10.07.2019 №875, т. е. 6 мая 2020 г.

ТОП-5 самых спорных разъяснений про страховые взносы: вредные советы от чиновников

Данные выводы можно сделать, если проанализировать в совокупности подпункт 5 пункта 1, подпункт 3 пункта 2, пункты 3 и 6 статьи 427 Налогового кодекса РФ, ОКВЭД2. Правильность данного подхода подтверждает Минфин России в письме от 19 января 2017 № 03-15-06/2197.

Внезапно весной 2017 года Минфин России сделал вывод, что членские взносы также нужно учитывать в доходах по основному виду деятельности (письмо от 2 марта 2017 № 03-15-05/11813). Дело в том, что деятельность ТСЖ финансируют за счет платежей и (или) взносов членов ТСЖ на оплату стоимости содержания, ремонта общего имущества, коммунальных услуг. Раньше Минтруд России в своих разъяснениях также делал выводы, как в письме Минфина России от 2 марта 2017 № 03-15-05/11813. Только Минтруд указывал, что все суммы целевых взносов и платежей в целях применения пониженных тарифов – доходы по основному виду деятельности (см., например, письмо от 26 мая 2015 № 17-4/ООГ-27).

Судебной практики по данному вопросу нет – все же глава 34 НК РФ действует совсем мало. Арбитражка по закону № 212-ФЗ была разнородная. Так что предугадать исход разбирательства сложно. Поскольку разъяснения Минфина противоречат прямым нормам НК РФ, безопаснее их не применять. Однако если очень хочется платить взносы по пониженным тарифам, узнайте в своей инспекции, что там думают насчет целевых поступлений. В идеале вообще отправить официальный запрос – на него должны дать ответ по существу (подп. 4 п. 1 ст. 32 НК РФ).

Разъяснение № 5: СНТ членские и целевые взносы учитывают в доходах для целей пониженных тарифов

Еще одна категория организаций на упрощенке, которые заняты управлением недвижимым имуществом – садовые некоммерческие товарищества (СНТ). Условия для пониженных тарифов у них такие же, как у ТСЖ и ТСН.

В коридорах Минфина на Ильинке посовещались и решили, что обижать СНТ нехорошо. Тем более у них зачастую 99 процентов доходов составляют именно членские и целевые взносы членов товарищества. При этом страховые взносы все же надо платить. Поэтому такие поступления хоть и целевые по своей природе, но вполне себе доход для целей пониженных тарифов (письмо от 24 апреля 2017 № 03-15-05/24417).

Чиновников нисколько не смутило то, что их «широкий жест» вступает в формальное противоречие с прямыми нормами статьи 427 НК РФ. Комментарии излишни.

Общее резюме: скоро начнутся массовые проверки по страховым взносам и начнет формироваться судебная практика. Хорошо, если налоговики на местах окажутся такими же добрыми, как представители Минфина и ФНС в официальных письмах. А то сейчас такие разъяснения с посылом «можно не платить» больше похожи на вредные советы от Григория Остера.

Новости компании «Объединенные КриптоСистемы»

17:01, 19 Октября 2020

Федеральным законом №265-ФЗ от 31.07.2020 г. предусмотрены льготы по страховым взносам для IT-организаций.

С 1 января 2021г. для таких компаний установлено бессрочное применение пониженных тарифов по страховым взносам:

  • 6 процентов — на обязательное пенсионное страхование;
  • 1,5 процента — на обязательное социальное страхование на случай временной нетрудоспособности и в связи с материнством;
  • 0,1 процента — на обязательное медицинское страхование.

Применять их смогут организации осуществляющие деятельность в области информационных технологий и компании, которые занимаются проектированием и разработкой изделий электронной компонентной базы и электронной (радиоэлектронной) продукции. Требования,  которым IT-компания должна соответствовать  для применения пониженных тарифов, закреплены в пп. 3 п. 1 и п. 5 ст. 427 НК РФ. 

Для организаций-разработчиков  электронной продукции  условия, при которых можно платить взносы по пониженным тарифам, установлены в новом п. 14 ст. 427 НК РФ (пп. «д» п. 5 ст. 1 Закона № 265-ФЗ).

В программах 1С:ЗУП ред.3. и 1С:ЗКГУ ред.3. начиная с версии 3.1.15.96 внесены следующие изменения:



Фото 1 из 1

Твитнуть

Поделиться

Плюсануть

Поделиться

Отправить

Класснуть

Линкануть

Запинить

Новый пакет налоговых льгот для IT-компаний с 2021 года

Мария Овсянникова, Менеджер по налоговому и юридическому консалтингу Crowe CRS 
Источник: RusBase

Изменились ли в 2021 году льготы для IT-компаний? Что произошло с налогом на прибыль и НДС? В нововведениях разбиралась Мария Овсянникова, менеджер по налоговому и юридическому консалтингу Crowe CRS.

Наличие налоговых льгот в определенной отрасли экономики служит индикатором заинтересованности государства в ее развитии. Усиление льготирования в сфере IT-технологий ярким образом иллюстрирует такой интерес.

Обновления налогового льготирования, действующие с 2021 года, разработаны на основании предложенного президентом «налогового маневра», цель которого – создать благоприятную для разработчиков юрисдикцию, развить долгосрочную перспективу импортозамещения и выиграть в борьбе за кадры, то есть сократить поток IT-специалистов, стремящихся работать в иностранных юрисдикциях. Особенно пакет налоговых льгот актуален в свете пандемии коронавируса, которая ясно обозначила необходимость ускоренной цифровой трансформации и подчеркнула высокую степень зависимости от зарубежного софта.

Страховые взносы

Тарифы страховых взносов для IT компаний значительно снизились – теперь суммарно они составляют 7,6%. Самое весомое понижение пришлось на тариф на обязательное медицинское страхование – с 4,0% до 0,1%. Тарифы по страховым взносам на страхование на случай временной нетрудоспособности и в связи с материнством и тарифы на обязательное пенсионное страхование составляют 1,5% и 6,0%.

Льготирование компаний в IT

Право на пониженные тарифы страховых взносов сохраняется за IT-компаниями с госаккредитацией Минкомсвязи в качестве таковых и получившими резидентство в технико-внедренческой или промышленно-производственной ОЭЗ. Штат должен насчитывать 7 или более человек, а доля доходов от деятельности в IT – минимум 90% общего дохода. Деятельностью в области IT по-прежнему считается деятельность по реализации экземпляров программ для ЭВМ, баз данных, передаче исключительных прав на них, а также по предоставлению прав использования программ для ЭВМ и баз данных по лицензионным договорам.

Юридически не вновь созданные организации должны соблюсти перечисленные условия за девять месяцев года, предшествующего периоду, когда компания начала уплачивать взносы по пониженным тарифам. Вновь созданные организации должны будут соблюсти требования по итогам отчетного (расчетного) периода.

В этом году появилось существенное дополнение, сужающее круг организаций, способных претендовать на льготирование: программы для ЭВМ и базы данных должны быть самостоятельно созданы компанией, применяющей льготу. Тем самым законодатель поощряет именно разработку IT-продуктов, а не их «перепродажу».

Компании, которые зарабатывают на IT-продуктах для распространения рекламы, а также поиска клиентов, под льготу не попадают – эти доходы не входят в 90% дохода. Видимо, эта оговорка нацелена на то, чтобы не поощрять налоговыми льготами IT-технологии без высокого инновационного потенциала и ориентированные на развитие продаж существующей продукции широкого профиля. 

Условия закреплены п. 5 ст. 427 НК РФ.

О налоге на прибыль

Согласно п. 1.15 ст. 284 НК РФ для российских компаний в IT 3% составила налоговая ставка по налогу, зачисляемому в федеральный бюджет, и 0% – в субъект Российской Федерации.

Условия применения указанных ставок идентичны закрепленным НК РФ для страховых взносов. Укажем, что об идентичности норм, задающих пороговые значения для применения льгот по страховым взносам и налогу на прибыль, говорит и финансовое ведомство (см. Письмо Минфина России от 24.08.2020 № 03-03-07/74034).

НДС

Правки в части НДС прямым образом не названы как те, которые касаются именно IT-области, но тесно с ней связаны.

На наш взгляд, эти изменения, в отличие от понижения тарифов страховых взносов, послужат не в пользу налогоплательщиков.

До 2021 года действовала норма подп. 26 п. 2 ст. 149 НК РФ, по которой не начислялся налог на реализацию, выполнение, передачу, оказание для собственных нужд на территории Российской Федерации исключительных прав на программы для ЭВМ, базы данных, а также прав на использование указанных результатов интеллектуальной деятельности на основании лицензионного договора. Но с этого года данная норма, измененная Федеральным законом от 31.07.2020 № 265-ФЗ, актуальна лишь для ПО, внесенного в реестр Минпромторга.

По ст. 1262 Гражданского кодекса РФ регистрация программ для ЭВМ и баз данных добровольная, но теперь без нее нельзя воспользоваться освобождением от НДС по подп. 26 п. 2 ст. 149 НК РФ.

Добавим, что с этого года льготы по НДС нет у компаний, если передаваемые права способствуют увеличению продажи посредством маркетинга и рекламы. Здесь, на наш взгляд, законодатель также захотел «отсечь от льготы» не обладающие инновационностью IT-продукты. Мотивы введения обязательной регистрации программы для ЭВМ или базы данных в реестре до конца не ясны.

Налоговые последствия взаимозависимости

По-прежнему актуален вопрос налоговых последствий взаимозависимости сторон. Как и ранее, Налоговый кодекс не ограничивает взаимозависимых лиц в IT-отрасли в их праве на применение пониженных ставок по налогу на прибыль, пониженных страховых взносов или освобождение от НДС. Хотя контролирующие органы делают оговорку на возможные злоупотребления и создание схем уклонения, эта оговорка применима к любому налоговому вопросу, а не только к рассматриваемой ситуации.

В целом фискальная нагрузка на отрасль информационных технологий снизилась – главным образом за счет понижения тарифов страховых взносов и благодаря низким ставкам по налогу на прибыль.

К слову, ставка в 3% (пониженная с 20%) действительно является одной из самых низких ставок в мире. Условия предоставления IT-компаниям льгот по страховым взносам изменились значительно. Усложняет положение новое условие получения права не уплачивать НДС для российского лицензионного софта – теперь это можно сделать только при регистрации в специальном государственном реестре российского ПО. Ранее этот реестр был обязательным только для IT-бизнеса, участвующего в госзакупках. 

По оценкам Минцифры, с 2021 года на налоговые льготы смогут претендовать около 13 тыс. компаний сферы информационных технологий. Эффект стимулирующих мер уже проявляется: число заявок на госаккредитацию в качестве IT-бизнеса сильно выросло и, по прогнозам специалистов Минцифры, только продолжит расти. И бизнес, и государство заинтересованы в создании отечественных уникальных IT-разработок, которые поощряются в том числе налоговыми преференциями.


% PDF-1.4 % 364 0 obj> эндобдж xref 364 92 0000000016 00000 н. 0000003292 00000 н. 0000003430 00000 н. 0000003656 00000 н. 0000002183 00000 п. 0000003699 00000 н. 0000003828 00000 н. 0000003860 00000 н. 0000004007 00000 н. 0000004166 00000 н. 0000004628 00000 н. 0000005725 00000 н. 0000006782 00000 н. 0000007826 00000 н. 0000008295 00000 н. 0000012694 00000 п. 0000013838 00000 п. 0000014009 00000 п. 0000023295 00000 п. 0000024692 00000 п. 0000083203 00000 п. 0000084919 00000 п. 0000085033 00000 п. 0000085145 00000 п. 0000085216 00000 п. 0000085291 00000 п. 0000085394 00000 п. 0000085484 00000 п. 0000085527 00000 п. 0000085621 00000 п. 0000085664 00000 п. 0000085813 00000 п. 0000085856 00000 п. 0000085956 00000 п. 0000086043 00000 п. 0000086215 00000 п. 0000086258 00000 п. 0000086349 00000 п. 0000086444 00000 п. 0000086601 00000 п. 0000086644 00000 п. 0000086742 00000 п. 0000086858 00000 н. 0000087033 00000 п. 0000087075 00000 п. 0000087155 00000 п. 0000087236 00000 п. 0000087395 00000 п. 0000087437 00000 п. 0000087527 00000 п. 0000087615 00000 п. 0000087777 00000 п. 0000087819 00000 п. 0000087924 00000 п. 0000088033 00000 п. 0000088164 00000 п. 0000088206 00000 п. 0000088288 00000 п. 0000088369 00000 п. 0000088457 00000 п. 0000088499 00000 н. 0000088541 00000 п. 0000088632 00000 п. 0000088674 00000 п. 0000088716 00000 п. 0000088758 00000 п. 0000088878 00000 п. 0000088920 00000 н. 0000089038 00000 п. 0000089080 00000 п. 0000089122 00000 п. 0000089164 00000 п. 0000089275 00000 п. 0000089317 00000 п. 0000089359 00000 п. 0000089401 00000 п. 0000089443 00000 п. 0000089485 00000 п. 0000089592 00000 п. 0000089635 00000 п. 0000089678 00000 п. 0000089720 00000 н. 0000089828 00000 п. 0000089871 00000 п. 0000089914 00000 н. 0000089957 00000 н. 00000

00000 п. 00000 00000 н. 00000 00000 п. 00000

00000 п. 00000

00000 п. 00000 00000 п. трейлер ] >> startxref 0 %% EOF 368 0 obj> поток %! $ bYlRRx’W / A ~ j | JPsW` / 9 \ + uԄP! 38-} SǵԤ] eIFa6 ꄰ) +! y.`Bf * ​​gHDm, JDFoy1x [$ 2mnz-W4 \ As [| DcsvL! R * 8K’A4m & ̯b * jta e% dPt_0sS5) ƫbIoK ~ c_

EpCAM-high стволовые клетки рака печени сопротивляются цитотоксичности, опосредованной естественными клетками-киллерами CEACAM1 за счет up

Общие сведения

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) — вторая ведущая причина смерти от рака и пятая по распространенности злокачественная опухоль в мире.1 2 После десятилетий неудач иммунной терапии недавнее использование ингибиторов иммунных контрольных точек продемонстрировало эффективность у пациентов с запущенной стадией ГЦК.3 Однако частота ответа на препарат ниволумаб, направленный против запрограммированной смерти 1, по-прежнему составляет менее 20% как у пациентов, ранее не получавших сорафениб, так и у пациентов, получавших сорафениб, с запущенной стадией ГЦК. Монотерапия не смогла достичь основных целей в качестве лечения первой линии при запущенном ГЦК.5 Следовательно, существует острая потребность в новых методах, которые могут использовать противоопухолевый иммунный ответ для лечения ГЦК.6

Естественные киллеры (NK) — это важные лимфоциты, которые могут убивать инфицированные вирусом и раковые клетки.7–9 NK-клетки выполняют важные функции во время раннего развития ГЦК. NK-клетки определяются как клетки CD3 CD56 + у человека и как клетки CD3 NK1.1 + или CD3 NKp46 + у мышей.10 Активный баланс между сигналами активации и ингибирующие рецепторы регулируют функции NK-клеток.11 Большие популяции NK-клеток, экспрессирующие высокие уровни активирующих рецепторов и низкие уровни ингибирующих рецепторов, участвуют в контроле HCC.12 13 Кроме того, существует положительная корреляция между плотностью инфильтрирующих внутриопухолевых NK-клеток и общей выживаемостью у пациентов с HCC.12 ​​14 Тем не менее, внутриопухолевые NK-клетки при HCC обнаруживают дефектный гамма-интерферон (IFN-γ) и фактор некроза опухоли альфа. (TNF-α), что указывает на необходимость эндогенной стимуляции NK-клеток или адоптивной терапии NK-клетками у пациентов с этой опухолью.

Раковые стволовые клетки (РСК), описываемые как небольшая подгруппа раковых клеток со способностью к самообновлению, могут давать дифференцированное потомство.15 Эти клетки являются причиной рецидива, метастазирования и устойчивости к химиотерапии при раке; таким образом, CSC являются многообещающими мишенями для лечения рака16. Биомаркеры CSC для HCC включают молекулу адгезии эпителиальных клеток (EpCAM), CD90, CD44, CD133, CD24 и CD13; некоторые из них могут функционально поддерживать фактические фенотипы CSC в печени.15 17 18 Среди биомаркеров CSC EpCAM представляет собой трансмембранный гликопротеин I типа, который действует как кальций-независимая гомофильная молекула клеточной адгезии.19 EpCAM напрямую влияет на клеточный цикл и пролиферацию клеток, действуя как фактор транскрипции путем активации c-myc, циклина A и циклина E.19 EpCAM + Клетки ГЦК, полученные из клеточных линий и образцов опухолей, являются высокоинвазивными и канцерогенными, что делает EpCAM полезным биомаркером для исхода выживаемости при ГЦК. 18 20 21 Высокие уровни экспрессии EpCAM при ГЦК связаны с клинико-патологическими особенностями. болезни, включая высокий уровень альфа-фетопротеина (AFP) и плохую дифференциацию22.

Уязвимость CSC для NK-клеток до конца не изучена. Более ранние исследования показали сниженную иммуногенную природу CSC по сравнению с не-CSC на основании пониженных уровней экспрессии MHC класса I (MHC-I), тем самым указывая на уязвимость CSC для нацеливания на NK-клетки.23 Считается, что восприимчивость CSC к атаке NK также обусловлена ​​активацией рецепторов естественной цитотоксичности, в частности NKp30 и NKp44.23 Несколько доклинических исследований продемонстрировали многообещающую роль иммунотерапии NK в преимущественном воздействии на CSC24. нет исследований цитотоксичности NK-клеток в отношении РСК при ГЦК. В этом исследовании мы исследовали, проявляют ли NK-клетки повышенную или пониженную цитотоксичность по отношению к CSC печени EpCAM high , и мы определили основной механизм.

Методы

Образцы пациентов и клиническая информация

Были изучены медицинские карты всех пациентов, перенесших хирургические вмешательства в нашем учреждении в период с января 2012 года по декабрь 2017 года. Индивидуальное согласие пациента было отклонено из-за ретроспективного характера этого исследования с одобрения Институционального наблюдательного совета Сеульской больницы Святой Марии. В это исследование были включены двести двенадцать пациентов с ГЦК, перенесших хирургическое лечение.Все пациенты находились под наблюдением до декабря 2018 г. Диагноз ГЦК был основан на результатах различных методов визуализации и биомаркерах опухолей в соответствии с последними международными рекомендациями, в том числе рекомендациями Американской ассоциации по изучению заболеваний печени и Европейской ассоциации по изучению заболеваний печени. Исследование печени.1 2 Все пациенты были патологически подтверждены как имеющие ГЦК после операции. Резекцию и трансплантацию печени выполняли, как описано ранее.25 ELISA на белок CEACAM1 в сыворотке крови пациентов выполняли, как описано ранее.26 год

Культура клеток

Клетки Huh-7, HepG2, K562 и Hepa1-6 выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) с 10% фетальной бычьей сывороткой (Invitrogen), 100 мкг / мл пенициллина и 0,25 мкг / мл стрептомицина (Invitrogen). Клетки Hep3B выращивали в минимальной необходимой среде (MEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) с 10% фетальной бычьей сывороткой (Invitrogen), 100 мкг / мл пенициллина и 0,25 мкг / мл стрептомицина (Invitrogen). Все клеточные линии поддерживали при 37 ° C и 5% CO 2 .Клеточные линии Huh-7, HepG2, Hep3B и K562 были приобретены из Американской коллекции типовых культур.

Трансдукция shRNA-CEACAM1-лентивирусов

Клетки Huh-7 выращивали в среде DMEM (Invitrogen) с 10% фетальной бычьей сывороткой (Invitrogen), 100 мкг / мл пенициллина и 0,25 мкг / мл стрептомицина (Invitrogen) при 37 °. C и 5% CO 2 . Клетки, трансдуцированные короткой шпилечной РНК (shRNA), выращивали в полной среде, содержащей 1 мкг / мл пуромицина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Используя метод shRNA для подавления экспрессии CEACAM1, у Sigma-Aldrich были приобретены два различных типа лентивирусных конструкций shRNA-CEACAM1 с подтвержденными последовательностями.Последовательности этих кшРНК следующие: CCGGCTATCACTCTAATTCGGATTTCTCGAGAAATCCGAATTAGAGTGATAGTTTTTG и CCGGCCACCTAACAAGATGAATGAACTCGAGTTCATTCATCTTGTTAGGTGGTTTTTG. Лентивирусный вектор кшРНК MISSION (Sigma) трансдуцировали в клетки Huh-7. Через 48 часов к клеткам добавляли 1 мкг / мл пуромицина, которые выращивали в течение 4 недель в полной среде, содержащей пуромицин, до достижения стабильного фенотипа.

Анализ цитотоксичности и дегрануляции

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) от взрослых здоровых доноров выделяли с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла-гипака, как описано ранее.27 NK-клеток были отделены от PBMC с использованием стартового набора OctoMACS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA), как описано ранее. 27 Клетки гепатомы культивировали в 24-луночном планшете в течение 24 часов. Затем добавляли изолированные человеческие NK-клетки в различных соотношениях эффектор-мишень. Затем добавляли 1 нг / мл каждого человеческого рекомбинантного интерлейкина-12 (IL-12). После дополнительных 6 часов инкубации при 37 ° C цитотоксичность анализировали путем окрашивания йодидом TO-PRO-3. Для положительного контроля клетки убивали замораживанием-оттаиванием (-70 ° C в течение 10 мин).Для анализа дегрануляции клетки гепатомы (1 × 10 5 клеток / лунку) культивировали в 24-луночном планшете в течение 24 часов. Затем клетки-мишени совместно культивировали с NK-клетками при различных соотношениях эффектор-мишень. К каждой культуре добавляли анти-CD107a-PE (20 мкл), и через 6 часов инкубации NK-клетки окрашивали на поверхностные биомаркеры CD3 и CD56, а также с помощью набора LIVE / DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit (ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) в течение 30 мин в темноте при 4 ° C. Анализ дегрануляции проводили с использованием проточной цитометрии.

Для экспериментов с опосредованной антителами блокировкой использовали антитело против CEACAM1 (D14HD11; Abcam, Кембридж, Великобритания) или антитело изотипического контроля в концентрации 20 мкг / мл. Перед экспериментами по совместному культивированию блокирующие антитела обрабатывали либо клетками гепатомы, либо NK-клетками в течение 1 часа при 37 ° C. Чтобы заблокировать CEACAM1 исключительно на клетках гепатомы или на NK-клетках, следовали 3 промывки PBS для удаления свободных и неплотно прикрепленных антител.

Проточная цитометрия

Для многоцветной проточной цитометрии использовались следующие коммерчески доступные антитела: BV510-конъюгированные анти-CD3, PE-конъюгированные анти-CD107a, APC-конъюгированные анти-ICAM1, PE-конъюгированные анти-EpCAM, PE- конъюгированный анти-CD13, FITC-конъюгированный анти-CD44, FITC-конъюгированный анти-CD90, PE-конъюгированный анти-CD133 (BD ​​Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США), APC-конъюгированный анти-CD56 (Miltenyi Biotec), APC- конъюгированные анти-MHC-1, APC-конъюгированные анти-ULBP-1, APC-конъюгированные анти-ULBP-2/5/6, APC-конъюгированные анти-ULBP-3, APC-конъюгированные анти-TRAIL-R1 (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США), APC-конъюгированные анти-CEACAM1, APC-конъюгированные анти-HLA-G и APC-конъюгированные анти-MICA / B (Biolegend, Сан-Диего, Калифорния, США).Мертвые клетки были исключены с использованием красного флуоресцентного реактивного красителя LIVE / DEAD (Invitrogen). Для некоторых экспериментов клетки, окрашенные поверхностными маркерами, пермеабилизировали с использованием набора буфера для окрашивания Foxp3 (eBioscience) и дополнительно окрашивали на PE-конъюгированные антиальдегиддегидрогеназы (ALDH) (Sino Biological, PA, USA). Многоцветную проточную цитометрию выполняли с использованием прибора Canto II (BD Biosciences), а данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (TreeStar, Ashland, OR, США).

Иммуноблоттинг

Готовили лизаты клеток, и 20 мкг каждого лизата загружали в гели SDS-PAGE и анализировали иммуноблоттингом, как описано ранее.28 Антитела, используемые для иммуноблотов, были следующими: кроличьи моноклональные анти-CEACAM1 (D1P4T; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), кроличьи поликлональные анти-EpCAM (Abcam), кроличьи поликлональные анти-Bcl-xL, кроличьи поликлональные антитела. -расщепленная каспаза-3, кроличьи поликлональные анти-mTOR (Cell Signaling Technology), мышиные моноклональные анти-β-актин и кроличьи поликлональные анти-GAPDH (Sigma-Aldrich). После блоттинга мембраны инкубировали с первичными антителами (разведенными от 1: 200 до 1: 2000) в течение ночи при 4 ° C.Сигнал детектировали с использованием вторичного антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена, с реагентами с усиленной хемилюминесценцией (GE Healthcare, Бакингемшир, Великобритания). Плотность каждой полосы измеряли с помощью программного обеспечения для визуализации Multi Gage (Raytest). Полные изображения блотов показаны в дополнительной онлайн-информации.

Модель мыши in vivo

Сингенные модели ГЦК были получены путем инъекции 5 × 10 6 или 1 × 10 6 клеток Hepa1–6 (клетки рака печени мыши) во фланг 6-недельного C57BL. / 6 мышей.Затем в соответствии с графиком вводили антитела против NK1.1 (Invitrogen) и против CEACAM1 (NOVUS, Centennial, CO, США) (20 мкг). Размер опухоли измеряли цифровым штангенциркулем и рассчитывали по формуле LW 2 /2, где L — длина, а W — ширина. Ткань опухоли удаляли с помощью скальпеля и измельчали ​​до почти жидкой консистенции. Затем удаляли супернатант, добавляли буфер для лизиса эритроцитов и смесь хранили при 26 ° C в течение 3 минут. После центрифугирования при 1500 об / мин в течение 5 минут супернатант удаляли и добавляли 10 мл 1 × PBS для осторожной промывки осадка.Затем осадок суспендировали в 200 мкл 1 × PBS для флуоресцентного окрашивания и анализа FACS.

Лаборатория лабораторных животных Korea Excellence Управления по контролю за продуктами и лекарствами Кореи была аккредитована в 2007 году Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) и Департаментом лабораторных животных (DOLA) Католического университета Кореи, кампус Сонгеуи, и получил полную оценку и аккредитацию Международной аккредитации по уходу за лабораторными животными в 2018 году. Все процедуры исследования на животных проводились в соответствии с Законом о благополучии лабораторных животных, Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, а также Руководством и политикой экспериментов на грызунах, предоставленными IACUC в Медицинской школе Корейского католического университета (Сертификат No.CUMS-2017-0322-02).

Иммуногистохимия и иммунофлуоресценция

Залитые парафином блоки были разделены (толщиной 5 мкм) и перенесены на силанизированные стеклянные предметные стекла. Затем срезы депарафинизировали в ксилоле и регидратировали в спирте с определенной последовательностью. Извлечение антигена осуществляли путем нагревания образца в 0,01 М цитратном буфере (pH 6,0) с использованием микроволнового вакуумного гистопроцессора (RHS-1; Milestone, Бергамо, Италия) при конечной температуре 121 ° C в течение 15 минут. Чтобы заблокировать активность эндогенной пероксидазы, срезы блокировали 3% перекисью водорода в метаноле в течение 10 мин.Срезы инкубировали с мышиными антителами против CEACAM-1 / CD66a (R&D Systems), анти-EpCAM (клон: MOC-31, Abcam), анти-CD45 (Abcam) и анти-CD56 (Abcam) антителами, которые были разведены до соотношение 1:50 в разбавителе антител Dako (Dako, Carpinteria, CA, USA) с компонентами, снижающими фон, при комнатной температуре в течение 30 мин. После промывки использовали систему Dako EnVision Plus (Dako) при комнатной температуре в течение 5 мин. Иммунореакцию проводили диаминобензидином в течение 5 мин с последующим контрастным окрашиванием гематоксилином.Иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью конфокальной микроскопии выполняли, как описано ранее, с антителами против CEACAM1 и против EpCAM.29

Статистический анализ

Программное обеспечение SPSS V.20 использовалось для всех анализов. Дискретные переменные сравнивались с использованием критерия χ 2 , а независимый t-критерий использовался для непрерывных переменных. Тесты корреляции Пирсона были выполнены для анализа корреляций между двумя параметрами. Статистическая значимость определялась как значение p <0.05.

Результаты

Экспрессия EpCAM в перитуморальной области представляет собой самую высокую частоту рецидивов после лечебной операции по поводу ГЦК.

Иммуногистохимическое окрашивание на EpCAM было выполнено в хирургически удаленных тканях человека с ГЦК (рис. 1A – C). Паттерны экспрессии EpCAM были классифицированы как пантуморальные положительные (A), отрицательные (B) или перитуморальные положительные (C). Репрезентативные результаты окрашивания для EpCAM и CD45 в нормальной печени и печени с острым вирусным гепатитом представлены на дополнительных рисунках 1A и 1B онлайн.Ткани HCC с перитуморальной экспрессией EpCAM (рисунок 1C) имели «инвазивный фронт» с EpCAM-положительными клетками (красный квадрат), в то время как клетки во внутриопухолевой области были отрицательными для белка (синий квадрат). Клетки, которые были положительно окрашены на EpCAM, противостояли различным иммунным клеткам, экспрессирующим CD45, а также NK-клеткам, экспрессирующим CD56, которые проникли в строму опухоли (фигура 1D).

Рисунок 1

Различные паттерны экспрессии EpCAM в тканях гепатоцеллюлярной карциномы человека (ГЦК) и их связь с рецидивом опухоли после лечебной хирургии.(A – C) Паттерны экспрессии EpCAM в 280 тканях HCC человека: (A) пантуморальный положительный (n = 76), (B) отрицательный (n = 169) и (C) перитуморальный положительный (n = 35) (красный квадрат) : инвазивный фронт, синий квадрат: внутриопухолевая область). (D) Паттерны окрашивания EpCAM, CD45 и CD56 в EpCAM + и AFP + HCC. N — неопухолевая печень; S — стромальная ткань опухоли; Т, опухоль. Многие NK-клетки CD56 + обнаруживаются в стромальной ткани опухоли (стрелка). (E) Кривая Каплана-Мейера для безрецидивной выживаемости 280 пациентов с ГЦК после лечебной операции в соответствии с паттернами экспрессии EpCAM: EpCAM + и EpCAM HCC.(F – G) Сывороточный AFP и экспрессия Ki-67 опухоли в EpCAM + и EpCAM HCC. (H) Кривая Каплана-Мейера для безрецидивной выживаемости 280 пациентов с ГЦК после лечебной операции в соответствии с паттернами экспрессии EpCAM: пантуморальный EpCAM + , перитуморальный EpCAM + и EpCAM HCC. (I – J) Сывороточный AFP и опухоль Ki-67 экспрессия в пантуморальном EpCAM + , перитуморальном EpCAM + и EpCAM HCC.

Затем мы провели анализ выживаемости, используя информацию о пациентах.Клинические характеристики включенных в исследование пациентов представлены в таблице 1. Пациенты с EpCAM + HCC показали более короткую безрецидивную выживаемость после радикальной хирургической операции (рисунок 1E). Репрезентативные результаты окрашивания для EpCAM и Ki-67 представлены на дополнительных рисунках 1C и 1D. Уровни АФП в сыворотке и процент клеток, экспрессирующих Ki-67, были выше у пациентов с EpCAM + HCC (рис. 1F и G). После разделения группы пациентов EpCAM + на пантуморальные группы EpCAM + и перитуморальные группы EpCAM + с ГЦК, мы обнаружили, что перитуморальная группа пациентов с ГЦК EpCAM + показала самую короткую выживаемость без рецидива (рис. 1H), хотя сывороточный AFP уровни и процент Ki-67-положительных клеток были ниже, чем в группе пантуморального EpCAM + HCC (рис. 1I и J).

Таблица 1

Исходные характеристики зарегистрированных пациентов

Аттенуированный NK-клеточный цитолиз EpCAM

высокий Клетки Huh-7

Экспрессия различных маркеров раковых стволовых клеток проверялась в клетках Huh-7 и EpCAM, ALDH, CD13 , и было обнаружено, что CD133 экспрессируется в клетках Huh-7 (рисунок 2A). Значительное количество клеток Huh-7, экспрессирующих EpCAM, были положительными по CD13 (99%) и CD133 (51%) (дополнительный рисунок 2 в Интернете). Для экспериментов in vitro клетки Huh-7 окрашивали флуоресцентным антителом против EpCAM, и приблизительно 10% верхней и нижней популяций (клетки EpCAM high Huh-7, клетки EpCAM low Huh-7) в пересчете на интенсивности флуоресценции были отсортированы с использованием FACS Aria III (рисунок 2B).Затем был обнаружен цитолиз, опосредованный NK-клетками, при соотношении эффекторных клеток и клеток-мишеней 1: 1 и 5: 1 соответственно. Клетки EpCAM high Huh-7 были более устойчивы к цитолизу, опосредованному NK-клетками, чем клетки Huh-7 EpCAM low (фигура 2C). Характер экспрессии лигандов, которые связываются с рецепторами NK-клеток, исследовали, чтобы определить причину. Среди них было обнаружено, что CEACAM1, который, как известно, подавляет активность NK-клеток, экспрессируется на разных уровнях в клетках EpCAM high Huh-7 и EpCAM low Huh-7.Клетки EpCAM high Huh-7 экспрессировали более высокие уровни CEACAM1, чем клетки EpCAM low Huh-7 (фигура 2D). Подобные результаты наблюдались в других линиях клеток рака печени, HepG2 и Hep3B (рисунок 2F). EpCAM high HepG2 клетки были более устойчивы к NK-опосредованному уничтожению (фигура 2G). Иммуноблоттинг проводили для проверки уровней экспрессии белка EpCAM high и EpCAM low в клетках Huh-7. Было обнаружено, что уровень белка CEACAM1 выше в клетках EpCAM high Huh-7, чем в клетках EpCAM low Huh-7 (рис. 2H и I).Дополнительные рисунки демонстрируют отсутствие значительных различий в экспрессии лигандов NK-клеток в соответствии с другими маркерами раковых стволовых клеток, такими как уровни CD13, CD133 и ALDH в клетках Huh-7 (дополнительный рисунок 3 онлайн), а также в клетках HepG2. (дополнительный рисунок 4 онлайн).

Рисунок 2

Аттенуированный NK-клеточный цитолиз клеток EpCAM high Huh-7. (A) Дифференциальная экспрессия различных маркеров раковых стволовых клеток в клетках Huh-7. Данные представляют пять независимых экспериментов.(B) Окрашивание клеточной поверхности EpCAM в клетках Huh-7 и деление на популяции клеток EpCAM high и EpCAM low . (C) Дифференциальная цитотоксичность NK-клеток в клетках EpCAM high и EpCAM low Huh-7. ИЛ-12 добавляли во время экспериментов по цитотоксичности в концентрации 1 нг / мл. гистограммы представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего (n = 5). *** р <0,001. (D) Дифференциальная экспрессия лигандов, которые связываются с рецепторами NK-клеток на поверхности клеток EpCAM high и EpCAM low Huh-7.Данные представляют пять независимых экспериментов. (E) Экспрессия CEACAM1 в клетках CD13 + , CD133 + , ALDH high и CD13 , CD133 , ALDH low Huh-7. Данные представляют пять независимых экспериментов. (F) Экспрессия CEACAM1 в клетках HepG2 и Hep3B EpCAM high и EpCAM low . Данные представляют пять независимых экспериментов. (G) Дифференциальная цитотоксичность NK-клеток в клетках HepG2 EpCAM high и EpCAM low .ИЛ-12 добавляли во время экспериментов по цитотоксичности в концентрации 1 нг / мл. Гистограммы представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего (n = 5). (H) Уровни белка CEACAM1 в клетках EpCAM high и EpCAM low Huh-7. Данные представляют из трех независимых экспериментов. (I) Количественная оценка уровней белка CEACAM1, Bcl-xL, EpCAM в клетках EpCAM high и EpCAM low Huh-7. Гистограммы представляют собой средние значения ± SEM (n = 3). * p <0,05, *** p <0,001.

Подавление CEACAM1 усиливает цитотоксичность, опосредованную NK-клетками, в клетках Huh-7

Чтобы подтвердить влияние CEACAM1 на опосредованную NK-клетками гибель клеток, было выполнено опосредованное лентивирусами нокдаун CEACAM1, и стабильные клеточные линии были созданы по колонии выбор (рисунок 3А).Не было существенной разницы в жизнеспособности клеток между клетками shCEACAM1 и shControl Huh-7 при обработке ингибитором тирозинкиназы сорафенибом (фигура 3B). Мы провели дополнительные эксперименты с использованием клеток CEACAM1 high и CEACAM1 low Huh-7, отсортированных с использованием FACS Aria III. Обработка сорафенибом не привела к какой-либо значительной разнице в жизнеспособности клеток между клетками CEACAM1 high и CEACAM1 low Huh-7 (фигура 3C). Однако при лечении TNF-α и циклогексимидом повышенный апоптоз был отмечен в клетках shCEACAM1 Huh-7 (рисунок 3D).При совместном культивировании стабильных клеточных линий shControl и shCEACAM1 Huh-7 с активированными NK-клетками мы наблюдали повышенную цитотоксичность NK-клеток в клетках Huh-7, подавляющих CEACAM1 (фигура 3E). Блокирование белка CEACAM1 на поверхности клеток Huh-7 с помощью антитела против CEACAM1 усиливало уничтожение клеток shControl Huh-7, но не клеток shCEACAM1 Huh-7, что позволяет предположить, что наша система нокдауна достаточна для демонстрации того, что CEACAM1 на поверхности клеток находится в Клетки Huh-7 имеют решающее значение в NK-опосредованном уничтожении (рис. 3F).Интересно, что дегрануляция NK-клеток была значительно выше при совместном культивировании с клетками shCEACAM1 Huh-7 (рисунок 3G). Однако не было различий в экспрессии лигандов, которые связываются с активирующими или ингибирующими рецепторами NK-клеток, между клетками shCEACAM1 и shControl Huh-7 (фигура 3H). Более того, молчание CEACAM1 не оказывало никакого влияния на экспрессию маркеров CSC в клетках Huh-7 (онлайн-дополнительная фигура 5). В совокупности эти данные позволяют предположить, что подавление CEACAM1 делает клетки гепатомы уязвимыми для апоптоза цитотоксическими стимулами и активнее активирует NK-клетки во время совместного культивирования.

Рисунок 3

Дифференциальная цитотоксичность, опосредованная NK-клетками, в зависимости от уровня экспрессии CEACAM1 в клетках Huh-7. (A) Создание CEACAM1-молчащих и контрольных клеточных линий Huh-7. Эффективность нокдауна была подтверждена проточной цитометрией и иммуноблоттингом. (B) Сорафениб-индуцированная гибель клеток в подавленных CEACAM1 и контрольных клеточных линиях Huh-7. Гистограммы представляют собой средние значения ± SEM (n = 3). (C) Сорафениб-индуцированная гибель клеток между клетками CEACAM1 high и CEACAM1 low Huh-7.Гистограммы представляют собой средние значения ± SEM (n = 3). (D) Дифференциальная экспрессия белков при апоптозе или выживании клеток после стимуляции с помощью CHX и TNF-α в клеточных линиях, подавляющих CEACAM1, и контрольных клеточных линиях Huh-7. Данные представляют два независимых эксперимента. (E) Дифференциальная цитотоксичность NK-клеток в клеточных линиях с подавленным CEACAM1 и контрольных клеточных линиях Huh-7. Гистограммы представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего (n = 5). * р <0,05. (F) Дифференциальная цитотоксичность NK-клеток в CEACAM1-замалчиваемых и контрольных линиях клеток Huh-7, когда CEACAM1 на клетках Huh-7 был заблокирован, а не не заблокирован.Гистограммы представляют собой средние значения ± SEM (n = 3). * р <0,05. (G) Дифференциальная экспрессия CD107a в NK при совместном культивировании с подавленным CEACAM1 и контрольными линиями клеток Huh-7. Гистограммы представляют собой средние значения ± SEM (n = 3). *** р <0,001. (H) Экспрессия лигандов, которые связываются с NK-клетками, в клеточных линиях с подавленным CEACAM1 и контрольных клеточных линиях Huh-7. Данные представляют из трех независимых экспериментов.

Блокирование CEACAM1 в NK-клетках приводит к усиленному уничтожению EpCAM

high CSC

Затем мы исследовали рецептор экспрессирующего опухоль CEACAM1 на поверхности NK-клеток.Внеклеточные домены CEACAM1 необходимы для функционирования, так как они необходимы для гомофильных взаимодействий (CEACAM1-CEACAM1) 30. CEACAM1 экспрессировался на поверхности клеток как в NK-клетках CD56 , так и в CD56 dim , и экспрессия увеличивалась после IL. -12 лечения (рисунок 4А, Б). Чтобы подтвердить ингибирующие эффекты NK-клетки CEACAM1 на активацию клеток, NK-клетки, обработанные антителом против CEACAM1, культивировали совместно с клетками K562 в соотношениях 1: 1 и 5: 1. Нейтрализация экспрессии CEACAM1 в NK-клетках привела к значительному увеличению лизиса клеток K562 (фиг. 4C).В то же время дегрануляция была выше, когда CEACAM1 был заблокирован в NK-клетках (рисунок 4D). Опосредованная NK-клетками цитотоксичность в клетках Huh-7 также была выше после нейтрализации CEACAM1 в NK-клетках (фигура 4E). Наконец, клетки Huh-7 EpCAM high и EpCAM low культивировали совместно с NK-клетками с нейтрализацией экспрессии CEACAM1 или без нее. NK-опосредованная цитотоксичность в клетках EpCAM high была сравнима с таковой в клетках EpCAM low после нейтрализации CEACAM1 в NK-клетках.Это свидетельствует о том, что нейтрализация NK-клеток CEACAM1 может изменить устойчивость ЦСК печени EpCAM high к NK-опосредованной цитотоксичности (фиг. 4F).

Рисунок 4

Блокирование CEACAM1 в NK-клетках приводит к усиленному уничтожению CSC EpCAM high . (А) Экспрессия CEACAM1 на поверхности NK-клеток. IL-12 добавляли в концентрации 1 нг / мл в течение 6 часов. (B) Экспрессия CEACAM1 в двух разных подмножествах NK-клеток. IL-12 добавляли в концентрации 1 нг / мл в течение 6 часов. Данные представляют из трех независимых экспериментов.(C) Повышенная цитотоксичность NK-клеток против клеток K562, когда CEACAM1 на поверхности NK-клеток был заблокирован. Гистограммы представляют собой средние значения ± SEM (n = 3). * р <0,05. (D) Повышенная дегрануляция NK-клеток, когда CEACAM1 на поверхности NK-клеток был заблокирован. Гистограммы представляют собой средние значения ± SEM (n = 3). ** р <0,01. (E) Повышенная цитотоксичность NK-клеток против клеток Huh-7, когда CEACAM1 на поверхности NK-клеток был заблокирован. Гистограммы представляют собой средние значения ± SEM (n = 3). *** р <0,001. (F) Повышенная цитотоксичность NK-клеток против EpCAM high Huh-7 клеток, когда CEACAM1 на поверхности NK-клеток был заблокирован.Данные представляют из трех независимых экспериментов.

In vivo активация внутриопухолевых NK-клеток антителом против CEACAM1

Для подтверждения наших результатов in vitro были проведены эксперименты in vivo с сингенной моделью HCC на мышах. Клетки Hepa1-6 окрашивали на EpCAM и разделили на две группы (EpCAM high и EpCAM low ; фиг. 5A). Затем клетки вводили в бок мышам. Размер опухолей с EpCAM high Hepa1-6 клеток увеличивался более быстрыми темпами, чем опухоли с EpCAM low Hepa1-6 клеток (рисунок 5B).Иммуногистохимические исследования показали, что опухоли, полученные из клеток EpCAM high Hepa1-6, показали более высокую экспрессию EpCAM, чем опухоли, полученные из клеток EpCAM low Hepa1-6 (рис. 5C, D). Интересно, что в опухолях EpCAM high экспрессия EpCAM была более очевидной в перитуморальных областях (фигура 5D). Значительно более высокие уровни экспрессии CEACAM1 наблюдались в перитуморальных областях опухоли EpCAM high (красный квадрат), хотя внутриопухолевые уровни CEACAM1 не были очевидны в опухолях EpCAM high и EpCAM low (синий квадрат) (рисунок 5C, D).С помощью конфокальной микроскопии было подтверждено, что клетки EpCAM high и CEACAM high совместно локализованы на периферии опухоли (фигура 5E). В другом эксперименте in vivo антитело против CEACAM1 вводили на 7-й и 14-й день инъекции клеток Hepa1-6 (фиг. 5F). Для истощения NK-клеток антитело против NK1.1 вводили на 7-й и 14-й день инъекции гематомы (фигура 5F). Популяции внутриопухолевых NK-клеток были исследованы и проанализированы с использованием проточной цитометрии после переваривания сингенных опухолей (фигура 5G).Количество NK-клеток уменьшилось после истощения клеток антителом против NK1.1 по сравнению с контрольной группой (фигура 5H). Размеры опухолей измеряли по графику и сравнивали. Через четырнадцать и 21 день после инъекции опухолевых клеток наблюдалось значительное увеличение размера опухоли после инъекции антитела против NK1.1 и значительное уменьшение размера опухоли после инъекции антитела против CEACAM1 (фигура 5I). Увеличение размера опухоли после истощения NK-клеток и уменьшение после нейтрализации CEACAM1 также наблюдались, когда аналогичные эксперименты проводились только с отсортированными по FACS клетками EpCAM high (фигура 5J и дополнительная фигура 6 в режиме онлайн).Активность внутриопухолевых NK-клеток определяли по поверхностной экспрессии CD69. Уровень экспрессии CD69 на NK-клетках был разделен на средний и высокий уровни в соответствии с распределением в популяции (рисунок 5K). Процентные и средние значения интенсивности флуоресценции (MFI) внутриопухолевых NK-клеток CD69 total (средний + высокий) и CD69 high NK-клеток были проанализированы с использованием проточной цитометрии (фиг. 5L, M). Значения MFI NK-клеток CD69 high показали значительное увеличение внутриопухолевых NK-клеток, обработанных антителом против CEACAM1 (фиг. 5M).

Рисунок 5

Активация in vivo внутриопухолевых NK-клеток антителом против CEACAM1. (A) Окрашивание EpCAM в клетках Hepa1-6 и их деление на популяции клеток EpCAM high и EpCAM low . (B) Последовательные изменения размера опухолей, образованных из клеток Hepa1-6 EpCAM high и EpCAM low (5 × 10 6 клеток). ** р <0,01. (C – D) Экспрессия EpCAM и CEACAM1 в опухолях EpCAM low и EpCAM high в сингенной модели ГЦК (красный квадрат: инвазивный фронт, синий квадрат: внутриопухолевая область).Данные представляют пять независимых экспериментов. (E) Иммунофлуоресцентное окрашивание EpCAM (зеленый), CEACAM1 (красный) и ядер (синий) в опухолях EpCAM high сингенной модели мыши. Масштабная шкала соответствует 20 мкм. (F) Экспериментальный график в сингенной модели мышей HCC. Двадцать микрограммов антитела αCEACAM1 или αNK1.1 вводили внутрибрюшинно. (G) Стратегия гейтинга для количественного определения клеток NK1.1 с использованием проточной цитометрии. (H) Подтверждение истощения NK-клеток антителом αNK1.1.Данные представляют четыре независимых эксперимента. (I) Последовательные изменения размера опухолей, образованных из клеток Hepa1-6 (5 × 10 6 клеток) после обработки антителом αCEACAM1 или αNK1.1. * р <0,05. (J) Серийные изменения размера опухолей, образованных из клеток Hepa1-6 EpCAM high (1 × 10 6 клеток) после обработки антителом αCEACAM1 или αNK1.1. * р <0,05, ** р <0,01. (K) Уровень экспрессии CD69 в NK-клетках, выделенных из опухолей у мышей с имитацией инъекции или αCEACAM1.(L – M) Частота и MFI экспрессирующих CD69 NK-клеток, выделенных из опухолей у мышей с имитацией инъекции или αCEACAM1. ** р <0,01. Все данные экспериментов на мышах выражены как среднее ± стандартное отклонение, n = от 5 до 10 мышей на группу.

Экспрессия CEACAM1 коррелирует с экспрессией EpCAM в тканях HCC человека

Наконец, экспрессия белка CEACAM1 была оценена в тканях HCC человека. CEACAM1 экспрессировался в тканях HCC человека на разных уровнях и по разным образцам. Иммунофлуоресценция с мгновенно замороженными тканями HCC человека, экспрессирующими EpCAM, в перитуморальных раковых клетках продемонстрировала, что только EpCAM-положительные клетки экспрессируют CEACAM1 на клеточной поверхности (фигура 6A).Иммуноблоттинг с тканями HCC человека продемонстрировал положительную корреляцию между экспрессией EpCAM и CEACAM1 на уровне белка (фиг. 6B, C). Интересно, что уровни CEACAM1 в сыворотке также были значительно выше у пациентов с EpCAM + HCC (рисунок 6D).

Фиг.6.

Связь уровня CEACAM1 с экспрессией EpCAM в тканях гепатоцеллюлярной карциномы человека (HCC). (A) Иммунофлуоресценция EpCAM и CEACAM1 в тканях HCC человека. Данные представляют из трех независимых экспериментов.Масштабная шкала соответствует 10 мкм. (B – C) Положительная корреляция экспрессии EpCAM с экспрессией CEACAM1 на уровне белка в тканях рака печени (n = 17). Данные были проанализированы с помощью корреляции Пирсона. * р <0,05. (D) Более высокий уровень CEACAM1 в сыворотке у пациентов с EpCAM-положительным HCC (n = 20), чем EpCAM-отрицательный HCC (n = 43). * р <0,05.

Обсуждение

В этом исследовании мы впервые продемонстрировали, что ЦСК печени EpCAM high сопротивляются цитотоксичности, опосредованной NK-клетками, за счет активации CEACAM1 на поверхности клеток.Используя клеточные линии, мышиную модель и полученные от пациентов образцы, наши данные предполагают, что нацеливание на CEACAM1 может оказаться полезным для искоренения EpCAM-экспрессирующих CSC при ГЦК.

С молекулярной точки зрения, ГЦК — очень гетерогенное заболевание.31 32 Известные факторы риска ГЦК обычно вызывают неразрешимый воспалительный ответ, характеризующийся инфильтрацией незрелых миелоидных клеток, лимфоцитов и макрофагов. играют решающую роль в иммунном ответе против ГЦК 8, 9 обеспечивая основу для разработки новых стратегий лечения для улучшения клеточного ответа NK-клеток на лечение ГЦК.

Недавно было продемонстрировано преимущественное нацеливание NK-клеток на CSC: было показано, что NK-клетки являются основными иммунными эффекторами, способными воздействовать и формировать несколько низкодифференцированных опухолей, таких как рак полости рта, глиобластома, поджелудочная железа и меланома23 24 34–36 Интересно, что даже несмотря на то, что недифференцированные опухоли обладают высокой устойчивостью к химиотерапевтическим препаратам или лучевой терапии, сообщается, что они очень чувствительны к цитотоксичности, опосредованной NK-клетками.37 38 Однако другое сообщение продемонстрировало, что РСК молочной железы оказались устойчивыми к NK. клетки, 39, поэтому этот вопрос вызывает споры.На сегодняшний день сообщений об устойчивости к ГЦК нет.

Разные молекулярные сигнатуры были обнаружены в разных субпопуляциях CSC при HCC.40 Различные гены имеют независимую связь с прогнозом HCC в разных субпопуляциях CSC, что подразумевает, что на прогрессирование опухоли и внутриопухолевую гетерогенность влияет разнообразный транскриптом CSC печени.40 Среди различных биомаркеры раковых стволовых клеток при ГЦК, EpCAM является наиболее хорошо известным поверхностным биомаркером пролиферирующих протоковых клеток (PDC) у различных видов, включая крыс, мышей и людей.41 Дифференциация EpCAM-позитивных PDC из печени мыши и человека в холангиоцитах и ​​гепатоцитах указывает на возникновение гепатоканцерогенеза, происходящего от стволовых клеток / предшественников, из EpCAM-позитивных клеток.41 В недавнем метаанализе было обнаружено, что сверхэкспрессия EpCAM связана с клинико-патологические особенности ГЦК, включая высокие уровни АФП и плохую дифференцировку.22 Примечательно, что роль EpCAM была подчеркнута в связанном с вирусом гепатита B (HBV) HCC.42 В реплицирующихся HBV клетках экспрессия EpCAM регулирует внутримембранный протеолиз, способствует активация канонической передачи сигналов Wnt и приводит к более высокой экспрессии генов плюрипотентности hCSC , OCT4 и NANOG , а также маркеров SOX2 , CD44, , BAMBI 3 и 9 CD.42

Результаты текущего исследования согласуются с недавними иммуногистохимическими анализами, которые продемонстрировали, что экспрессия EpCAM в перитуморальных тканях печени (клетках на «инвазивном фронте») была связана с плохим прогнозом.43 44 Перитуморальные клетки сталкиваются с инфильтрирующими опухоль иммунными клетками. и противостоять цитотоксичности со стороны различных иммунных клеток, включая NK-клетки. В отличие от других биомаркеров CSC, на которые преимущественно нацелены NK-клетки, CSC печени EpCAM + , по-видимому, противостоят NK-опосредованной цитотоксичности и вызывают прогрессирование опухоли, тем самым сопротивляясь давлению со стороны инфильтрирующих опухоль иммунных клеток.Недавно сообщалось, что IFN-γ, полученный из NK-клеток, способен стимулировать HCC за счет активации EpCAM у трансгенных мышей по HBV.45 Наши данные согласуются с этим сообщением, поскольку клетки EpCAM + постоянно противостоят NK-клеткам и выживают. под их противоопухолевым давлением.

Это исследование впервые продемонстрировало, что активация CEACAM1 в клетках EpCAM + связана с устойчивостью к NK-клеткам. CEACAM1 представляет собой трансмембранный гликопротеин, экспрессируемый на эндотелиальных, эпителиальных и иммунных клетках.46 Функции CEACAM1 зависят от его внеклеточных доменов для межклеточной адгезии с CEA (гетерофильный) и CEACAM1 (гомофильный). Кроме того, CEACAM1 прикрепляется к белку TIM-3 и регулирует толерантность и истощение Т-клеток.30 Среди членов семейства CEACAM CEACAM1 является единственным гликопротеином, который имеет ингибирующий мотив на основе иммунорецепторного тирозина.30 Альтернативный сплайсинг CEACAM1 может привести к к секреции вариантов CEACAM1. Существует ограниченное понимание роли секретируемых вариантов CEACAM1; однако они могут действовать как рецепторы-ловушки и ингибировать внутриклеточную гомофильную адгезию.30 В иммунной системе, особенно в NK-клетках, CEACAM1 исследовали на предмет его связанной с опухолью функции. Уклонение от NK-опосредованного уничтожения опухолевых клеток надежно стимулируется CEACAM1 на опухолевых клетках.47 48 Независимое от экспрессии MHC класса I ингибирование NK-опосредованного уничтожения происходит в присутствии CEACAM1 на поверхности как меланомы, так и NK-клеток.47

При различных формах рака, включая ГЦК, высокие уровни экспрессии CEACAM1 связаны с метастазированием, плохой общей выживаемостью и прогрессированием опухоли.30 49 Прямые противоопухолевые эффекты, включая активацию функции иммунных клеток или ингибирование роста опухолевых клеток, могут возникать, когда CEACAM1 нацелен на терапевтическое моноклональное антитело. В предыдущем исследовании на NK-опосредованное уклонение от иммунитета влияла экспрессия CEACAM1 на опухолевых клетках, что приводило к сокрытию лигандов, которые связываются с NKG2D, в NK-клетках.30 50 В этом отчете исследователи провели большую часть экспериментов по подавлению молчания с помощью клетки аденокарциномы толстой кишки человека и мыши. Различное происхождение типов клеток (рак толстой кишки по сравнению с ГЦК) могло вызывать разные ответы на молчание CEACAM1.Кроме того, мы провели анализы для исследования потенциальных различий в экспрессии MICA / B в клетках CEACAM1 high и CEACAM1 low среди клеток Huh-7 и HepG2. Не было разницы в экспрессии MICA / B между этими клетками. В совокупности наши данные показывают, что CEACAM1-опосредованная устойчивость против NK-индуцированного цитолиза не связана со сниженной экспрессией лигандов NKG2D в клетках HCC. Подобные результаты были представлены в недавнем отчете, в котором авторы продемонстрировали, что уровни CEACAM1 на поверхности клетки, уровни мРНК CEACAM1 и уровни растворимого CEACAM1 в супернатантах были значительно выше в Huh7.5.1 клеток, инфицированных ВГС, чем неинфицированных клеток Huh7.5.126. Кроме того, было показано, что пациенты с ХГС имеют более высокие уровни CEACAM1 в сыворотке по сравнению со здоровыми людьми.26 Эти результаты подтверждаются в настоящем исследовании.

% PDF-1.6 % 208 0 объект > эндобдж xref 208 117 0000000016 00000 н. 0000003567 00000 н. 0000003788 00000 н. 0000003917 00000 н. 0000003953 00000 н. 0000004189 00000 п. 0000004240 00000 п. 0000004400 00000 н. 0000004544 00000 н. 0000004704 00000 п. 0000004849 00000 н. 0000005038 00000 н. 0000005181 00000 п. 0000005341 00000 п. 0000005486 00000 н. 0000005751 00000 п. 0000006471 00000 н. 0000006560 00000 н. 0000006845 00000 н. 0000007384 00000 п. 0000009094 00000 н. 0000010286 00000 п. 0000011484 00000 п. 0000012672 00000 п. 0000013495 00000 п. 0000013758 00000 п. 0000013866 00000 п. 0000013976 00000 п. 0000014556 00000 п. 0000014826 00000 п. 0000015376 00000 п. 0000015510 00000 п. 0000022885 00000 п. 0000022924 00000 п. 0000023493 00000 п. 0000023588 00000 п. 0000023841 00000 п. 0000024348 00000 п. 0000026259 00000 п. 0000028004 00000 п. 0000029326 00000 п. 0000030824 00000 п. 0000032367 00000 п. 0000033863 00000 п. 0000035121 00000 п. 0000036560 00000 п. 0000038061 00000 п. 0000085449 00000 п. 0000094714 00000 п. 0000098128 00000 п. 0000098383 00000 п. 0000153976 00000 н. 0000154387 00000 н. 0000210091 00000 н. 0000263925 00000 н. 0000264397 00000 н. 0000264656 00000 н. 0000265068 00000 н. 0000300992 00000 н. 0000301031 00000 н. 0000301367 00000 н. 0000301456 00000 н. 0000301592 00000 н. 0000302790 00000 н. 0000303009 00000 н. 0000303123 00000 п. 0000303432 00000 н. 0000303480 00000 н. 0000303723 00000 н. 0000303805 00000 н. 0000303930 00000 н. 0000304018 00000 н. 0000304090 00000 н. 0000304460 00000 н. 0000304530 00000 н. 0000304637 00000 н. 0000304748 00000 н. 0000304820 00000 н. 0000304944 00000 н. 0000305016 00000 н. 0000305161 00000 п. 0000305233 00000 п. 0000305446 00000 н. =

Комбинированная терапия у нелеченных пациентов улучшает исход при назальной NK / T лимфоме: результаты клинического исследования

  • 1.

    Уши К. Прогресс, понимание и лечение злокачественных новообразований естественных клеток-киллеров. Br J Haematol. 2007; 139: 532–44.

    Артикул Google ученый

  • 2.

    Корт Х., Адвани Р. Экстранодальный естественный киллер / Т-клеточная лимфома. Лимфома лейка. 2009. 50: 1773–84.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • 3.

    Авилес А., Родригес Л., Гусман Р. и др. Ангиоцентрическая Т-клеточная лимфома носа, придаточных пазух носа и твердого неба.Гематол Онкол. 1992; 10: 141–4.

    PubMed Статья Google ученый

  • 4.

    Авилес А., Диас Н., Нери Н., Клето С., Талавера А. Ангиоцентрическая назальная Т / лимфома из естественных киллерных клеток. Единый центр исследования прогностических факторов у 108 пациентов. Clin Lab Haematol. 2000; 22: 215–20.

    PubMed Статья Google ученый

  • 5.

    Li YX, Luang H, Feng XL и др. Иммунофенотипические характеристики и клиническая значимость CD56 + и CD56-, экстранодальных естественных киллеров носового типа / Т-клеточной лимфомы.Лимфома лейка. 2011; 52: 417–24.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • 6.

    Ай В, Чанг Э. Т., Фиш К., Фу К., Вайзенбургер СС, Киган ТН. Расовые паттерны экстранодальной лимфомы естественных киллеров / Т-клеток, носового типа в Калифорнии. Br J Haematol. 2012; 156: 626–32.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • 7.

    Li YX, Liu QF, Fang H, et al.Различные клинические проявления носовой лимфомы и лимфомы с естественным киллером Вальдейера / Т-клеточной лимфомы. Clin Cancer Res. 2009; 15: 2905–12.

    PubMed Статья Google ученый

  • 8.

    Kim GE, Cho JH, Yang WO et al. Ангиоцентрическая лимфома головы и шеи: закономерности системной недостаточности после лучевой терапии. J Clin Oncol. 2006: 244–63.

  • 9.

    Li YX, Liu GF, Wang HW и др. Типы отказов и клинические последствия при первичной лучевой терапии на ранней стадии носовой лимфомы с естественными киллерами / Т-клетками.Рак. 2011; 117: 5203–11.

    PubMed Статья Google ученый

  • 10.

    Lee J, Suh C, Park YH, et al. Экстранодальный естественный убийца / Т-клеточная лимфома, носовой тип: прогностическая модель из ретроспективного многоцентрового исследования. J Clin Oncol. 2006; 24: 612–8.

    PubMed Статья Google ученый

  • 11.

    Suzuki R, Suzumiya J, Yamaguchi M, et al. Факторы прогноза естественных новообразований клеток-киллеров (NK): агрессивный NK-клеточный лейкоз и экстранодальная NK-клеточная лимфома, носовой тип.Энн Онкол. 2010; 21: 1032–40.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • 12.

    Wang ZY, Li YX, Wang H, et al. Неблагоприятный прогноз для пожилых пациентов с ранней стадией экстранодальной NK / T-клеточной лимфомы носового типа. Энн Онкол. 2011; 22: 390–6.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • 13.

    Wang ZY, Li XY, Wang WH и др. Первичная лучевая терапия показала благоприятный результат при лечении NK / Т-клеточной лимфомы добавочного носового типа у детей и подростков.Кровь. 2009. 114: 4771–6.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • 14.

    Yoo JY, Chi KH, Ymg MH, et al. Лучевая терапия в сравнении с химиотерапией в качестве начального лечения локализованной носовой лимфомы естественных киллеров / Т-клеток. Энн Онкол. 2004; 15: 618–25.

    Артикул Google ученый

  • 15.

    Chim CS, Ma SY, Au YA, et al. Первичная лимфома из естественных клеток-киллеров.Долгосрочный результат лечения и связь с Международным прогностическим индексом. Кровь. 2004. 103: 212–24.

    Google ученый

  • 16.

    Шикама Н., Учеда Х., Накамура С. и др. Локализация агрессивной неходжкинской лимфомы носовой полости. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2001; 51: 1228–33.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • 17.

    Cheong MM, Chan JKC, Lau WN, et al.Назальная NK / Т-клеточная лимфома на ранней стадии. Клинический исход, прогностические факторы и влияние метода лечения. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2002; 54: 182–90.

    Артикул Google ученый

  • 18.

    Макдональд С.Л., Малрой Л., Уилке Д.Р., Баррел С. ПЭТ / КТ помогает в определении стадии и планировании лучевой терапии для экстранодальной лимфомы с естественными киллерами / Т-клетками носового типа на ранней стадии. Радиат Онкол. 2011; 6: 182.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • 19.

    Wang H, Li YX, Wang WH и др. Умеренная токсичность и благоприятный прогноз высокодозной и расширенной лучевой терапии с модулированной интенсивностью поля для пациентов с NK / T-клеточной лимфомой носа на ранней стадии. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2012; 82: 1115–21.

    PubMed Статья Google ученый

  • 20.

    Li YX, Wang H, Jin J, et al. Только лучевая терапия с лечебной целью у пациентов с экстранодальной NK / T-клеточной лимфомой I стадии носового типа.Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2012; 82: 1809–15.

    PubMed Статья Google ученый

  • 21.

    Chauchetad A, Michallet AS, Berger F, et al. Полная ремиссия после лучевой химиотерапии первой линии как предиктор выживаемости при экстранодальной NK / T-клеточной лимфоме. J Hematol Oncol. 2012; 8: 2–7.

    Google ученый

  • 22.

    Huang LI, Lin X, Cai Q, et al. Долгосрочные исходы пациентов с недавно диагностированной лимфомой с естественными киллерами / Т-клетками, получавших режим этопозида, преднизона, винкристина, циклофосфамида и доксорубицина.Лимфома лейка. 2011; 52: 1041–8.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • 23.

    Ямагути М., Тобинай К., Огучима М. и др. Исследование фазы I / II одновременной химиолучевой терапии локализованной назальной лимфомы естественных киллеров / Т-клеток. J Clin Oncol. 2009. 27: 5594–600.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • 24.

    Ким С.Дж., Ким К., Ким Б.С. и др. Испытание фазы II одновременного облучения и еженедельного приема цисплатина с последующей химиотерапией VIPD при впервые диагностированной стадии от IE до IIE, носовой, экстранодальной NK / T-клеточной лимфоме.J Clin Oncol. 2009. 27: 6027–32.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • 25.

    Шимада К., Судзуки Р. Параллельная химиолучевая терапия экстранодальной ограниченной стадии, лимфомы с естественными киллерами / Т-клетками носового типа. J Clin Oncol. 2010; 29: e239. (Письмо).

    Google ученый

  • 26.

    Jaclard A, Cachard N, Marin B, et al. Эффективность L-аспарагиназы с метотрексатом и дексаметазоном (режим Asad-Met-Dex) у пациентов с рефрактерной или рецидивирующей экстранодальной NK / T-клеточной лимфомой.Кровь. 2011; 117: 1834–9.

    Артикул Google ученый

  • 27.

    Ямагути М., Куонг Ю.Л., Ким К.С. и др. Испытание фазы II химиотерапии SMILE для вновь диагностированной стадии IV, рецидивирующей или рефрактерной экстранодальной лимфомы с естественными киллерами / Т-клетками носового типа. J Clin Oncol. 2009. 29: 4410–6.

    Артикул Google ученый

  • 28.

    Yong W, Zheng W, Zhu J, et al. L-аспарагиназа в лечении рефрактерной и рецидивирующей экстранодальной NK / T-клеточной лимфомы носового типа.Ann Hematol. 2009. 88: 647–52.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • 29.

    Чан А, Тан Т, Не Т и др. УЛЫБАТЬСЯ или нет: поддерживающая терапия имеет значение. J Clin Oncol. 2012; 30: 1015–6. (Письмо).

    PubMed Статья Google ученый

  • 30.

    Квонг Ю.Л., Андерсон Б.О., Адвани Р., Ким В.С., Левин А.М., Лин СТ. Управление Т-клеточными и естественными новообразованиями-киллерами в Азии.Ланцет Онкол. 2009; 10: 1093–101.

    PubMed Статья Google ученый

  • 31.

    Авилес А., Нери Н., Фернандес Р., Кальва А., Уэрта-Гусман Дж., Намбо М.Дж. Назальная NK / T-клеточная лимфома с диссеминированным заболеванием, леченная агрессивной комбинированной химиотерапией. Med Oncol. 2003; 20: 13–7.

    PubMed Статья Google ученый

  • 32.

    Авилес А., Клето С., Кастаньеда С., Намбо М.Дж.CMED в лечении назальной T / -клеточной лимфомы с отдаленными метастазами. Гематология. 2007; 12: 241–4.

    PubMed Статья Google ученый

  • 33.

    Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B и др. Отчет международного семинара по стандартизации критериев ответа на неходжкинскую лимфому. J Clin Oncol. 1999; 17: 1244–53.

    PubMed CAS Google ученый

  • 34.

    Исида Ф., Нишина С., Асано Н. и др. Поздний рецидив экстранодальной лимфомы природных киллеров / Т-лимфоцитов составляет более 10 лет. Лимфома лейка. 2010; 51: 171–3.

    PubMed Статья Google ученый

  • Патрулирование NK-клеток и уничтожение донорских дендритных клеток в пользу косвенной аллореактивности

    % PDF-1.6 % 126 0 объект > эндобдж 125 0 объект > поток Acrobat Distiller 7.0 (Windows) 2021-03-06T18: 56: 47-08: 002010-02-02T07: 21: 49 + 05: 30Arbortext Advanced Print Publisher 9.1.510 / W Unicode2021-03-06T18: 56: 47-08: 00application / pdf

  • Патрулирование NK-клеток и устранение донорских дендритных клеток в пользу косвенной аллореактивности
  • uuid: 5ce484f9-8c5d-4267-917a-a101b8fa8ab1uuid: 39160688-1dd2-11b2-0a00-810038f0a2ff конечный поток эндобдж 122 0 объект > эндобдж 2 0 obj > эндобдж 158 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Type / Page >> эндобдж 124 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / Thumb 121 0 R / Type / Page >> эндобдж 1 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / Thumb 3 0 R / Type / Page >> эндобдж 14 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageI] / Properties> / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 15 0 R / Type / Page >> эндобдж 81 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 82 0 R / Type / Page >> эндобдж 86 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 87 0 R / Type / Page >> эндобдж 91 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 92 0 R / Type / Page >> эндобдж 96 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / Thumb 97 0 R / Type / Page >> эндобдж 100 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / Thumb 101 0 R / Type / Page >> эндобдж 190 0 объект [193 0 R] эндобдж 191 0 объект > поток HW] с } У ٱ ĉc ‘{i: — &!) 88X, Et8ɋWhQC ٞ OwɋoPIFQhY.TlɆkb \ 7ƾh) Yv, ƚR6td ~ ((V ܗ: [DY = fBG: 4 «! DA (_OS, MP ‘› ;; ~ ì ~ h ڡ * vSpv, vL4DlYkr (0ø mNz * 9_; RV) c7Uq

    Комбинированная терапия у нелеченных пациентов улучшает исход при назальной NK / T-лимфоме: результаты клинического исследования

    Экстранодальный естественный киллер (NK) / T-клеточная лимфома (NKTCL) носового типа имеет была определена как отдельная клинико-патологическая сущность с 1994 г. (Harris et al. Blood 84: 1361–1392, 1994; Chan et al. Extranodal NK / T-cell лимфома, носовой тип. In: Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW (eds) Классификация опухолей Всемирной организации здравоохранения: патология и генетика опухолей кроветворной и лимфоидной тканей.IARC Press, Лион. п. 204–207, 2001; Чан и др. Экстранодальная NK / Т-клеточная лимфома носового типа. В: Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW (ред.). Классификация опухолей Всемирной организации здравоохранения: патология и генетика опухолей кроветворной и лимфоидной тканей. IARC Press, Лион. п. 285–288, 2008) с агрессивным клиническим течением. Он редко диагностируется в Европе и Северной Америке, но относительно часто встречается в Восточной Азии и Южной Америке, составляя 10–30% всех случаев неходжкинских лимфом (НХЛ) в этих странах (Vose et al.J Clin Oncol 26: 4124–4130, 2008; Au et al. Кровь 113: 3931–3937, 2009; Sun et al. Am J Clin Pathol 138: 429–434, 2012; Ян и др. Диагноз Патол 6:77, 2011). Это заболевание может возникать в любом экстранодальном органе или ткани, но обычно затрагивает верхний аэродинамический тракт (UADT), например носовую полость и кольцо Вальдейера (Aviles et al. Clin Lab Haematol 22: 215-220, 2000; Li et al. Cancer 83: 449–456, 1998; Ли и др. J Clin Oncol 24: 181–189, 2006, Ли и др. Кровь 112: 3057–3064, 2008; Ли и др. Clin Cancer Res 15: 2905–2912, 2009 г.).Клинически он характеризуется преобладанием среди взрослых мужчин, большой долей заболеваний на ранних стадиях, хорошей работоспособностью, обширной инвазивностью первичных опухолей, оценкой низкого риска по Международному прогностическому индексу (IPI) и склонностью к экстранодальному распространению (Au et др. Blood 113: 3931–3937, 2009; Aviles и др. Clin Lab Haematol 22: 215–220, 2000; Li и др. Cancer 83: 449–456, 1998; Li и др. J Clin Oncol 24: 181– 189, 2006; Ли и др. Blood 112: 3057–3064, 2008; Ли и др. Clin Cancer Res 15: 2905-2912, 2009).Прогноз NKTCL варьировался, в основном в зависимости от прогностического фактора и лечения (Cheung et al. Int J Radiat Oncol Biol Phys 54: 182–190, 2002; Chim et al. Blood 103: 216–221, 2004). Редкость и неоднородность NKTCL и отсутствие данных проспективных исследований привели к появлению множества вариантов лечения, режимов химиотерапии, объемов и доз лучевой терапии в различных учреждениях. Тем не менее, лучевая терапия является основой лечения ранней стадии NKTCL. Новый режим химиотерапии показывает многообещающие результаты против рефрактерного или прогрессирующего NKTCL.

    Границы | Налтрексон восстанавливает нарушенный временный рецепторный потенциал меластатин-3-ионного канала в естественных клетках-киллерах у пациентов с миалгическим энцефаломиелитом / синдромом хронической усталости

    Введение

    Миалгический энцефаломиелит / синдром хронической усталости (ME / CFS) — это тяжелое системное приобретенное состояние неизвестной причины, характеризующееся стойкой или повторяющейся потерей трудоспособности, сопровождающейся рядом мультисистемных проявлений (1). В настоящее время не существует подтверждающих диагностических тестов или принятых специфических методов лечения.В настоящее время диагноз основывается на критериях консенсуса Канады (CCC, 2003), а с недавних пор и на Международных критериях клинического случая (ICC, 2011), которые определяют симптомы недомогания после физической нагрузки, утомляемость, не снимающуюся отдыхом, головную боль, боль в суставах и мышцах, память. нарушение концентрации внимания, боль в горле и отек лимфатических узлов как компоненты болезни (2). Кроме того, ME / CFS проявляет нейрокогнитивные, вегетативные, сердечно-сосудистые, нейроэндокринные и иммунные проявления.

    Хотя этиология ME / CFS остается неясной, иммунная дисфункция и нарушения функций естественных киллеров (NK) являются наиболее устойчивыми лабораторными иммунологическими признаками (3–18).NK-клетки представляют собой лимфоциты врожденной иммунной системы, которые контролируют патогены и опухолевые клетки, ограничивая их распространение и последующее повреждение тканей под действием эндогенного интерлейкина-2 (IL-2) и интерлейкина-12 (IL-12), в дополнение к активация иммунных клеток и продукция цитокинов (19). Хотя в некоторых иммунологических отчетах есть несоответствие, различия в фенотипах NK-клеток и значительное снижение количества периферических NK-клеток, приводящее к значительному снижению цитотоксичности NK-клеток, были зарегистрированы при ME / CFS и связаны с тяжестью заболевания (3–18).

    Важно отметить, что NK-клетки нуждаются в кальции (Ca 2+ ) для эффективной стимуляции и функций, включая цитотоксичность NK-клеток (20–23). Внутриклеточная концентрация Ca 2+ ([Ca 2+ ] i ) жестко регулируется многочисленными участниками, включая селективные и неселективные каналы, насосы и обменники, расположенные на плазматической мембране и / или на органеллах. Нарушение этой строго регулируемой гомеостатической системы приводит к нарушению метаболизма Ca 2+ и функций иммунных клеток, играющих ключевую роль в патофизиологии ряда заболеваний и иммунодефицитов (24).

    Одним из основных участников передачи сигналов Ca 2+ является большое и разнообразное семейство неселективных катионных каналов с транзиентным рецепторным потенциалом (TRP), которые функционируют как полимодальные клеточные сенсоры, участвующие в тонкой настройке многих биологических процессов как в возбудимых, так и невозбудимые клетки (25). Подсемейство TRP-меластатина (TRPM) млекопитающих является самым крупным и состоит из восьми членов, широко экспрессирующихся в различных клетках и тканях, таких как сенсорные ганглии, центральная нервная система (ЦНС), бета-клетки поджелудочной железы, иммунные клетки, сердечно-сосудистая система и почечная системы и имеют решающее значение для сенсорной и моторной физиологии (26).В частности, член 3 TRPM (TRPM3) представляет собой проницаемый для Ca 2+ неселективный катионный канал, активируемый широким спектром стимулов в окружающей среде, начиная от температуры, природных химических веществ и токсинов или синтетических соединений, включая эндогенный нейростероид прегненолона сульфат (PregS), и ингибитор потенциалзависимых каналов L-типа Ca 2+ , нифедипин, на механические стимулы. Каналы TRPM3 также реагируют на эндогенные агенты и мессенджеры, образующиеся при повреждении тканей и воспалении (27).Важно отметить, что TRPM3 ранее был идентифицирован как термочувствительный и ноцицепторный канал, участвующий в обнаружении острой чувствительности к теплу и воспалительной тепловой гипералгезии, а также в передаче боли в ЦНС (27). Таким образом, TRPM3 участвует в нескольких патологических состояниях / модальностях, связанных с болью, включая воспалительную или невропатическую боль, и, таким образом, идентифицируется как потенциальная мишень для лечения анальгетиками. Более того, у пациентов с ME / CFS сообщалось о нарушении регуляции терморегуляторных реакций, а генерализованная боль при отсутствии явного повреждения тканей является характеристикой ME / CFS, предполагающей потенциальные нарушения ЦНС (1).

    Наши предыдущие исследования показали, что потеря ионного канала TRPM3 связана с ME / CFS (28, 29). Предыдущее геномное исследование показало важность TRPM3 в патофизиологии ME / CFS и выявило пять однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) (rs6560200, rs1106948, rs12350232, rs11142822, rs18) у TRPM3 пациентов с генами (30). Впоследствии сообщалось о значительном снижении поверхностной экспрессии TRPM3 и мобилизации Ca 2+ в иммунных клетках у пациентов с ME / CFS (31, 32).Недавно в новых электрофизиологических исследованиях использовались методы зажима на целых клетках, чтобы сообщить о значительном снижении активности ионного канала TRPM3 после стимуляции PregS и нифедипином в NK-клетках пациентов с ME / CFS (28, 29). Более того, ионные токи у пациентов с ME / CFS были устойчивы к ононетину в присутствии PregS и нифедипина. Следовательно, нарушение регуляции функции TRPM3 у пациентов с ME / CFS, влияющее на передачу сигналов [Ca 2+ ] i и Ca 2+ , имеет значительные последствия для регуляторного аппарата и функций NK-клеток и представляет собой новую и привлекательную терапевтическую мишень для Патология ME / CFS.

    Существует несколько способов лечения людей, страдающих от сильной или продолжительной боли, характерной для ME / CFS. В настоящее время вещества, называемые опиоидами, агонистами мю (μ) -опиоидных рецепторов (μOR), являются наиболее сильными обезболивающими, доступными в клинической практике (33). Опиоиды опосредуют свои эффекты, взаимодействуя с молекулами, которые принадлежат к группе рецепторных белков, называемых рецепторами, сопряженными с G-белками (GPCR). Эти опиоидные рецепторы широко распространены в ЦНС и играют роль в обнаружении и передаче болевых сигналов (33).Было плохо изучено, как активация опиоидных рецепторов снижает активность чувствительных к боли нервных клеток, однако недавняя литература предполагает, что активация GPCR может влиять на каналы TRPM3 и, в свою очередь, уменьшать поток ионов Ca 2+ через поры (33–1). 35). GPCR взаимодействуют с G-белками, которые при активации рецептором высвобождают димеры Gβγ из субъединиц Gα подсемейства G i / o . Ингибирование активности TRPM3 путем стимуляции GPCR (в частности μOR) опосредуется прямым связыванием субъединицы G βγ с ионным каналом (34).Эти недавние результаты показывают, что препараты, уже используемые для лечения боли, могут косвенно существенно изменить функцию TRPM3 (33).

    Налтрексона гидрохлорид (NTX) — антагонист опиоидов длительного действия, обычно используемый при лечении опиоидной и алкогольной зависимости (36). NTX специфически ингибирует μOR и, в меньшей степени, дельта (δ) -опиоидные рецепторы (δOR), тем самым сводя на нет ингибирующие эффекты агонистов опиоидных рецепторов (37, 38). Недавнее исследование продемонстрировало, что налоксон, альтернатива налтрексону с быстрым ответом, не оказывает прямого воздействия на TRPM3-зависимые сигналы Ca 2+ в нейронах ганглиев дорсальных корешков мыши (33).Однако при совместном применении с DAMGO, высокоселективным агонистом μOR, налоксон полностью предотвращал действие DAMGO, что указывает на возможную роль налоксона в влиянии на передачу сигналов TRPM3. Интересно, что активация TRPM3 нифедипином и PregS также ингибировалась активацией μOR, подтверждая, что ингибирование TRPM3 является важным следствием активации периферической μOR (33, 35). Более того, было высказано предположение, что лечение низкими дозами налтрексона (LDN) может действовать как иммуномодулятор и может быть полезным при ряде воспалительных состояний, включая болезнь Крона, рассеянный склероз и фибромиалгию (39–41).Предыдущие исследования также сообщают о терапевтических эффектах LDN при лечении рака, включая B-клеточную лимфому и рак поджелудочной железы, а также синдромов хронической боли, злокачественных новообразований и психических расстройств за счет уменьшения боли, усталости, нарушений сна, головных болей и желудочно-кишечных заболеваний (42).

    Поскольку ME / CFS потенциально является нарушением ионного канала TRP, возникающим в результате нарушения функции ионного канала TRPM3 (28–32), понимание механизма (ов), участвующих в регуляции и модуляции функции ионного канала, предоставит потенциально важную информацию и приведет к новым мишеням для разработка эффективных терапевтических вмешательств.Кроме того, дозы 3–5 мг LDN в день использовались для лечения различных заболеваний, включая ME / CFS (42, 43). Однако нет литературы, подтверждающей эффективность NTX для пациентов с ME / CFS, поэтому полезность этого препарата при этом состоянии еще предстоит определить. Кроме того, механизмы действия NTX в иммунных клетках и при патологии ME / CFS требуют дальнейшего изучения. Поскольку функция ионного канала TRPM3 нарушена в NK-клетках пациентов с ME / CFS (28, 29), в настоящем исследовании мы стремились изучить способность NTX восстанавливать функцию ионного канала TRPM3 при ME / CFS с использованием методов патч-кламп для всей клетки. .Восстановление функции TRPM3 необходимо для стимулирования ремоделирования сигнала Ca 2+ в NK-клетках. Наши результаты показывают, что NTX восстанавливает TRPM3-подобные ионные токи в стимулированных IL-2 NK-клетках пациентов с ME / CFS после 24-часовой инкубации. Наши результаты также показывают, что NTX не влияет на TRPM3-зависимые сигналы Ca 2+ при прямом применении как на стимулированные IL-2 NK-клетки от неутомленных контрольных групп, так и у пациентов с ME / CFS, что позволяет предположить, что NTX не действует как агонист, прямое соединение с механизмом стробирования ионного канала TRPM3.В заключение, наши новые результаты показывают, что NTX имеет потенциал для восстановления активности канала TRPM3 у пациентов с ME / CFS, что приводит к ремоделированию сигнала Ca 2+ , что, в свою очередь, влияет на функции клеток, подтверждая гипотезу о том, что NTX может иметь потенциал для использовать в качестве лечения ME / CFS.

    Материалы и методы

    Набор участников

    Восемь пациентов с ME / CFS и 8 здоровых людей из контрольной группы (HC) соответствующего возраста и пола были набраны с использованием исследовательской базы данных Национального центра нейроиммунологии и новых заболеваний (NCNED) в период с апреля по июнь 2019 года.Возраст участников был от 18 до 60 лет. Все пациенты с ME / CFS ранее получили подтвержденный медицинский диагноз и были обследованы с использованием комплексного вопросника, соответствующего определениям случаев Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC), CCC и ICC. Все восемь пациентов с ME / CFS были определены CCC. ХК не сообщили о случаях утомляемости и были здоровы без признаков болезни. Участницы были исключены из этого исследования, если они были беременны или кормили грудью, или если они сообщили о предыдущем анамнезе курения, злоупотребления алкоголем или хронических заболеваний (например, аутоиммунные заболевания, сердечные заболевания и первичные психологические расстройства) или страдали патологическим ожирением (ИМТ ≥ 30). .Ни один из участников не сообщил об использовании опиоидов или любых других болеутоляющих в течение предшествующих 3 месяцев, а также фармакологических агентов, которые прямо или косвенно влияют на передачу сигналов TRPM3 или Ca 2+ . Это исследование было одобрено Комитетом по этике исследований на людях Университета Гриффита (HREC / 15 / QGC / 63).

    Выделение мононуклеарных клеток периферической крови и выделение естественных клеток-киллеров

    Всего с 8:30 до 10:30 в пробирки с этилендиаминтетрауксусной кислотой (EDTA) было собрано 85 мл цельной крови.м. на Золотом побережье, QLD, Австралия. Обычный полный анализ крови был выполнен в течение 4 часов после сбора для определения количества эритроцитов, лейкоцитов и количества гранулоцитов.

    В лабораторию было предоставлено

    образцов, идентифицированных с использованием уникального кода независимым сборщиком крови. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) выделяли из 80 мл цельной крови центрифугированием в среде с градиентом плотности (Ficoll-Paque Premium; GE Healthcare, Упсала, Швеция), как описано ранее (3, 44).PBMC окрашивали трипановым синим (Invitrogen, Carlsband, CA, USA) для определения количества клеток и их жизнеспособности. РВМС доводили до конечной концентрации 5 × 10 7 клеток / мл для выделения NK-клеток.

    NK-клеток выделяли иммуномагнитной селекцией с использованием набора EasySep Negative Human NK Cell Isolation Kit (Stem Cell Technologies, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада). Очистку NK-клеток определяли с помощью проточной цитометрии. NK-клетки инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре в присутствии CD56 FITC (0.25 мкг / 5 мкл) и моноклональные антитела к CD3 PE Cy7 (0,25 мкг / 20 мкл) (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния, США), как описано ранее (32). 7-аминоактиномицин (7-AAD) (2,5 мкл / тест) (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния, США) использовали для определения жизнеспособности клеток. Клетки промывали и ресуспендировали в 200 мкл буфера для окрашивания (BD Bioscience, Нью-Джерси, Нью-Джерси, США) и собирали при 10000 событий с использованием LSRFortessa X-20 (BD Biosciences, Сан-Диего, Калифорния, США). Используя прямое и боковое рассеяние, популяцию лимфоцитов регистрировали при взятии образца.Затем популяция NK-клеток была идентифицирована как клетки CD3 CD56 + .

    Стимуляция интерлейкина-2 и медикаментозное лечение

    Свежевыделенные NK-клетки стимулировали 20 МЕ / мл рекомбинантного человеческого ИЛ-2 (удельная активность 5 × 10 6 МЕ / мг) (Miltenyi Biotech, BG, Германия) в комбинации или без 200 мкМ NTX (Sigma- Aldrich, Сент-Луиза, Миссури, США), как описано ранее (36), в концентрации 2 × 10 5 клеток / мл и инкубировали в течение 24 часов при 37 ° C с 5% CO 2 в Мемориале парка Розуэлл. Институтская среда (RPMI) -1640 (Invitrogen Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Invitrogen Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США).Перед каждым экспериментом NTX ресуспендировали в воде, свободной от эндотоксинов.

    Запись электрофизиологии всей клетки

    Электрофизиологические записи выполнялись с помощью капиллярных электродов из боросиликатного стекла с внешним диаметром 1,5 мм и внутренним диаметром 0,86 мм (Harvard Apparatus, Холлистон, Массачусетс, США). Сопротивление пипетки при заполнении пипеточным раствором составляло 8–12 МОм. Пипетки устанавливали на головной столик CV203BU (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США), соединенный с трехходовым манипулятором грубого помола и микроманипулятором (Наришиге, Токио, Япония).Электрические сигналы усиливали и записывали с использованием усилителя Axopatch 200B и программного обеспечения PClamp 10.7 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США). Данные фильтровали с частотой 5 кГц и дискретизировали в цифровом виде с частотой 10 кГц с помощью аналого-цифрового преобразователя Digidata 1440A (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США). Протокол линейного нарастания напряжения представлял собой шаг от удерживающего потенциала от +10 мВ до -90 мВ с последующим нарастанием на 0,1 с до +110 мВ перед возвратом к +10 мВ (повторяется каждые 10 с). Потенциал перехода жидкости между пипеткой и растворами ванны (+10 мВ) был скорректирован при анализе данных.Составляющая тока утечки из записанных токов не вычиталась. Электрод заполняли внутриклеточным пипеточным раствором, содержащим 30 мМ CsCl, 2 мМ MgCl 2 , 110 мМ L-аспарагиновой кислоты, 1 мМ EGTA, 10 мМ HEPES, 4 мМ АТФ, 0,1 мМ GTP, pH доводили до 7,2 с помощью CsOH и осмоляльность 290 мОсм / л с D-маннитом. Раствор пипетки фильтровали с использованием мембранного фильтра 0,22 мкм (Sigma-Aldrich, St. Louise, MO, USA), разделяли на аликвоты и хранили при -20 ° C. Раствор ванны содержал: 130 мМ NaCl, 10 мМ CsCl, 1 мМ MgCl 2 , 1.5 мМ CaCl 2 2H 2 O, 10 мМ HEPES, pH доведен до 7,4 с помощью NaOH и осмоляльность 300 мОсм / л с помощью D-глюкозы. Все реагенты были приобретены у Sigma-Aldrich, за исключением АТФ и GTP, которые были приобретены у Sapphire Bioscience. Токи TRPM3 на необработанных или обработанных NTX NK-клетках стимулировали добавлением 100 мкМ PregS (Tocris Bioscience, Бристоль, Великобритания) или 200 мкМ гидрохлорида NTX (Sigma-Aldrich, Сент-Луиза, Миссури, США) в раствор ванны. тогда как PregS- и NTX-индуцированные токи TRPM3 блокировали добавлением 10 мкМ ононетина (Tocris Bioscience, Бристоль, Великобритания).Таким образом, для каждого из 8 пациентов с ME / CFS и 8 HC соответствующего возраста и пола были выполнены три разных протокола. Для каждого протокола было сделано 4 разных записи. Следовательно, N относится к количеству участников в каждой группе (пациенты с ME / CFS или HC), а n — к количеству показаний или размеру выборки для каждого отдельного протокола. Все измерения проводились при комнатной температуре. Авторы исключили возможность участия хлоридного тока в оценке TRPM3 с помощью L-аспарагиновой кислоты во внутриклеточном растворе пипетки.Ячейки с нестабильными токами также были исключены из анализа.

    Статистический анализ

    популяции лимфоцитов были идентифицированы с использованием точечных графиков прямого и бокового рассеяния. Исключение составляли клетки CD3 + , и только лимфоциты CD3 были дополнительно использованы для характеристики популяций субпопуляций NK-клеток с использованием CD56 и CD16. Подмножества NK-клеток были охарактеризованы с использованием поверхностной экспрессии NK-клеток CD56 Bright CD16 Dim / — и CD56 Dim CD16 Bright / + NK-клеток.Данные цитометрии были экспортированы из FacsDiva v8.1 и проанализированы с использованием SPSS v24 (IBM Corp, Version 24, Armonk, NY, USA) и GraphPad Prism v7 (GraphPad Software Inc., Version 7, La Jolla, CA, USA). Электрофизиологические данные анализировали с использованием программного обеспечения pCLAMP 10.7 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США). Для статистического анализа и представления данных использовались Origin 2018 (OriginLab Corporation, Нортгемптон, Массачусетс, США) и GraphPad Prism v7 (GraphPad Software Inc., версия 7, Ла-Хойя, Калифорния, США). В дополнение к тестам на асимметрию и эксцесс для определения нормальности данных были проведены тесты нормальности Шапиро-Уилка для определения распределения данных.Статистическое сравнение было выполнено с использованием независимого непараметрического U-критерия Манна-Уитни (таблица 1, рисунки 1, 2, 4, 6) и точного критерия Фишера (рисунки 3, 5, 7) для определения любых значимых различий. Достоверность была установлена ​​на уровне p <0,05, и данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего, если не указано иное.

    Таблица 1 . Параметры крови и демографические данные пациентов.

    Рисунок 1 . Естественная чистота клеток-киллеров. (A) Стратегия гейтинга, используемая для идентификации NK-клеток.Репрезентативные графики проточной цитометрии из PBMC одного из участников исследования. Лимфоциты регистрировали в режиме реального времени во время сбора данных с использованием точечного графика бокового и прямого рассеяния, а затем исключали одиночные и мертвые клетки. Кроме того, с использованием отрицательной и положительной стратегии стробирования были идентифицированы популяции лимфоцитов CD3 , а также CD56 + . (B) Гистограммы, представляющие чистоту изолированных NK-клеток для пациентов с HC и ME / CFS. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.HC = 90,34% ± 0,6782 и ME / CFS = 90,9% ± 1,695. 7-AAD, 7-аминоактиномицин; ME / CFS, миалгический энцефаломиелит / синдром хронической усталости; FSC, прямое рассеяние; HC, здоровый контроль; NK-клетка, естественная клетка-киллер; SSC, боковой разброс.

    Рисунок 2 . Активность TRPM3 после последовательных применений PregS. Данные были получены в условиях патч-зажима целых клеток. (A) Типичный временной ряд амплитуды тока при +100 мВ и -100 мВ, показывающий влияние последовательных применений 100 мкМ PregS (серый цвет) на ионные токи в стимулированных IL-2 NK-клетках из HC. (B) I V до и после первой стимуляции PregS в клетке, соответствующей (A). (C) I V до и после второй стимуляции PregS в клетке, соответствующей (A). (D) Репрезентативный временной ряд амплитуды тока при +100 мВ и -100 мВ, показывающий влияние последовательных применений 100 мкМ PregS (серый цвет) на ионные токи в стимулированных IL-2 NK-клетках от пациентов с ME / CFS. (E) I V до и после первой стимуляции PregS в клетке, как показано в (D).(F) I V до и после второй стимуляции PregS в клетке, как показано в (D). (G) Гистограммы, представляющие амплитуду тока TRPM3 при +100 мВ после последовательных применений 100 мкМ PregS у пациентов с ME / CFS ( N = 8 ; n = 27 и n = 25) по сравнению с HC ( N = 8; N = 31 и N = 29). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. ME / CFS, миалгический энцефаломиелит / синдром хронической усталости; HC, здоровый контроль; Н.К., естественный убийца; PregS, прегненолон сульфат; TRPM3, временный рецепторный потенциал меластатина 3.*** p = 0,0001, **** p <0,0001.

    Рисунок 3 . Модуляция PregS-вызванных токов Ононетином. Данные были получены в условиях патч-зажима целых клеток. (A) Репрезентативный временной ряд амплитуды тока при +100 мВ и -100 мВ, показывающий влияние 10 мкМ ононетина (серый) на ионные токи в присутствии 100 мкМ PregS в стимулированных IL-2 NK-клетках из HC . (B) I V до и после первого применения ононетина в присутствии PregS в клетке, как показано в (A).(C) I V до и после второго применения ононетина в присутствии PregS в клетке, как показано в (A). (D) Репрезентативный временной ряд амплитуды тока при +100 мВ и -100 мВ, показывающий влияние 10 мкМ ононетина (серый) на ионные токи в присутствии 100 мкМ PregS в NK-клетках, стимулированных IL-2 ME / CFS пациенты. (E) I V до и после первого применения ононетина в присутствии PregS в клетке, как показано в (D).(F) I V до и после второго применения ононетина в присутствии PregS в клетке, как показано в (D). (G, H) точечных диаграмм, представляющих изменение каждой амплитуды тока до и после первого применения ононетина в присутствии PregS во всех NK-клетках от пациентов с HC и ME / CFS. Каждая ячейка, представленная красными линиями, имела снижение тока ононетином. (I, J) Диаграммы разброса, представляющие изменение каждой амплитуды тока до и после второго применения ононетина в присутствии PregS во всех NK-клетках от пациентов с HC и ME / CFS.Каждая ячейка, представленная красными линиями, имела снижение тока ононетином. (K) Таблица, обобщающая данные для чувствительных и нечувствительных клеток к первому применению 10 мкМ ононетина в присутствии PregS в HC ( N = 8; n = 31) по сравнению с пациентами ME / CFS ( N = 8; n = 27). (L) Таблица, обобщающая данные для чувствительных и нечувствительных клеток ко второму применению 10 мкМ ононетина в присутствии PregS в HC ( N = 8; n = 29) по сравнению с пациентами ME / CFS ( N = 8; n = 24).Данные анализируются с помощью точного критерия Фишера. ME / CFS, миалгический энцефаломиелит / синдром хронической усталости; HC, здоровый контроль; Н.К., естественный убийца; PregS, прегненолон сульфат; TRPM3, временный рецепторный потенциал меластатина 3.

    Результаты

    Характеристики участников и параметры крови

    В это исследование были включены шестнадцать участников того же возраста и пола. Демографические и клинические данные для пациентов представлены в таблице 1. Не было существенной разницы в возрасте или поле между пациентами и HC.Краткий опросник из 36 пунктов (SF-36) и График оценки инвалидности Всемирной организации здравоохранения (WHODAS) использовались для определения качества жизни участников, связанного со здоровьем (45, 46). Как и ожидалось, наблюдалась значительная разница в оценках SF-36 и WHODAS между пациентами с ME / CFS и HC. Кроме того, у каждого здорового участника были измерены параметры полного анализа крови. Все результаты участников были в пределах указанных эталонных диапазонов для каждого параметра. Не было значительных различий между здоровыми участниками и пациентами с ME / CFS для этих отчетных параметров, как было предоставлено отделением патологии больницы Университета Голд-Коста, лабораторией, аккредитованной NATA.

    Натуральная чистота клеток-киллеров

    Чистота

    NK-клеток (CD3 / CD56 + ) составила 90,34% ± 0,6782 для HC и 90,9% ± 1,695 для пациентов с ME / CFS, как определено с помощью проточной цитометрии (рис. 1A). Не было значительных различий в чистоте NK-клеток у пациентов с ME / CFS по сравнению с HC (рис. 1B).

    Влияние последовательного применения PregS на активность TRPM3

    Электрофизиологические записи были получены от изолированных человеческих NK-клеток, инкубированных в течение 24 часов с IL-2, с использованием метода фиксации целых клеток.Активность эндогенного канала TRPM3 стимулировалась двумя последовательными приложениями 100 мкМ PregS, что позволяло измерять небольшой выпрямляющий ток, направленный наружу в условиях ограничения напряжения, и наблюдать типичную форму зависимости тока от напряжения TRPM3 ( I V ) ( Фигура 2). Действительно, мы измерили небольшой ионный ток с типичным TRPM3-подобным выпрямлением наружу в NK-клетках, выделенных из HC после обоих последовательных добавлений PregS (Рисунки 2B, C). Напротив, как сообщалось ранее (28, 29), амплитуды исходящего ионного тока были значительно уменьшены после последовательных стимуляций PregS в NK-клетках от пациентов с ME / CFS по сравнению с HC (Рисунки 2E-G) ( p <0.0001 и p = 0,0001). Эти результаты подтверждают предыдущие результаты и сообщают, что активность канала TRPM3 нарушается после последовательных применений PregS на стимулированных IL-2 NK-клетках от пациентов с ME / CFS.

    Модуляция PregS-вызванных токов с помощью ононетина

    Ононетин эффективно ингибирует PregS-индуцированный приток Ca 2+ и ионные токи через ионные каналы TRPM3 (47). Поэтому, чтобы подтвердить, что активность TRPM3 участвует в ионных токах, вызываемых PregS в NK-клетках, мы затем использовали 10 мкМ ононетина для модуляции ионных каналов TRPM3 (рис. 3).Как показано ранее (28, 29), ионные токи, вызванные обоими последовательными применениями PregS, эффективно ингибировались одновременным применением ононетина в изолированных NK-клетках из HC (Рисунки 3G, I, K, L). Более того, токи, чувствительные к ононетину, I V были выпрямлены наружу и типичны для TRPM3 (Рисунки 3B, C). Напротив, ионные токи, вызванные обоими последовательными применениями PregS, были в основном устойчивы к ононетину в изолированных NK-клетках от пациентов с ME / CFS (рисунки 3E, F, H, J) по сравнению с HC (рисунки 3K, L) ( p = 0.0030 и p = 0,0035). В совокупности эти результаты подтверждают значительную потерю активности канала TRPM3 в NK-клетках у пациентов с ME / CFS после стимуляции IL-2 в течение 24 часов.

    Влияние последовательного применения PregS на активность TRPM3 после обработки NTX

    Стимулированные IL-2 NK-клетки обрабатывали 200 мкМ NTX в течение 24 часов, как описано ранее (36). Действительно, сообщалось, что при такой концентрации и времени инкубации NTX не влияет на жизнеспособность клеток и не индуцирует апоптоз иммунных клеток.Поскольку NTX действует как антагонист μOR, тем самым сводя на нет ингибирующую функцию этого опиоидного рецептора на TRPM3, мы проверили, были ли изменены амплитуды PregS-индуцированных токов в NK-клетках, обработанных NTX, от пациентов как с HC, так и с ME / CFS. Последовательные приложения PregS (100 мкМ) вызвали небольшие ионные токи (Рисунки 4B, C) с типичной формой соотношения ток-напряжение TRPM3 ( I В ) в NK-клетках, изолированных от HC; однако не сообщалось о значительных различиях в группе HC между NK-клетками, обработанными или не обработанными NTX (рис. 4H).Напротив, применение PregS в обработанных NTX NK-клетках от пациентов с ME / CFS имитировало индуцированное PregS увеличение NK-клеток от HC (Рисунки 4E – G, I). Действительно, последовательные стимуляции PregS вызывали значительное увеличение амплитуд внешне выпрямленного тока в NK-клетках, обработанных NTX, от пациентов с ME / CFS по сравнению с необработанными NK-клетками от пациентов с ME / CFS, и до того же уровня, что и леченные и не леченные. NK-клетки из HC (Рисунки 4G – I) ( p = 0,0001 и p = 0.0035). Более того, токи, вызванные PregS, представляют собой типичную форму зависимости тока от напряжения TRPM3 ( I В ) (рисунки 4E, F). Данные свидетельствуют о том, что NTX восстанавливает активность канала TRPM3 у пациентов с ME / CFS.

    Рисунок 4 . Влияние лечения NTX на активность TRPM3 после последовательного применения PregS. Данные были получены в условиях патч-зажима целых клеток. (A) Репрезентативный временной ряд амплитуды тока при +100 мВ и -100 мВ, показывающий влияние последовательных применений 100 мкМ PregS (серый цвет) на ионные токи в стимулированных IL-2 NK-клетках, обработанных 200 мкМ NTX для 24 часа из HC. (B) I V до и после первой стимуляции PregS в клетке, соответствующей (A). (C) I V до и после второй стимуляции PregS в клетке, соответствующей (A). (D) Репрезентативный временной ряд амплитуды тока при +100 мВ и -100 мВ, показывающий влияние последовательных применений 100 мкМ PregS (серый) на ионные токи в стимулированных IL-2 NK-клетках, обработанных 200 мкМ NTX в течение 24 дней. ч от пациентов с ME / CFS. (E) I V до и после первой стимуляции PregS в клетке, как показано в (D). (F) I V до и после второй стимуляции PregS в клетке, как показано в (D). (G) Гистограммы, представляющие влияние лечения NTX на амплитуду тока TRPM3 при +100 мВ после последовательного применения 100 мкМ PregS у пациентов с ME / CFS ( N = 8 ; n = 22 и n = 16) по сравнению с HC ( N = 8; n = 20 и n = 19). (H) Гистограммы, представляющие амплитуду тока TRPM3 при +100 мВ после последовательного применения 100 мкМ PregS в NK-клетках, обработанных 200 мкМ NTX ( N = 8 ; n = 20 и n = 19 ) или необработанные NK-клетки ( N = 8 ; n = 31 и n = 29) из HC. Тот же элемент управления использовался, что и на рисунке 2G. (I) Гистограммы, представляющие амплитуду тока TRPM3 при +100 мВ после последовательного применения 100 мкМ PregS в NK-клетках, обработанных 200 мкМ NTX ( N = 8 ; n = 22 и n = 16 ) или необработанные NK-клетки ( N = 8 ; n = 27 и n = 25) от пациентов с ME / CFS.Тот же элемент управления использовался, что и на рисунке 4G. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. ME / CFS, миалгический энцефаломиелит / синдром хронической усталости; HC, здоровый контроль; Н.К., естественный убийца; NTX, гидрохлорид налтрексона; PregS, прегненолон сульфат; TRPM3, временный рецепторный потенциал меластатина 3. ** p = 0,0035, *** p = 0,0001.

    Модуляция PregS-вызванных токов ононетином после лечения NTX

    Чтобы подтвердить, что активность TRPM3 участвует в ионных токах, вызываемых PregS в обработанных NTX NK-клетках пациентов с ME / CFS, мы затем использовали 10 мкМ ононетина для модуляции ионных каналов TRPM3 (рис. 5).Поскольку NTX не изменял амплитуды внешне выпрямленного тока в обработанных NTX NK-клетках из HC, никакой разницы не было показано в HC, а ионные токи, вызванные обоими последовательными применениями PregS, эффективно ингибировались одновременным применением ононетина (рисунки 5G, I, К, Л). Напротив, ионные токи, вызванные последовательными применениями PregS, эффективно ингибировались одновременным применением 10 мкМ ононетина в изолированных NTX-обработанных NK-клетках от пациентов с ME / CFS (Рисунки 5E, F, H, J – L).Действительно, ионный ток, изначально устойчивый к ононетину в изолированных NK-клетках от пациентов с ME / CFS, стал чувствительным к ононетину после инкубации с NTX в течение 24 часов (рис. 5L). Более того, токи, чувствительные к ононетину, I V были выпрямлены наружу и типичны для TRPM3 (Рисунки 5E, F). В совокупности эти результаты подтверждают восстановление активности канала TRPM3 в NK-клетках пациентов с ME / CFS после лечения NTX в течение 24 часов.

    Рисунок 5 .Модуляция PregS-вызванных токов ононетином после лечения NTX. Данные были получены в условиях патч-зажима целых клеток. (A) Репрезентативный временной ряд амплитуды тока при +100 мВ и -100 мВ, показывающий влияние 10 мкМ ононетина (серый) на ионные токи в присутствии 100 мкМ PregS в стимулированных IL-2 NK-клетках, обработанных 200 мкМ NTX от HC. (B) I V до и после первого применения ононетина в присутствии PregS в клетке, как показано в (A).(C) I V до и после второго применения ононетина в присутствии PregS в клетке, как показано в (A). (D) Репрезентативный временной ряд амплитуды тока при +100 мВ и -100 мВ, показывающий влияние 10 мкМ ононетина (серый) на ионные токи в присутствии 100 мкМ PregS в стимулированных IL-2 NK-клетках, обработанных 200 мкМ NTX ME / CFS пациенты. (E) I V до и после первого применения ононетина в присутствии PregS в клетке, как показано в (D).(F) I V до и после второго применения ононетина в присутствии PregS в клетке, как показано в (D). (G, H) Диаграммы разброса, представляющие изменение каждой амплитуды тока до и после первого применения ононетина в присутствии PregS во всех NK-клетках, обработанных 200 мкМ NTX от пациентов с HC и ME / CFS. Каждая ячейка, представленная красными линиями, имела снижение тока ононетином. (I, J) Диаграммы разброса, представляющие изменение каждой амплитуды тока до и после второго применения ононетина в присутствии PregS во всех NK-клетках, обработанных 200 мкМ NTX от пациентов с HC и ME / CFS.Каждая ячейка, представленная красными линиями, имела снижение тока ононетином. (K) Таблица, обобщающая данные для чувствительных и нечувствительных клеток, обработанных 200 мкМ NTX до первого применения 10 мкМ ононетина в присутствии PregS в HC ( N = 8; n = 20) по сравнению с ME / CFS пациентов ( N = 8; N = 22). (L) Таблица, обобщающая данные для чувствительных и нечувствительных клеток, обработанных 200 мкМ NTX, для второго применения 10 мкМ ононетина в присутствии PregS в HC ( N = 8; n = 19) по сравнению с ME / CFS пациентов ( N = 8; N = 16).Данные анализируются с помощью точного критерия Фишера. ME / CFS, миалгический энцефаломиелит / синдром хронической усталости; HC, здоровый контроль; Н.К., естественный убийца; NTX, гидрохлорид налтрексона; PregS, прегненолон сульфат; TRPM3, временный рецепторный потенциал меластатина 3.

    Влияние последовательного применения NTX и PregS на активность TRPM3

    Опиоидные антагонисты, такие как NTX, как сообщалось ранее, не влияют на TRPM3-зависимые сигналы Ca 2+ при прямом применении в перфузии (33).Следовательно, чтобы проверить, может ли NTX напрямую регулировать активность канала TRPM3, мы стимулировали TRPM3 в NK-клетках, используя только опиоидный антагонист NTX (рис. 6). Никакие TRPM3-подобные ионные токи не индуцировались NTX (200 мкМ). Действительно, мы не измеряли какие-либо внешне выпрямляющие токи в условиях фиксации напряжения с типичной формой зависимости ток-напряжение TRPM3 ( I В ) в стимулированных IL-2 NK-клетках из любой из HC (рис. 6B, G. ) или пациентов с ME / CFS (Фигуры 6E, G) после добавления NTX.Однако, поскольку PregS в настоящее время является наиболее мощным агонистом TRPM3, описанным в литературе (48), и для подтверждения того, что активность ионного канала TRPM3 может быть стимулирована, мы затем применили 100 мкМ PregS к NK-клеткам пациентов как с HC, так и с ME / CFS (рисунки 6А, Б). Применение PregS индуцировало TRPM3-подобные токи как у пациентов с HC (Рисунки 6C, G), так и у пациентов с ME / CFS (Рисунки 6F, G). I-V вызванных PregS токов был выпрямлен наружу (рис. 6C, F), что является стандартным для TRPM3. Однако амплитуды выходящего тока значительно уменьшились после стимуляции PregS в NK-клетках пациентов с ME / CFS (рис. 6G) ( p = 0.0006), как показано ранее (Рисунок 4G). Данные свидетельствуют о том, что активность канала TRPM3 не стимулируется напрямую NTX ни у пациентов с HC, ни у пациентов с ME / CFS. Следовательно, NTX не является прямым агонистом ионного канала TRPM3.

    Рисунок 6 . Активность TRPM3 после последовательного применения NTX и PregS. Данные были получены в условиях патч-зажима целых клеток. (A) Типичный временной ряд амплитуды тока при +100 мВ и -100 мВ, показывающий влияние 100 мкМ PregS и 200 мкМ NTX (серый цвет) на ионные токи в стимулированных IL-2 NK-клетках из HC. (B) I V до и после стимуляции NTX в клетке, соответствующей (A). (C) I V до и после стимуляции PregS в клетке, соответствующей (A). (D) Репрезентативный временной ряд амплитуды тока при +100 мВ и -100 мВ, показывающий влияние 100 мкМ PregS и 200 мкМ NTX (серый) на ионные токи в стимулированных IL-2 NK-клетках от пациентов с ME / CFS. (E) I V до и после стимуляции NTX в клетке, как показано в (D).(F) I V до и после стимуляции PregS в клетке, как показано в (D). (G) Гистограммы, представляющие амплитуду тока TRPM3 при +100 мВ после последовательного применения 100 мкМ PregS у пациентов с ME / CFS ( N = 8 ; n = 19 и n = 19) по сравнению с HC ( N = 8; N = 23 и N = 21). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. ME / CFS, миалгический энцефаломиелит / синдром хронической усталости; HC, здоровый контроль; Н.К., естественный убийца; PregS, прегненолон сульфат; TRPM3, временный рецепторный потенциал меластатина 3.*** р = 0,0006.

    Модуляция индуцированных токов NTX и PregS с помощью ононетина

    Поскольку никакие TRPM3-подобные ионные токи не индуцировались после стимуляции NTX, не сообщалось о различиях при одновременном применении 10 мкМ ононетина в стимулированных IL-2 NK-клетках из HC (Рисунки 7B, G, K) или у пациентов с ME / CFS ( Рисунки 7E, H, K). Напротив, ионные токи, вызванные PregS, эффективно ингибировались одновременным применением 10 мкМ ононетина в изолированных NK-клетках из HC (Фигуры 7C, I, L).Кроме того, ионные токи в присутствии PregS были в основном устойчивыми к ононетину в изолированных NK-клетках от пациентов с ME / CFS (рисунки 7F, J, L) по сравнению с HC, подтверждая, что активность канала TRPM3 не модулируется напрямую NTX по сравнению с с PregS.

    Рисунок 7 . Модуляция NTX- и PregS-вызванных токов с помощью Ононетина. Данные были получены в условиях патч-зажима целых клеток. (A) Репрезентативный временной ряд амплитуды тока при +100 мВ и -100 мВ, показывающий влияние 10 мкМ ононетина (серый) на ионные токи в присутствии 200 мкМ NTX или 100 мкМ PregS в стимулированном IL-2 NK-клетки из HC. (B) I V до и после применения ононетина в присутствии NTX в клетке, как показано в (A). (C) I V до и после применения ононетина в присутствии PregS в клетке, как показано в (A). (D) Типичный временной ряд амплитуды тока при +100 мВ и -100 мВ, показывающий влияние 10 мкМ ононетина (серый) на ионные токи в присутствии 200 мкМ NTX или 100 мкМ PregS в стимулированных IL-2 NK. клетки ME / CFS пациентов. (E) I V до и после применения ононетина в присутствии NTX в клетке, как показано в (D). (F) I V до и после применения ононетина в присутствии PregS в клетке, как показано в (D). (G, H) точечных графиков, представляющих изменение каждой амплитуды тока до и после применения ононетина в присутствии NTX во всех NK-клетках от пациентов с HC и ME / CFS. Каждая ячейка, представленная красными линиями, имела снижение тока ононетином. (I, J) Диаграммы разброса, представляющие изменение каждой амплитуды тока до и после применения ононетина в присутствии PregS во всех NK-клетках от пациентов с HC и ME / CFS. Каждая ячейка, представленная красными линиями, имела снижение тока ононетином. (K) Таблица, обобщающая данные для чувствительных и нечувствительных клеток к 10 мкМ ононетина в присутствии NTX в HC ( N = 8; n = 23) по сравнению с пациентами ME / CFS ( N = 8; n = 19). (L) Таблица, обобщающая данные для чувствительных и нечувствительных клеток к 10 мкМ ононетина в присутствии PregS в HC ( N = 8; n = 19) по сравнению с пациентами ME / CFS ( N = 8; n = 19).Данные анализируются с помощью точного критерия Фишера. ME / CFS, миалгический энцефаломиелит / синдром хронической усталости; HC, здоровый контроль; Н.К., естественный убийца; NTX, гидрохлорид налтрексона; PregS, прегненолон сульфат; TRPM3, временный рецепторный потенциал меластатина 3.

    Обсуждение

    Наши предыдущие исследования описали потерю функции ионного канала TRPM3, связанную с ME / CFS (28, 29). В настоящем исследовании мы использовали метод фиксации целых клеток в качестве метода измерения эндогенной активности TRPM3 в стимулированных IL-2 NK-клетках от пациентов с HC и ME / CFS, что позволило регистрировать ток ионного канала в условиях фиксации напряжения и наблюдать. формы зависимости тока от напряжения TRPM3 ( I V ).Это новое исследование подтверждает значительную потерю активности канала TRPM3 после модуляции PregS и ононетином в новой когорте участников ME / CFS (рис. 2, 3). Кроме того, мы сообщаем о подобном эффекте после второй модуляции с помощью PregS и ононетина на стимулированные IL-2 NK-клетки от пациентов с ME / CFS. Действительно, последовательное применение PregS позволило измерить небольшие ионные токи с типичным TRPM3-подобным выпрямлением наружу в стимулированных IL-2 NK-клетках, выделенных из HC. Напротив, амплитуда исходящих ионных токов значительно снизилась после последовательной PregS-стимуляции в стимулированных IL-2 NK-клетках от пациентов с ME / CFS, подтверждая нарушение активности канала TRPM3 у пациентов с ME / CFS.Кроме того, вызванные PregS ионные токи через ионные каналы TRPM3 значительно модулировались ононетином в стимулированных IL-2 NK-клетках из HC по сравнению с пациентами с ME / CFS. Действительно, ионные токи в присутствии PregS были в основном устойчивыми к ононетину в стимулированных IL-2 NK-клетках пациентов с ME / CFS.

    Мы впервые сообщаем, что активность канала TRPM3 была восстановлена ​​в стимулированных IL-2 NK-клетках, выделенных от пациентов с ME / CFS, после инкубации с 200 мкМ NTX в течение 24 часов (рисунки 4, 5).Мы продемонстрировали, что лечение NTX в течение 24 часов не имело эффекта на вызванные PregS TRPM3-подобные токи в HC, тогда как амплитуды выходящего тока значительно увеличивались после последовательных стимуляций PregS у пациентов с ME / CFS. Кроме того, лечение NTX также восстанавливает чувствительность NK-клеток пациентов с ME / CFS к ононетину, подтверждая, что активность TRPM3 участвует в ионных токах, вызванных PregS в обработанных NTX NK-клетках пациентов с ME / CFS. Наконец, мы сообщаем, что прямое применение NTX не влияет на TRPM3-зависимые сигналы Ca 2+ при тестировании перед стимуляцией PregS на стимулированных IL-2 NK-клетках от пациентов с HC и ME / CFS (рисунки 6, 7), предполагая, что NTX не действует как агонист, напрямую связываясь с гейтированием ионного канала TRPM3, но может задействовать восходящий устойчивый регуляторный механизм.

    ионных каналов TRPM3 действуют как интеграторы нескольких стимулов и сигнальных путей. TRPM3, в большом количестве экспрессируемый в сенсорных нейронах, определяется как термочувствительные и ноцицепторные каналы, которые помогают организмам ощущать тепло и делают их более чувствительными к боли во время воспаления (27). Сообщалось о нарушении регуляции терморегуляторных реакций у пациентов с ME / CFS, и генерализованная боль, а также воспаление головного мозга являются характеристиками ME / CFS (49). Физиологически эндогенные опиоиды синтезируются in vivo для модуляции болевых механизмов и воспалительных путей.Эндогенные и экзогенные опиоиды опосредуют анальгезию в ответ на болевые стимулы, связывающиеся с опиоидными рецепторами, членами семейства GPCR, на нейрональных клетках (38). Интересно, что молекулы, которые связываются с опиоидными рецепторами и активируют их, значительно уменьшают TRPM3-зависимую боль. Недавние сообщения предполагают, что активация каналов TRPM3 значительно снижается, если каналы также стимулируются любым из множества GPCR, и особенно μOR, ответственным за обезболивающие, полезные и нежелательные эффекты опиоидов (33, 34).При активации опиоидами, производимыми организмом (эндогенно) или принимаемыми в виде лекарственного средства, μOR может опосредовать спектр острой передачи сигналов и более долгосрочное регуляторное поведение (50). Такая функциональная универсальность не может быть объяснена простой моделью включения-выключения рецепторной активации и более совместима с динамическими и гибкими рецепторными структурами. Действительно, μOR взаимодействуют с гетеротримерными G-белками и активируют их для усиления сигнала и регулирования последующих эффекторов (51).

    Недавние исследования показали, что ингибирование TRPM3 требует диссоциации гетеротримерного G-белка, чтобы предотвратить взаимодействие ингибирующей субъединицы G α i с активированным μOR, блокируя комплекс в состоянии покоя тримерного состояния (33–35).С другой стороны, было продемонстрировано, что активность TRPM3 сильно ингибируется прямым взаимодействием с G βγ , поскольку поток ионов через каналы TRPM3 сильно и обратимо ингибируется, когда клеточная мембрана промывается очищенным G βγ ( 33, 35). Интересно, что для открытия каналов TRPM3 требуется фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат (PIP 2 ) в мембране, а некоторые другие субъединицы G α усиливают ингибирование TRPM3, воздействуя на локальное истощение PIP 2 . (35).Следовательно, специфическая сборка белковых комплексов μOR-G регулирует открытие и закрытие поры ионного канала TRPM3 и, в свою очередь, влияет на сигнальный каскад Ca 2+ и биологические ответы.

    Важно отметить, что опиоидные рецепторы широко распространены в тканях и системах органов за пределами ЦНС, таких как клетки иммунной системы, что указывает на то, что опиоиды способны оказывать дополнительные эффекты на периферии, такие как иммуномодулирующие и иммунодепрессивные эффекты (38).В настоящее время существуют данные, показывающие, что обезболивающие эффекты опиоидов не опосредуются исключительно опиоидными рецепторами в головном мозге, но также могут опосредоваться активацией рецепторов в иммунных клетках. В свою очередь, этот механизм приводит к различным побочным эффектам, включая иммуносупрессивные функции и обострение определенных болезненных состояний (38). Хотя опиоиды модулируют как врожденную, так и адаптивную иммунную системы, дефекты врожденного иммунитета, по-видимому, имеют более широкие последствия. Например, опиоиды действуют как иммуносупрессоры в отношении миграции и функциональной активности врожденных иммунных ответчиков, модулируя рекрутирование лейкоцитов, секрецию цитокинов и бактериальный клиренс, что приводит к нарушению способности хозяев уничтожать патогены (38).Интересно, что опиоидные пептиды иммунного происхождения также играют существенную роль в модуляции воспалительной боли. Например, сообщалось, что (β) -эндорфин (βEP), эндогенный опиоидный нейропептид и пептидный гормон, продуцируется Т- и В-лимфоцитами, а также в моноцитах воспаленной лапы крысы (52). βEP действует в первую очередь на μOR и δOR и модулирует функции лимфоцитов и других клеток, участвующих в защите и иммунитете хозяина (53). Недавно было показано, что NTX способствует активности δOR и увеличивает цитолитическую активность NK-клеток в ответ на βEP in vitro на спленоцитах крысы, что предполагает потенциальное использование NTX при лечении иммунодефицита (54).Агонистическая активность NTX в отношении δOR в отношении спленоцитов, по-видимому, обусловлена ​​его мощной антагонистической функцией μOR, поскольку экспрессия δOR жестко контролируется регуляцией μOR по отрицательной обратной связи. NTX нарушает этот контроль обратной связи, снижая функцию μOR, тем самым повышая регуляцию связывания δOR, что приводит к усилению цитолитического ответа NK-клеток на лиганды (54). Интересно, что исследование Conti et al. сообщили о значительном снижении βEP у пациентов с ME / CFS, что отражает состояние хронической иммунной активации (55).

    Важно отметить, что NTX действует как антагонист μOR, таким образом сводя на нет ингибирующую функцию этого опиоидного рецептора на TRPM3 (37, 38). Действительно, связывание опиоидов с μOR блокирует приток Ca 2+ за счет ингибирования каналов TRPM3. Растормаживающий эффект NTX восстанавливает активность ионного канала TRPM3 у пациентов с ME / CFS и, в свою очередь, восстанавливает соответствующую передачу сигналов Ca 2+ . Каждый тип клеток, включая NK-клетки, имеет уникальный сигнальный фенотип, способный доставлять сигналы Ca 2+ с пространственными и временными свойствами, необходимыми для регулирования его конкретной функции (24).Фенотипическая стабильность, по-видимому, поддерживается с помощью механизмов обратной связи, зависимых от Ca 2+ , которые регулируют уровни экспрессии отдельных компонентов набора инструментов, которые вносят вклад в эти клеточно-специфичные сигнальные системы. Эти гомеостатические системы очень пластичны и могут подвергаться процессу фенотипического ремоделирования, в результате чего сигналы Ca 2+ устанавливаются либо слишком высокими, либо слишком низкими. Такое тонкое нарушение регуляции сигналов Ca 2+ может сильно влиять на функции клеток и приводить к заболеваниям (24, 56).Высвобождение Ca 2+ с помощью TRPM3, по-видимому, играет центральную роль в активации и функции NK-клеток, поскольку нарушение регуляции функции TRPM3 у пациентов с ME / CFS, как было показано, влияет на передачу сигналов Ca 2+ , что приводит к нарушению регуляции NK-клеток. машины и функции. Восстановление активности канала TRPM3 с помощью NTX приводит к ремоделированию сигнала Ca 2+ , что, в свою очередь, будет способствовать активации клеток, эффекторным функциям, экспрессии или дифференцировке генов. Таким образом, восстановление гомеостаза Ca 2+ в NK-клетках поможет реактивировать и сбалансировать различные механизмы, зависимые от Ca 2+ , включая текущие транскрипционные процессы, модуляцию поверхностной экспрессии TRPM3 или конститутивный и регулируемый везикулярный транспорт самого ионного канала или вспомогательных и регулирующих белков.Следовательно, восстановление гомеостаза Ca 2+ приводит также к восстановлению целостности и стабильности этих систем передачи сигналов, специфичных для NK-клеток.

    В заключение, ME / CFS — это длительное заболевание с широким спектром симптомов, включая хроническую боль, нарушение памяти и концентрации, а также воспаление (1). Широко выраженный проницаемый неселективный катионный канал для Ca 2+ , TRPM3, функционирует как хемо- и термодатчик, позволяющий обнаруживать болезненные и безвредные термические стимулы (27).Сообщалось, что дисфункция TRPM3 вносит вклад в патологическое состояние ME / CFS (28–32). В настоящем исследовании мы подтвердили нарушение активности TRPM3 у пациентов с ME / CFS посредством электрофизиологических исследований на стимулированных IL-2 NK-клетках после последовательной активации PregS и ингибирования ононетином. Важно отметить, что мы продемонстрировали, что активность канала TRPM3 восстанавливалась в стимулированных IL-2 NK-клетках, выделенных от пациентов с ME / CFS, после инкубации с NTX в течение 24 часов. Действительно, антагонист опиоидов NTX отрицает ингибирующую функцию опиоидных рецепторов на TRPM3 в NK-клетках пациентов с ME / CFS.Это исследование не только помогает понять этиологию и патомеханизм ME / CFS, но и подтверждает, что опиоидные рецепторы в иммунных клетках играют важную роль в анальгетических эффектах. Наконец, восстановление активности канала TRPM3 предполагает иммуномодулирующее действие NTX путем ремоделирования TRPM3-зависимых сигналов Ca 2+ , что, в свою очередь, влияет на функции NK-клеток, и поддерживает гипотезу о том, что NTX может иметь потенциал для использования в качестве лечение ME / CFS.

    Заявление о доступности данных

    Все наборы данных, созданные для этого исследования, включены в файлы рукописи / дополнительные файлы.

    Заявление об этике

    Все участники дали письменное согласие на участие и публикацию. Утверждение этики было одобрено Комитетом по этике исследований с участием человека Университета Гриффита (HREC / 15 / QGC / 63).

    Авторские взносы

    HC, KM, SM-G и DS разработали исследование и написали рукопись. ХК проводил эксперименты. HC и KM провели анализ данных.

    Финансирование

    Это исследование было поддержано Mason Foundation, McCusker Charitable Foundation, Stafford Fox Medical Research Foundation, Mr.Дуглас Штутт, Мемориальный фонд Элисон Хантер, Фонд Бакстона, Фонд Блейка Беккета, Пожертвование Хенти и Благотворительный фонд «Смена для меня».

    Конфликт интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Сокращения

    7-AAD, 7-аминоактиномицин; βEP, бета-эндорфины; δOR, дельта-опиоидный рецептор; μOR, опиоидный рецептор Mu; ИМТ, индекс массы тела; Ca 2+ , кальций; [Ca 2+ ] i , внутриклеточная концентрация Ca 2+ ; CCC, Канадские критерии консенсуса; CDC, Центры по контролю и профилактике заболеваний; ЦНС, Центральная нервная система; ЭДТА, этилендиаминтетрауксусная кислота; FBS, фетальная бычья сыворотка; HC — Здоровые контроли; ICC, Международные критерии консенсуса; ИЛ-2, Интерлейкин-2; ИЛ-12, Интерлейкин-12; I-V , Взаимосвязь тока и напряжения; ME / CFS, миалгический энцефаломиелит / синдром хронической усталости; NCNED, Национальный центр нейроиммунологии и новых заболеваний; Н.К., Натуральный убийца; NTX, гидрохлорид налтрексона; PBMC, мононуклеарные клетки периферической крови; PIP 2 , 4,5-бисфосфат фосфатидилинозитола; PregS, прегненолон сульфат; RPMI, среда Розуэлл-Парк Мемориального института; SF-36, Краткий обзор из 36 пунктов; SNP, однонуклеотидные полиморфизмы; TRP, временный рецепторный потенциал; TRPM, временный рецепторный потенциал меластатина; TRPM3, временный рецепторный потенциал меластатина 3; WHODAS, График оценки инвалидности Всемирной организации здравоохранения.

    Список литературы

    1. Фукуда К., Страус С.Е., Хики И., Шарп М.К., Доббинс Дж. Г., Комаров А. Синдром хронической усталости: комплексный подход к его определению и изучению. Международная группа по изучению синдрома хронической усталости. Ann Intern Med. (1994) 121: 953–9. DOI: 10.7326 / 0003-4819-121-12-199412150-00009

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    2. Каррутерс Б.М., ван де Санде М.И., Де Мейрлейр К.Л., Климас Н.Г., Бродерик Г., Митчелл Т. и др.Миалгический энцефаломиелит: критерии международного консенсуса. J Intern Med. (2011) 270: 327–38. DOI: 10.1111 / j.1365-2796.2011.02428.x

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    3. Брену Е.В., ван Дриэль М.Л., Стейнс Д.Р., Эштон К.Дж., Рамос С.Б., Кин Дж. И др. Иммунологические аномалии как потенциальные биомаркеры синдрома хронической усталости / миалгического энцефаломиелита. J Transl Med. (2011) 9:81. DOI: 10.1186 / 1479-5876-9-81

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    4.Брену Э. У., ван Дриел М. Л., Стейнс Д. Р., Эштон К. Дж., Хардкасл С. Л., Кин Дж. И др. Продольное исследование естественных клеток-киллеров и цитокинов при синдроме хронической усталости / миалгическом энцефаломиелите. J Transl Med. (2012) 10:88. DOI: 10.1186 / 1479-5876-10-88

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    5. Курриу М., Каррильо Дж., Массанелла М., Ригау Дж., Алегре Дж., Пуч Дж. И др. Скрининг фенотипа и функции NK-, B- и T-клеток у пациентов, страдающих синдромом хронической усталости. J Transl Med. (2013) 11:68. DOI: 10.1186 / 1479-5876-11-68

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    6. Хардкасл С.Л., Брену Е.В., Джонстон С., Нгуен Т., Хут Т., Вонг Н. и др. Характеристика функций клеток и рецепторов при синдроме хронической усталости / миалгическом энцефаломиелите (CFS / ME). BMC Immunol. (2015) 16:35. DOI: 10.1186 / s12865-015-0101-4

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    7.Хут Т.К., Брену Э.В., Рамос С., Нгуен Т., Бродли С., Стейнс Д. и др. Пилотное исследование естественных клеток-киллеров при синдроме хронической усталости / миалгическом энцефаломиелите и рассеянном склерозе. Scand J Immunol. (2016) 83: 44–51. DOI: 10.1111 / sji.12388

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    8. Климас Н.Г., Сальвато FR, Морган Р., Флетчер М.А. Иммунологические нарушения при синдроме хронической усталости. J Clin Microbiol. (1990) 28: 1403–10.

    PubMed Аннотация | Google Scholar

    9.Махер К.Дж., Климас Н.Г., Флетчер М.А. Синдром хронической усталости связан с уменьшением внутриклеточного перфорина. Clin Exp Immunol. (2005) 142: 505–11. DOI: 10.1111 / j.1365-2249.2005.02935.x

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    10. Natelson BH, Haghighi MH, Ponzio NM. Доказательства наличия иммунной дисфункции при синдроме хронической усталости. Clin Diagn Lab Immunol. (2002) 9: 747–52. DOI: 10.1128 / CDLI.9.4.747-752.2002

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    11.Nijs J, Frémont M. Внутриклеточная иммунная дисфункция при миалгическом энцефаломиелите / синдроме хронической усталости: современное состояние и терапевтические последствия. Мнение эксперта Ther Targets. (2008) 12: 281–9. DOI: 10.1517 / 14728222.12.3.281

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    12. Шарп М.К., Арчард Л.К., Банатвала Дж.Э., Борисевич Л.К., Клэр А.В., Дэвид А. и др. Отчет-синдром хронической усталости: рекомендации для исследования. J R Soc Med. (1991) 84: 118–21.DOI: 10.1177 / 0141076800224

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    13. Сигел С.Д., Антони М.Х., Флетчер М.А., Махер К., Сегота М.К., Климас Н. Нарушение естественного иммунитета, когнитивная дисфункция и физические симптомы у пациентов с синдромом хронической усталости: предварительные доказательства для подгруппы? J Psychosom Res. (2006) 60: 559–66. DOI: 10.1016 / j.jpsychores.2006.03.001

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    15.Флетчер М.А., Зенг XR, Махер К., Левис С., Гурвиц Б., Антони М. и др. Биомаркеры синдрома хронической усталости: оценка функции естественных киллерных клеток и дипептидилпептидазы IV / CD26. PLoS ONE. (2010) 5: e10817. DOI: 10.1371 / journal.pone.0010817

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    16. Ривас Дж. Л., Паленсия Т., Фернандес Дж., Гарсия М. Ассоциация фенотипа Т- и NK-клеток с диагнозом миалгического энцефаломиелита / синдрома хронической усталости (ME / CFS). Front Immunol. (2018) 9: 1028. DOI: 10.3389 / fimmu.2018.01028

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    17. Стюарт CC, Cookfair DL, Hovey KM, Wende KE, Bell DS, Warner CL. Прогностические иммунофенотипы: профиль заболевания при синдроме хронической усталости. Cytometry B Clin Cytom. (2003) 53: 26–33. DOI: 10.1002 / cyto.b.10034

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    18. Теорелл Дж., Билевичиуте-Люнгар И., Теси Б., Шлумс Х., Джонсгаард М.С., Асади-Азарбайджани Б. и др.Фенотип и функция невозмущенных цитотоксических лимфоцитов у пациентов с миалгическим энцефаломиелитом / синдромом хронической усталости. Front Immunol. (2017) 8: 723. DOI: 10.3389 / fimmu.2017.00723

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    20. Анасетти С., Мартин П.Дж., Джун С.Х., Хеллстром К.Э., Ледбеттер Дж. А., Рабинович П.С. и др. Индукция притока кальция и усиление цитолитической активности в естественных клетках-киллерах путем сшивания связывающего эритроциты овцы белка (CD2) и Fc-рецептора (CD16). J Immunol. (1987) 139: 1772–9.

    PubMed Аннотация | Google Scholar

    23. Schwarz EC, Qu B, Hoth M. Кальций, рак и убийство: роль кальция в уничтожении раковых клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами и естественными клетками-киллерами. Biochim Biophys Acta. (2013) 1833: 1603–11. DOI: 10.1016 / j.bbamcr.2012.11.016

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    25. Джис М., Колсул Б., Нилиус Б. Роль временных катионных каналов рецепторного потенциала в передаче сигналов Ca 2+ . Cold Spring Harb Perspect Biol. (2010) 2: a003962. DOI: 10.1101 / cshperspect.a003962

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    27. Вринс Дж., Овсяник Дж., Хофманн Т., Филипп С.Е., Стаб Дж., Чен Х и др. TRPM3 — это ноцицепторный канал, участвующий в обнаружении ядовитого тепла. Нейрон. (2011) 70: 482–94. DOI: 10.1016 / j.neuron.2011.02.051

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    28. Cabanas H, Muraki K, Eaton N, Balinas C, Staines D, Marshall-Gradisnik S.Потеря функции временного рецепторного потенциала меластатин-3 ионного канала в естественных клетках-киллерах у пациентов с синдромом хронической усталости / миалгическим энцефаломиелитом. Мол Мед . (2018) 24:44. DOI: 10.1186 / s10020-018-0046-1

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    29. Кабанас Х, Мураки К., Балинас С., Итон-Фитч Н., Стейнс Д., Маршалл-Градисник С. Подтверждение нарушения транзиторного рецепторного потенциала активности ионного канала меластатина 3 в естественных клетках-киллерах у пациентов с синдромом хронической усталости / миалгическим энцефаломиелитом. Mol Med. (2019) 25:14. DOI: 10.1186 / s10020-019-0083-4

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    30. Маршалл-Градисник С., Хут Т., Чако А., Джонстон С., Смит П., Стейнс Д. Естественные клетки-киллеры и однонуклеотидные полиморфизмы определенных ионных каналов и генов рецепторов при миалгическом энцефаломиелите / синдроме хронической усталости. Appl Clin Genet. (2016) 9: 39–47. DOI: 10.2147 / TACG.S99405

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    31.Нгуен Т., Стейнс Д., Нилиус Б., Смит П., Маршалл-Градисник С. Новая идентификация и характеристика транзиторных рецепторных потенциальных каналов меластатина 3 на естественных киллерных клетках и В-лимфоцитах: влияние на передачу сигналов клеток у пациентов с синдромом хронической усталости / миалгическим энцефаломиелитом. Biol Res. (2016) 49:27. DOI: 10.1186 / s40659-016-0087-2

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    32. Нгуен Т., Джонстон С., Кларк Л., Смит П., Стейнс Д., Маршалл-Градисник С.Нарушение мобилизации кальция в естественных клетках-киллерах у пациентов с синдромом хронической усталости / миалгическим энцефаломиелитом связано с переходными рецепторными потенциальными ионными каналами меластатина 3. Clin Exp Immunol. (2017) 187: 284–93. DOI: 10.1111 / cei.12882

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    33. Дембла С., Берендт М., Мор Ф., Гёке С., Зондерманн Дж., Шнайдер Ф.М. и др. Антиноцицептивное действие периферических мю-опиоидных рецепторов за счет опосредованного G-бета-гамма ингибирования каналов TRPM3. Элиф. (2017) 6: e26280. DOI: 10.7554 / eLife.26280

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    35. Бадека Д., Юдин Ю., Борбиро И., Хартл С.М., Язычи А., Миршахи Т. и др. Ингибирование временного рецепторного потенциала ионных каналов меластатина 3 с помощью субъединиц G-белка β γ . Элиф . (2017) 6: e26147. DOI: 10.7554 / eLife.26147

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    36. Кант Р., Далглиш А.Г., Аллен Р.Л.Налтрексон подавляет продукцию IL-6 и TNFα в субпопуляциях иммунных клеток человека после стимуляции лигандами внутриклеточных толл-подобных рецепторов. Front Immunol. (2017) 8: 809. DOI: 10.3389 / fimmu.2017.00809

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    37. Weerts EM, Kim YK, Wand GS, Dannals RF, Lee JS, Frost JJ, et al. Различия в блокаде дельта- и мю-опиоидных рецепторов, измеренные с помощью позитронно-эмиссионной томографии у недавно воздержавшихся от алкоголя субъектов, получавших налтрексон. Нейропсихофармакология. (2008) 33: 653–65. DOI: 10.1038 / sj.npp.1301440

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    39. Smith JP, Bingaman SI, Ruggiero F, Mauger DT, Mukherjee A, McGovern CO, et al. Терапия опиоидным антагонистом налтрексоном способствует заживлению слизистых оболочек при активной болезни Крона: рандомизированное плацебо-контролируемое исследование. Dig Dis Sci. (2011) 56: 2088–97. DOI: 10.1007 / s10620-011-1653-7

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    41.Младший JW, Заутра AJ, Cummins ET. Влияние налтрексона на болевую чувствительность и настроение при фибромиалгии: нет данных об эндогенной опиоидной патофизиологии. PLoS ONE. (2009) 4: e5180. DOI: 10.1371 / journal.pone.0005180

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    43. Рингерик Т., Пайк Э, Невьяр Дж., Клемп М. Использование налтрексона в малых дозах сверх утвержденных показаний . Осло: отчет Норвежского центра знаний для служб здравоохранения (NOKC) (2015).

    Google Scholar

    44. Муньос Н.М., Лефф А.Р. Высокоочищенное селективное выделение эозинофилов из периферической крови человека с помощью отрицательной иммуномагнитной селекции. Nat Protoc. (2006) 1: 2613–20. DOI: 10.1038 / nprot.2006.340

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    45. Эндрюс Г., Кемп А., Сандерленд М., Корфф М.В., Устун ТБ. Нормативные данные для 12 пунктов таблицы оценки инвалидности ВОЗ 2.0. PLoS ONE. (2009) 4: e8343.DOI: 10.1371 / journal.pone.0008343

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    47. Штрауб И., Мор Ф., Стаб Дж., Конрад М., Филипп С., Обервинклер Дж. И др. Вторичные метаболиты цитрусовых и фабацеа эффективно и избирательно блокируют TRPM3. Br J Pharmacol. (2013) 168: 1835–50. DOI: 10.1111 / bph.12076

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    49. Виллер В.Б., Годанг К., Мёркрид Л., Саул Дж. П., Таулов Е., Валлё Л.Аномальные реакции терморегуляции у подростков с синдромом хронической усталости: связь с клиническими симптомами. Педиатрия. (2007) 120: e129–37. DOI: 10.1542 / педс.2006-2759

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    50. Томпсон Г.Л., Лейн Дж. Р., Кудрат Т., Секстон П.М., Кристопулос А., Каналс М. Смещенный агонизм эндогенных опиоидных пептидов в отношении μ-опиоидного рецептора. Mol Pharmacol. (2015) 88: 335–46. DOI: 10.1124 / mol.115.098848

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    52.Кэбот П.Дж., Картер Л., Гайддон С., Чжан К., Шефер М., Лёффлер Дж. П. и др. Бета-эндорфин, полученный из иммунных клеток. Производство, высвобождение и контроль воспалительной боли у крыс. J Clin Invest. (1997) 100: 142–8. DOI: 10.1172 / JCI119506

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    53. Бидлак Дж. М., Химич М., Паркхилл А. Л., Сумагин С., Сун Б., Типтон С. М.. Опиоидные рецепторы и передача сигналов клетками иммунной системы. J Neuroimmune Pharmacol. (2006) 1: 260–9.DOI: 10.1007 / s11481-006-9026-2

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    54. Бояджиева Н.И., Саркар ДК. Опиоидная активность налтрексона на цитолитическую активность естественных клеток-киллеров и продукцию цитокинов в спленоцитах: влияние алкоголя.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *