Регистрация ип через ифнс: Я хочу проверить данные об ИП или компании в едином реестре (ЕГРИП/ЕГРЮЛ) | ФНС России

Содержание

Что делать после регистрации ИП?|Первые шаги после регистрации ИП


Доброго времени суток! В прошлой статье я уже рассмотрел вопрос о том как пройти регистрацию в качестве индивидуального предпринимателя , теперь встает закономерный вопрос «А что дальше ?», какие шаги должен сделать ИП после своей регистрации в налоговой ?

Давайте рассмотрим несколько основных и важных шагов которые должен сделать после своей регистрации каждый ИП.

Действия ИП после регистрации в ИФНС

Порядок действий будет зависеть от некоторых факторов, разберем их:

Регистрация в ПФР и ФСС

После регистрации предпринимателя ИФНС (инспекция федеральной налоговой службы) автоматически передает данные в ПФР (пенсионный фонд России) и ИП нет необходимости проходить регистрацию в ПФР.

Но здесь есть некоторый нюанс, регистрацию в ПФР нет необходимости проходить тем предпринимателям у которых нет работников.

В случае если у Вас есть работники, то Вам необходимо встать на учет в ПФР как работодатель. Регистрация в ПФР как работодателя производится в течении 30 дней.

Относительно ФСС  (фонд социального страхования) ситуация аналогичная, если у Вас нет работников, то Вы не становитесь на учет.

В случае если Вы берете на работу людей, то так же необходимо встать на учет ФСС как работодатель (на это отводится 10 дней с момента заключения трудового договора с человеком).

Выбрать систему налогообложения ИП

После регистрации в качестве ИП необходимо определиться с системой налогообложения которую Вы будете использовать.

ИП в своей деятельности может пользоваться следующими системами налогообложения:

ОСНО, ЕНВД , ПСН, УСН, ЕСХН. Более подробно о системах налогообложения ИП Вы можете ознакомиться в рубрике «Налогообложение для бизнеса».

После регистрации предприниматель автоматически находится на налоге ОСНО и Вы можете использовать для своей деятельности любой другой налоговый режим.

Из перечисленного списка нас интересует налог УСН, дело в том что по закону отводится всего 30 дней с момента регистрации для того чтобы встать на данное налогообложение.

В случае если не успеете, то придется ждать конца календарного года и только после этого можно будет на него перейти.

Так что если Вы решили что будете работать на налоге УСН, то тогда Вам после регистрации ИП необходимо в течении 30 дней сдать в налоговую уведомление о переходе на налог УСН по форме №26.2-1

У остальных систем налогообложения нет жестком привязки к сроку регистрации ИП и открыть Вы сможете их в любой момент.

Совет: В настоящее время многие предприниматели для расчета налогов, взносов и сдачи отчетности онлайн используют данную «Интернет-бухгалтерию». Сервис помог мне сэкономить на услугах бухгалтера и избавил от походов в налоговую. Мне также удалось достать подарочный промокод для подписчиков моего сайта, по которому Вы сможете получить 3 месяца сервиса бесплатно, чтобы по достоинству оценить его. Для этого просто введите промокод

74436115 на странице активации подарка.

Заказать изготовление печати

Сразу оговорюсь: Индивидуальный предприниматель по закону имеет полное право работать без печати ( в таких случаях на месте печати просто ставят б/п, что расшифровывается как БЕЗ ПЕЧАТИ).

Но несмотря на это я рекомендую всем без исключения индивидуальным предпринимателям после регистрации обязательно заказать изготовление печати!

Во первых — это придаст Вашему бизнесу некоторую солидность и во вторых Вы будете уверены, что никто не сможет провернуть с Вашими документами никаких махинаций. Так что не пожалейте денег и закажите себе печать.

Письмо из отдела статистики

После своей регистрации ИП должен посетить так называемый ОТДЕЛ СТАТИСТИКИ и получить там на свое ИП письмо со всеми статистическими данными и кодами.

Данное письмо может Вам потребоваться в дальнейшем, например, для того чтобы открыть расчетный счет в банке, как раз требуют это письмо.

Открыть расчетный счет в банке

Ситуация та же что и с печатью — расчетный счет для ИП открывать не обязательно. И на самом деле он не всегда нужен.

Допустим если Вы просто оказываете услуги частным гражданам, то расчетный счет просто ни к чему.

В случае если Вы оказывая услуги планируете работать с организациями, а так же при торговле и производстве РАСЧЕТНЫЙ СЧЕТ ПРОСТО НЕОБХОДИМ.

Так что стоит позаботиться об его открытии, для этого достаточно обратиться в любой банк который больше придется Вам по душе.

Уведомлять об открытии расчетного счета предприниматель никого не должен. Банки самостоятельно оповещают ИФНС и ПФР.

Приобретение и постановка на учет  кассового аппарата

В зависимости от того какую систему налогообложения Вы выберете может потребоваться приобретение ККТ (контрольно-кассовой техники).

ККТ нужен только при торговле на налогах УСН,  ОСНО и ЕСХН. В случае если Вы используете один из перечисленных видов налогообложения, то приобретайте и ставьте на учет кассовый аппарат.

Постановка кассового аппарата на учет происходит в ИФНС где предприниматель открыл свое ИП.

Регистрация ИП в Роспотребнадзоре
Для некоторых видов деятельности предприниматель перед тем как начать ими заниматься должен подготовить и сдать комплект документов в Роспотребнадзор. Подробнее в статье «Регистрация ИП в Роспотребнадзоре».

Вот такие шаги необходимо предпринять после того как Вы зарегистрируете ИП. Сложного тут ничего нет, но лучше эти вопросы решить сразу, чтобы в последующем не отвлекаться на это от своего бизнеса.

Процедура государственной регистрации индивидуального предпринимателя теперь стала еще проще, подготовьте документы на регистрацию ИП совершенно бесплатно не выходя из дома через проверенный мной онлайн сервис: «Регистрация ИП бесплатно за 15 минут».

В случае если что-то не понятно и у Вас возникли сложности и вопросы Вы можете задать их в группе ВК «Секреты бизнеса для новичка», консультации для новичков совершенно бесплатны.

Теперь Вы стали еще на один шаг ближе к своему, я уверен, успешному бизнесу.

На этом все! Удачного бизнеса и пока!

За полгода ликвидировано рекордные 725 000 компаний

«Известия» выяснили, что с начала года с рынка ушло 724 000 юридических лиц и индивидуальных предпринимателей. Так, январе–июне количество закрывшихся ИП и фермерских хозяйств составило 553 000 – на 81% больше, чем в аналогичный период 2020-го. 

Наиболее частой причиной ликвидации было решение о прекращении деятельности (его приняли 289 000 ИП). В почти 7000 случаев ИП был упразднен из-за смерти бизнесмена, 310 предприятий прекратили существование в связи с аннулированием документа, подтверждающего право их владельцев проживать в России, а 842 ИП обанкротились, следует из статистики ФНС.

В этом сюжете
  • 3 июня, 12:57

  • 24 ноября, 8:49

При этом 258 000 ИП прекратили деятельность в связи с принудительным исключением из реестра (ЕГРИП). Под эту меру попадают предприниматели, которые более 15 месяцев не сдают налоговую отчетность или не продлевают действие патента. Исключение позволяет им не накапливать долги по налогам.

Упраздненных юрлиц оказалось в три раза меньше: по данным налоговой, это 170 000 фирм. При этом по сравнению с 2019 годом их количество сократилось на 22% и в целом стало самым скромным с 2015 года (тогда деятельность прекратило 138 000 юрлиц).

Издание отмечает, что количество закрытых компаний стало рекордным после 2013 года, когда было ликвидировано 820 000 юрлиц и ИП.

При этом регистрация новых фирм в коронавирусный период не прекратилась. В первой половине 2021 года было создано 410 000 ИП и 121 000 юрлиц. Таким образом, чистый отток компаний составил 192 000 фирм. Всего же на сегодня в России действует 6,9 млн бизнесов — 3,3 млн компаний и 3,5 млн ИП.

Безвременно закрыто: за полгода в РФ ликвидировано 725 тыс. компаний | Статьи

В первой половине 2021 года с рынка ушло 724 тыс. юридических лиц и индивидуальных предпринимателей, что стало самым высоким показателем с 2013-го. Это следует из данных ФНС, которые проанализировали «Известия». Чаще всего компании ликвидировались, так как сами принимали решение прекратить деятельность, а также из-за принудительного исключения из ЕГРИП. Такие тенденции связаны с сокращением мер господдержки и переходом части предпринимателей в статус самозанятых, пояснили эксперты. При этом число зарегистрированных в этот период фирм, наоборот, выросло: оно составило 531 тыc. — на 34% больше, чем в прошлом году.

Работать нельзя закрыться

В январе–июне 2021 года количество закрывшихся ИП и фермерских хозяйств составило 553 тыс. — на 81% больше, чем в аналогичный период 2020-го. Наиболее частой причиной ликвидации было решение о прекращении деятельности (его приняли 289 тыс. ИП), однако она не была единственной. В почти 7 тыс. случаев ИП был упразднен из-за смерти бизнесмена, 310 предприятий прекратили существование в связи с аннулированием документа, подтверждающего право их владельцев проживать в России, а 842 ИП обанкротились, следует из статистики ФНС. Среди менее популярных причин ликвидации оказались решение суда и лишение права заниматься бизнесом.

При этом 258 тыс. ИП прекратили деятельность в связи с принудительным исключением из реестра (ЕГРИП). Под эту меру попадают предприниматели, которые более 15 месяцев не сдают налоговую отчетность или не продлевают действие патента. Исключение позволяет им не накапливать долги по налогам.

Упраздненных юрлиц оказалось в три раза меньше: по данным налоговой, это 170 тыс. фирм. При этом по сравнению с 2019 годом их количество сократилось на 22% и в целом стало самым скромным с 2015 года (тогда деятельность прекратило 138 тыс. юрлиц).

При рассмотрении причин ликвидации ФНС выяснила, что в первой половине 2021 года большинство юрлиц (134 тыс.) признали покинувшими рынок по решению органа, регистрирующего их в ЕГРЮЛ, — это возможно, если в последние 12 месяцев они не предоставляли отчетности и не осуществили ни одной операции по банковским счетам. Более 29 тыс. компаний самостоятельно приняли решение прекратить деятельность, а 4 тыс. перестали существовать в результате реорганизации.

В общей сложности на фоне преодоления последствий пандемического кризиса в 2021 году с рынка ушло 724 тыс. юрлиц и ИП. Это рекорд с 2013 года: тогда деятельность прекратило 820 тыс. компаний и индивидуальных предпринимателей. Однако регистрация новых фирм в этот период не прекратилась: по данным ФНС, в первой половине 2021 года было создано 410 тыс. ИП и 121 тыс. юрлиц. Таким образом, чистый отток компаний составил 192 тыс. фирм. Всего же на сегодня в России действует 6,9 млн бизнесов — 3,3 млн компаний и 3,5 млн ИП, следует из статистики налоговой службы.

В Минэкономразвития прокомментировали динамику численности малых и средних компаний, для которых существует отдельный реестр. Там заявили, что наблюдают низкую активность по созданию новых фирм сектора МСП, но при этом поддерживают небольшие компании в рамках профильного нацпроекта.

Ранее глава ведомства Максим Решетников прогнозировал полное восстановление экономики страны от последствий пандемии к середине лета 2021 года. Кроме того, министерство улучшило прогноз экономического развития: в частности, рост ВВП в этом году ожидается на уровне 3,8%.

Есть причины

Негативную динамику по ликвидации компаний спровоцировало сразу несколько тенденций, заявил руководитель направления «Макроэкономика» ЦМАКП Дмитрий Белоусов. Во-первых, это влияние кризисного эпизода, который, несомненно, подтолкнул многие компании к уходу с рынка. Кроме того, скорее всего, произошло поглощение малых фирм крупными — причем это выгодно государству, так как позволяет собрать больше налогов. И, наконец, часть предпринимателей могла перейти в статус самозанятых для оптимизации нагрузки — не случайно их насчитывается уже 2,4 млн, отметил эксперт.

Статистика демографии фирм — хороший способ получить представление о положении бизнеса в стране, отметил директор Центра исследования экономической политики МГУ Олег Буклемишев. И существующая динамика обусловлена в первую очередь тем, что государство перестало оказывать части предпринимателей антикризисную помощь.

— Никогда не было секретом, что после прекращения действия мер господдержки будет отскок по числу действующих фирм, — заявил эксперт.

Меры по предотвращению распространения коронавируса в период пандемии сильнее всего затронули малый бизнес, заявила старший директор группы корпоративных рейтингов АКРА Екатерина Можарова. Пострадали как юридические лица, так и индивидуальные предприниматели. При этом вполне вероятно, что граждане закрывали ИП в том числе для того, чтобы иметь возможность получать пособие по безработице, которое было увеличено в период коронакризиса, предположила она.

Для оценки уровня экономической активности целесообразно отслеживать динамику закрытия и открытия юрлиц, уверен управляющий директор рейтингового агентства НКР Дмитрий Орехов. А она в 2021 году улучшилась по сравнению с 2020-м: число открывшихся компаний выросло на 13%, а закрывшихся — сократилось на 22%. Это свидетельствует об улучшении рыночной конъюнктуры, оптимистичен эксперт.

Он также подчеркнул, что основная часть юрлиц (79%) завершила работу в связи с исключением из ЕГРЮЛ по решению регистрирующего органа, что говорит о продолжающейся работе ФНС по ликвидации фиктивных и не ведущих деятельность компаний. В целом гораздо важнее иметь меньше организаций, но работающих и конкурентоспособных, нежели много, но неэффективных, отметил Дмитрий Орехов.

Как работает Мадридская система

Процесс международной регистрации товарных знаков

Этап 1 — Подача заявки через национальное или региональное ведомство ИС (ведомство происхождения)

Прежде чем вы сможете подать международную заявку, вам необходимо уже зарегистрироваться или подать заявку в своем «домашнем» офисе ИС. Регистрация или заявка известны как базовая отметка . Затем вам необходимо подать международную заявку через это же ведомство IP, которое будет сертифицировать и направить ее в ВОИС.

Этап 2 — Формальная экспертиза в ВОИС

ВОИС проводит только формальную экспертизу вашей международной заявки. После утверждения ваш знак вносится в Международный реестр и публикуется в Бюллетене международных знаков ВОИС. Затем ВОИС отправит вам свидетельство о вашей международной регистрации и уведомит ведомства ИС на всех территориях, где вы желаете защитить свой знак.

Важно отметить, что объем охраны международной регистрации на данном этапе процесса неизвестен.Он определяется только после предметного изучения и решения ведомств ИС на территориях, на которых вы запрашиваете охрану, как указано в Этапе 3.

Этап 3 — Экспертиза по существу национальными или региональными ведомствами ИС (ведомством указанной Договаривающейся стороны)

Ведомства интеллектуальной собственности территорий, на которых вы хотите защитить свой знак, примут решение в течение установленного срока (12 или 18 месяцев) в соответствии со своим законодательством. ВОИС заносит решения ведомств ИС в Международный реестр, а затем уведомляет вас.

Если IP Office полностью или частично отказывается защищать ваш знак, это решение не повлияет на решения других IP Office. Вы можете оспорить решение об отказе непосредственно в соответствующем ведомстве интеллектуальной собственности в соответствии с его законодательством. Если IP Office соглашается защитить ваш знак, оно выдает заявление о предоставлении защиты.

Международная регистрация вашего знака действительна в течение 10 лет. Вы можете продлевать регистрацию в конце каждого 10-летнего периода непосредственно в ВОИС с вступлением в силу в соответствующих указанных Договаривающихся сторонах.

Движение вперед

Если вы хотите приступить к подаче заявки, обратитесь по номеру:

Узнать больше

Видео: Как пользоваться Мадридской системой.

Терапия интерфероном-β у пациента с Incontinentia Pigmenti и аутоантителами против IFN типа I, инфицированных SARS-CoV-2

Редактору,

17 интерферонов типа I (IFNs) лежат в основе опасной для жизни пневмонии COVID-19, по крайней мере, у 10% большой группы пациентов [1].Пациенты с врожденными ошибками TLR3- и IRF7-зависимой продукции и амплификации IFN типа I также предрасположены к опасной для жизни пневмонии COVID-19 [2]. Эти данные свидетельствуют о том, что раннее введение IFN-α2 или -β, двух клинически доступных IFN человека I типа, может быть полезным для пациентов с врожденными ошибками или ауто-Abs против IFN типа I, инфицированного SARS-CoV-2. Недавно мы сообщили о безопасности и очевидной эффективности раннего введения однократной подкожной инъекции Peg-IFN-α2a двум неродственным пациентам с аутосомно-доминантной недостаточностью TLR3 и IRF3, генетические нарушения которых были диагностированы до заражения SARS-CoV-2 [3] .Оба пациента прошли курс лечения в первые 7 дней после заражения SARS-CoV-2 и выздоровели без развития тяжелой пневмонии COVID-19.

Введение IFN-α2, вероятно, будет неэффективным для большинства пациентов с ауто-АТ против IFN типа I, которые обычно нейтрализуют высокие концентрации IFN-ω и 13 отдельных IFN-α, включая IFN-α2, в частности, in vitro. 1 . Недавно сообщалось, что плазмаферез снижает титры ауто-АТ крови у госпитализированных пациентов с критической пневмонией [4].Однако эту инвазивную процедуру нельзя предлагать в амбулаторных условиях до развития тяжелой пневмонии. Более многообещающим вариантом является раннее введение IFN-β, поскольку только 2% пациентов с опасным для жизни COVID-19 и ауто-АТ против IFN типа I имеют ауто-АТ, которые нейтрализуют IFN-β в условиях, в которых I IFN нейтрализованы.

В январе 2021 года с нами связалась 24-летняя женщина с пигментным недержанием мочи (IP), редким Х-сцепленным доминантным заболеванием, вызванным гетерозиготными вариантами с потерей функции IKBKG .Мы показали, что у некоторых женщин с IP есть ауто-АТ против IFN типа I [1], в том числе у этой пациентки, у которой высокие титры нейтрализующих ауто-АТ против IFN-α2 и IFN-ω, но не IFN-β (рис. .). Единственная женщина с IP, ранее сообщавшаяся о заражении SARS-CoV-2, страдала опасной для жизни пневмонией COVID-19 и демонстрировала нейтрализующие ауто-АТ против интерферонов I типа [1]. Это привело нас к превентивному скринингу когорты женщин с IP на наличие ауто-Abs против IFN типа I, включая IFN-β.Мы проинформировали тех, у кого есть ауто-АБС против интерферонов типа, чтобы они немедленно связались с нами в случае инфекции SARS-CoV-2.

Auto-Abs против различных подтипов IFN типа I. ELISA для ауто-Abs против 13 различных подтипов IFN-α, IFN-ω, IFN-β, IFN-κ и IFN-ε у пациента IP с ауто-Abs против IFN типа I, получавшего IFN-β, пациент с аутоиммунным полиэндокринным синдромом 1 типа (APS-1) и здоровым контролем

Пациент имел классический анамнез ИП с различными стадиями кожных поражений, везикулярными и бородавчатыми в неонатальном периоде (стадии 1 и 2), гиперпигментирован с линейным узором по линиям Бляшко от младенчества до подросткового возраста (стадия 3).У нее также была очаговая алопеция на макушке и агенезия зубов, которая привела к имплантации зубов. В детстве не наблюдалось поражения глаз или центральной нервной системы, психомоторное развитие у пациента хорошее. У пациента была обнаружена обычная IP-делеция экзонов с 4 по 10 в гене IKBKG . Ее мать протекала бессимптомно и не подверглась мутации. Диагноз спорадической формы ИП сохранен.

Она работала медсестрой в государственной больнице в Париже и не была вакцинирована, когда заразилась SARS-CoV-2.Она связалась с нами в тот день, когда заболела, и ее поместили в отделение внутренней медицины больницы Коччи для клинического ведения.

У пациента была высокая температура (39,5 ° C), сообщалось о головных болях, одышке, полной аносмии и агевзии, кашле, утомляемости и диффузной миалгии. Она также сообщила о зуде по ходу остаточных поражений IP стадии 3 в подмышечных и паховых складках. Ее физическое обследование было нормальным. Насыщение кислородом тоже было в норме. ПЦР на мазке из носа, взятом при поступлении, подтвердила COVID-19 с высокой вирусной нагрузкой SARS-CoV-2 (Ct: 14).КТ легких, проведенная на второй день симптомов, не выявила признаков пневмонии или тромбоэмболии легочной артерии. Уровни С-реактивного белка (CRP) были ниже порога обнаружения, а общий анализ крови был нормальным (гемоглобин, 12,3 г / дл; тромбоциты, 224000 / мм 3 ; количество нейтрофилов: 1490 / мм 3 и лимфоцитов кол, 1540 / мм 3 ).

Поскольку эта пациентка находилась на ранних стадиях инфекции (6-й день после появления первых симптомов), без рентгенологических признаков пневмонии, биологических признаков воспаления или потребности в добавлении кислорода, ей были назначены три внутримышечные инъекции 44 мкг IFN- β1a (AVONEX) каждые 48 ч.После первой инъекции у нее появились симптомы гриппа, которые разрешились пероральным приемом парацетамола. На следующий день ее выписали, а последние две инъекции провела медсестра на дому. Аносмия и агевзия исчезли в течение 48 часов, а кашель у пациента исчез после второй инъекции. Через десять дней после появления симптомов у пациента не было симптомов, за исключением легкой астении, с отрицательными результатами ПЦР и положительными серологическими результатами на SARS-CoV-2 (индекс IgG: 6.1). Через 4 недели у нее не было симптомов.

Обоснование введения IFN-β этой пациентке было основано на (i) ее высоких титрах ранее существовавших ауто-АТ в крови, нейтрализующих большинство отдельных IFN типа I, включая 13 индивидуальных IFN-α и IFN-ω; (ii) сообщения о развитии угрожающей жизни пневмонии COVID-19 у всех известных пациентов с этими ауто-АТ (т.е. полная пенетрантность критической пневмонии при вирусной инфекции при отсутствии медицинского вмешательства) [1]; (iii) высокая смертность (36%) от COVID-19 у пациентов с ауто-АТ против интерферонов I типа [1]; (iv) чувствительность контрольных клеток к SARS-CoV-2 при инфицировании в присутствии плазмы пациентов с ауто-АТ против IFN типа I, несмотря на введение экзогенного IFN-α2 [2]; (v) известный профиль безопасности трех внутримышечных инъекций IFN-β1a (AVONEX).

Симптомы и признаки пациентки исчезли быстро, и у нее появился ответ антител на SARS-CoV-2. Auto-Abs против IFN типа I, включая IFN-β, будет контролироваться. Наши результаты показывают, что три внутримышечных инъекции IFN-β1a пациентам с ауто-АТ против IFN типа I на ранней стадии инфекции SARS-CoV-2 являются безопасными и эффективными. Мы будем следить за ее клинической реакцией и реакцией на антитела к SARS-CoV-2. Этот пациент — единственный известный человек с нейтрализующими ауто-АТ против интерферонов I типа, у которого не развилась опасная для жизни пневмония при инфицировании SARS-CoV-2 [1].Это наблюдение предполагает, что пациенты с ауто-АТ против IFN-α и / или IFN-ω, но не с IFN-β, могут получить пользу от раннего лечения с помощью трех внутримышечных инъекций IFN-β или одной подкожной инъекции Peg-IFN. -β или ингаляционный IFN-β [5]. Более того, IFN-β также можно рассматривать в определенных группах, в которых распространенность ауто-АБС высока, например, у мужчин старше 65 лет [1]. Этот подход также может быть полезным для отдельных пациентов с побочными реакциями на живую аттенуированную вакцину вируса желтой лихорадки из-за продукции этих ауто-АТ, при условии, что соответствующие антитела не нейтрализуют IFN-β [6].

Финансирование

Лаборатория генетики инфекционных заболеваний человека поддерживается Медицинским институтом Говарда Хьюза, Рокфеллеровским университетом, Фондом Сент-Джайлса, Национальным институтом здравоохранения (NIH) (R01AI088364), Национальным центром содействия развитию переводов. Наук (NCATS), программа NIH Clinical and Translational Science Award (CTSA) (UL1 TR001866), быстрый грант от Emergent Ventures, Центра Меркатуса в Университете Джорджа Мейсона, Йельского центра Менделирующей геномики и Координационного центра GSP, финансируемого Национальным агентством по правам человека. Институт исследования генома (NHGRI) (UM1HG006504 и U24HG008956), Французское национальное исследовательское агентство (ANR) в рамках программы «Инвестиции в будущее» (ANR-10-IAHU-01), Лаборатория передового опыта по интегративной биологии возникающих инфекционных заболеваний ( ANR-10-LABX-62-IBEID), Французский фонд медицинских исследований (FRM) (EQU201

7798), проект FRM и ANR GENCOVID, ANRS-COV05, Square Foundation, Gran реж — Фонд солидарности для детей , Корпоративный фонд науки СКОР, Национальный институт Санте и медицинских исследований (INSERM) и Парижский университет.PB был поддержан программой MD-PhD Института Imagine (при поддержке Fondation Bettencourt-Schueller). RL был поддержан Фондом Bettencourt-Schueller.

Границы | Расшифровка протеома, регулируемого интерфероном человека, с помощью количественного анализа, основанного на масс-спектрометрии, выявляет степень и динамику индукции и репрессии белка

Введение

Интерфероны (IFN) представляют собой плейотропные цитокины, которые быстро экспрессируются при встрече с патогенами, такими как вирусы, бактерии и грибки, или при наличии опухолей.Мутации, нарушающие способность стимулировать секрецию IFN или распознавать и адекватно реагировать на IFN, имеют серьезные последствия с точки зрения повышенной чувствительности к патогенам и увеличения частоты опухолей. Мыши, несущие целевые мутации в центральных компонентах системы IFN, гибнут от экспериментальных инфекций с различными патогенами даже при очень низких дозах инфекции (иногда в диапазоне соответствующего предела обнаружения или даже ниже), в то время как животные дикого типа легко переживают инфекции с высокими дозами. количество одного и того же возбудителя (1, 2).Были идентифицированы люди, страдающие от подобных мутаций — часто из-за явной заболеваемости и смертности после заражения аттенуированными вирусами живой вакцины или другими легкими и / или условно-патогенными агентами (3). Важность IFN в контроле опухолей очевидна из выводов о том, что мыши, лишенные функциональных систем IFN, более склонны к спонтанному развитию опухолей и увеличению опухолевой нагрузки в экспериментальных моделях (4-6), а также из того факта, что потеря функции мутации обогащаются генами, кодирующими центральные медиаторы системы IFN во время развития опухоли (например,g., в случае меланомы) (7, 8), что указывает на выраженное давление отбора, вызванное системой IFN.

Интерфероны влияют на множество фундаментальных биологических процессов, таких как пролиферация клеток и трансляция белков. Соответственно, экспрессия IFN имеет серьезные последствия и должна строго контролироваться. На уровне организма лечение IFN часто связано с гриппоподобными симптомами и может вызывать значительные побочные эффекты (например, депрессию). Чрезмерная индукция и / или передача сигналов IFN из-за мутаций может привести к заболеваниям, называемым интерферонопатиями (9).

В соответствии с их молекулярной гомологией и использованием рецепторов, IFN могут быть подразделены на IFN типа I, типа II и недавно описанные IFN типа III. IFN типа I состоят из всех подклассов IFNα и IFNβ. IFNγ является единственным членом IFN типа II (IFN-II). Семейство IFN типа III включает несколько подтипов IFNλ. Различные рекомбинантные IFN использовались или в настоящее время используются в качестве лекарств. Человеческие IFNα2A и α2B, комбинация IFNα2A, B и C, а также синтетическая дизайнерская молекула, основанная на консенсусе различных подтипов IFNα, IFNβ и IFNγ были одобрены FDA для лечения различных инфекционных заболеваний (см. Http: / / www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/daf/index.cfm). Однако наиболее часто назначаемый IFN — это IFNα2.

Все IFN типа I (IFN-I) связываются с одним и тем же рецепторным комплексом, состоящим из IFNAR1 и IFNAR2, которые предварительно связаны с тирозинкиназой 2 (Tyk2) и киназой Janus 1 (Jak1), соответственно. После связывания IFN-I с родственным им рецепторным комплексом киназы Janus фосфорилируют внутриклеточные домены рецепторных цепей, создавая таким образом сайты связывания для преобразователя сигнала и активатора транскрипции (STAT) 1 и STAT2.После того, как STAT связывает рецепторы, они фосфорилируются с помощью Tyk2 и Jak1 по определенному остатку тирозина, расположенному вокруг аминокислотного положения 700 (Y701 в случае STAT1). Из-за внутримолекулярных взаимодействий между фосфорилированным остатком тирозина одной молекулы STAT с доменом src homology 2 второй молекулы STAT и , наоборот, образуется активный гетеродимер. Предыдущие модели часто подразумевали взаимодействие de novo мономерных белков STAT при фосфорилировании, тогда как недавние работы приводят доводы в пользу предварительно сформированных димеров STAT (10, 11), которые изменяют свою конформацию и ориентацию при активации (12-14).Вместе с регуляторным фактором 9 IFN (IRF9), STAT1 и STAT2 образуют активные гетеротримеры, называемые IFN-стимулированным генным фактором 3 (ISGF3), которые перемещаются в ядро, связываются со специфическими элементами энхансера ДНК [называемыми IFN-стимулированными элементами ответа (ISRE)] и вызывают экспрессию соседних генов. Связывание и распознавание ДНК опосредуются как STAT, так и молекулой IRF9. Соответственно, центральная часть консенсуса ISRE напоминает сайт связывания ДНК IRF (также называемый сайтом IRF-E) (15).

Было показано, что

IFN типа III связываются с отдельным рецепторным комплексом, который экспрессируется только в определенных тканях, но индуцирует IFN-I-подобную передачу сигналов и, таким образом, аналогичный транскрипционный ответ ISRE (16, 17). Следовательно, IFN типа I и типа III можно сгруппировать в соответствии с активацией комплексов факторов транскрипции ISGF3, индуцирующих гены, несущие элементы промотора / энхансера ISRE.

Интерферон γ связывается с рецептором, состоящим из IFNGR1 и IFNGR2, которые предварительно связаны с Jak1 и Jak2 соответственно.В отличие от IFN-I и IFN-III, IFNγ в основном индуцирует гомодимеры STAT1. Поскольку распознавание ДНК зависит от молекул STAT1 (а не от молекулы IRF IRF9), соответствующий элемент энхансера ДНК, называемый гамма-активированной последовательностью (GAS), представляет собой канонический сайт связывания ДНК STAT и отличается от элементов ISRE. Считается, что чувствительность данного гена к IFN определяется наличием, а также количеством, расстоянием и расположением энхансерных элементов ISRE и GAS.

Помимо этих двух канонических сигнальных путей (активация ISRE и GAS), отделяющих IFN типа I и III от IFN типа II, было описано несколько неканонических сигнальных событий: например, IFN-I индуцирует гомодимеры STAT1 (в данном случае называемые альфа-активированными). factor), которые вызывают IFNγ-подобный ответ (18), а IFNγ индуцирует STAT2 и IRF9, содержащие комплексы, которые стимулируют ISRE-подобные ответы (19–22).Под этими проксимальными сигнальными событиями рецептора перекрестные помехи также могут быть индуцированы ниже по потоку путем индукции второго слоя факторов транскрипции (например, IRF): IFNγ сильно индуцирует IRF1, который, в свою очередь, может усиливать гены, несущие сайты IRF-E. Поскольку центральная часть элементов ISRE напоминает сайт IRF-E, IFNγ может косвенно стимулировать несколько реагирующих на IFN-I генов через IRF, таких как IRF1. Учитывая эти описания перекрытия и перекрестного взаимодействия между сигнальными каскадами, удивительно, что оба цитокина, как считается, вызывают разные биологические ответы: IFN-I (и IFN-III), как полагают, вызывают прямую противовирусную активность, тогда как IFNγ в основном рассматривается как стимулятор адаптивных иммунных ответов (например,g., улучшая представление антигена).

Большое количество IFN-стимулированных генов (ISG) было описано в прошлом с использованием различных методов. Тем не менее, мы и другие предоставили доказательства того, что IFNγ может репрессировать транскрипцию значительного числа генов, которые мы назвали IFN-репрессированными генами (IRepG) (22). Это открытие поднимает очевидный и актуальный вопрос, приводит ли такая регуляция к изменению белкового состава клеток, подвергшихся воздействию IFN, особенно у людей.

Здесь мы применили количественную оценку без метки на основе масс-спектрометрии для определения амплитуды и динамики IFN-индуцированных изменений в протеоме человека. Мы проанализировали динамические изменения, вызываемые IFNγ, по сравнению с IFN, активирующими ISRE. Поскольку IFN-I и IFN-III активируют сходные сигнальные каскады, мы сосредоточили внимание на IFNα2 как на архетипическом IFN из-за его значимости как противовирусного препарата. Для согласованности и воспроизводимости мы выбрали диплоидную клеточную линию человека, которая широко использовалась для создания нескольких вакцин и для размножения нескольких вирусов, лишена неопластических свойств (23) и которая, как было показано, может быть репрограммируемой путем принудительной экспрессии факторов транскрипции, индуцирующих плюрипотентность (24) как признак сохранения естественности.

Материалы и методы

Культура клеток

Клетки MRC-5 человека были получены из Американской коллекции типовых культур и культивированы в шестилуночных планшетах с модифицированной Дульбекко средой Игла с добавлением 10% (об. / Об.) Фетальной телячьей сыворотки (FCS) и 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл. мл стрептомицина. Обработку средой, содержащей 500 Ед / мл IFN-α и IFN-γ (Hu-IFN-α2a, Hu-IFN-γ; PBL Assay Science), начинали после того, как клетки промывали PBS. Затем клетки инкубировали в течение 4, 24 и 48 часов соответственно при 37 ° C и 5% CO 2 .

Сбор и лизис клеток

Собирали

клеток и дважды промывали ледяным стерильным PBS [4 ° C, 2 мин, 4000 об / мин (1,699 rcf)], суспендировали и лизировали в 50 мМ триэтиламмонийбикарбонате, содержащем 0,1% (мас. / Об.) Поверхностно-активного вещества Rapigest SF (Waters). . После 3 мин обработки ультразвуком суспензии клеток центрифугировали в течение 40 мин при 4 ° C и 12700 об / мин (18 213 rcf) для удаления остатков клеток. Супернатант хранили при -80 ° C до анализа.

Протокол пищеварения

Для каждого образца количество белка в 4 мкг уменьшали с помощью 20 мМ дитиотреитола в течение 30 минут при 60 ° C и алкилировали 15 мМ йодацетамида в течение 30 минут при комнатной температуре.Добавляли трипсин (3 мкл, c = 0,1 мкг / мкл) для разложения в течение 16 часов при 37 ° C. Активность фермента гасили подкислением с использованием 10% (об. / Об.) TFA в течение 30 мин при 37 ° C. Нерастворимое гидролизованное поверхностно-активное вещество удаляли 10-минутным центрифугированием при 14000 g . Супернатант собирали и сушили в центробежном испарителе. 300 нг каждого образца объединяли для получения мастер-микса, используемого для мониторинга характеристик ЖХ в течение всего эксперимента и согласования прогонов ЖХ-МС / МС в последующем количественном анализе.

Анализ ЖХ-МС / МС

Для объективного анализа образцы, полученные из разных экспериментальных групп, были проанализированы рандомизированным образом. Для каждого измерения 300 нг триптических пептидов растворяли в 15 мкл 0,1% (об. / Об.) TFA и вводили в онлайн-систему Ultimate ® 3000 RSLC nanoLC, соединенную с масс-спектрометром Orbitrap Elite (оба Thermo Scientific). Пептиды предварительно концентрировали в течение 7 минут на колонке-ловушке (Acclaim ® PepMap 100, 75 мкм × 2 см, C18, размер частиц 5 мкм, размер пор 100 Å) с использованием 30 мкл / мин 0.1% (об. / Об.) TFA и затем разделены на аналитической колонке (Acclaim ® PepMap RSLC, 75 мкм × 50 см, nano Viper, C18, размер частиц 5 мкм, размер пор 100 Å) с применением градиента от 5 до 40% растворителя B за 98 мин [растворитель A: 0,1% (об. / об.) муравьиная кислота; растворитель B: 0,1% (об. / об.) муравьиная кислота, 84% ацетонитрил; 400 нл / мин; температура термостата колонки 60 ° C]. Полные сканы были получены в анализаторе Orbitrap с разрешением 60 000 в режиме зависимости от данных. 20 наиболее распространенных ионов в спектре, полученном на уровне MS1, были фрагментированы диссоциацией, вызванной столкновениями, и измерены в линейной ионной ловушке.

Анализ данных

Идентификацию пептидов проводили с использованием программного обеспечения Proteome Discoverer 1.4 (Thermo Scientific, Бремен, Германия). Поиск в базе данных был выполнен с помощью Mascot (v. 2.5.1, Matrix Sciences Ltd., Лондон, Великобритания) по базе данных UniProt-SwissProt (Release 2014_10; v. 2.5; 546790 последовательностей). Таксономия была ограничена Homo sapiens (20 194 последовательностей). Трипсин был установлен как расщепляющий фермент с одним разрешенным пропущенным сайтом расщепления. Массовая область была установлена ​​на 350–10 000 Да, а допуски по массе — 5 ppm для прекурсора и 0.4 Да для фрагментных ионов соответственно. Окисление метионина рассматривалось как динамическая модификация, а карбамидометилирование цистеина — как статическое. Достоверность идентификации пептида оценивалась с помощью узла Target Decoy PSM Validator, реализованного в Proteome Discoverer. Учитывались определения пептидов с вероятностью ложного обнаружения (FDR) <1%. Применяли функцию группировки белков.

Количественный анализ данных был выполнен с использованием Progenesis QI для протеомики (версия 2.0.5387.52102; Non-linear Dynamics, Newcastle upon Tyne, UK).Вкратце, циклы ЖХ-МС / МС были импортированы и согласованы с циклом мастер-микса. При обнаружении признаков учитывались только сигналы с минимум тремя изотопами и зарядами от +2 до +5. После удаления признаков, не удовлетворяющих указанным критериям, необработанное количество признаков было нормализовано для корректировки экспериментальных вариаций (25). На следующем этапе прогоны ЖХ-МС / МС с коэффициентами нормализации от 0,5 до 2,0 были рассмотрены для дальнейшего анализа и сгруппированы в соответствии с экспериментальными группами.Затем полученные идентификаторы пептидов и белков были сопоставлены с соответствующими функциями путем импорта файлов результатов из Proteome Discoverer. Количественная оценка белков проводилась с использованием только неконфликтующих пептидов, и опция группирования белков была отключена.

Данные по протеомике

были депонированы в виде полного представления Консорциуму ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) через репозиторий партнеров PRIDE с идентификатором набора данных PXD006442 и DOI 10.6019 / PXD006442. Данные были загружены с помощью ProteomeXchange Submission Tool (версия 2.3.2). ProCon — PROteomics CONversion tool (версия 0.9.641) использовался для необходимого преобразования файлов результатов Proteome Discoverer в стандартный формат mzIdentML (26).

Функциональные аннотации были выполнены с использованием базы данных для аннотаций, визуализации и интегрированного обнаружения (DAVID, версия 6.8) (27, 28).

Статистический анализ

Нормализованные количества белка были экспортированы из Progenesis QI и преобразованы в arcsinh.С использованием собственного письменного сценария R (Фонд R для статистических вычислений, Вена, Австрия). Односторонний дисперсионный анализ Бенджамини – Хохберга с поправкой был использован для расчета скорректированных с помощью FDR значений p (29). Для белков, прошедших уровень значимости 0,05, был проведен апостериорный тест (метод честной значимой разницы Тьюки) для получения значений p для парных сравнений.

Иммуноблоты

Иммуноблоттинг проводили, как описано ранее (30).

Проточная цитометрия

Проточный цитометрический анализ выполняли, как описано ранее (31), с использованием указанных здесь антител.

Результаты

IFNs изменяют протеом человека путем индукции и репрессии белка

Согласно плану исследования, показанному на рисунке 1A, протеомные изменения в клетках человека, индуцированные IFNα и IFNγ, анализировали с помощью количественной протеомики без метки, основанной на ионной интенсивности. Для выяснения зависящих от времени эффектов, изменения содержания белка по крайней мере в шести биологических повторностях относительно контрольных клеток, подвергнутых ложной обработке, отслеживали через 4, 24 и 48 часов.

Рисунок 1 . Глобальная идентификация и количественная оценка белков, регулируемых интерфероном (IFN), в клетках человека. (A) Общий план проведенного протеомного исследования. (B) Обзор значительно регулируемых белков ( p <0,05) в зависимости от типа IFN (IFNα: серый, IFNγ: черный) и времени воздействия (4, 24 и 48 часов). Пороги изменения сгиба (двойное регулирование) обозначены пунктирными линиями. Количество белков, прошедших порог значимости, указано в скобках.Количество белков, удовлетворяющих значимости, а также критерии изменения кратности указаны без скобок. (C) Условия эксперимента такие же, как в (A) , но клетки собирали и лизировали для иммуноблот-анализа с использованием указанных антител. Линии и числа слева отображают миграцию маркерных белков с указанными молекулярными массами в кДа. (D) Изображены нормализованные содержания тех же белков (или их регуляторов), показанные в (C) , рассчитанные с использованием данных МС.Как и во всех анализах, нестимулированный контроль изображен белым цветом, стимуляция IFNα — светло-серым, а стимуляция IFNγ — темно-серыми полосами, соответственно. Индивидуальные количественные оценки ( n = 6–8) обозначены точками, столбцы отображают средние значения с SD (планки ошибок).

Во всем исследовании LC-MS / MS 2945 белков были успешно идентифицированы и количественно определены по крайней мере с одним уникальным пептидом в 69 параллельных образцах (см. Таблицу S1 в дополнительных материалах). Краткий обзор соответствующих названий белков, наиболее значительно активируемых IFN (например,g., IFN-индуцированный GTP-связывающий белок Mx2) сразу же выявил обогащение IFN-стимулированных белков, что указывает на валидность нашего подхода. Чтобы справиться с проблемой менее точных результатов количественной оценки, основанных на количественной оценке одного пептида (32, 33), мы определили индивидуальные коэффициенты вариации (CV) для каждого белка, представленного одним уникальным пептидом. Количественные определения отдельных пептидов с большими отклонениями, показанными в виде среднего CV> 50%, были исключены. Сравнение средних значений CV показало, что эта пересмотренная группа белков с количественным определением одного пептида демонстрирует такие же вариации, как наблюдаемые для белков, количественно определяемых с помощью двух пептидов (см. Рисунок S1 в дополнительном материале).Число белков, окончательно рассмотренных для анализа данных, касающихся изменений протеома, зависящих от времени и типа, составило 2735 (полный набор данных см. В дополнительном материале).

После количественного и статистического анализов для каждого типа IFN и времени инкубации определяли количество белков, показывающих значительно различающееся количество ( p <0,05) в образцах, обработанных IFN, по сравнению с контрольными образцами, обработанными имитацией. В зависимости от типа ИФН и продолжительности лечения содержание до 1700 белков значительно изменилось (см. Число в скобках на Рисунке 1В).Основываясь на нашем опыте с ограничениями количественной оценки без меток (34) и наших критериях биологической значимости и значимости, мы установили порог двукратного изменения с точки зрения медианного содержания белка (см. Числа без скобок на рисунке 1B) для последующего анализа. Поскольку изменения ниже этого достаточно произвольно выбранного заданного значения могут иметь значение при определенных обстоятельствах, эти белки были включены в дополнительный материал, позволяющий другим повторно анализировать данные с более высокими или более низкими критериями строгости.

В зависимости от типа ИФН и периода воздействия более 600 белков значительно изменили свое количество более чем в два раза, что свидетельствует о глубоких изменениях клеточного белкового состава в ответ на ИФН. После 4 часов воздействия IFN обработка IFNα приводила к усилению регуляции большего количества белков по сравнению с IFNγ (45 против 27 белков). В отличие от этого, через 24 и 48 часов количество белков с повышенной регуляцией в случае IFNγ в пять-восемь раз выше (55 против 436 через 24 часа).Мы также наблюдали несколько белков, которые были значительно подавлены. В этом отношении разница между IFNα и IFNγ была даже более выраженной, поскольку такие белковые регуляции были явно более заметными при лечении IFNγ. Функциональные аннотации всех белков, которые в значительной степени и, по крайней мере, двукратно регулируются IFNα или IFNγ, выполнялись для каждой исследуемой временной точки. Полученные результаты отображают широкий спектр связанных молекулярных функций, биологических процессов и клеточных компонентов (см. Рисунки S2 – S4 в дополнительных материалах).Как и ожидалось, для обоих типов IFN передача сигналов IFN (и несколько родственных или подобных генных онтологий, называемых, например, «защитная реакция на вирус») была обнаружена как высокообогащенный биологический процесс среди белков с повышенной регуляцией. Кроме того, было обнаружено, что несколько биологических процессов, связанных с презентацией антигена через MHC-I, обогащаются белками, индуцированными обоими IFN, после длительного воздействия. В частном случае IFNγ полученные результаты, кроме того, показывают, что изменяется широкий спектр разнообразных биологических процессов.Это соответствует ожиданиям, основанным на чрезвычайно высоком количестве белков, регулируемых IFNγ, по сравнению с IFNα. Кроме того, динамический характер модуляции клеточного протеома хорошо демонстрируется обогащением определенных биологических процессов среди белков с повышенной и пониженной регуляцией в различные моменты времени. Например, различные процессы трансляции были обнаружены высокообогащенными среди IFNγ-репрессированных белков через 24 часа, тогда как те же процессы были обнаружены в группе белков, индуцированных IFNγ, через 48 часов (см. Дополнительные материалы).

Подтверждение протеомных изменений, наблюдаемых с помощью масс-спектрометрии

Для обеспечения соответствующих условий стимуляции IFN и дальнейшей проверки наших результатов, основанных на ЖХ-МС, мы приготовили лизаты и подвергли их SDS PAGE и последующему иммуноблот-анализу. Мембраны зондировали антителами, специфичными к фосфорилированным тирозином («активным») молекулам STAT1 и STAT2, а также к STAT1, STAT2 и ISG15. Как и ожидалось, обработка IFN индуцировала фосфорилирование STAT1 и STAT2 и приводила к увеличению IFN-чувствительного гена ISG15, а также белков, конъюгированных с ISG15 (рис. 1C).В соответствии с представлением о том, что STAT1 и STAT2 сами реагируют на IFN [например, Ref. (35) и др.], Оба белка также становились активными во время воздействия IFNα и IFNγ. Результаты, полученные с помощью количественного анализа на основе ЖХ-МС, соответствовали результатам, полученным с помощью иммуноблоттинга (рис. 1D). Из-за их важной роли в ISGlation (36, 37), количественные данные для Trim25 (также называемого EFP) и Ube2L6 (также называемого UBCH8) также показаны (рис. 1D).

IFN типа I и типа II вызывают дискретные изменения в протеоме человека

Интерфероны различаются по своим биологическим ответам.В зависимости от природы соответствующего патогена были зарегистрированы заметные расхождения в отношении прямой противовирусной активности [например, (38)]. Согласно слишком упрощенной концепции из учебников, IFNα действует непосредственно против вируса (например, индуцируя эффекторные белки, такие как Mx, PKR и OAS), тогда как IFNγ модулирует адаптивные иммунные ответы, например, путем стимуляции экспрессии MHC. Такие различия должны отражаться неперекрывающимися изменениями протеома. Таким образом, специфическая комплементарность IFN была проанализирована на качественном уровне, чтобы выяснить, в какой степени оба IFN регулируют как общие, так и отдельные наборы белков.С этой целью для каждой временной точки анализа сравнивали списки белков, демонстрирующих значительную, по крайней мере, двукратную повышающую и понижающую регуляцию после обработки IFNα и IFNγ соответственно. Результаты показаны на рисунке 2А. После короткого времени инкубации, равного 4 часам, IFNα и IFNγ имели только 10 общих белков с повышенной активностью и 26 репрессированных белков. Однако активность 17 и 35 белков повышалась исключительно под действием IFNγ и IFNα соответственно. Точно так же 75 белков репрессировались только IFNγ и 11 белков только IFNα после 4 часов обработки.В более поздние моменты времени большинство белков, реагирующих на IFNα, также реагировали на IFNγ. Помимо этих обычно чувствительных белков, IFNγ был способен специфически активировать дополнительные белки (393 и 267) через 24 и 48 часов лечения. Что касается белков с пониженной регуляцией, эта тенденция была еще более выраженной: через 24 и 48 часов только 2 и 1 белок, соответственно, были значительно и, по крайней мере, двукратно репрессированы IFNα, тогда как IFNγ также репрессировал эти белки плюс 185 и 110 дополнительных белков соответственно ( Рисунок 2А).

Рисунок 2 . Дифференциальные изменения протеома, вызванные разными интерферонами (IFN). (A) Диаграммы Венна, иллюстрирующие прямое сравнение количества IFNα- и IFNγ-стимулированных и репрессированных белков ( p <0,05, по крайней мере двукратное регулирование) после разного времени воздействия. (B) Графики разброса, показывающие линейную корреляцию IFNα- и IFNγ-индуцированных регуляций белка (log 2 -трансформированные отношения значимых регуляторов с p <0.05). Расчет линий регрессии показывает более сильную регуляцию IFNγ после длительного воздействия (24 и 48 ч).

Помимо этой качественной оценки, наш подход также позволяет проводить прямые количественные сравнения изменений, вызванных IFNα и IFNγ, посредством корреляционного анализа. Поэтому мы сравнили силу регуляции IFNα по отношению к силе регуляции IFNγ на диаграммах разброса (рис. 2B). В отличие от предыдущего анализа, все белки, показавшие значительно измененное содержание при обработке IFN, были включены независимо от кратного изменения.Линейный регрессионный анализ для исследуемых временных точек показан на рисунке 2B. Для каждой временной точки белки, которые, по крайней мере, дважды регулируются обоими типами IFN, демонстрировали идентичное направление регуляции, на что указывает очевидная нехватка белков во II и IV квадрантах (рис. 2B). За некоторыми исключениями, большинство белков, специфически регулируемых по крайней мере вдвое одним типом ИФН, демонстрируют устойчивую и значительную тенденцию при лечении другим ИФН. Однако в последнем случае критерии смены складок часто не выполняются.Что касается силы регулирования, то через 4 часа после лечения наклон линии регрессии (~ 1) указывает на то, что как IFNα, так и IFNγ обладают сравнимыми индуктивными или репрессивными эффектами. Как показано наклонами выше 1, через 24 и 48 ч регуляция белка, индуцированная IFNγ, более выражена, чем соответствующая регуляция IFNα.

Протеомные изменения, индуцированные IFN, являются высокодинамичными

Для выяснения зависящих от времени протеомных изменений, наблюдаемых для одного типа IFN, сравнивали белки, значительно регулируемые, по крайней мере, в два раза через 4, 24 и 48 часов после обработки.Результаты этих сравнений, основанных на образцах, изображены в виде диаграмм Венна на Рисунке 3A. В случае обоих IFN протеомные изменения оказываются очень динамичными, на что указывает четкая комплементарность между исследованными временными точками. Было обнаружено, что для IFNα 169 белков в значительной степени регулируются, по крайней мере, в одной из трех исследованных временных точек. Из них только 2, 5 и 18 белков регулировались в двух временных точках и только 5 в каждый момент времени после обработки IFNα. Более тщательное изучение этих белков (рис. 3В) выявило общие направления регуляции в течение исследуемого периода времени, за исключением противоположных регуляций пяти белков, которые значительно регулируются через 4 и 24 часа.Напротив, 70, 29 и 40 белков по-разному регулировались только в один конкретный момент времени. В случае IFNγ из 936 белков, регулируемых по крайней мере в два раза, 17, 44 и 135 белков регулировались в двух и 26 во всех трех точках времени. 41, 418 и 255 белков регулировались IFNγ только в один конкретный момент времени. Интересно, что, за исключением IFIT3, все белки, обнаруженные в перекрытиях с 4-часовыми образцами, показывают перевернутые профили регуляции в одной или обеих из двух других временных точек.Напротив, из 135 белков, обычно изменяемых через 24 и 48 часов, 127 проявляют то же направление регуляции (рис. 3B, нижняя панель). Взятые вместе, эти данные показывают необычайную динамику и круговорот изменений, вызванных IFN, и подчеркивают необходимость проведения таких экспериментов с определенным временным разрешением — в противном случае значительные изменения могут быть пропущены или, по крайней мере, сильно недооценены.

Рисунок 3 . Динамика протеома человеческого интерферона (IFN). (A) Диаграммы Венна, иллюстрирующие прямое сравнение количества существенно и, по крайней мере, двукратно регулируемых белков после разного времени обработки. (B) Профили регуляции (log 2 трансформированных соотношений) для белков, которые в значительной степени и, по крайней мере, двукратно регулируются более чем в одной отдельной временной точке. Белки, показывающие противоречивые правила в разные моменты времени, показаны серым, а те, которые постоянно повышаются или понижаются, — черным.

IFN типа I модулируют механизм презентации антигена

Ядерные клетки непрерывно представляют моментальный снимок своего текущего профиля экспрессии белка в контексте молекул лейкоцитарного антигена человека (HLA) для циркулирующих Т-лимфоцитов (см. Рисунок 4A для обзора).В частности, IFNγ хорошо известен своим действием на несколько белков, участвующих в презентации антигена. Протеасома и другие протеазы расщепляют белки до пептидов, которые переносятся в просвет ER транспортером, связанным с презентацией антигена (TAP). Через TabBP (также называемый тапазином) TAP связан с молекулами HLA, состоящими из тяжелой цепи HLA и β2m. Загрузка пептидов на молекулы HLA / MHC, а также контроль качества катализируются несколькими шаперонами (например,g., ERp57, кальретикулин, калнексин). Повышенная экспрессия нескольких генов, участвующих в презентации антигена, индуцированной IFNγ, хорошо описана. Кроме того, IFNγ вызывает изменение состава протеасомы от конститутивной протеасомы к так называемой иммунной протеасоме, стимулируя обмен трех субъединиц (PSMB5, ​​6 и 7) тремя альтернативными субъединицами [а именно PSBM8 (LMP7), 9 ( LMP2) и 10 (MECL1)]. Основываясь на данных протеома, мы в качестве примера сравнили регуляцию белков, участвующих в презентации HLA после обработки IFNα и IFNγ.В соответствии с предыдущими сообщениями о клетках MRC-5 (39), наш протеомный анализ идентифицировал и количественно определил белки HLA, соответствующие аллелям HLA-A2, -A29 и B44. Хотя IFNγ превосходил индукцию компонентов презентации антигена, IFNα также увеличивал количество нескольких белков (например, HLA-A, HLA-B, HLA-C, PSBM9, TAP1 и TAP2) (рис. 4B). В соответствии с этой чувствительностью к IFNα важных компонентов пути презентации HLA / MHC, эксперимент с проточной цитометрией с использованием HLA-специфического антитела W6 / 32 показал повышенную регуляцию презентации HLA на поверхности клеток, обработанных IFNα и IFNγ (рис. ) проверка наших протеомных данных на биологическом уровне.

Рисунок 4 . Интерферон (IFN) компонентов нагрузки пептида и презентации антигена MHC. (A) Упрощенная схема загрузки пептида и презентации MHC / человеческого лейкоцитарного антигена (HLA). См. Текст для более подробной информации. (B) Нормализованное содержание указанных белков в указанные моменты времени. Изображенные белки были выбраны на основе их хорошо известной роли в образовании пептидов, загрузке пептидов и / или презентации MHC. Нестимулированные контроли показаны белым цветом, стимуляция IFNα — светло-серым, а стимуляция IFNγ — темно-серыми полосами, соответственно.Индивидуальные количественные оценки ( n = 6–8) изображены в виде точек, столбцы указывают средние значения с SD (планки ошибок). (C) Распределение поверхности MHC-I, определенное с помощью проточного цитометрического анализа с использованием антитела W6 / 32, которое распознает β2m-ассоциированные молекулы HLA-A, -B и -C (верхняя гистограмма) и общее содержание белка тяжелой HLA цепи, как определено иммуноблоттингом с использованием антитела НС10 (нижняя панель).

IFN типа II активирует специфический набор противовирусных эффекторных белков

Как указано выше, IFN обладают выраженной антипатогенной активностью.Однако IFN-I и IFN-II различаются по своей относительной активности против определенных таксонов патогенов. Противовирусная активность осуществляется множеством эффекторных белков. Таким образом, расхождение в эффективности против разных агентов также должно отражаться в дифференциальной экспрессии соответствующих факторов рестрикции. Основываясь на общем наборе данных, мы выбрали прототипы IFN-чувствительных белков с документально подтвержденной антипатогенной активностью, чтобы подчеркнуть, что некоторые белки одинаково чувствительны к обоим IFN, тогда как другие в большей степени индуцируются IFNα или IFNγ.Хотя некоторые классические противовирусные гены, такие как Mx1 и PKR, больше отвечали на IFNα, значительная индукция также стала очевидной при лечении IFNγ (рис. 5, левая панель). Второй набор белков с ранее продемонстрированной противовирусной активностью против вирусов, таких как ВИЧ и грипп [например, BST2 / Tetherin, SAMHD1 и IFIT3 (40–42)], одинаково реагировал на оба IFN (рис. 5, средняя панель). Наиболее интересно то, что третий класс белков, которые более или даже почти исключительно реагировали на IFNγ, содержал такие белки, как IDO, GBP5 и PML (рис. 5, правая панель), которые, как известно, обладают противовирусной активностью (43–45).

Рисунок 5 . Дифференциальная чувствительность эффекторных белков к интерферону (IFN). Количественное определение указанных белков представлено на фиг. 4. На левой панели показаны выбранные белки, которые более чувствительны к IFNα. Центральная панель отображает выбранные белки, которые одинаково чувствительны к IFNα и IFNγ, а правая панель выделяет выбранные белки, которые более чувствительны к IFNγ. Белки были выбраны в соответствии с их ранее описанной ролью в противовирусной активности.Полный набор количественно определенных белков можно найти в листе данных S1 в дополнительных материалах.

Ранняя активация белков, которые позже репрессируются IFNγ

При оценке IFNγ-репрессированных белков стали очевидными две интересные тенденции: (I) отдельные белки, которые были значительно репрессированы через 24 и 48 часов воздействия IFNγ, показали аналогичную, но менее выраженную тенденцию к небольшому снижению экспрессии через 24 и 48 часов воздействия IFNγ. Обработка IFNα (Фигуры 6A, B).(II) Более удивительно то, что в ранние моменты времени кондиционирования IFNγ те же белки проявляли тенденцию к увеличению (!) Содержания белка (Фигуры 6A, B). Оба эффекта также преобладали на глобальном уровне, когда были сгруппированы все белки, которые значительно подавлялись через 48 часов (Рисунок 6C) или через 24 часа (Рисунок 6D).

Рисунок 6 . Динамика индивидуальной и глобальной регуляции белков, репрессированных интерфероном (IFN). (A, B) Изображены относительные изменения содержания белка по сравнению с необработанными контрольными клетками для двух репрезентативных IFN-репрессированных генов (IRepG). (C) Все белки, значительно ( p <0,05) подавленные через 48 часов обработки IFNγ, были исследованы в отношении IFNα- и IFNγ-зависимой регуляции. (D) Показана 4- и 24-часовая регуляция белков, значительно ( p <0,05) подавляющая через 24 часа обработки IFNγ. Точки представляют индивидуальные количественные показатели (A, B) или отдельные белки (C, D) , столбцы отображают среднюю регуляцию соответствующей группы.

В совокупности описанный здесь набор данных раскрывает несколько новых взглядов на динамику и типоспецифичность протеомных изменений, индуцированных IFN, что составляет идеальную отправную точку для механистических исследований, например.g., в точные сигнальные пути, ведущие к репрессии IRepG, и их биологическое значение для защиты от патогенов и опухолей.

Обсуждение

Комплексный анализ белков, регулируемых IFN типа I и типа II

Наш анализ составляет исчерпывающий каталог белков, количество которых изменяется после различных периодов времени воздействия IFN-I и / или IFN-II. Некоторые исследования IFN-индуцированных протеомных изменений были выполнены ранее — обычно с применением двумерного гель-электрофореза и последующей идентификации отдельных пятен, которые дифференцированно регулируются (46, 47).В других исследованиях оценивался только один тип IFN, одна временная точка или конкретный клеточный компартмент (48–50). Насколько нам известно, мы представляем первое исследование, в котором глобальные протеомные изменения, вызванные IFN типа I и II, напрямую сравнивались в одних и тех же клетках в разные моменты времени. Тот факт, что наш набор данных включал от шести до восьми повторов для каждого состояния, использование клинически значимого IFNα подтипа IFNα2 и нетрансформированной клеточной линии, часто используемой в исследованиях вирусов и вакцин, делает наш набор данных эталоном для будущих исследований.Особенно при количественной оценке изменений клеточного протеома, вызванных патогеном или опухолью, индукция IFN и последующие IFN-зависимые изменения являются очевидными смешивающими факторами. Сравнение с описанным здесь набором данных позволит другим отличить IFN-зависимые и IFN-независимые эффекты от патоген-специфических изменений.

Многочисленные исследования документально подтвердили выраженную антипатогенную или противоопухолевую активность IFN. Однако в большинстве случаев действительные эффекторные механизмы в большинстве случаев неуловимы.Описанный здесь набор данных представляет собой идеальный ресурс и отправную точку для механистических исследований антипатогенных, антипролиферативных и иммуностимулирующих эффекторных функций.

Дифференциальная регуляция белков с помощью IFN-I и IFN-II

Биологические ответы типов IFN различаются. Некоторые вирусы более чувствительны к IFNα, тогда как другие (например, цитомегаловирус мыши и человека, а также вирус осповакцины) более чувствительны к IFNγ (20, 38, 51). Это несоответствие подчеркивается тем фактом, что отдельные IFN одобрены для лечения определенных заболеваний, тогда как другие IFN не одобрены.Основываясь на большом количестве информации о перекрестных помехах между сигнальными каскадами и перекрывающейся отзывчивости определенных ISG, это биологическое различие было довольно загадочным. Однако наш сравнительный анализ глобальных изменений в протеомах полностью согласуется с этим несоответствием: с точки зрения качества, количества и кинетики, IFN-индуцированные изменения значительно различаются между IFN-I и IFN-II. Этот эффект был наиболее очевиден для репрессированных белков, которые почти исключительно наблюдались в ответ на IFNγ.

Интересно, что хотя наши данные раскрывают заметные различия между классами IFN и временем инкубации, простая дихотомия, согласно которой ISRE-активирующие IFN (типы I и III) действуют непосредственно против вирусов, тогда как GAS-активирующий IFNγ действует иммуномодулирующе, явно упрощена: IFNγ индуцирует несколько прямых противовирусных эффекторных белков, по крайней мере, столь же сильных, как IFNα, или даже более сильных. Кроме того, IFNα также усиливает компоненты презентации MHC.

На биологический ответ на IFN может влиять количество соответствующих рецепторов IFN.На различия в ответах на IFNα по сравнению с IFNγ может влиять разное расположение рецепторов на поверхности. Поверхностные уровни белков могут быть определены цитометрией с использованием антител (или лигандов), связанных с флуорофорами. Однако эти антитела распознают свои родственные антигены с разной аффинностью, что приводит к неизбежной систематической ошибке при сравнительной количественной оценке различных белков. Точно так же определения на основе MS полагаются на разные пептиды с неперекрывающимися характеристиками во время идентификации и количественного определения.Для нашего анализа мы использовали насыщающие концентрации IFN. В зависимости от подмножеств ISG и IRepG мы наблюдали выраженные ответы либо на IFNα (см. Рисунок 5, левая панель), на IFNγ (Рисунок 5, правая панель), либо на оба IFN (Рисунок 5, центральная панель), что указывает на восприимчивость клеток. Кроме того, наш вывод о том, что дифференциальные ответы (например, репрессия генов IRepG, стимулированных IFNγ, но не IFNα), наблюдались на разных уровнях (белок и мРНК), у разных видов (мыши и человека) и в разных типах клеток (макрофаги). и фибробласты) позволяют предположить, что описанные здесь различия довольно обычны.Однако возможно, что определенные типы клеток с сильно искаженными уровнями экспрессии комплексов рецептора IFN могут отображать измененные ответы.

Наличие IFNγ-репрессированных белков в клетках человека

Наш предыдущий анализ транскрипции в мышиных клетках выявил существование расширенного набора IRepG в фибробластах и ​​макрофагах мыши (22). Ответы IRepG представляют собой первичный ответ транскрипции, устойчивый к блокаде трансляции циклогексимидом. Выравнивание IRepG и их промоторов / энхансеров не привело к обогащению элементами GAS или ISRE, но вместо этого обнаружило накопление GC-богатых элементов и соответствующих сайтов связывания SP1 / SP3 (22).Это согласуется с ранее описанной зависимостью SP1 / SP3 отдельных генов, которые, как было показано, подавляются IFNγ (52). Несмотря на отсутствие последовательностей ISRE и GAS, репрессия IRepG в значительной степени утрачена в STAT1-дефицитных фибробластах, что позволяет предположить, что репрессия генов с помощью IFNγ является в основном игнорируемой способностью его «сигнатуры» транскрипционного фактора STAT1. Эти данные сразу же подняли два важных вопроса: (I) существуют ли IRepG у других видов и особенно в клетках человеческого происхождения и (II) трансформируется ли репрессия транскрипционных генов, индуцированная IFNγ, в уменьшение количества белков? Это исследование дает ответы на оба вопроса: мы наблюдали удивительно большое количество белков, негативно регулируемых IFN и особенно IFN типа II в клетках человека: после 4 часов лечения количество IFNγ-репрессированных белков даже превышало количество индуцированных белков. .Через 24 и 48 часов после обработки примерно два белка ISG сталкиваются с одним белком IRepG. Лучшие результаты нашего глобального анализа включают такие белки, как коллаген α1 и 2, для которых отдельные эксперименты документально подтвердили репрессию IFNγ (53, 54), что дополнительно подтвердило наш набор данных в отношении IRepG.

Это ставит важный будущий вопрос относительно биологической значимости этих IRepG с точки зрения реакции на патогены и опухоли. Нетрудно представить, что индуцированное IFN подавление белков, необходимых для репликации определенных патогенов или опухолей, может иметь преимущества для хозяина — просто за счет удержания основных кофакторов, например.g., рецептор проникновения внутриклеточного патогена для предотвращения его инфицирования. Вирусы также полагаются на многочисленные внутриклеточные факторы и метаболические возможности клетки-хозяина, позволяя им размножаться. Одна объединяющая особенность вирусов — отсутствие в них рибосом и, следовательно, их неспособность транслировать белки за пределы клеток-хозяев. Соответственно, механизм трансляции является одним из основных полей битвы между патогенами и хозяином, и несколько ISG (например, PKR, ISG54 и ISG56) нацелены на трансляцию [см.(55)]. Подавление белков, необходимых для трансляции (или других важных метаболических путей, таких как синтез АТФ), может ограничивать репликацию патогенов. Мы последовательно наблюдали, что, например, eIF2A, eIF3M и другие подавлялись IFNγ (см. Лист данных S1 в дополнительных материалах). Таким образом, кажется, что IRepG вносят вклад в ограничение механизма трансляции. Казалось бы, суицидальный аспект такого подавления может быть преодолен с помощью строго контролируемой (понижающей) регуляции IFNs при заражении.

Возникает вопрос, можем ли мы найти определенные факторы хозяина среди IFN-репрессированных белков? Одним из белков, уровень регуляции которого был снижен, является синтаза жирных кислот FASN (идентификатор белка P49327, фиг. 6B). Из различных исследований известно, что FASN необходим для репликации вируса гепатита С, вируса денге, респираторно-синцитиального вируса, парагриппа 3 (PIV3) человека, астровируса и репликации риновируса (56–60). Следовательно, есть соблазн предположить, что подавление FASN с помощью IFNγ может снизить репликацию таких вирусов.Другим примером является белок Ergic53, который необходим для репликации Arena, Corona и Filoviruses (61) и который, как мы обнаружили, репрессируется IFNγ. Определенно необходимы функциональные исследования IRepG, но сравнение обнаруженных здесь IRepG с генами, обнаруженными по крайней мере в двух из трех опубликованных скринингов siRNA, необходимых для репликации ВИЧ (62), указывает на то, что семейство IRepG также включает дополнительные гены, необходимые для ВИЧ. репликация (например, IDh2).

Другим белком, регуляция которого была значительно снижена, был PFDN1 (идентификатор белка O60925).Интересно, что недавно было показано, что PFDN1 способствует эпителиально-мезенхимальному переходу и прогрессированию рака легких (63). Следовательно, также есть соблазн предположить, что этот или аналогичные эффекты репрессии белка могут также вносить вклад в противоопухолевые эффекты IFN. Однако в будущем предстоит выяснить, в какой степени и с помощью каких механизмов IRepG вносят вклад в известные свойства, такие как противовирусные, антибактериальные, антипролиферативные, противоопухолевые и иммуностимулирующие эффекты IFN, или, возможно, в побочные эффекты. индуцированный лечением IFN.

Ранняя экспрессия IRepG, индуцированная IFN

Обнаружение того, что IFN-репрессированные белки значительно подавлялись после 24 и 48 часов обработки IFNγ, показало незначительное увеличение численности после 4 часов IFN, на первый взгляд сложно согласовать. Дальнейшие исследования необходимы для выяснения вовлеченных молекулярных событий и факторов транскрипции, ведущих к репрессии генов IFN. Очень интересным вопросом будущего в этом отношении является вклад транскрипционных изменений по сравнению с измененной стабильностью белка.

Принимая во внимание наши предыдущие выводы о том, что IRepG могут наблюдаться на уровне формирующейся мРНК и что эффект в значительной степени зависит от STAT1 (22), а также с учетом описанной здесь ранней индукции, потенциальное объяснение может быть основано на регуляции отрицательной обратной связи IFNs. Хорошо известно, что IFN ограничивают свою собственную передачу сигналов, стимулируя мощные медиаторы петель отрицательной обратной связи (например, IFN-индуцированную экспрессию супрессоров передачи сигналов цитокинов и белкового ингибитора активированных STAT).Мы предполагаем, что IRepG могут слабо реагировать на IFN, но полностью реагировать на эффекты каскада отрицательной обратной связи. Мы пришли к выводу, что ответственные белки должны быть (I) репрессорами транскрипции, (II) IFN-индуцибельными и (III) способными «идентифицировать» IRepG. Помимо SP1 и SP3, три многообещающих кандидата на такие механизмы — это IRF-2, PRDM1 и Bcl6. Все три белка связываются с ДНК и подавляют транскрипцию (64–67), все индуцируются IFN и распознают ISRE, IRF-E, GAS или подобные элементы ДНК (30, 65, 68, 69).

В совокупности наш анализ обеспечивает исчерпывающий каталог вызванных IFN изменений протеома человека. Заметные различия в протеомных изменениях, индуцированных IFNα и IFNγ, стали очевидными, особенно при длительном воздействии. Протеомы IFN-стимулированных клеток резко меняются в течение продолжительности стимуляции IFN, что подчеркивает необходимость проведения экспериментов, в которых биологические ответы сравниваются с данными экспрессии белка с адекватным временным разрешением и сопоставимостью.Кроме того, было обнаружено, что на уровне протеома человека существует класс генов / белков, которые в значительной степени репрессируются IFN — и IFNγ в частности, — в основном игнорируемый.

Авторские взносы

Эксперименты проводили

DM, JP и VTKL-T. Все авторы проанализировали данные. DM, BS и MT разработали эксперименты и руководили проектом. DM и MT написали статью.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим Бенджамина Катчински, Керстин Вольгемут, Кристин Росовски, Биргит Корте и Стефани Татжес за отличную техническую поддержку.

Финансирование

VTKL-T, BS и MT получают финансирование от Deutsche Forschungsgemeinschaft (через TRR60 A7N и Z3, а также GRK1949 TP.13). MT выражает благодарность медицинскому факультету университетской клиники Эссена за очную поддержку (через программу инновационных исследований IFORES). BS также благодарит за финансовую поддержку PURE (Подразделение исследования белков в Рурской области в Европе) (233-1.08.03.03-031-68079), проект федеральной земли Германия, NRW.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fimmu.2017.01139/full#supplementary-material.

Список литературы

1. Muller U, Steinhoff U, Reis LF, Hemmi S, Pavlovic J, Zinkernagel RM, et al. Функциональная роль интерферонов типа I и типа II в противовирусной защите. Science (1994) 264: 1918–21.DOI: 10.1126 / science.8009221

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

2. Гил М.П., ​​Бон Э., О’Гуин А.К., Рамана К.В., Левин Б., Старк Г.Р. и др. Биологические последствия Stat1-независимой передачи сигналов IFN. Proc Natl Acad Sci U S. A (2001) 98: 6680–5. DOI: 10.1073 / pnas.111163898

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

4. Каплан Д.Х., Шанкаран В., Диге А.С., Стокерт Э., Агует М., Олд Л.Дж. и др. Демонстрация интерферон-гамма-зависимой системы наблюдения за опухолью у иммунокомпетентных мышей. Proc Natl Acad Sci U S. A (1998) 95: 7556–61. DOI: 10.1073 / pnas.95.13.7556

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5. Шанкаран В., Икеда Х., Брюс А. Т., Уайт Дж. М., Свансон П. Е., Олд Л. Дж. И др. IFNgamma и лимфоциты предотвращают развитие первичной опухоли и формируют иммуногенность опухоли. Nature (2001) 410: 1107–11. DOI: 10.1038 / 35074122

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Данн Г.П., Брюс А.Т., Шихан К.С., Шанкаран В., Уппалури Р., Буй Дж. Д. и др.Критическая функция интерферонов типа I при иммуноредактировании рака. Nat Immunol (2005) 6: 722–9. DOI: 10.1038 / ni1213

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Зарецкий Ю.М., Гарсия-Диас А., Шин Д.С., Эскуин-Ординас Х., Хьюго В., Ху-Лиескован С. и др. Мутации, связанные с приобретенной устойчивостью к блокаде PD-1 при меланоме. N Engl J Med (2016) 375: 819–29. DOI: 10.1056 / NEJMoa1604958

CrossRef Полный текст | Google Scholar

8.Sucker A, Zhao F, Pieper N, Heeke C, Maltaner R, Stadtler N и др. Приобретенная резистентность к IFNgamma снижает противоопухолевый иммунитет и приводит к появлению устойчивых к Т-клеткам меланомы. Нац Коммуна (2017) 8: 15440. DOI: 10.1038 / ncomms15440

CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. Meuwissen ME, Schot R, Buta S, Oudesluijs G, Tinschert S, Speer SD, et al. Дефицит USP18 у человека лежит в основе интерферонопатии 1 типа, приводящей к тяжелому псевдо-TORCH-синдрому. J Exp Med (2016) 213: 1163–74.DOI: 10.1084 / jem.20151529

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Станкато Л.Ф., Дэвид М., Картер-Су К., Ларнер А.С., Пратт В.Б. Преассоциация STAT1 со STAT2 и STAT3 в отдельных сигнальных комплексах до стимуляции цитокинами. J Biol Chem (1996) 271: 4134-7. DOI: 10.1074 / jbc.271.8.4134

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Чжун М., Хенриксен М.А., Такеучи К., Шефер О., Лю Б., Тен Хов Дж. И др.Влияние антипараллельной димерной структуры нефосфорилированного STAT1 на цикл активации-инактивации. Proc Natl Acad Sci U S. A (2005) 102: 3966–71. DOI: 10.1073 / pnas.0501063102

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

13. Mertens C, Zhong M, Krishnaraj R, Zou W, Chen X, Darnell JE Jr. Дефосфорилирование фосфотирозина на димерах STAT1 требует обширной пространственной переориентации мономеров, чему способствует N-концевой домен. Genes Dev (2006) 20: 3372–81. DOI: 10.1101 / gad.1485406

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14. Wenta N, Strauss H, Meyer S, Vinkemeier U. Фосфорилирование тирозина регулирует разделение STAT1 между различными конформациями димеров. Proc Natl Acad Sci U S. A (2008) 105: 9238–43. DOI: 10.1073 / pnas.0802130105

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Куреши С.А., Салдит-Джорджифф М., Дарнелл Дж. Э. мл.Фосфорилированные тирозином Stat1 и Stat2 плюс белок массой 48 кДа все контактируют с ДНК при образовании фактора 3, стимулированного интерфероном. Proc Natl Acad Sci U S. A (1995) 92: 3829-33. DOI: 10.1073 / pnas.92.9.3829

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16. Котенко С.В., Галлахер Г., Баурин В.В., Льюис-Антес А., Шен М., Шах Н.К. и др. IFN-лямбды опосредуют противовирусную защиту через особый рецепторный комплекс цитокинов класса II. Nat Immunol (2003) 4: 69–77.DOI: 10.1038 / ni875

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Pott J, Mahlakoiv T, Mordstein M, Duerr CU, Michiels T, Stockinger S, et al. IFN-лямбда определяет противовирусную защиту кишечного эпителия хозяина. Proc Natl Acad Sci U S. A (2011) 108: 7944–9. DOI: 10.1073 / pnas.1100552108

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Decker T, Lew DJ, Darnell JE Jr. Два различных пути передачи сигнала, зависимые от альфа-интерферона, могут способствовать активации транскрипции гена гуанилат-связывающего белка. Mol Cell Biol (1991) 11: 5147–53. DOI: 10.1128 / MCB.11.10.5147

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Мацумото М., Танака Н., Харада Х., Кимура Т., Йокочи Т., Китагава М. и др. Активация фактора транскрипции ISGF3 гамма-интерфероном. Biol Chem (1999) 380: 699–703. DOI: 10.1515 / BC.1999.087

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Циммерманн А., Триллинг М., Вагнер М., Уилборн М., Бубич И., Йонджич С. и др.Цитомегаловирусный белок обнаруживает двойную роль STAT2 в передаче сигналов IFN- {gamma} и противовирусных ответах. J Exp Med (2005) 201: 1543–53. DOI: 10.1084 / jem.20041401

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21. Бриерли М.М., Маркингтон К.Л., Юрисица I, Фиш EN. Идентификация GAS-зависимых генов-мишеней, чувствительных к интерферону, транскрипция которых зависит от STAT2, но не зависит от ISGF3. FEBS J (2006) 273: 1569–81. DOI: 10.1111 / j.1742-4658.2006.05176.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Триллинг М., Беллора Н., Рутковски А.Дж., Де Грааф М., Дикинсон П., Робертсон К. и др. Расшифровка модуляции экспрессии генов интерферонами типа I и II, сочетающая 4sU-тегирование, остановку трансляции и анализ промотора in silico. Nucleic Acids Res (2013) 41: 8107-25. DOI: 10.1093 / nar / gkt589

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Джейкобс Дж. П., Джонс С. М., Бейл Дж. П.Характеристики диплоидной клетки человека, обозначенной MRC-5. Nature (1970) 227: 168–70. DOI: 10.1038 / 227168a0

CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Park IH, Zhao R, West JA, Yabuuchi A., Huo H, Ince TA, et al. Перепрограммирование соматических клеток человека до плюрипотентности с определенными факторами. Nature (2008) 451: 141–6. DOI: 10.1038 / nature06534

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25. Меггер Д.А., Брахт Т., Коль М., Аренс М., Набулси В., Вебер Ф. и др.Протеомные различия между гепатоцеллюлярной карциномой и неопухолевой тканью печени исследовали с помощью комбинированного количественного протеомного исследования на основе геля и без метки. Mol Cell Proteomics (2013) 12: 2006–20. DOI: 10.1074 / mcp.M113.028027

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Хуанг да В., Шерман Б.Т., Лемпицки Р.А. Инструменты обогащения биоинформатики: пути к всестороннему функциональному анализу больших списков генов. Nucleic Acids Res (2009) 37: 1–13.DOI: 10.1093 / nar / gkn923

CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Хуанг да В., Шерман Б.Т., Лемпицки Р.А. Систематический и комплексный анализ больших списков генов с использованием ресурсов биоинформатики DAVID. Nat Protoc (2009) 4: 44–57. DOI: 10.1038 / nprot.2008.211

CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Набулси В., Брахт Т., Меггер Д.А., Рейс Х., Аренс М., Туревич М. и др. Количественный протеомный анализ выявляет корреляцию между белками, ассоциированными с эндоцитозом, и дедифференцировкой гепатоцеллюлярной карциномы. Biochim Biophys Acta (2016) 1864: 1579–85. DOI: 10.1016 / j.bbapap.2016.08.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Триллинг М., Ле В.Т., Рашиди-Алавиех Дж., Катчински Б., Шеллер Дж., Роуз-Джон С. и др. «Активированные» белки STAT: парадоксальное следствие подавления передачи сигналов JAK-STAT в инфицированных цитомегаловирусом клетках. J Immunol (2014) 192: 447–58. DOI: 10.4049 / jimmunol.1203516

CrossRef Полный текст | Google Scholar

31.Le VT, Trilling M, Hengel H. Цитомегаловирусный белок pUL138 действует как потенциатор поверхностной плотности рецептора 1 фактора некроза опухоли (TNF) для усиления кодируемой ULb’-модуляции передачи сигналов TNF-альфа. J Virol (2011) 85: 13260–70. DOI: 10.1128 / JVI.06005-11

CrossRef Полный текст | Google Scholar

32. Шалит Т., Элингер Д., Савидор А., Габашвили А., Левин Ю. Протеомика без метки на основе MS1 с использованием квадрупольного орбитального масс-спектрометра. J Proteome Res (2015) 14: 1979–86.DOI: 10.1021 / pr501045t

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

33. Теббе А., Кламмер М., Сигхарт С., Шааб С., Дауб Х. Систематическая оценка безметки и количественного определения супер-SILAC для анализа экспрессии протеома. Rapid Commun Mass Spectrom (2015) 29: 795–801. DOI: 10.1002 / rcm.7160

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

34. Меггер Д.А., Потт Л.Л., Аренс М., Падден Дж., Брахт Т., Кульманн К. и др. Сравнение стратегий без меток и на основе меток для протеомного анализа клеточных линий гепатомы. Biochim Biophys Acta (2014) 1844: 967–76. DOI: 10.1016 / j.bbapap.2013.07.017

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

35. Лехтонен А., Матикайнен С., Юлкунен И. Интерфероны повышают экспрессию генов факторов транскрипции STAT1, STAT2 и IRF в мононуклеарных клетках периферической крови человека и макрофагах. J Immunol (1997) 159: 794–803.

PubMed Аннотация | Google Scholar

36. Zhao C, Beaudenon SL, Kelley ML, Waddell MB, Yuan W, Schulman BA, et al.Фермент UbcH8 убиквитин E2 также является ферментом E2 для ISG15, IFN-альфа / бета-индуцированного убиквитин-подобного белка. Proc Natl Acad Sci U S. A (2004) 101: 7578–82. DOI: 10.1073 / pnas.0402528101

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

37. Zou W, Zhang DE. Интерферон-индуцируемая убиквитин-протеин-изопептидная лигаза (E3) EFP также функционирует как лигаза E3 ISG15. J Biol Chem (2006) 281: 3989–94. DOI: 10.1074 / jbc.M510787200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

38.Триллинг М., Ле В.Т., Циммерманн А., Людвиг Х., Пфеффер К., Саттер Г. и др. Гамма-интерферон-индуцированный интерферон-регуляторный фактор 1-зависимый противовирусный ответ подавляет репликацию вируса коровьей оспы в мышиных, но не человеческих фибробластах. J Virol (2009) 83: 3684–95. DOI: 10.1128 / JVI.02042-08

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

39. Солаш А., Морган К.Л., Доди А.И., Морте С., Скотт И., Бабуин С. и др. Идентификация трех HLA-A * 0201-ограниченных цитотоксических Т-клеточных эпитопов в цитомегаловирусном белке pp65, которые являются консервативными в восьми штаммах вируса. J Immunol (1999) 163: 5512–8.

Google Scholar

41. Голдстоун, округ Колумбия, Эннис-Адениран В., Хедден Дж. Дж., Грум Х. К., Райс Г. И., Христодулу Э и др. Фактор рестрикции ВИЧ-1 SAMHD1 представляет собой дезоксинуклеозидтрифосфаттрифосфогидролазу. Nature (2011) 480: 379–82. DOI: 10.1038 / nature10623

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

42. Hrecka K, Hao C, Gierszewska M, Swanson SK, Kesik-Brodacka M, Srivastava S, et al. Vpx снимает подавление ВИЧ-1-инфекции макрофагов, опосредованной белком SAMHD1. Nature (2011) 474: 658–61. DOI: 10.1038 / nature10195

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

43. Адамс О., Бескен К., Обердорфер С., Маккензи С.Р., Руссинг Д., Добенер В. Ингибирование вируса простого герпеса человека типа 2 интерфероном гамма и фактором некроза опухоли альфа опосредуется индоламин-2,3-диоксигеназой. Микробы заражают (2004) 6: 806–12. DOI: 10.1016 / j.micinf.2004.04.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

44.Крапп С., Хоттер Д., Гаванбахт А., Макларен П.Дж., Клюге С.Ф., Штурзель С.М. и др. Гуанилатсвязывающий белок (GBP) 5 является индуцируемым интерфероном ингибитором инфекционности ВИЧ-1. Клеточный микроб-хозяин (2016) 19: 504–14. DOI: 10.1016 / j.chom.2016.02.019

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

46. Найман Т.А., Матикайнен С., Саренева Т., Юлкунен И., Калккинен Н. Анализ протеома показывает, что убиквитин-конъюгированные ферменты представляют собой новое семейство генов, регулируемых интерфероном-альфа. Eur J Biochem (2000) 267: 4011–9. DOI: 10.1046 / j.1432-1327.2000.01433.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

47. Нагано К., Мастерс Дж. Р., Акпан А., Ян А., Корлесс С., Вуд С. и др. Дифференциальный синтез белков и уровни экспрессии в нормальных и неопластических клетках простаты человека и их регуляция интерферонами I и II типа. Онкоген (2004) 23: 1693–703. DOI: 10.1038 / sj.onc.1207297

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

48.Ян В., Ли Х., Йи Е.К., Рейсс Д., Шеннон П., Квечишевски Б.К. и др. Системный протеомный анализ интерферонового ответа в клетках печени человека. Genome Biol (2004) 5: R54. DOI: 10.1186 / GB-2004-5-8-r54

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

49. Jutras I, Houde M, Currier N, Boulais J, Duclos S, Laboissiere S и др. Модуляция протеома фагосомы интерфероном-гамма. Mol Cell Proteomics (2008) 7: 697–715. DOI: 10,1074 / mcp.M700267-MCP200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

50. Трост М., Инглиш Л., Лемье С., Курсель М., Дежарден М., Тибо П. Фагосомный протеом в макрофагах, активируемых гамма-интерфероном. Иммунитет (2009) 30: 143–54. DOI: 10.1016 / j.immuni.2008.11.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

51. Ле В.Т., Триллинг М., Уилборн М., Хенгель Х., Циммерманн А. Человеческий цитомегаловирус мешает сигнальному преобразователю и активатору транскрипции (STAT) 2, стабильности белка и фосфорилированию тирозина. J Gen Virol (2008) 89: 2416–26. DOI: 10.1099 / vir.0.2008 / 001669-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

52. Харрис С.М., Харви Э.Дж., Хьюз Т.Р., Рамджи Д.П. Опосредованное интерфероном гамма ингибирование транскрипции гена липопротеинлипазы в макрофагах включает опосредованную казеинкиназой 2- и фосфоинозитид-3-киназу регуляцию транскрипционных факторов Sp1 и Sp3. Cell Signal (2008) 20: 2296–301. DOI: 10.1016 / j.cellsig.2008.08.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

53.Хигаши К., Инагаки Ю., Сузуки Н., Мицуи С., Маувиэль А., Канеко Х. и др. Y-бокс-связывающий белок YB-1 опосредует репрессию транскрипции экспрессии гена коллагена альфа 2 (I) человека с помощью гамма-интерферона. J Biol Chem (2003) 278: 5156–62. DOI: 10.1074 / jbc.M208724200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

55. Уолш Д., Мэтьюз М.Б., Мор И. Занимаясь переводом: синтез белка в инфицированных вирусом клетках. Cold Spring Harb Perspect Biol (2013) 5: a012351.DOI: 10.1101 / cshperspect.a012351

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

56. Ян В., Худ Б.Л., Чедвик С.Л., Лю С., Уоткинс С.К., Луо Дж. И др. Синтаза жирных кислот активируется во время инфицирования вирусом гепатита С и регулирует проникновение и продуцирование вируса гепатита С. Гепатология (2008) 48: 1396–403. DOI: 10.1002 / hep.22508

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

57. Хитон Н.С., Перера Р., Бергер К.Л., Хадка С., Лаконт Д.Д., Кун Р.Дж. и др.Неструктурный белок 3 вируса денге перераспределяет синтазу жирных кислот к участкам репликации вируса и увеличивает синтез жирных кислот в клетках. Proc Natl Acad Sci U S. A (2010) 107: 17345–50. DOI: 10.1073 / pnas.1010811107

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

58. Gaunt ER, Cheung W, Richards JE, Lever A, Desselberger U. Ингибирование репликации ротавируса путем подавления синтеза жирных кислот. J Gen Virol (2013) 94: 1310–7.DOI: 10.1099 / vir.0.050146-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

59. Мурильо А., Вера-Эстрелла Р., Баркла Б.Дж., Мендес Е., Ариас К.Ф. Идентификация факторов клетки-хозяина, связанных с репликацией астровируса в клетках Caco-2. J Virol (2015) 89: 10359–70. DOI: 10.1128 / JVI.01225-15

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

60. Охол Ю.М., Ван З., Кембл Дж., Дюк Г. Прямое ингибирование клеточной синтазы жирных кислот ухудшает репликацию респираторно-синцитиального вируса и других респираторных вирусов. PLoS One (2015) 10: e0144648. DOI: 10.1371 / journal.pone.0144648

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

61. Клаус Дж. П., Эйзенхауэр П., Руссо Дж., Мейсон А. Б., До Д., Кинг Б. и др. Рецептор внутриклеточного груза ERGIC-53 необходим для производства инфекционных аренавирусов, коронавирусов и филовирусов. Клеточный микроб-хозяин (2013) 14: 522–34. DOI: 10.1016 / j.chom.2013.10.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

62.Бушман Ф.Д., Малани Н., Фернандес Дж., Д’Орсо И., Кэгни Дж., Даймонд Т.Л. и др. Факторы клетки-хозяина в репликации ВИЧ: метаанализ полногеномных исследований. PLoS Pathog (2009) 5: e1000437. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1000437

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

63. Ван Д., Ши В., Тан И, Лю И, Хе К., Ху И и др. Префолдин 1 способствует развитию EMT и рака легких, подавляя экспрессию циклина A. Онкоген (2017) 36: 885–98. DOI: 10.1038 / onc.2016.257

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

65. Nelson N, Marks MS, Driggers PH, Ozato K. Белок, связывающий консенсусную последовательность интерферона, член семейства факторов регуляции интерферона, подавляет индуцированную интерфероном транскрипцию генов. Mol Cell Biol (1993) 13: 588–99. DOI: 10.1128 / MCB.13.1.588

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

66. Chang CC, Ye BH, Chaganti RS, Dalla-Favera R.BCL-6, белок POZ / цинковые пальцы, представляет собой специфичный для последовательности репрессор транскрипции. Proc Natl Acad Sci U S. A (1996) 93: 6947–52. DOI: 10.1073 / pnas.93.14.6947

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

67. Рен Б., Чи К.Дж., Ким Т.Х., Маниатис Т. Репрессия PRDI-BF1 / Blimp-1 опосредуется корепрессорами семейства белков Граучо. Genes Dev (1999) 13: 125–37. DOI: 10.1101 / gad.13.1.125

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

68.Харада Х., Фудзита Т., Миямото М., Кимура Ю., Маруяма М., Фурия А. и др. Структурно похожие, но функционально разные факторы, IRF-1 и IRF-2, связываются с одними и теми же регуляторными элементами IFN и IFN-индуцибельных генов. Cell (1989) 58: 729–39. DOI: 10.1016 / 0092-8674 (89) -4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

69. Хартатик Т., Окада С., Окабе С., Арима М., Хатано М., Токухиса Т. Связывание BAZF и Bc16 с последовательностями ДНК, связывающими STAT6. Biochem Biophys Res Commun (2001) 284: 26–32.DOI: 10.1006 / bbrc.2001.4931

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

границ | Интеграция сигналов IFN-I и IFN-II с TLR4 включает последовательное привлечение STAT1-комплексов и NFκB для усиления провоспалительной транскрипции

Введение

Атеросклероз — хроническое воспалительное заболевание кровеносных сосудов, характеризующееся образованием атеросклеротических поражений. Раннее начало атеросклероза представлено рекрутированием лейкоцитов крови в поврежденный эндотелий сосудов и измененной сократимостью гладкомышечных клеток сосудов (VSMC), модулируемой множеством медиаторов воспаления (1).Соответственно, провоспалительные пути, активируемые Toll-подобными рецепторами (TLR) и интерферонами (IFN), были идентифицированы как ключевые компоненты атерогенеза (2–4). ИФН типа I (IFN-I; IFNα) и II (IFN-II; IFNγ) индуцируют экспрессию IFN-стимулированного гена (ISG) за счет зависимого от киназы Януса (JAK) фосфорилирования сигнального преобразователя и активатора транскрипции (STAT) 1. . Гомодимеры STAT1, известные как γ-активированный фактор (GAF), активируют транскрипцию в ответ на оба типа IFN путем прямого связывания с генами, содержащими γ-активированную последовательность (GAS) сайта активации IFN-II.Ассоциация фактора регуляции интерферона (IRF) 9 с гетеродимерами STAT1 – STAT2 [известный как фактор 3-стимулированного интерфероном гена (ISGF3)] в ответ на IFN-I перенаправляет эти комплексы на отдельную группу генов-мишеней, несущих стимулированный интерфероном ответ элемент (ISRE) (5, 6). Существуют ограниченные доказательства роли ISGF3 в ответах IFN-II ISRE-содержащих генов. Сходным образом, для ограниченного числа ISG, было показано, что неканонический комплекс STAT1 / IRF9 контролирует IFNγ-чувствительность (7-9).Частичное перекрытие и дифференциальная активация комплексов факторов транскрипции и регуляция экспрессии целевого гена с помощью IFN-I и IFN-II могут быть следствием биологического сходства и различий этих двух типов IFN.

Лигирование

TLR4 приводит к быстрой активации множества факторов транскрипции, включая членов семейств Nuclear Factor-κB (NFκB) и IRF (10, 11). Эти факторы быстро вызывают экспрессию сотен генов, которые усиливают начальную воспалительную реакцию, проявляют антимикробную активность и инициируют развитие приобретенного иммунитета.Некоторые из цитокинов, которые активируются в начальной волне немедленной ранней экспрессии генов, функционируют в петлях транскрипции с прямой связью — особенно важными примерами являются IFN-I, который индуцирует вторичную волну STAT1- и STAT2-зависимой экспрессии генов, и опухоль фактор некроза (TNF), который поддерживает передачу сигналов NFκB.

Было показано, что регуляция экспрессии генов многих провоспалительных генов зависит от интеграции сигналов (SI) между IFN и TLR4 посредством комбинаторного действия STAT1-содержащих комплексов ISGF3 и GAF с NFκB.Например, предыдущие анализы мышиного промотора Nos2 выявили область ответа IFN (содержащую сайты GAS и ISRE) и сайты связывания для NFκB (12). Действительно, было показано, что последовательные и кооперативные вклады NFκB, предшествующего ISGF3, участвуют в индукции транскрипции гена Nos2 в макрофагах (MΦ), инфицированных внутриклеточным бактериальным патогеном Listeria monocytogenes (13). Ген Nos2 отражает большую группу генов, совместно регулируемых TLR4 и IFN (14, 15).С другой стороны, глубокие эффекты предварительной обработки IFNγ («прайминга») на активацию МФ, индуцированную TLR4, также давно признаны. В этом отношении SI между IFNγ и липополисахаридом (LPS) зависит от комбинаторного действия STAT1 с NFκB и IRF на сайты связывания ISRE / NFκB или GAS / NFκB, что приводит к усиленной регуляции транскрипции многих провоспалительных генов. Вместе это координирует противомикробные и воспалительные реакции в MΦ, но также и в дендритных клетках (DC) (16-19).Недавно мы охарактеризовали роль STAT1 в путях транскрипционного ответа, участвующих во взаимодействии между передачей сигналов IFN-II и TLR4 в эндотелиальных клетках (EC) и VSMC (20). Промоторный анализ генов, кодирующих несколько хемокинов, молекул адгезии и белков противовирусного и антибактериального ответа, предсказал, что сотрудничество между NFκB и STAT1 участвует в усиленной регуляции транскрипции ответов на IFN-II и LPS. Синергетические взаимодействия между IFNγ и TLR4 также привели к увеличению миграции Т-клеток и нарушению сократительной способности аорты в зависимости от STAT1 (20).Интересно, что экспрессия гена Nos2 в MΦ в ответ на IFNα / LPS вела себя так же, как после IFNγ / LPS (21), что отражает существующее перекрытие в механизмах активации между различными типами IFN. Однако механистическая роль SI между IFN-I и TLR4 в контексте «прайминга» в сосудистых и иммунных клетках подробно не изучена.

Чтобы охарактеризовать механизм индуцированного праймированием IFNα + LPS- и IFNγ + LPS-зависимого SI в сосудистых клетках по сравнению с иммунными клетками, мы выполнили комплексный полногеномный анализ VSMC, MΦ и DC в ответ на IFNα, IFNγ. , и / или LPS.Таким образом, за счет увеличения ацетилирования гистонов и рекрутирования РНК-полимеразы II (PolII) совместное связывание комплексов факторов транскрипции, активированных IFN-I или IFN-II вместе с LPS, включая гетеродимеры GAF, ISGF3, STAT1 / IRF9 и p65-p50, обеспечивает платформа для надежной транскрипционной активации провоспалительных генов. Более того, наши данные предлагают объяснение сравнимых эффектов примирования IFNα или IFNγ на TLR4-индуцированную активацию в сосудистых и иммунных клетках, что имеет важные последствия для атеросклероза.

Материалы и методы

VSMC, MΦ и изоляция по постоянному току

мышей WT (фоновый штамм C57BL / 6) были получены от Charles River Laboratories. Мыши STAT1 — / — (фоновый штамм C57BL / 6) (22) были любезно предоставлены Thomas Decker (Департамент микробиологии, иммунобиологии и генетики Венского университета). Перед проведением любых манипуляций животных умерщвляли путем смещения шейных позвонков под изофлурановой анестезией. Первичные VSMC были выделены из аорты мышей WT и STAT1 — / — путем ферментативного расщепления (23).Вкратце, аорты вырезали, тщательно очищали от остатков жира и соединительной ткани и разрезали на кольца. Затем ткань инкубировали со смесью для переваривания, состоящей из DMEM [Thermo Fisher Scientific (TFS), 11960044], дополненной 0,744 ед. / Мл эластазы I (Sigma Aldrich, E1250), 1 мг / мл коллагеназы II (Sigma Aldrich, 1148090) и 1 мг / мл. мг / мл ингибитора трипсина сои (TFS, 17075029) в течение 1 ч при 37 ° C. После переваривания клеточную суспензию пропускали через сетчатый фильтр для клеток 100 мкм и оставляли в покое на 1 неделю.Исследование экспрессии маркерного гена (α-актин, смоотелин, калпонин) с помощью ОТ-ПЦР использовали для оценки фенотипа клеток VSMC. Свежевыделенные бедренные и большеберцовые кости мышей WT очищали от остатков мышечной ткани путем соскабливания. Оба конца костей были разрезаны, костный мозг промыт и центрифугирован в течение 5 минут при 1500 об / мин. Осадок клеток инкубировали в буфере ACK (pH 7,2–7,4) для лизиса эритроцитов. Моноциты очищали с помощью градиента фиколл-пак (GE Healthcare, 17-1440). Затем первичный MΦ был дифференцирован в среде DMEM [Thermo Fisher Scientific (TFS), 11960044] с добавлением 30% кондиционированной среды L929 (содержащей M-CSF), 15% FBS (Sigma-Aldrich, F7524) и раствора антибиотика / антимикотика 1: 100. (Sigma-Aldrich, A5955) в течение 5 дней (24).Точно так же первичные DC были дифференцированы из костного мозга с использованием раствора, содержащего среду RPMI1640 (Sigma-Aldrich, R5886), 200 ед / мл rmGM-CSF (PeproTech, 315–03), 10% FBS (Sigma-Aldrich, F7524), 1: 100 раствор антибиотика / антимикотика (Sigma-Aldrich, A5955), 2 мМ L-глутамина (Sigma-Aldrich, 67513) и 50 мкМ β-ME (TFS, 31350-010) в течение 6 дней в соответствии с модифицированным Lutz et al. al. протокол (25). Чистоту популяций MΦ и DC оценивали методом проточной цитометрии с использованием маркеров F4 / 80 и CD11b, CD11c соответственно.Экспериментальные процедуры, выполненные в этом исследовании, включающие умерщвление мышей для выделения костного мозга или ткани, не требовали какого-либо медицинского этического одобрения в соответствии с местным законодательством и институциональными требованиями.

Культура клеток и лечение

WT и STAT1 — / — VSMC культивировали в полной среде DMEM (TFS, 11960044) с добавлением 10% FBS (TFS, 10500-064), 1: 100 L-глутамина (BioWest, X0550) и 1: 100. раствор антибиотика / антимикотика (Sigma-Aldrich, A5955).За день до обработки полную среду заменяли на 2% FBS, содержащую голодную среду. Дифференцированные MΦ и DC немедленно помещали в бессывороточную среду (TFS, 12065074) или 2% FBS (Sigma-Aldrich, F7524), содержащую RMPI1640 (Sigma-Aldrich, R5886) с добавлением 1: 100 раствора антибиотика / антимикотика (Sigma-Aldrich, A5955) и 50 мкМ β-ME (TFS, 31350-010) соответственно в течение 24 часов. После этого клетки обрабатывали одним стимулом следующим образом: 1000 ед / мл IFNα (Merck Millipore, IF009) или 10 нг / мл IFNγ (TFS, PMC4031) в течение 8 часов; 10 нг / мл (MΦ и DC) / 1 мкг / мл (VSMC) LPS (Sigma-Aldrich, L4391) в течение 4 часов.Для дальнейшего изучения влияния предварительной обработки IFN на передачу сигналов LPS, клетки сначала обрабатывали IFNα или IFNγ, через 4 часа LPS добавляли в те же планшеты для культивирования клеток на дополнительные 4 часа, в результате чего в итоге получали 8-часовую обработку. с IFN и 4-часовой обработкой LPS в концентрациях, перечисленных выше. Описанная стратегия лечения применялась в экспериментах с RNA-seq и ChIP-seq, проведенными в этом исследовании.

Онтология генов (GO)

Ресурс

Protein ANalysis TH through Evolutionary Relationships (PANTHER) (26) был применен для выявления статистически избыточно представленных GO-терминов для картированных списков обычно активируемых [Fold Change (FC)> 2] генов в VSMC, MΦ и DC после комбинированной обработки с IFNα + LPS (579 генов) и IFNγ + LPS (536 генов) с использованием набора аннотационных данных GO Biological Process Complete.Термины GO, подлежащие дальнейшему сравнению между списками генов, были выбраны как репрезентативные термины, относящиеся к биологическим функциям, участвующим в иммунной, воспалительной, защитной и стрессовой реакции. Только члены GO со значением p <0,05 считались значительно обогащенными.

Анализ промотора

Избыточно представленные консервативные сайты связывания фактора транскрипции (TFBS) для STAT1 и NFκB были проверены в регуляторных областях обычно активируемых (FC> 2) генов в VSMC, MΦ и DC после комбинированной обработки IFNα + LPS (579 генов) и IFNγ + LPS (536 генов) с использованием веб-сервера pSCAN (27).Профили JASPAR для: GAS — MA0137.2, MA0137.3, ISRE — MA0652.1, MA0137.1, MA0.517.1 и NFκB — MA0105.1, MA0105.3. TFBS анализировали в области -950 / + 50 п.н. до ближайшего сайта начала транскрипции гена. Примененный порог оценки сходства матриц для потенциальных сайтов связывания GAS / ISRE и NFκB составлял ≥0,85 и ≥0,90, соответственно.

Вестерн-блот

Белковые экстракты из первичного VSMC дикого типа получали с использованием буфера для анализа радиоиммуно-преципитации (RIPA) (50 мМ Трис-HCl, pH = 8,0 (Invitrogen, 15568025), 150 мМ NaCl (Sigma-Aldrich, S9888), 1% Nonidet-40. (Био-магазин, NON505), 0.5% дезоксихолат натрия (Bio-Shop, DCA333), 0,1% SDS (Bio-Shop, SDS001), 1% коктейль ингибиторов протеазы (Sigma-Aldrich, P8340), 1% EDTA (TFS, 15575-038), 0,1% PMSF (Sigma-Aldrich, 93482) и хранили при -80 ° C. Концентрации белка определяли количественно с использованием набора бицинхониновой кислоты (BCA) (Pierce, 23227). Шестьдесят микрограммов белка нагревали в буфере Bolt LDS (Invitrogen, B0008) при 70 ° C в течение 10 минут и наносили на блот 4–12% гелей Bis-Tris Plus (Invitrogen, NW04120BOX), подвергали электрофорезу и переносили на мембрану PVDF (GVS Nort Америка, 1231325).Эксперименты по вестерн-блоттингу проводили с использованием системы обнаружения белка SNAP ID (Merck Millipore). Мембраны блокировали либо 0,125% обезжиренным сухим молоком, либо 1% БСА в TBS-Tween (TBS-T) и инкубировали с первичными антителами: tSTAT1 (CST, 14994, D1K9Y) 1: 500, pSTAT1 (CST, 7649, D4A7) 1: 500, tSTAT2 (CST, 72604, D9J7L) 1: 400, pSTAT2 (Merck Millipore, 07-224) 1: 500, IRF1 (CST, 8478, D5E4) 1: 300, IRF9 (CST, 28845, D9I5H ) 1: 500, tp65 (CST, 6956, L8F6) 1: 500, тубулин (Merck Millipore, 04-1117, EP1332Y) 1: 2000 и далее со вторичными конъюгированными с HRP антителами: антикроличьи (Sigma-Aldrich, A9169) 1: 20 000, антимышь (Sigma-Aldrich, A9044) 1: 20 000.Комплексы антитело-антиген визуализировали по усиленной хемилюминесценции (ECL) с использованием Luminata Forte HRP Substrate (Merck Millipore, WBLUF0500) и детектировали с помощью системы G: Box (Syngene). Программное обеспечение Image Studio Lite (LI-COR Biosciences) использовалось для количественной оценки вестерн-блоттинга.

Коиммунопреципитация (Co-IP)

клеток VSMC WT лизировали в течение 30 мин в буфере co-IP [1% NP-40 (Bio-Shop, NON505), 150 мМ NaCl (Sigma-Aldrich, S9888), 1 мМ EDTA (TFS, 15575-038), 50 мМ Трис HCl pH 7.5 (Invitrogen, 15567027) 10% глицерин (Bio-Shop, GLY001)] с добавлением ингибиторов протеаз. Лизаты клеток иммунопреципитировали антителами IRF1 (CST, 8478, D5E4) и IRF9 (CST, 28845, D9I5H) в течение ночи при 4 ° C. Иммунокомплексы выделяли с помощью Dynabeads Protein A / G [TFS, 10008D (A), 10009D (G)], насыщенного 1% BSA (Sigma-Aldrich, A3059), осторожным покачиванием в течение 3 ч при температуре. Гранулы промывали 3 раза ледяным буфером co-IP и один раз буфером Tris-EDTA. Следующие связанные белки извлекали путем кипячения в буфере Bolt LDS (Invitrogen, B0008) в течение 10 минут.Иммунокомплексы анализировали с помощью вестерн-блоттинга (описанного в разделе «Материалы и методы», Вестерн-блоттинг) с tSTAT1 (CST, 14994, D1K9Y) 1: 500 и tSTAT2 (CST, 72604, D9J7L) 1: 400.

RNA-seq Экспериментальная процедура

Суммарную РНК из первичных VSMC дикого типа, MΦ дикого типа и DC дикого типа, обработанных, как описано выше, выделяли с использованием набора GeneMATRIX Universal RNA Purification Kit (EURx, E3598). Библиотеки РНК-seq получали по меньшей мере из трех биологических повторов с использованием набора для подготовки библиотеки TruSeq RNA Library (Illumina, RS-122) в соответствии с протоколом производителя.Библиотеки количественно оценивались флуорометром Qubit (TFS), а качество оценивалось с помощью набора Agilent High Sensitivity DNA (Agilent Technologies, 5067-4626). Библиотеки секвенировали с помощью секвенатора Illumina HiScanSQ. Для проверки качества набора данных RNA-seq первичные VSMC WT, MΦ WT и DC WT обрабатывали, как описано ранее, и 1 мкг РНК использовали для синтеза комплементарной ДНК с помощью обратной транскриптазы RevertAid (TFS, EP0441). Cxcl9, Cxcl10, Ccl5, Nos2, Gbp6 Транскрипты были количественно определены с использованием Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (TFS, K0223) и термоциклера CFX Connect (Bio-Rad).Уровни целевого гена были нормализованы до β-актина (ACTB) и количественно определены, как описано в другом месте (28) (описано в разделе «Результаты»; данные не показаны).

Иммунопреципитация хроматина (ChIP) -seq Экспериментальная процедура

ChIP был выполнен, как описано ранее (29), с небольшими изменениями. Вкратце, первичные WT и STAT1 — / — VSMC, обработанные, как описано выше, были подвергнуты двойному перекрестному связыванию с 0,5 М DSG (Sigma-Aldrich, 80424) в течение 45 минут с последующим введением 1% формальдегида (TFS, 28906) в течение 10 минут.Глицин (Sigma-Aldrich, G7126) добавляли на 10 мин в конечной концентрации 125 мМ, чтобы остановить процесс сшивания. После фиксации ядра выделяли добавлением буфера для лизиса ChIP (1% Triton X-100 (Bio-Shop, TRX777), 0,1% SDS (Bio-Shop, SDS001), 150 мМ NaCl (Sigma-Aldrich, S9888), 1 мМ EDTA (TFS, 15575-038) и 20 мМ Tris, pH 8,0 (TFS, 15568-025). Хроматин обрабатывали ультразвуком с помощью Diagenode Bioruptor для получения фрагментов размером 100–2000 пар оснований и иммунопреципитировали tSTAT1 (Santa Cruz, sc-346 ), pSTAT1 (CST, 7649, D4A7), tSTAT2 (CST, 72604, D9J7L), pSTAT2 (Merck Millipore, 07-224), IRF1 (CST, 8478, D5E4), IRF9 (CST, 28845, D9I5H), tp65 ( CST, 6956, L8F6), РНК-полимераза II (Merck Millipore, 05-623, CTD4H8), ацетил-гистон h4 (Lys27) (CST, 8173, D5E4) и три-метил-гистон h4 (Lys27) (CST, 9733 , C36B11) антитела.После инкубации в течение ночи при 4 ° C добавляли Dynabeads Protein A / G [TFS, 10008D (A), 10009D (G)] и инкубировали в течение 6 ч при 4 ° C с вращением. Гранулы промывали при 4 ° C. Комплексы ДНК-белок элюировали буфером для элюции (1% SDS (Bio-Shop, SDS001), 0,1 M NaHCO3 (Sigma-Aldrich, S5761) и дестишили 0,2 M NaCl (Sigma-Aldrich, S9888) при 65 ° C.ДНК очищали с помощью набора для очистки MinElute PCR Purification kit (Qiagen, 28006) и количественно оценивали с помощью флуориметра Qubit (TFS). Библиотеки ChIP-seq получали из двух биологических повторов (для tSTAT1 и tp65 IP) с использованием набора для подготовки библиотеки TruSeq ChIP ( Illumina, IP-202) согласно инструкции производителя.Библиотеки количественно оценивались флуорометром Qubit (TFS), а качество оценивалось с помощью набора Agilent High Sensitivity DNA (Agilent Technologies, 5067-4626). Библиотеки секвенировали с помощью секвенатора Illumina HiSeq 2500. Качество набора данных ChIP-seq было подтверждено экспериментами ChIP-PCR для выбранных генов-мишеней STAT1 и p65 (описано в разделе «Результаты»; данные не показаны). Все представленные анализы ChIP-PCR были выполнены с использованием биологических дубликатов с праймерами, перечисленными в таблице S2 (дополнительный материал).Статистическая значимость оценивалась с помощью двустороннего дисперсионного анализа и непарного двустороннего критерия Стьюдента T .

Анализ данных РНК-seq

Анализ считываний исходных последовательностей

RNA-seq выполняли с использованием программного обеспечения Strand NGS. После контроля качества перед выравниванием (QC) выравнивание по сборке генома mm10 (GRCm38) мыши проводили с использованием внутреннего выравнивателя Strand NGS, который следует подходу выравнивания Берроуза-Уиллера (BWA). Все выровненные чтения были нормализованы с помощью пакета DESeq. Данные RNA-seq можно найти в NCBI GEO DataSets с номером доступа GSE120807.Для определения дифференциально экспрессируемых генов (FC ≥ 2: повышенная регуляция) списки генов сначала были отфильтрованы на основе их нормализованных значений интенсивности сигнала с нижним пороговым значением> 8. FC был рассчитан для этих генов в различных условиях, и полученные списки активированных генов были использованы для последующего анализа. 18 списков (3 типа клеток × 6 условий: контроль, IFNα, IFNγ, LPS, IFNα + LPS, IFNγ + LPS) дифференциально экспрессируемых генов были сравнены и визуализированы с помощью инструмента диаграммы BioVenn (30).Тепловые карты, представляющие log2 трансформированные значения FC для обычно активируемых генов в VSMC, MΦ и DC после комбинированной обработки IFNα + LPS (579 генов) и IFNγ + LPS (536 генов) в контроле, IFNα, IFNγ, LPS, IFNα + LPS и Условия обработки IFNγ + LPS были созданы с использованием программного обеспечения GraphPad Prism v.7.

Анализ данных ChIP-seq

Первичный анализ считываний необработанной последовательности ChIP-seq проводился с использованием конвейера командной строки ChIP-seq analysis (31). Считанные последовательности были сопоставлены со сборкой генома мыши mm10 (GRCm38) с использованием инструмента BWA (v0.7.10) (32), а файлы bam были созданы SAMTools (v0.1.19) (32). После преобразования отображенных чтений (файлов bam) с помощью makeTagDirectory (HOMER v4.2 Hypergeometric Optimization of Motif EnRichment (33), чтобы они стали доступными для других инструментов HOMER, makeUCSCfile.pl (HOMER) создал файлы покрытия генома (графическое изображение) (33). и преобразованы в мозаичные файлы данных (tdfs) с помощью IGVtools (34). Пики были предсказаны MACS2 (v2.0.10) ( q -значение ≤ 0,01) (35), а артефакты были удалены в соответствии с черным списком ENCODE (36 ).Пересечения, вычитания и объединение предсказанных пиков (файлы пластов) были выполнены с помощью BedTools (v2.23.0) (37). Были визуализированы файлы Tdf и кровати, а также были сделаны снимки генома с помощью IGV2.3 (38). Ближайший ген для каждого пика был идентифицирован annotatePeaks.pl (HOMER). Идентификацию мотивов ДНК проводили в два этапа. Во-первых, scanMotifGenomeWide.pl (HOMER) использовался для идентификации всех мотивов в масштабе генома, указанных в общедоступных файлах мотивов. Во-вторых, мы определили пересечение между идентифицированными мотивами и пиками с помощью correctBed (bedtools).Данные секвенирования были представлены в NCBI GEO DataSets под номером доступа GSE120806.

RD (распространение для чтения) Подготовка участка

Для кластеризации значения занятости (выраженные как чтения на миллион килобаз, RPKM) были рассчитаны для всех пиков STAT1 и p65. Пики были сгруппированы с использованием кластеризации k-средних ( n = 10) на основе паттерна связывания STAT1 и p65 в 6 образцах (всего 12 наборов данных ChIP-seq). Нормализованное количество тегов для гистограмм RD было создано HOMER, а затем визуализировано Java TreeView.

График распределения пиков (гистограмма) Подготовка

Расстояния между вершинами STAT1 и ближайшими вершинами пиков p65 были рассчитаны с помощью Phyton. Гистограммы были сгенерированы annotatePeaks.pl из HOMER (с размером опции 2000 и -hist 25) и визуализированы R с использованием пакета ggplot2.

Интегративный анализ RNA-seq и ChIP-seq

консенсусных мотивов GAS, ISRE и NFκB-p65 из базы данных HOMER (GAS-motif273, ISRE-motif140, NFκB-motif208; логотипы мотивов в дополнительном материале, рис. S1) были повторно отображены в названные области пиков в STAT1 и p65 ChIP- seq экспериментов после обработки IFNα + LPS и IFNγ + LPS в VSMC.Затем список из 579 и 536 обычно экспрессируемых генов в сосудистых и иммунных клетках, обработанных IFNα + LPS и IFNγ + LPS, соответственно, идентифицированный в эксперименте с RNA-seq, перекрывался списками повторно картированных областей мотивов. Списки аннотированных генов, содержащих повторно картированные мотивы GAS, ISRE и NFκB, были первоначально отфильтрованы в соответствии с расстоянием между мотивами от ближайшего аннотированного гена TSS (- / + 100 т.п.н.) и в соответствии с порогом оценки мотива (MST) (GAS — MST 6, ISRE — MST 6, NFκB — MST 7).Распределение консенсусных сайтов связывания GAS, ISRE и NFκB, занимаемых STAT1 и p65 в геноме, было классифицировано по семи категориям геномных местоположений: промотор / TSS (от -1 до +100 п.н.), интроны, межгенные, экзон, 5 ‘UTR , 3 ‘UTR и TTS. Распределение повторно картированных мотивов строили как процент от общего числа занятых сайтов связывания GAS, ISRE и NFκB при обработке IFNα + LPS или IFNγ + LPS.

Результаты

Обычно гены, регулируемые IFNα + LPS и IFNγ + LPS, раскрывают механизм и функциональное перекрытие SI

, индуцированного праймингом

Чтобы охарактеризовать механизм индуцированного примированием IFNα + LPS- и IFNγ + LPS-зависимого SI в сосудистых клетках по сравнению с иммунными клетками, мы сравнили полногеномные транскрипционные ответы VSMC, MΦ и DC в ответ на IFNα (8 ч. ), IFNγ (8 часов) или LPS (4 часа) отдельно или после комбинированного лечения (IFNα 8 часов + LPS 4 часа; IFNγ 8 часов + LPS 4 часа) с использованием RNA-seq.Следовательно, 579 генов обычно активируются в VSMC, MΦ и DC после комбинированного лечения IFNα + LPS (рис. 1A). Точно так же 536 генов обычно экспрессировались после комбинированного лечения IFNγ + L PS (рис. 1A). Полные списки активируемых генов в ответ на IFNα, IFNγ или LPS по отдельности или после комбинированного лечения в каждом типе клеток показаны в таблице S1. Чтобы проверить качество нашего набора данных RNA-seq, экспрессия ряда этих генов, включая Cxcl9, Cxcl10, Ccl5, Nos2, Gbp6 , была дополнительно подтверждена с помощью ОТ-ПЦР (данные не показаны).

Рисунок 1 . Механистические и функциональные характеристики общей экспрессии генов между VSMC и MΦ, DC в ответ на IFNα + LPS и IFNγ + LPS. (A) Диаграммы Венна, основанные на результатах RNA-seq, демонстрирующие пересечение списков активированных (FC> 2) генов в VSMC, MΦ и DC после комбинированной стимуляции IFNα (8 часов) + LPS (4 часа) и IFNγ (8 ч) + ЛПС (4 ч). Списки генов для этих диаграмм Венна показаны в Таблице S1. Общие 579 IFNα + LPS и 536 IFNγ + LPS гены между тремя типами клеток были выделены фиолетовой рамкой. (B) Графики тепловой карты , отображающие паттерн экспрессии обычно активируемых генов, индуцированных 579 IFNα (8 часов) + LPS (4 часа) и 536 IFNγ (8 часов) + LPS (4 часа) в VSMC, в результате RNA-seq. Три основных столбца на каждой тепловой карте представляют одно конкретное условие лечения [IFNα (8 часов), IFNγ (8 часов), LPS (4 часа), IFNα (8 часов) + LPS (4 часа) или IFNγ (8 часов) + LPS ( 4 ч)]. Увеличение яркости красного цвета указывает на более высокий уровень экспрессии гена (экспрессия гена представлена ​​как log2 FC по сравнению с контролем). (C) Коробчатая диаграмма распределения экспрессии генов для обычно активируемых генов IFNα (8 часов) + LPS (4 часа) и IFNγ (8 часов) + LPS (4 часа) в результате RNA-seq (ген экспрессия представлена ​​как log2 FC по сравнению с контролем) в VSMC. Линия внутри каждого прямоугольника представляет собой медианное значение, а нижняя и верхняя границы каждого прямоугольника указывают соответственно первый и третий квартили. (D) Сравнение генов, обычно активируемых IFNα (8h) + LPS (4 часа) и IFNγ (8 часов) + LPS (4 часа) из RNA-seq, показывает 64.21% совпадений между списками генов. (E) GO анализ генов, обычно активируемых IFNα (8 часов) + LPS (4 часа) и IFNγ (8 часов) + LPS (4 часа) (RNA-seq), выявил сильное обогащение терминов, отражающих про -воспалительная и проатерогенная биологические функции. P -значение <0,05. (F) Диаграмма Венна Распределение промотора, расположенного (-950 / + 50 п.н.) сайтов связывания GAS, ISRE и NFκB среди обычно активируемых генами IFNα (8 часов) + LPS (4 часа) и IFNγ (8 часов). ) + ЛПС (4 ч) из эксперимента с РНК-секвенцией.

Тепловые карты, представляющие характер экспрессии генов, обычно регулируемых 579 IFNα + LPS и 536 IFNγ + LPS в VSMC, иллюстрируют потенциальный эффект SI после комбинированного лечения IFNα + LPS или IFNγ + LPS по сравнению с одиночными стимулами (Рисунок 1B) . Увеличение яркости красного цвета на тепловой карте отражает увеличение уровней экспрессии генов, которые в целом заметно выше после комбинированной обработки IFNα + LPS и IFNγ + LPS по сравнению с одиночными стимулами. После сравнения общего диапазона и распределения экспрессии общих генов после однократной или комбинированной стимуляции (рис. 1C), в VSMC эффект SI был четко виден на представленной прямоугольной диаграмме.Средняя экспрессия гена после комбинированного лечения IFNα + LPS и IFNγ + LPS была выше по сравнению с одиночным лечением IFNs или LPS (рис. 1C). Таблицы 1A, B дают представление о 30 из этих обычно активируемых генов и иллюстрируют то, как они реагируют на IFNα + LPS и IFNγ + LPS в VSMC по сравнению с одиночными стимулами. Гены, на которые влияет SI (отраженная повышенной экспрессией генов после комбинированной обработки IFNα + LPS или IFNγ + LPS по сравнению с суммой отдельных обработок; см. Материалы и методы), отмечены звездочкой (Таблицы 1A, B).Поразительно, но значительное перекрытие можно было наблюдать между обычно активируемыми генами в ответ на IFNα + LPS и IFNγ + LPS. Действительно, диаграмма Венна на Рисунке 1D показывает 64,21% перекрытия между 579 IFNα + LPS и 536 IFNγ + LPS генами, обычно активируемыми генами (Рисунок 1D). Более того, анализ GO этих 579 IFNα + LPS и 536 IFNγ + LPS генов, обычно активируемых, выявил значительное обогащение перекрывающихся терминов, связанных со стрессом, иммунным и воспалительным ответом, ответом на цитокин, регуляцией пролиферации и миграции клеток, регуляцией клеточной адгезии. а также хемотаксис, гибель клеток и апоптотический процесс, реакция на липиды и метаболический процесс активных форм кислорода (АФК), все они отражают провоспалительные и проатерогенные биологические функции.Это также подтверждает существование функционального перекрытия между сосудистыми и иммунными клетками, опосредованного взаимодействием обоих IFN с LPS, что приводит к выполнению общих биологических ответов клеточного типа (рис. 1E).

Таблица 1A . Репрезентативные топ-30 генов, обычно активируемых (FC> 2) IFNα + LPS в VSMC, MΦ и DC, отражая SI между IFNα и LPS в VSMC.

Таблица 1B . Репрезентативные топ-30 генов, обычно активируемых (FC> 2) IFNγ + LPS в VSMC, MΦ и DC, отражая SI между IFNγ и LPS в VSMC.

В тех же списках генов, обычно активируемых IFNα + LPS и IFNγ + LPS, мы также выполнили анализ промотора in silico на предмет наличия сайтов связывания ISRE, STAT или NFκB в проксимальном промоторе (от -950 до +100 п.н.). Прогнозируемое представление отдельных или комбинированных сайтов связывания GAS, ISRE или NFκB показано на рисунке 1F. Большинство генов содержали либо отдельные сайты GAS (89 генов IFNα + LPS и 85 генов IFNγ + LPS), либо, скорее, комбинации потенциальных GAS-ISRE (98 генов IFNα + LPS и 91 ген IFNγ + LPS), GAS-NFκB (68 IFNα + Гены LPS и 66 генов IFNγ + LPS), ISRE-NFκB (22 гена IFNα + LPS и 17 генов IFNγ + LPS) или GAS-ISRE-NFκB (92 гена IFNα + LPS и 88 генов IFNγ + LPS) сайтов связывания.Все вместе это предполагает, что общий механизм SI участвует во взаимодействии между IFNα и LPS или IFNγ и LPS в VSMC, по аналогии с MΦ и DC.

Связывание STAT1 и p65 по всему геному с регулируемыми генами IFNα + LPS и IFNγ + LPS опосредуется с помощью сопоставимых режимов одиночного и совместного связывания

Чтобы получить более полное представление о механизме индуцированного праймингом SI между IFN и LPS в VSMC, мы охарактеризовали связывание STAT1 и NFκB (p65) по всему геному с регуляторными областями IFNα + LPS и IFNγ + LPS, обычно активируемых. гены.Таким образом, мы выполнили ChIP-seq на хроматине из VSMC, подвергнутого воздействию IFNα (8 часов), IFNγ (8 часов) или LPS (4 часа) по отдельности или комбинированного лечения (IFNα 8 часов + LPS 4 часа; IFNγ 8 часов + LPS. 4 ч).

Кластерный анализ областей генома, занятых STAT1 и / или p65 в ответ на одно или комбинированное лечение (рис. 2A), визуализируется в виде подсчета тегов (синие сигналы) на графике RD. Этот анализ показал, что подмножество связывающих областей STAT1 и p65 (т.е. кластер 7) явно было совместно занято этими факторами транскрипции при использовании комбинированных обработок (IFNα + LPS или IFNγ + LPS), что отражалось в повышенной интенсивности синего цвета на график (рис. 2А).Однако другие области генома коррелировали со связыванием только STAT1 или p65 [то есть кластера C1, C9 (только p65), кластера C2 и C8 (только STAT1)]. Впоследствии с помощью программного обеспечения HOMER консенсусные мотивы GAS, ISRE и NFκB (рисунки S1A – C) были повторно картированы на связывающие области STAT1 и p65 и сравнены со списками 579 IFNα + LPS и 536 IFNγ + LPS, обычно активируемых генами. (Рисунок 2B). Анализ геномного связывания показал, что сайты связывания STAT1 (GAS или ISRE) и p65 (NFκB) в основном расположены в отдаленных межгенных областях и интронных областях, в то время как в меньшей степени в промоторах IFNα + LPS- и IFNγ + LPS-чувствительных генов. (Рисунок 2B).Аналогичное распределение можно было наблюдать для местоположения сайтов совместного связывания STAT1-NFκB (рис. 2B), что согласуется с представленным выше анализом промотора (рис. 1F) и предсказывает присутствие нескольких сайтов связывания STAT1 и NFκB в промоторы генов IFNα + LPS и IFNγ + LPS обычно активируются.

Рисунок 2 . Общегеномная роль STAT1 и p65 в регуляции транскрипции обычно активируемых IFNα + LPS- и IFNγ + LPS-индуцированных генов. (A) Тепловые карты RD для пиков ChIP-seq сгруппированы ( k -означает кластеризацию) на основе паттерна связывания STAT1 и p65 в контроле, IFNα (8 часов), IFNγ (8 часов), LPS (4 часа), IFNα (8 часов) + LPS (4 часа), IFNγ (8 часов) + LPS (4 часа) в условиях обработки в VSMC.Идентифицированные кластеры помечены как кластер (C) 1–10. (B) Глобальное распределение занятых сайтов связывания STAT1 (GAS и ISRE) и p65 (NFκB) (из ChIP-seq) в 7 геномных местоположениях (обозначенных цветом с отображением, приведенным в легенде): промотор / TSS (- От 1 т.п.н. до +100 п.н.), интроны, межгенные, экзон, 5′-UTR, 3′-UTR и TTS. Распределение повторно картированных мотивов строили по проценту от общего числа занятых сайтов связывания GAS, ISRE и NFκB, присутствующих в регуляторных областях обычно активируемых IFNα (8 часов) + LPS (4 часа) — и IFNγ (8 часов). ) + LPS (4 ч) -индуцированные гены. (C) Представление занятых сайтов связывания STAT1 и p65, идентифицированных ChIP-seq, представляющих «одиночные» режимы (связывание STAT1 с GAS и / или ISRE; связывание p65 с NFκB) или режимы «совместного связывания» (связывание STAT1 с GAS и / или ISRE вместе с p65 согласно NFκB). В таблице показано количество генов в каждом режиме связывания STAT1 / p65 среди генов, индуцированных IFNα (8 часов) + LPS (4 часа) и IFNγ (8 часов) + LPS (4 часа), вместе с процентным перекрытием между двумя условиями лечения. .

Путем следующего сравнения результатов связывания по всему геному для STAT1 и p65 после стимуляции VSMC IFNα + LPS и IFNγ + LPS, мы смогли идентифицировать разные группы генов, где STAT1 связан с консенсусными сайтами ISRE и / или GAS, а p65 — с сайтами NFκB.Эти сайты связывания присутствовали в регуляторных областях генов и существовали в различных комбинациях. Таким образом, мы могли различать гены, которые содержали отдельные сайты ISRE, GAS или NFκB, а также сайты GAS-ISRE, ISRE-NFκB, GAS-NFκB или GAS-ISRE-NFκB. На основе этих групп генов мы дополнительно определили способы связывания STAT1 и p65, включая «одиночный» (связывание STAT1 с GAS и / или ISRE; p65 с NFκB) или «совместное связывание» (связывание STAT1 с GAS и / или ISRE + p65 с NFκB) (Рисунок 2C). Среди генов, индуцированных IFNα + LPS, были идентифицированы 6 генов, содержащих только GAS, 81 ген только ISRE, 85 генов, содержащих только NFκB, и 51 ген, содержащий GAS-ISRE.В случае стимуляции IFNγ + LPS мы могли различить 17 GAS-only, 45 ISRE-only, 28 NFκB-only и 53 GAS-ISRE-содержащих гена. Вместе они отражают «единый» режим привязки. Кроме того, гены, индуцированные IFNα + LPS- и IFNγ + LPS, также включают гены «совместного связывания» STAT1-p65, которые можно разделить на GAS-NFκB: 23 и 40 гены, ISRE-NFκB: 94 и 59 гены и GAS. -ISRE-NFκB гены: 99 и 178 генов соответственно.

Сравнение различных режимов связывания между IFNα + LPS- и IFNγ + LPS-индуцированными состояниями выявило существенное перекрытие только для NFκB (15.9%), только GAS (13%) и только ISRE (29,4%), содержащие гены из «одиночного» режима (рис. 2C). Как сообщалось ранее, как IFN-I, так и IFN-II направляют комплексы GAF на мотивы GAS, что в нашем исследовании отражается в 13% -ном перекрытии между двумя условиями в режиме GAS-only. Тем не менее 29,4% совпадение, обнаруженное между IFNα- и IFNγ-активированными генами в режиме ISRE-only, было очень неожиданным, поскольку существуют ограниченные доказательства роли ISGF3 в экспрессии генов, управляемой IFN-II. Аналогичным образом, это совпадение может наблюдаться для GAS-ISRE (32.7%), GAS-NFκB (11,1%), ISRE-NFκB (21,6%) и GAS-ISRE-NFκB (29,6%) из режима «совместного связывания» (рис. 2C).

В совокупности это предполагает, что существует общий механизм SI для всего генома, который включает комбинаторные действия ISGF3 или GAF с NFκB на сайты связывания ISRE / NFκB или GAS / NFκB во взаимодействии IFNα и LPS или IFNγ и LPS в VSMC.

STAT1 как часть ISGF3 регулирует транскрипцию ISRE-содержащих генов в ответ на IFN-I и IFN-II

Поразительным наблюдением после сравнения обычно активируемых генов IFNα + LPS и IFNγ + LPS было большое количество перекрывающихся STAT1-связывающих ISRE-содержащих генов (рис. 2C).Тщательное изучение генов, содержащих 45 ISRE-only и 59 ISRE-NFκB, активированных после стимуляции IFNγ + LPS (рис. 2C), выявило присутствие ISRE, но отсутствие сайта связывания GAS, занятого STAT1 в регуляторных областях. этих генов. Более того, связывание STAT1 уже можно было наблюдать после обработки VSMC одним IFNγ (данные не показаны), что коррелирует с их транскрипционной активностью. Среди этих генов были классические ISRE-содержащие гены, из которых мы выбрали Ifit1, Mx2, Oas2, Cxcl10 и Irf7 (рис. 3A), чтобы дополнительно охарактеризовать природу этого STAT1-зависимого механизма в нескольких экспериментах.Все 5 генов очень чувствительны к IFNα и, в меньшей степени, к IFNγ, при этом на Ifit1, Mx2 и Cxcl10 оказывает влияние SI после комбинированного лечения IFNα + LPS и IFNγ + LPS (рис. 3A). Это коррелировало с небольшим увеличением фосфорилирования STAT1 и STAT2 в ответ на оба стимула по сравнению с индивидуальными (рис. 3B). Ifit1, Mx2, Oas2 и Irf7 являются примерами генов ISRE-only, что согласуется с одним пиком связывания STAT1 (рис. 3D).В случае Cxcl10 два пика связывания STAT1 были ранее идентифицированы Rauch et al., Дистальный и проксимальный, соответствующие известному составному сайту ISRE-GAS и одному мотиву ISRE, соответственно (9). Поэтому в этой части нашего исследования единственный сайт ISRE, присутствующий в проксимальной области промотора Cxcl10 , был выбран для дальнейшей проверки IFN-зависимого рекрутирования STAT1 (Рисунок 3D). Представления браузера генома IGV продемонстрировали связывание STAT1 с ISRE-содержащими областями всех этих генов в VSMC, обработанных IFNα, IFNγ, LPS, IFNα + LPS и IFNγ + LPS (рис. 3D).Результаты STAT1 ChIP-seq были дополнительно проверены с помощью количественной ChIP-PCR, которая продемонстрировала значительное увеличение привлечения tSTAT1 к мотивам ISRE, присутствующим в промоторах Ifit1, Mx2, Oas2, Cxcl10 и Irf7 после стимуляции как IFNα, так и IFNγ (рис. 3E). Это совпало со связыванием pSTAT1, которое было значительно выше после обработки IFNγ, чем после обработки IFNα, и отражало уровни фосфорилирования STAT1 в этих условиях (рис. 3E). Точно так же мы исследовали потенциальное связывание pSTAT2, tSTAT2 и IRF9 в этих условиях (рисунки 3F, G, соответственно).Он продемонстрировал повышенное привлечение pSTAT2 к ISRE-содержащим промоторам генов Ifit1, Mx2, Oas2, Cxcl10 и Irf7 после стимуляции IFNα и, что удивительно, IFNγ (фиг. 3F). Как и pSTAT1, уровень обогащения pSTAT2 соответствовал уровням фосфорилирования STAT2, которые неожиданно также можно было обнаружить после обработки IFNγ и IFNγ + LPS (рис. 3B). Связывание IRF9 показало аналогичный паттерн, как у pSTAT2, и соответствовал уровням экспрессии IRF9, присутствующим в клетках, обработанных IFNα, IFNγ и / или LPS (фиг. 3B).Одновременное привлечение pSTAT1, pSTAT2 и IRF9 после обработки IFNα и IFNγ четко коррелирует с участием ISGF3 в регуляции транскрипции этих ISRE-содержащих генов в ответ на оба типа IFN. Действительно, совместное IP IRF9 с STAT1 и STAT2 в VSMC, обработанных IFNα и IFNγ, подтвердило это наблюдение (рис. 3C). Паттерн экспрессии этих генов точно отражал паттерн связывания pSTAT2 и IRF9, будучи выше после обработки IFNα по сравнению с обработкой IFNγ.Интересно, что связывание STAT1 имело противоположный характер (выше после обработки IFNγ, чем после IFNα). Это предполагает участие STAT1 в дополнительном ISRE-связывающем комплексе в клетках, обработанных IFNγ. Исходя из высоких уровней фосфорилирования STAT1 и повышенной экспрессии IRF9 в этих условиях, этот комплекс, возможно, может состоять из гомодимеров STAT1 вместе с IRF9 (39).

Рисунок 3 . STAT1, STAT2, IRF9 и IRF1 в регуляции транскрипции ISRE-содержащих генов при стимуляции IFN-I и IFN-II. (A) Значения экспрессии гена (FC по сравнению с контролем) для генов Ifit1, Mx2, Oas2, Cxcl10 и Irf7 , полученные в результате RNA-seq: VSMC, необработанные или обработанные IFNα (8 ч), IFNγ (8 часов), LPS (4 часа), IFNα (8 часов) + LPS (4 часа), IFNγ (8 часов) + LPS (4 часа). (B) Вестерн-блот. Белковые экстракты выделяли из VSMC, необработанных или обработанных IFNα (8 часов), IFNγ (8 часов), LPS (4 часа), IFNα (8 часов) + LPS (4 часа), IFNγ (8 часов) + LPS (4 часа). ). Уровни tSTAT1, pSTAT1, tSTAT2, pSTAT2, IRF1, IRF9, p65 и тубулина оценивали с помощью вестерн-блоттинга. n = 3, представлен один репрезентативный блот; Количественная оценка вестерн-блоттингом. Столбцы представляют собой среднюю количественную оценку отношения pSTAT1 / tSTAT1 и pSTAT2 / tSTAT2 (нормализованного к тубулину). Среднее ± стандартное отклонение, n = 3; (C) Co-IP. Белковые экстракты выделяли из VSMC, необработанных или обработанных IFNα (8 часов) и IFNγ (8 часов), иммунопреципитированных антителами IRF9 или IRF1 и анализировали вестерн-блоттингом tSTAT1 и / или tSTAT2. n = 3, представлен один репрезентативный блот. (D) Репрезентативные виды пиков STAT1 ChIP-seq, обнаруженных в ISRE-содержащих промоторах генов Ifit1, Mx2, Oas2, Cxcl10 и Irf7 , в необработанных или IFNα (8 часов), IFNγ (8 часов). ), LPS (4 часа), IFNα (8 часов) + LPS (4 часа), IFNγ (8 часов) + LPS (4 часа) -стимулированные VSMC. Пики STAT1 были нанесены на карту эталонного генома мыши mm10 и визуализированы с использованием браузера генома IGV. (E) VSMC не обрабатывались или обрабатывались IFNα (8 часов) и IFNγ (8 часов) и ChIP-PCR для подтверждения связывания tSTAT1 и pSTAT1 с мотивом ISRE, присутствующим в промоторах на Ifit1, Mx2, Oas2, Cxcl10 , и Irf7 генов.Среднее ± стандартное отклонение, n = 2. Праймеры перечислены в таблице S2. ЧИП-ПЦР. VSMC не обрабатывали или обрабатывали IFNα (8 часов) и IFNγ (8 часов), хроматин выделяли и иммунопреципитировали антителами (F) tSTAT2, pSTAT2, (G) IRF9 и (H) IRF1 с последующим введением ChIP-PCR анализ. Среднее ± стандартное отклонение, n = 2. Праймеры перечислены в таблице S2.

Поскольку уровни экспрессии IRF1 увеличиваются в VSMC, обработанных IFNα, IFNγ и / или LPS (рис. 3В), мы также протестировали возможное участие комплекса, содержащего STAT1-IRF1.Интересно, что IRF1 также рекрутировался в эти ISRE-содержащие гены после стимуляции IFNγ, но лишь слабо после обработки IFNα (рис. 3H). Наиболее сильное рекрутирование IRF1 было отмечено для промоторов Ifit1 и Mx2 по сравнению с промоторами гена Oas2, Cxcl10 и Irf7 . Однако в этих условиях не удалось обнаружить взаимодействия между STAT1 и IRF1 (рис. 3C), что указывает на независимую от STAT1 роль IRF1 в регуляции транскрипции селективной группы ISRE-содержащих генов.

Наши результаты согласуются с существованием более общего механизма в первичных VSMC мышей, при котором IFNα-ответ ISRE-содержащих генов в основном управляется ISGF3. Напротив, их ответ IFNγ опосредуется ISGF3 и, возможно, STAT1 / IRF9.

Рекрутмент STAT1 и p65 в ответ на IFNα + LPS или IFNγ + LPS ограничен сайтами GAS / NFκB или ISRE / NFκB

Затем мы сконцентрировались на перекрытии режимов «совместного связывания» STAT1-p65 между IFNα + LPS- и IFNγ + LPS-индуцированными состояниями.Интересно, что по всему геному эти сайты совместного связывания расположены на одинаковом расстоянии не более ~ 200 п.н. (Рисунок 4A). Во-первых, мы определили, сколько генов, которые были отнесены к режимам GAS-NFκB, ISRE-NFκB или GAS-ISRE-NFκB (рис. 2C), были затронуты SI в этих условиях. Мы идентифицировали 170 таких генов, активируемых IFNα + LPS и 211 IFNγ + LPS, из которых 106 были общими (рис. 4B). Из этого списка генов мы выбрали несколько примеров, представляющих три режима «совместного связывания» STAT1-p65: Serpina3i, Steap4, Irf1 (режим GAS-NFκB), Ccl5, Ifit1, Gbp6 (режим ISRE-NFκB). , Cxcl10, Gbp7 (режим GAS-ISRE-NFκB).Значения RNA-seq FC, представляющие изменения экспрессии генов после обработки IFNα, IFNγ, LPS и IFNα + LPS, IFNγ + LPS, представлены на Фигуре 4C. Действительно, все эти гены реагировали по крайней мере на два одиночных стимула и подвергались воздействию SI, что отражалось в увеличении экспрессии генов после комбинированного лечения IFNα + LPS или IFNγ + LPS по сравнению с суммой отдельных обработок (Рисунок 4C).

Рисунок 4 . Представители режимов «одиночного» и «совместного связывания» STAT1 и p65. (A) Графики распределения пиков, показывающие расстояния между вершинами STAT1 и ближайшими вершинами пиков p65, полученными в результате ChIP-seq в VSMC под действием IFNα (8 часов) + LPS (4 часа) и IFNγ (8 часов) + LPS (4 часа). ) условия лечения. (B) Диаграмма Венна, показывающая пересечение 170 IFNα (8 ч) + LPS (4 ч) — и 211 IFNγ (8 ч) + LPS (4 ч) -активированных генов SI, полученных в результате RNA-seq. (C) В таблице представлены значения экспрессии генов (FC по сравнению с контролем), полученные в результате эксперимента с последовательностью РНК: VSMC, обработанные IFNα (8 часов), IFNγ (8 часов), LPS (4 часа), IFNα (8 часов). ) + LPS (4 часа), IFNγ (8 часов) + LPS (4 часа) и расстояние между сайтами связывания GAS-NFκB и ISRE-NFκB (п.о.) для выбранных генов, представляющих идентифицированные режимы «совместного связывания» STAT1 и p65: GAS- NFκB: Serpina3i, Steap4, Irf1 ; ISRE-NFκB: Ccl5, Ifit1, Gbp6 ; GAS-ISRE-NFκB: Cxcl10 и Gbp7 ; ISRE: Irf7 ; NFκB: Saa1 . (D) Репрезентативные виды пиков ChIP-seq STAT1 и p65 (STAT1: фиолетовые пики, p65: темно-синие пики), идентифицированных в регуляторных областях Serpina3i, Steap4, Irf1, Ccl5, Ifit1, Gbp6, Cxcl10, Gbp7, Irf7 и Saa1 гены в необработанном виде или IFNα (8 часов), IFNγ (8 часов), LPS (4 часа), IFNα (8 часов) + LPS (4 часа), IFNγ (8 часов) + LPS ( 4 ч) -стимулированный VSMC. Пики связывания STAT1 и p65 были нанесены на карту эталонного генома мыши mm10 и визуализированы с использованием браузера генома IGV.

STAT1 и p65 ChIP-seq IGV-обозреватели генома этих предварительно отобранных генов в ответ на IFNα + LPS и IFNγ + LPS охватывают различные режимы «совместного связывания» STAT1-p65 (рис. 4D). Дорожки IGV выявляют паттерн связывания STAT1 и p65 с промоторами Serpina3i, Steap4, Irf1 (сайты GAS-NFκB), Ccl5, Ifit1, Gbp6 (сайты ISRE-NFκB), Cxcl10, Gbp7 (GAS- Сайтов ISRE-NFκB) после стимуляции IFNα, IFNγ, LPS и комбинированного лечения IFNα + LPS или IFNγ + LPS (рис. 4D).В случае Cxcl10 можно было наблюдать два пика совместного связывания STAT1-p65 (рис. 4D), дистальный и проксимальный, соответствующие известному составному сайту GAS-ISRE-NFκB и объединенному мотиву ISRE-NFκB (9, 40). В этой второй части нашего исследования составной сайт GAS-ISRE-NFκB, присутствующий в дистальной области промотора Cxcl10 , был выбран для дальнейшей проверки IFN-зависимого рекрутирования STAT1 и p65.

В заключение, для большинства этих генов пики связывания STAT1 и p65 были близко выровнены в промоторах совместно связанных генов, что дополнительно коррелировало с близостью сайтов связывания GAS и NFκB или ISRE и NFκB.Такое распределение сайтов тесного связывания может быть предпосылкой для эффективного сотрудничества STAT1 и p65.

Рекрутирование STAT1 в составные сайты GAS / NFκB или ISRE / NFκB предшествует p65 и коррелирует с повышенной транскрипцией IFNα + LPS и IFNγ + LPS регулируемых генов в VSMC

Проверочные эксперименты для STAT1 и p65 с помощью количественной ChIP-PCR с использованием свежевыделенного материала (рисунки 5A, B) подтвердили характер связывания как STAT1, так и p65, как показано на рисунке 4D. Он также поддержал следующие выводы.Во-первых, для всех генов пики связывания STAT1 и p65 были близко выровнены в промоторах. Это коррелирует с близостью сайтов связывания GAS и NFκB или ISRE и NFκB (~ 200 п.н .; рис. 4C), что может быть предпосылкой для эффективного сотрудничества STAT1 и p65. Более того, таблицы 1A, B подтверждают присутствие сайтов связывания GAS, ISRE и NFκB [обозначенных точкой (•)] в промоторах 30 наиболее часто активируемых генов IFNγ + LPS и IFNα + LPS в VSMC. . Это дополнительно подчеркивает наблюдение, что доступность множественных сайтов связывания для этих факторов транскрипции внутри промоторов генов может играть роль в координации немедленной и надежной активации транскрипции генов.

Рисунок 5 . STAT1 модулирует повышенное привлечение p65 к композитным сайтам GAS / NFκB или ISRE / NFκB. (A) ChIP-PCR STAT1 на Serpina3i, Steap4, Irf1, Ccl5, Ifit1, Gbp6, Cxcl10 и Gbp7 Промоторы гена (праймеры перечислены в таблице S2) в VSMC WT, обработанном IFNα (8 часов ), IFNγ (8 часов), LPS (4 часа), IFNα (8 часов) + LPS (4 часа), IFNγ (8 часов) + LPS (4 часа). Среднее ± sem, n = 2. (B) ChIP-PCR p65 на Serpina3i, Steap4, Irf1, Ccl5, Ifit1, Gbp6, Cxcl10 и Gbp7 промоторов гена VSMC WT, обработанных IFNα ( 8 часов), IFNγ (8 часов), LPS (4 часа), IFNα (8 часов) + LPS (4 часа), IFNγ (8 часов) + LPS (4 часа).Среднее ± sem, n = 2. (C) ChIP-PCR p65 на Serpina3i, Steap4, Irf1, Ccl5, Ifit1, Gbp6, Cxcl10 и Gbp7 промоторов гена в VSMC STAT1 KO, обработанных IFNα (8 часов), IFNγ (8 часов), LPS (4 часа), IFNα (8 часов) + LPS (4 часа), IFNγ (8 часов) + LPS (4 часа). Среднее ± стандартное отклонение, n = 2.

Во-вторых, хотя стимуляция как IFN-I, так и IFN-II приводила к повышенным уровням общего белка STAT1, но не общего белка p65 (рис. 3B), для большинства генов эффективность привлечения STAT1 коррелировала с эффективностью связывания p65. .Интересно, что это не ограничивалось обработкой IFNα + LPS и IFNγ + LPS, но также было ясно видно после однократной обработки IFNα или IFNγ. В целом, связывание STAT1 и p65 после IFNγ и IFNγ + LPS было сильнее, чем после IFNα и IFNα + LPS (Фигуры 5A, B). В-третьих, повышенное связывание p65 после однократной обработки IFNα или IFNγ может быть обнаружено только в композитных сайтах GAS / NFκB или ISRE / NFκB (рис. 4D), но не в генах с отдельными последовательностями связывания NFκB (на примере Saa1 ; рис. 4D) .

В-четвертых, для всех промоторов совместно связанных генов STAT1-p65, за исключением Gbp6 , мы наблюдали умеренное увеличение рекрутирования STAT1 после комбинированной обработки IFNγ + LPS по сравнению с одним IFNγ. Аналогичным образом, комбинированная обработка IFNα + LPS приводила к незначительному увеличению связывания STAT1 по сравнению с однократной обработкой IFNα (фиг. 5A). Примечательно, что связывание STAT1 после обработки IFNα было значительно слабее по сравнению с IFNγ-индуцированным привлечением STAT1, а также с увеличением набора STAT1 после комбинированного лечения.Это наблюдение коррелировало со значениями экспрессии FC исследованных «совместно связанных» генов STAT1-p65 (фиг. 4C), которые в целом были более чувствительны к IFNγ + LPS, чем к IFNα + LPS. То же самое было верно для p65, рекрутирование которого, подобно STAT1, увеличивалось после обработки IFNα + LPS или IFNγ + LPS по сравнению с однократной стимуляцией LPS, но в гораздо большей степени (Рисунок 5B). Напротив, ChIP-PCR для p65 на хроматине, выделенном из необработанного, IFNα, IFNγ, LPS, IFNα + LPS, IFNγ + LPS-обработанный STAT1 KO VSMC, для всех генов приводил к отмене набора p65 после однократной обработки IFNα или IFNγ ( Рисунок 5C).Более того, связывание p65 оставалось неизменным после комбинированного лечения IFNα + LPS или IFNγ + LPS по сравнению с одним LPS (рис. 5C).

Вместе эти наблюдения могут указывать на STAT1-зависимую роль в соседнем рекрутировании p65 при однократном воздействии IFNα или IFNγ через близкорасположенные сайты связывания GAS и NFκB или ISRE и NFκB в промоторах генов SI. Что еще более важно, это совместное связывание STAT1-p65 значительно увеличивалось при последующем воздействии LPS и приводило к усилению транскрипционной активности.

Индуцированная IFNα + LPS и IFNγ + LPS SI коррелирует с активными гистоновыми метками и повышенным рекрутированием PolII в зависимом способе совместного связывания STAT1-p65

Чтобы понять более подробно эпигенетические изменения, которые совпадают с совместным связыванием STAT1 и p65, мы исследовали установление активных гистоновых меток на промоторах режима «совместного связывания» Cxcl10 и Gbp7 . Мы наблюдали повышенное обогащение h4K27Ac на этих промоторах в ответ на IFNα, IFNγ и LPS, которое дополнительно увеличивалось после обработки IFNα + LPS и IFNγ + LPS (рис. 6A).Как и ожидалось, паттерн связывания отрицательной метки h4K27me3 был противоположен таковому для h4K27Ac при различных условиях обработки (фиг. 6A). Это может указывать на то, что эти гены обладают пермиссивной конформацией хроматина, на которую положительно влияет стимуляция IFNα + LPS и IFNγ + LPS. Чтобы обратиться к механизму увеличения транскрипции после совместного связывания STAT1 и p65, мы также проанализировали рекрутирование PolII. Как показано на Фигуре 6A, ассоциация PolII с промоторами Cxcl10 и Gbp7 отражала ассоциацию метки h4K27Ac и указала на совместное связывание STAT1-p65, зависимое от ацетилирования гистонов и транскрипционной активности IFNα + LPS и IFNγ. + Лечение ЛПС.

Рисунок 6 . Изменения модификации PolII и гистонов при стимуляции IFNs и LPS на промоторах STAT1 и p65 представителей «совместного связывания» и «одиночного» режима. (A) ChIP-PCR h4K27Ac, ​​h4K27me3 и PolII на промоторах гена Cxcl10 и Gbp7 (праймеры перечислены в таблице S2) в VSMC, обработанном IFNα (8 часов), IFNγ (8 часов), LPS (4 часа), IFNα (8 часов) + LPS (4 часа), IFNγ (8 часов) + LPS (4 часа). Среднее ± sem, n = 2. (B) ChIP-PCR STAT1 и p65 на промоторах гена Irf7 и Saa1 (праймеры перечислены в таблице S2) в VSMC, обработанном IFNα (8 ч), IFNγ (8 часов), LPS (4 часа), IFNα (8 часов) + LPS (4 часа), IFNγ (8 часов) + LPS (4 часа).Среднее ± sem, n = 2. (C) ChIP-PCR h4K27Ac, ​​h4K27me3 и PolII на промоторах гена Irf7 и Saa1 (праймеры перечислены в таблице S2) в VSMC, обработанном IFNα (8 ч. ), IFNγ (8 часов), LPS (4 часа), IFNα (8 часов) + LPS (4 часа), IFNγ (8 часов) + LPS (4 часа). Среднее ± стандартное отклонение, n = 2.

Чтобы еще раз доказать это, мы проанализировали паттерн обогащения этих двух гистоновых меток и PolII на промоторах генов «одиночного» режима связывания Irf7 (только STAT1) и Saa1 (только NFκB) (рисунки 4D, 6B). .Действительно, связывание h4K27Ac и PolII с промотором Irf7 показало усиление после обработки IFNα, IFNγ и LPS. Обратное было верно для связывания h4K27me3 (рис. 6C), тогда как паттерны связывания для h4K27Ac, ​​h4K27me3 и PolII существенно не изменились после индукции IFNα + LPS или IFNγ + LPS (рис. 6C). Это соответствовало только связыванию STAT1 и отсутствию NFκB (Фигуры 4D, 6B) и отсутствию SI на транскрипционной активности (Фиг.4C). Для промотора Saa1 ассоциация h4K27Ac не зависела от обработки IFNα или IFNγ, но увеличивалась в аналогичной степени после стимуляции LPS, IFNα + LPS и IFNγ + LPS (фиг.6C).Это совпадало со связыванием только NFκB и отсутствием STAT1 (фиг. 4D, 6B). Подобный, но только маргинальный LPS-опосредованный эффект на отмену связывания h4K27me3 может наблюдаться для промотора Saa1 (фиг. 6C). Рекрутирование PolII на промотор Saa1 демонстрирует такой же LPS-зависимый паттерн, что и h4K27Ac, ​​хотя небольшое увеличение наблюдалось в ответ на IFNγ + LPS. Это коррелировало с транскрипционной активностью Saa1 , которая существенно повышалась при стимуляции IFNα + LPS и IFNγ + LPS по сравнению с одиночными стимулами (фиг. 4C).

Наши результаты предполагают, что STAT1 и p65 связываются с ДНК независимо, но последовательно, под управлением IFN-I или IFN-II с последующей стимуляцией LPS. Таким образом, стимуляция IFN приводит к устойчивому рекрутированию STAT1 в мотивы ISRE и / или GAS в промоторах генов и потенциально вводит модификации хроматина для увеличения связывания NFκB с близко расположенными сайтами и усиления транскрипции.

Обсуждение

Избыточные иммунные и воспалительные реакции, передаваемые иммунными и сосудистыми клетками, способствуют локальному воспалению и дисфункции сосудов с последующим образованием атеросклеротических бляшек в интиме артериальной стенки.Индуцированный праймингом SI IFN-II и, возможно, IFN-I, с TLR4 — обычное явление для взаимодействующих с атеромой иммунных клеток, которое модулирует важные аспекты воспаления, при этом STAT1 и NFκB являются центральными медиаторами. Таким образом, предварительная обработка IFN («праймирование») с последующей стимуляцией LPS приводит к усилению транскрипционных ответов по сравнению с индивидуальными стимулами. Чтобы охарактеризовать механизм индуцированного примированием IFNα + LPS- и IFNγ + LPS-зависимого SI в сосудистых клетках по сравнению с иммунными клетками, мы выполнили комплексный полногеномный анализ мышиного VSMC, MΦ и DC в ответ на IFNα, IFNγ. , и / или LPS.В частности, мы стремились обеспечить понимание механизма совместного связывания комплексов STAT1 с NFκB с сайтами связывания ISRE / NFκB и / или GAS / NFκB в отношении транскрипции и того, как это участвует в перекрытии IFN-I / LPS и IFN- II / LPS активировал SI в VSMC.

Во-первых, мы сравнили профили экспрессии генов различных типов клеток, подверженных индивидуальным или комбинированным стимулам, чтобы идентифицировать обычно активируемые гены в результате взаимодействия между IFNα и LPS или между IFNγ и LPS.Как правило, для всех трех типов клеток комбинированная обработка IFNα + LPS или IFNγ + LPS приводила к синергетическому увеличению экспрессии генов по сравнению с отдельными обработками, указывая на общий эффект SI, опосредованный различными IFN (рис. 1). В соответствии с аналогичным эффектом SI, опосредованного различными IFN и LPS, мы наблюдали> 64% перекрытия между обычно активируемыми генами в ответ на IFNα + LPS и IFNγ + LPS. Анализ GO выявил функциональное перекрытие этих генов, связанное со стрессом, иммунным и воспалительным ответом, ответом на цитокин, регуляцией клеточной пролиферации и миграции, регуляцией клеточной адгезии и хемотаксиса, гибелью клеток и апоптотическим процессом, ответом на липиды и метаболическим процессом ROS. все они отражают провоспалительные и проатерогенные биологические функции (рис. 1).Вместе это может быть отражением частичного перекрытия в активации комплексов факторов транскрипции и регуляции экспрессии целевого гена с помощью IFN-I и IFN-II, что приводит к выполнению общих биологических ответов клеточного типа. Последующий промоторный анализ этих генов действительно предсказал присутствие либо отдельных сайтов GAS, либо, скорее, комбинаций потенциальных связывающих мотивов GAS-ISRE, GAS-NFκB или GAS-ISRE-NFκB с аналогичным распределением сайтов связывания между IFNα + LPS и IFNγ +. Условия обработки ЛПС (рисунок 1).В целом, в этих условиях мотивы ISRE соответствуют связыванию STAT1 и STAT2 (в форме ISGF3) и, возможно, различных IRF (IRF1, IRF7, IRF8, IRF9), мотивы GAS — связыванию STAT1, а мотивы NFκB — связыванию p65. и p50. Ранее мы обнаружили, что промоторы генов, на которые влияет SI между IFNγ и LPS, таких как Cxcl9, Cxcl10 и Nos2 , которые также присутствуют среди наиболее экспрессируемых общих генов в текущем исследовании, содержат STAT-NFκB и Модули IRF-NFκB или комбинации отдельных сайтов связывания ISRE, GAS или NFκB (20, 41).Все вместе это предполагает, что общий механизм SI участвует во взаимодействии между IFNα и LPS или IFNγ и LPS в VSMC, MΦ и DC. В совокупности это свидетельствует о том, что хотя VSMC, MΦ и DC выполняют специфические для клеточного типа функции в здоровом сосуде, стимуляция провоспалительными стимулами приводит к активации общего механизма SI во взаимодействии между IFNα и LPS или IFNγ и LPS.

Чтобы понять этот механизм SI более подробно, мы охарактеризовали связывание STAT1 и NFκB (p65) по всему геному с генами, обычно активируемыми IFNα + LPS- и IFNγ + LPS.Используя ChIP-seq на хроматине из VSMC, были идентифицированы связанные с STAT1 и p65 гены IFNα + LPS и IFNγ + LPS, содержащие мотивы связывания GAS, ISRE или NFκB, расположенные в промоторных областях, а также в вышестоящих и нижних областях генома. . Очевидно, что взаимодействие между IFNα + LPS и IFNγ + LPS увеличивало количество сайтов связывания STAT1 и p65 по всему геному (по сравнению с отдельными обработками), что коррелировало с наблюдаемым эффектом SI на транскрипцию в этих условиях (данные не показаны).Подавляющее большинство событий связывания STAT1 и p65 локализовано вне промоторов генов (рис. 2). Это коррелирует с общим представлением об охвате генома отдельными факторами транскрипции, которые регулируют экспрессию генов посредством интегрированного действия проксимальных и дистальных цис -регуляторных элементов [обзор в (42)], причем последние функционально связаны с типом клеток специфическая экспрессия гена (43). Это распределение сайтов связывания совпало с другими исследованиями. Например, в клетках HeLa S3, стимулированных IFNγ, Satoh et al.предоставили доказательства присутствия STAT1-связывающих мотивов GAS в интронных областях (44), в то время как другие наблюдали, что ~ 50% всех сайтов связывания, занимаемых STAT1, были внутригенными и 25% межгенными (45). Подобные наблюдения были зарегистрированы для NFκB. Как показано для обработанных LPS клеток THP1, значительная часть сайтов связывания NFκB в масштабе всего генома расположена в проксимальных областях промотора выше по течению (26%), тогда как еще большая доля сайтов связывания p65, как было обнаружено, находится внутри интронов (38% ) (46).С другой стороны, в клетках HeLa, обработанных TNFα, анализ локализации показал, что сайты связывания p65 в основном являются внутригенными (46%) и только 7% расположены в промоторах, что согласуется с предыдущими исследованиями (47). Функция большинства дистальных участков связывания STAT1 и p65 остается в значительной степени неизвестной. Тем не менее, он предсказывает наличие общего регуляторного механизма регуляции транскрипции ISG.

Сосредоточившись на связывающих мотивах в промоторах генов, мы смогли различить различные способы связывания STAT1 и p65, включая «одиночный» (связывание STAT1 с GAS и / или ISRE; p65 с NFκB) или «совместное связывание» (связывание STAT1 с GAS и / или или ISRE + p65 к NFκB) (рисунок 2).Сравнение различных режимов связывания между IFNα + LPS и IFNγ + LPS-индуцированными состояниями выявило существенное перекрытие для NFκB-only (15,9%), GAS-only (13%) и ISRE-only (29,4%), содержащих гены из одиночный режим. Аналогичным образом, это перекрытие можно было наблюдать для генов GAS-ISRE (32,7%), GAS-NFκB (11,1%), ISRE-NFκB (21,6%) и GAS-ISRE-NFκB (29,6%) из режима совместного связывания. Более подробное сравнение IFNα + LPS и IFNγ + LPS, обычно активируемых ISRE-содержащих генов, выявило связывание STAT1 с этими сайтами ISRE в ответ на IFNα и, неожиданно, на IFNγ (рис. 2).Что еще более важно, это связывание ДНК STAT1 четко соответствует транскрипционной активности в VSMC, а также в MΦ и DC. Среди этих генов было много классических ISRE-содержащих генов, в том числе Ifit1, Mx2, Oas2, Irf7 и Cxcl10 , которые были очень чувствительны к IFNα и, в меньшей степени, к IFNγ (рис. 3A). Все пять генов очень чувствительны к IFNα и, в меньшей степени, к IFNγ, при этом на Ifit1, Mx2 и Cxcl10 оказывает влияние SI после комбинированного лечения IFNα + LPS и IFNγ + LPS (рис. 3A).Это коррелировало с небольшим увеличением фосфорилирования STAT1 и STAT2 в ответ на оба стимула по сравнению с индивидуальными (рис. 3B). Одновременное привлечение pSTAT1, pSTAT2 и IRF9 после обработки IFNα и IFNγ явно согласуется с участием ISGF3 в регуляции транскрипции этих ISRE-содержащих генов в ответ на оба типа IFN. Паттерн экспрессии этих генов точно отражал паттерн связывания pSTAT2 и IRF9 и отражал уровень фосфорилирования STAT2 и экспрессию IRF9, будучи выше после обработки IFNα, чем после обработки IFNγ.

В подтверждение прямой роли STAT2 в ответе IFNγ, его фосфорилирование тирозина было зарегистрировано в исследовании с использованием обработанных IFNγ первичных эмбриональных фибробластов мыши дикого типа, которые вызывали образование ISGF3 (8). Это согласуется с наблюдениями, сделанными в той же группе, в которой у мышей, лишенных IRF9, нарушается не только их IFN-ответ типа I, но также и их IFNγ-индуцированная ISRE-зависимая экспрессия гена (48). Аналогичные наблюдения были сделаны другими в отношении MEF, в которых фосфорилирование STAT2 было важным для противовирусной активности IFNγ (49).Вместе это выявило существование ISGF3-зависимого механизма, с помощью которого IFN-I и IFN-II могут обычно вызывать противовирусную активность.

Противоположный паттерн связывания pSTAT1 (более высокий после обработки IFNγ, чем после IFNα; фиг. 3) по сравнению с pSTAT2 и IRF9, предполагает участие STAT1 в дополнительном ISRE-связывающем комплексе в клетках, обработанных IFNγ. Основываясь на высоких уровнях фосфорилирования STAT1 и повышенной экспрессии IRF9 в этих условиях, мы предполагаем, что этот комплекс состоит из гомодимеров STAT1 вместе с IRF9.Первые доказательства STAT1- и IRF9-зависимой и STAT2-независимой транскрипционной регуляции экспрессии IFNγ-индуцированного гена были зарегистрированы для Ifit2 , классического регулируемого ISRE гена (39) и CXCL10 (50). Совсем недавно роль STAT1 / IRF9 в регуляции последнего гена была изучена в контексте модели колита у мышей. Молекулярный анализ MΦ подтвердил, что комплексы STAT1 / IRF9 образуются в ответ на IFNγ и связываются с последовательностями ISRE энхансерных областей 1 и 2 промотора гена Cxcl10 (9).В том же исследовании авторы наблюдали, что экспрессия IRF7 и DDX58, двух других известных ISRE-содержащих генов, зависела от STAT1 и IRF9, а также от STAT2 для их ответа на IFNγ, указывая на роль ISGF3 вместо STAT1 / IRF9. . Таким образом, они предположили, что промоторы, содержащие ISRE, могут потенциально выбирать комплексы STAT1 / IRF9 с субъединицей STAT2 или без нее для клеточного ответа на IFNγ. Однако в VSMC, который мы используем в нашем исследовании, мы не можем предоставить прямых доказательств роли комплекса STAT1 / IRF9 в IFNγ-опосредованных ответах в дополнение к ISGF3.Для подтверждения этого предположения потребуются дальнейшие эксперименты с VSMC на мышах STAT2 и IRF9 KO. Интересно, что IRF1 также рекрутировался в эти ISRE-содержащие гены после стимуляции IFNγ, но лишь слабо после обработки IFNα (рис. 3). Поскольку в этих условиях не может быть обнаружено взаимодействия между STAT1 и IRF1 (Figure 3), можно предположить STAT1-независимую роль IRF1 в регуляции транскрипции селективной группы ISRE-содержащих генов. Это контрастировало с прямым взаимодействием между нефосфорилированным STAT1 и IRF1, которое было обнаружено в клетках U3A, сверхэкспрессирующих мутант тирозина 701 STAT1, и предполагалось, что оно опосредует конститутивную экспрессию гена LMP2 (51).

Наши результаты согласуются с существованием более общего механизма в первичных VSMC мышей, в котором ISGF3 и, возможно, STAT1 / IRF9 регулируют экспрессию IFNγ-чувствительных ISRE-содержащих генов. Вместе с гомодимерами STAT1, связывающими GAS, это обеспечивает дополнительный поворот канонического пути передачи сигналов IFNγ, который может объяснить некоторые перекрывающиеся ответы на IFNα и IFNy в этих клетках (рис. 7). Основываясь на перекрывающихся паттернах экспрессии этих генов в VSMC, MΦ и DC и вышеописанных находках в MΦ, есть соблазн предположить, что IFNα-ответ ISRE-содержащих генов во всех трех типах клеток в основном управляется ISGF3.Напротив, их ответ IFNγ опосредуется ISGF3 и, возможно, STAT1 / IRF9 (рис. 7). В последнем случае можно предусмотреть механизм конкуренции или избирательного связывания, в зависимости от последовательности ISRE.

Рисунок 7 . Модель, описывающая регуляцию транскрипции сигнальных интегрированных генов посредством STAT1-опосредованного предшествования p65 и PolII ацетилированным сайтам GAS / NFκB или ISRE / NFκB. 1-я волна стимуляции: после первоначального воздействия на клетки IFNα или IFNγ рецепторы димеризуются и способствуют трансфосфорилированию связанных с рецептором киназ JAK1 / TYK2 для IFNα и киназ JAK1 / JAK2 для IFNγ.Следующие белки STAT рекрутируются, фосфорилируются и димеризуются либо в форме комплекса ISGF3 (STAT1-STAT2 вместе с IRF9), GAF (гомодимеры STAT1) или комплекса STAT1 / IRF9. Активированные факторы транскрипции обеспечивают платформу для 2-й волны стимуляции: LPS стимулирует рецептор TLR4, связанный с адапторными молекулами MyD88 и TRAM, и активирует NFκB, а также транскрипционные комплексы, содержащие STAT1. Стимуляция IFNα приводит к привлечению ISGF3 к сайтам ISRE и GAF к сайтам GAS, присутствующим в промоторах ISG.IFNγ инициирует связывание GAF с сайтами GAS, а также ISGF3 и, возможно, STAT1 / IRF9 с элементами ISRE. Первоначальное связывание STAT1-содержащих комплексов с последующим связыванием гетеродимеров p65-p50 (показано фиолетовой изогнутой стрелкой) с сайтами NFκB, близко расположенными к сайтам ISRE и GAS (~ 200 п.н.), вместе приводит к обогащению ацетилированием гистонов и привлечению PolII к ISG промоутеры. Подробное объяснение см. В тексте.

Для дальнейшего понимания механизма кооперативного участия STAT1 с NFκB в SI, опосредованного взаимодействием IFNα и LPS или IFNγ и LPS, мы затем сосредоточились на перекрытии режимов совместного связывания STAT1-p65.Поэтому мы проанализировали более подробно паттерны связывания STAT1 и p65 в 170 IFNα + LPS и 211 IFNγ + LPS генах, на которые обычно влияет SI в трех типах клеток (рис. 4). Поразительно, что для большинства этих генов пики связывания STAT1 и p65 были близко выровнены в промоторах совместно связанных генов, что в дальнейшем коррелировало с близостью GAS и NFκB (41–234 п.н.) или ISRE и NFκB (38–264 п.н. ) сайты связывания (рис. 4). Такое распределение сайтов тесного связывания может быть предпосылкой для эффективного сотрудничества STAT1 и p65.Сходная организация близко расположенных сайтов ISRE и NFκB, в пределах близости ~ 50 п.н., была описана для совместной оккупации IRF3 и NFκB, чтобы контролировать активацию генов, индуцированную вирусом Сендай (52). Также в клетках, обработанных IFNγ, в полногеномных исследованиях совместное связывание STAT1 и IRF1 происходило в близко расположенных сайтах GAS и ISRE (6, 53).

Индуцированное стимулами связывание двух разных факторов транскрипции с близко расположенными мотивами ДНК может предполагать возникновение прямых белок-белковых взаимодействий, которые, если превышают> 20 п.н., должны будут включать образование петель ДНК (54).Действительно, в нескольких исследованиях было показано, что STAT1 и NFκB напрямую взаимодействуют (55, 56). С другой стороны, хотя сообщалось, что комбинированное действие STAT1 и NFκB является решающим для регуляции экспрессии генов Cxcl9, IP-10, Becn1 и NOS2, прямого межбелкового взаимодействия этих факторов транскрипции не наблюдалось (40, 57 –59). Аналогичным образом, при проведении экспериментов по совместному IP на экстрактах белков, выделенных из VSMC, обработанных IFNα + LPS и IFNγ + LPS, мы не смогли обнаружить прямого взаимодействия между STAT1 и белком p65 (данные не показаны).Дальнейшее изучение режимов совместного связывания STAT1-p65 раскрыло участие STAT1-зависимой роли в близлежащем рекрутировании p65 через близко расположенные сайты связывания GAS-NFκB или ISRE-NFκB. IFNγ и, в меньшей степени, IFNα индуцировали связывание STAT1 с промоторами гена, содержащими GAS-NFκB ( Serpina3i, Steap4, Irf1 ), ISRE-NFκB ( Ccl5, Ifit1, Gbp6 ) или GAS-ISRE-NFκB ( Cxcl10 , Gbp7 ) мотивы. Гораздо более слабое рекрутирование STAT1 было также обнаружено при стимуляции LPS, что коррелировало с тем фактом, что активация транскрипции генов SI в этих условиях в первую очередь вызывается IFN (Таблицы 1A, B; Фигуры 4, 5).Интересно, что привлечение STAT1 к этим разным генам совпало со связыванием p65 уже после обработки IFNα или IFNγ. Это повышенное связывание p65 после однократной обработки IFNα или IFNγ не могло быть обнаружено в генах с отдельными последовательностями связывания NFκB (рис. 4). Что еще более важно, последующее воздействие LPS привело к усилению совместного связывания STAT1-p65, в основном за счет усиленного рекрутирования p65, которое коррелировало с ацетилированием гистонов, рекрутированием PolII и амплифицированной транскрипцией целевого гена в зависимости от совместного связывания STAT1-p65.В целом, связывание STAT1 и p65 после IFNγ и IFNγ + LPS было сильнее, чем после IFNα и IFNα + LPS (рис. 5). Тот факт, что мы не смогли обнаружить прямое белок-белковое взаимодействие STAT1-p65 при изученных условиях лечения в VSMC (данные не показаны), мы постулируем, что STAT1 и p65 связываются с ДНК независимо, но последовательным образом под управлением IFN- I или IFN-II с последующей стимуляцией LPS. Таким образом, стимуляция IFN приводит к устойчивому привлечению STAT1 к мотивам ISRE и / или GAS в промоторах генов и потенциально вносит модификации хроматина для увеличения связывания NFκB с близко расположенными сайтами.

Совместное связывание STAT1 и NFκB было изучено в контексте бактериальной инфекции. Например, было показано, что последовательный и кооперативный вклад NFκB, предшествующего ISGF3, без прямого белок-белкового взаимодействия, участвует в индукции транскрипции генов Nos2 и Il-6 в MΦ, инфицированном внутриклеточным бактериальным патогеном Listeria. monocytogenes . В этом контексте NFκB действовал как основной сигнал, стимулируемый TLR4, который вводил эпигенетические метки для производства благоприятного для транскрипции хроматина и усиливал последующее рекрутирование ISGF3 в качестве основного сигнала от последующей продукции и действия IFNβ.Это совместное связывание NFκB с последующим ISGF3 в комбинации с PolII было предпосылкой для продуктивного удлинения мРНК Nos2 и Il-6 (13, 60). Аналогичным образом Wort et al. наблюдали, что комбинированная стимуляция первичных клеток HPASM с помощью TNFα и IFNγ коррелировала как с повышенным ацетилированием гистона h5 в различных сайтах NFκB, так и с привлечением PolII в промоторную область PreproET-1 (61). Другие показали, что в фагоцитах, обработанных IL-10 и LPS, STAT3 способствует привлечению NFκB к промотору гена IL-1ra из-за его повышенного ацетилирования (62).Более полное исследование совместного связывания IRF3 и NFκB в масштабе всего генома выявило механизм индуцированной вирусом активации транскрипции, при котором IRF3 был способен организовать промотор-специфическое рекрутирование PolII и NFκB, что обеспечивало способность стимулировать его эффективное и процессивное удлинение ( 52). С другой стороны, Giorgetti et al. продемонстрировали способность p65 аддитивно рекрутировать PolII на несколько сайтов κB, содержащих промоторы генов, что приводит к повышенной активации транскрипции генов (63). В случае праймирования IFNγ был описан механизм синергии, посредством которого IFNγ создавал примированную среду хроматина, которая поддерживала занятость STAT1, IRF1 и связанное ацетилирование гистонов в предварительно выбранных генах-мишенях.Это значительно увеличило и продлило рекрутирование последующих TLR4-индуцированных факторов транскрипции, включая NFκB и PolII, в промоторы и энхансеры генов (64).

На основе этих моделей наши результаты предсказывают следующий механизм совместного связывания STAT1-NFκB, участвующего в SI IFN-I и IFN-II с TLR4 в VSMC, MΦ и DC (Рисунок 7). На первом этапе активированный IFN-I STAT1 рекрутируется в близко расположенные сайты связывания ISRE-NFκB или GAS-NFκB в форме ISGF3 или GAF, соответственно.Точно так же IFNγ стимулирует связывание STAT1-комплексов ISGF3 (и, возможно, STAT1 / IRF9) и GAF с этими соответствующими сайтами. Эта первая волна связывания STAT1 вводит модификации хроматина и инициирует последующее рекрутирование p65-p50 в соседние (~ 200 п.н.) сайты NFκB в ответ на IFNγ и в меньшей степени после обработки IFNα, что коррелирует с активностью связывания STAT1 и уровнями транскрипции. Второй этап, который опосредуется последующей стимуляцией LPS, увеличивает совместное связывание STAT1-p65 с этими разными составными сайтами и в основном управляется усиленным образованием и привлечением димера p65-p50.Это совпадает с ацетилированием гистонов, привлечением PolII и усиленной транскрипцией генов, активируемых IFNα + LPS и IFNγ + LPS, которые в целом сильнее после IFNγ + LPS, чем после IFNα + LPS (Рисунок 7). В случае генов, несущих составные сайты GAS-ISRE-NFκB, вероятно, задействованы аналогичные, но более сложные механизмы канонических и неканонических комплексов STAT1 в ответ на IFN-I или IFN-II в сочетании с LPS-активированным NFκB.

Таким образом, комплексы факторов транскрипции, активируемые IFN-I или IFN-II вместе с LPS, включая гетеродимеры GAF, ISGF3, STAT1 / IRF9 и p65-p50, обеспечивают платформу для надежной транскрипционной активации провоспалительных генов.Более того, наша модель впервые предлагает объяснение сравнимых эффектов примирования IFNα или IFNγ на TLR4-индуцированную активацию в сосудистых и иммунных клетках, что коррелирует с важной ролью обоих типов IFN в сосудистом воспалении и прогрессировании атеросклероза. Однако мы понимаем, что это всего лишь прогностическая модель, и мы не можем исключить участие других STAT1-содержащих комплексов транскрипционных факторов или IRF. Более того, необходимы дальнейшие исследования, чтобы получить представление о механизме STAT1-зависимого рекрутирования NFκB и последующей регуляции транскрипции при SI, участвующих в ген-специфических сценариях.

Авторские взносы

AP-B проводил ChIP-seq, ChIP-PCR, Western blot и Co-IP эксперименты, анализ RNA-seq / ChIP-seq ниже по потоку in silico и участвовал в разработке концепции, написании, подготовке рисунков и таблиц и редактировании. рукопись. LS и AC выполнили анализ in silico ChIP-seq. H-CC выделила РНК из DC для дальнейшего эксперимента по РНК-seq и провела проверку RT-PCR. C-KL и LN участвовали в разработке концепции, связанной с экспериментами DC и MΦ.JW критически оценил рукопись. HB разработал концепцию исследования и участвовал в интерпретации данных, написании и редактировании рукописи, а также координировал вклад всех соавторов.

Финансирование

Работа поддержана Польским национальным научным центром [UMO2015 / 17 / B / NZ2 / 00967, UMO2016 / 23 / B / NZ2 / 00623]; Центр исследования РНК KNOW [01 / KNOW2 / 2014]; и Вышеградский фонд [21280006]; и NR-NET ITN PITN-GA-2013-606806 из программы EU-FP7 PEOPLE-2013.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим Томаса Декера за мышей STAT1 KO и Адама Олейника за подготовку библиотек RNA-seq.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2019.01253/full#supplementary-material

Сокращения

ChIP, Иммунопреципитация хроматина; Co-IP, Коиммунопреципитация; DC, дендритные клетки; ЭК — эндотелиальные клетки; GAF, γ-активированный фактор; GO, генная онтология; IFN, интерферон; IRF, фактор регуляции интерферона; ISG, IFN-стимулированный ген; ISGF3, фактор 3 гена, стимулированного интерфероном; ISRE, элемент ответа, стимулированный интерфероном; JAK, киназа Януса; ЛПС, липополисахарид; МФ — макрофаги; NFκB, ядерный фактор-κB; PolII, РНК-полимераза II; ROS, активные формы кислорода; SI, интеграция сигналов; STAT, преобразователь сигналов и активатор транскрипции; TNF, фактор некроза опухоли; TLR, Toll-подобный рецептор; VSMC, гладкомышечные клетки сосудов.

Список литературы

1. Дзау В.Дж., Браун-Дуллей Р.С., Седдинг Д.Г. Сосудистая пролиферация и атеросклероз: новые перспективы и терапевтические стратегии. Nat Med. (2002) 8: 1249–56. DOI: 10,1038 / нм1102-1249

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

2. Whitman SC, Ravisankar P, Elam H, Daugherty A. Экзогенный гамма-интерферон усиливает атеросклероз у мышей с аполипопротеином E — / -. Am J Pathol. (2000) 157: 1819–24.DOI: 10.1016 / S0002-9440 (10) 64820-1

CrossRef Полный текст | Google Scholar

3. Такер С.Г., Чжао В., Смит К.К., Ло В., Ван Х., Вивеканандан-Гири А. и др. Интерфероны типа I модулируют функцию сосудов, репарацию, тромбоз и развитие бляшек на мышиных моделях волчанки и атеросклероза. Arthritis Rheum. (2012) 64: 2975–85. DOI: 10.1002 / art.34504

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

4. Лу З., Чжан Х, Ли И, Цзинь Дж, Хуан Ю.Антагонист TLR4 снижает атеросклероз на ранней стадии у мышей с диабетом с дефицитом аполипопротеина E. J Endocrinol. (2013) 216: 61–71. DOI: 10.1530 / JOE-12-0338

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5. Blaszczyk K, Nowicka H, ​​Kostyrko K, Antonczyk A, Wesoly J, Bluyssen HA. Уникальная роль STAT2 в конститутивной и индуцированной IFN транскрипции и противовирусных ответах. Cytokine Growth Factor Rev. (2016) 29: 71–81. DOI: 10.1016 / j.cytogfr.2016.02.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Михальска А., Блащик К., Весоли Дж., Блуиссен HAR. Схема усилителя положительной обратной связи, которая регулирует экспрессию генов, стимулированную интерфероном (IFN), и контролирует ответы IFN типа I и типа II. Front Immunol. (2018) 9: 1135. DOI: 10.3389 / fimmu.2018.01135

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст

7. Блюссен А.Р., Дурбин Дж. Э., Леви Д. ISGF3 гамма p48, переключатель специфичности для факторов транскрипции, активируемых интерфероном. Cytokine Growth Factor Rev. (1996) 7: 11-7. DOI: 10.1016 / 1359-6101 (96) 00005-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8. Мацумото М., Танака Н., Харада Х., Кимура Т., Йокочи Т., Китагава М. и др. Активация фактора транскрипции ISGF3 гамма-интерфероном. Biol Chem. (1999) 380: 699–703. DOI: 10.1515 / BC.1999.087

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. Rauch I, Rosebrock F, Hainzl E, Heider S, Majoros A, Wienerroither S и др.Неканонические эффекты IRF9 при воспалении кишечника: больше, чем у интерферонов типа I и типа III. Mol Cell Biol. (2015) 35: 2332–43. DOI: 10.1128 / MCB.01498-14

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

13. Фарлик М., Ройттерер Б., Шиндлер С., Гретен Ф., Фогл С., Мюллер М. и др. Нетрадиционная сборка комплекса инициации с помощью факторов транскрипции STAT и NF-kappaB регулирует экспрессию синтазы оксида азота. Иммунитет. (2010) 33: 25–34.DOI: 10.1016 / j.immuni.2010.07.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14. Proost P, Verpoest S, Van de Borne K, Schutyser E, Struyf S, Put W. и др. Синергетическая индукция CXCL9 и CXCL11 лигандами Toll-подобных рецепторов и гамма-интерфероном в фибробластах коррелирует с повышенными уровнями лигандов CXCR3 в синовиальных жидкостях септического артрита. J Leukoc Biol. (2004) 75: 777–84. DOI: 10.1189 / jlb.1003524

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15.Tamassia N, Calzetti F, Ear T, Cloutier A, Gasperini S, Bazzoni F, et al. Молекулярные механизмы, лежащие в основе синергической индукции CXCL10 LPS и IFN-гамма в нейтрофилах человека. Eur J Immunol. (2007) 37: 2627–34. DOI: 10.1002 / eji.200737340

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16. Шредер К., Свит MJ, Хьюм Д.А. Интеграция сигналов между сигнальными путями IFNgamma и TLR в макрофагах. Иммунобиология. (2006) 211: 511–24.DOI: 10.1016 / j.imbio.2006.05.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Ху Х, Чен Дж, Ван Л., Ивашков Л.Б. Перекрестные помехи между Jak-STAT, Toll-подобным рецептором и ITAM-зависимыми путями активации макрофагов. J Leukoc Biol. (2007) 82: 237–43. DOI: 10.1189 / jlb.1206763

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Ху Х, Чакраварты С.Д., Ивашков Л.Б. Регулирование передачи сигналов интерферона и Toll-подобных рецепторов во время активации макрофагов путем противодействия механизмам подавления с прямой связью и обратной связью. Immunol Rev. (2008) 226: 41–56. DOI: 10.1111 / j.1600-065X.2008.00707.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Ху Х, Ивашков Л.Б. Перекрестная регуляция сигнальных путей интерфероном-гамма: последствия для иммунных ответов и аутоиммунных заболеваний. Иммунитет. (2009) 31: 539–50. DOI: 10.1016 / j.immuni.2009.09.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Chmielewski S, Olejnik A., Sikorski K, Pelisek J, Blaszczyk K, Aoqui C, et al.STAT1-зависимая интеграция сигнала между IFNgamma и TLR4 в сосудистых клетках отражает проатерогенные ответы при атеросклерозе человека. PLoS ONE. (2014) 9: e113318. DOI: 10.1371 / journal.pone.0113318

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21. Meraz MA, White JM, Sheehan KC, Bach EA, Rodig SJ, Dighe AS, et al. Направленное нарушение гена Stat1 у мышей обнаруживает неожиданную физиологическую специфичность сигнального пути JAK-STAT. Cell. (1996) 84: 431–42. DOI: 10.1016 / S0092-8674 (00) 81288-X

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Дурбин Дж. Э., Хакенмиллер Р., Саймон М. С., Леви Д. Е.. Целенаправленное нарушение гена Stat1 мыши приводит к нарушению врожденного иммунитета к вирусным заболеваниям. Cell. (1996) 84: 443–50. DOI: 10.1016 / S0092-8674 (00) 81289-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Кобаяси М., Иноуэ К., Вараби Э., Минами Т., Кодама Т.Простой метод выделения эндотелиальных клеток аорты мыши. J Atheroscler Thromb. (2005) 12: 138–42. DOI: 10.5551 / jat.12.138

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Бариш Г.Д., Даунс М., Алайник В.А., Ю.Р.Т., Окампо С.Б., Буккаут А.Л. и др. Атлас ядерных рецепторов: активация макрофагов. Мол Эндокринол. (2005) 19: 2466–77. DOI: 10.1210 / me.2004-0529

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25.Лутц М.Б., Кукуч Н., Огилви А.Л., Росснер С., Кох Ф., Романи Н. и др. Усовершенствованный метод культивирования для получения больших количеств высокочистых дендритных клеток из костного мозга мыши. J Immunol Methods. (1999) 223: 77–92. DOI: 10.1016 / S0022-1759 (98) 00204-X

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26. Ми Х, Хуанг Х, Муругануджан А., Тан Х, Миллс С., Канг Д. и др. PANTHER версии 11: расширенные данные аннотаций из путей Gene Ontology и Reactome, а также усовершенствования инструмента анализа данных. Nucleic Acids Res. (2017) 45: D183–9. DOI: 10.1093 / nar / gkw1138

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Zambelli F, Pesole G, Pavesi G. Pscan: обнаружение избыточно представленных мотивов сайта связывания факторов транскрипции в последовательностях совместно регулируемых или совместно экспрессируемых генов. Nucleic Acids Res. (2009) 37: W247–52. DOI: 10.1093 / nar / gkp464

CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Виллемс Э., Лейнс Л., Вандесомпеле Дж.Стандартизация данных экспрессии генов ПЦР в реальном времени из независимых биологических повторов. Anal Biochem. (2008) 379: 127–9. DOI: 10.1016 / j.ab.2008.04.036

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Сирсбек М.С., Лофт А, Аагаард М.М., Нильсен Р., Шмидт С.Ф., Петрович Н. и др. Полногеномное профилирование гамма-рецепторов, активируемых пролифератором пероксисом, в первичных эпидидимальных, паховых и коричневых адипоцитах показывает, что депо-селективное связывание коррелирует с экспрессией генов. Mol Cell Biol. (2012) 32: 3452–63. DOI: 10.1128 / MCB.00526-12

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Hulsen T, de Vlieg J, Alkema W. BioVenn — веб-приложение для сравнения и визуализации биологических списков с использованием диаграмм Венна, пропорциональных площади. BMC Genomics. (2008) 9: 488. DOI: 10.1186 / 1471-2164-9-488

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

33. Хайнц С., Беннер С., Спанн Н., Бертолино Е., Лин Ю.К., Ласло П. и др.Простые комбинации факторов транскрипции, определяющих клонирование, активируют цис-регуляторные элементы, необходимые для идентичности макрофагов и В-клеток. Mol Cell. (2010) 38: 576–89. DOI: 10.1016 / j.molcel.2010.05.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

34. Thorvaldsdottir H, Robinson JT, Mesirov JP. Integrative Genomics Viewer (IGV): высокопроизводительная визуализация и исследование данных геномики. Краткая биография. (2013) 14: 178–92. DOI: 10.1093 / bib / bbs017

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36. Консорциум EP. Интегрированная энциклопедия элементов ДНК в геноме человека. Природа. (2012) 489: 57–74. DOI: 10.1038 / nature11247

CrossRef Полный текст | Google Scholar

39. Блуиссен Х.А., Музаффар Р., Флиестстра Р.Дж., ван дер Маде А.С., Леунг С., Старк Г.Р. и др. Комбинаторная ассоциация и обилие компонентов фактора 3 гена, стимулированного интерфероном, определяют селективность интерфероновых ответов. Proc Natl Acad Sci USA. (1995) 92: 5645–9. DOI: 10.1073 / pnas.92.12.5645

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

40. Ohmori Y, Hamilton TA. Совместное взаимодействие между элементом стимульного ответа интерферона (IFN) и мотивами последовательности каппа B контролирует транскрипцию, стимулированную гамма- и липополисахаридами IFN, с промотора IP-10 мыши. J Biol Chem. (1993) 268: 6677–88.

PubMed Аннотация | Google Scholar

41.Сикорски К., Весоли Дж., Блуиссен Х.А. Анализ данных транскриптомов атеросклеротических бляшек позволяет прогнозировать STAT1-зависимую интеграцию воспалительного сигнала при сосудистых заболеваниях. Int J Mol Sci. (2014) 15: 14313–31. DOI: 10.3390 / ijms150814313

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

44. Сато Дж., Табуноки Х. Исчерпывающий профиль генов-мишеней STAT1 на основе ChIP-Seq предполагает сложность механизмов регуляции генов, опосредованных STAT1. Джин Регул Syst Bio. (2013) 7: 41–56. DOI: 10.4137 / GRSB.S11433

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

45. Робертсон Г., Херст М., Бейнбридж М., Биленки М., Чжао Ю., Цзэн Т. и др. Полногеномные профили ассоциации ДНК STAT1 с использованием иммунопреципитации хроматина и массового параллельного секвенирования. Нат. Методы. (2007) 4: 651–7. DOI: 10.1038 / nmeth2068

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

46. Рао Н.А., МакКалман М.Т., Моулос П., Франкойс К.Дж., Чациоанну А., Колисис Ф.Н. и др.Коактивация GR и NFKB изменяет репертуар их сайтов связывания и генов-мишеней. Genome Res. (2011) 21: 1404–16. DOI: 10.1101 / gr.118042.110

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

47. Лим CA, Яо Ф., Вонг Дж. Дж., Джордж Дж., Сюй Х., Чиу К. П. и др. Полногеномное картирование связывания RELA (p65) идентифицирует E2F1 как активатор транскрипции, рекрутируемый NF-kappaB при активации TLR4. Mol Cell. (2007) 27: 622–35. DOI: 10.1016 / j.molcel.2007.06.038

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

48. Кимура Т., Кадокава И., Харада Х., Мацумото М., Сато М., Кашивадзаки Ю. и др. Существенные и неизбыточные роли p48 (ISGF3 гамма) и IRF-1 в ответах на интерферон как типа I, так и типа II, как показали исследования нацеливания на гены. Genes Cells. (1996) 1: 115–24. DOI: 10.1046 / j.1365-2443.1996.08008.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

49. Циммерманн А., Триллинг М., Вагнер М., Уилборн М., Бубич И., Йонджич С. и др.Цитомегаловирусный белок обнаруживает двойную роль STAT2 в передаче сигналов IFN- {gamma} и противовирусных ответах. J Exp Med. (2005) 201: 1543–53. DOI: 10.1084 / jem.20041401

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

50. Маджумдер С., Чжоу Л.З., Чатурведи П., Бэбкок Г., Арас С., Рансохофф Р.М. Комплексы, содержащие p48 / STAT-1альфа, играют преобладающую роль в индукции IFN-гамма-индуцируемого белка 10 кДа (IP-10) одним IFN-гамма или совместно с TNF-альфа. J Immunol. (1998) 161: 4736–44.

Google Scholar

51. Чаттерджи-Кишор М., Райт К.Л., Тинг Дж. П., Старк Г. Р.. Как Stat1 опосредует конститутивную экспрессию гена: комплекс нефосфорилированных Stat1 и IRF1 поддерживает транскрипцию гена LMP2. EMBO J. (2000) 19: 4111–22. DOI: 10.1093 / emboj / 19.15.4111

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

52. Фрини Дж. Э., Ким Р., Мандхана Р., Хорват С. М.. Обширное сотрудничество основных иммунных регуляторов IRF3 и NFkappaB в привлечении РНК Pol II и приостановке высвобождения при врожденной антивирусной транскрипции человека. Cell Rep. (2013) 4: 959–73. DOI: 10.1016 / j.celrep.2013.07.043

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

53. Абу Эль Хассан М., Хуанг К., Эсвара М.Б., Сюй З., Ю Т., Обри А. и др. Свойства энхансеров STAT1 и IRF1 и влияние SNP. BMC Mol Biol. (2017) 18: 6. DOI: 10.1186 / s12867-017-0084-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

54. Heinz S, Glass CK. Роли факторов транскрипции, определяющих клонирование, в установлении открытого хроматина: уроки высокопроизводительных исследований. Curr Top Microbiol Immunol. (2012) 356: 1–15. DOI: 10.1007 / 82_2011_142

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

55. Ганстер Р.В., Го З., Шао Л., Геллер Д.А. Дифференциальные эффекты TNF-альфа и IFN-гамма на транскрипцию генов, опосредованную взаимодействиями NF-kappaB-Stat1. J Interferon Cytokine Res. (2005) 25: 707–19. DOI: 10.1089 / jir.2005.25.707

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

57.Ганстер Р.В., Тейлор Б.С., Шао Л., Геллер Д.А. Комплексная регуляция транскрипции гена индуцибельной синтазы оксида азота с помощью Stat 1 и NF-kappa B. Proc Natl Acad Sci USA. (2001) 98: 8638–43. DOI: 10.1073 / pnas.151239498

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

58. Hiroi M, Ohmori Y. CREB-связывающий белок коактиватора транскрипции взаимодействует с STAT1 и NF-каппа B для синергической транскрипционной активации лиганда 9 / монокина CXC, индуцированной геном гамма-интерферона. J Biol Chem. (2003) 278: 651–60. DOI: 10.1074 / jbc.M204544200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

59. Zhu S, Cao L, Yu Y, Yang L, Yang M, Liu K и др. Ингибирование аутофагии усиливает противораковую активность IFN1 @ / IFNalpha в клетках хронического миелоидного лейкоза. Аутофагия. (2013) 9: 317–27. DOI: 10.4161 / auto.22923

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

60. Винерройтер С., Шукла П., Фарлик М., Майорос А., Стич Б., Фогл С. и др.Кооперативная транскрипционная активация антимикробных генов путями STAT и NF-kappaB путем согласованного набора медиаторного комплекса. Cell Rep. (2015) 12: 300–12. DOI: 10.1016 / j.celrep.2015.06.021

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

61. Wort SJ, Ito M, Chou PC, Mc Master SK, Badiger R, Jazrawi E, et al. Синергетическая индукция эндотелина-1 альфа-фактором некроза опухоли и гамма-интерфероном обусловлена ​​усилением связывания NF-kappaB и ацетилированием гистонов в специфических участках kappaB. J Biol Chem. (2009) 284: 24297–305. DOI: 10.1074 / jbc.M109.032524

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

62. Tamassia N, Castellucci M, Rossato M, Gasperini S, Bosisio D, Giacomelli M, et al. Выявление IL-10-зависимого рекрутирования NF-kappaB на промотор IL-1ra, которое нарушено у пациентов с функциональными дефектами STAT3. FASEB J. (2010) 24: 1365–75. DOI: 10.1096 / fj.09-145573

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

63.Джорджетти Л., Сиггерс Т., Тиана Дж., Капрара Дж., Нотарбартоло С., Корона Т. и др. Некооперативные взаимодействия между факторами транскрипции и кластерными сайтами связывания ДНК обеспечивают дифференцированный транскрипционный ответ на воздействие окружающей среды. Mol Cell. (2010) 37: 418–28. DOI: 10.1016 / j.molcel.2010.01.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

64. Рамзауэр К., Фарлик М., Зупковиц Г., Зайзер С., Крогер А., Хаузер Н. и др. Определенные способы действия, применяемые факторами транскрипции STAT1 и IRF1 для инициации транскрипции гена gbp2, индуцируемого IFN-гамма. Proc Natl Acad Sci USA. (2007) 104: 2849–54. DOI: 10.1073 / pnas.0610944104

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Белок, индуцируемый гамма-интерфероном 10

Белок, индуцируемый гамма-интерфероном 10

Интерферон-гамма-индуцибельный белок 10 кДа (IP-10), также классифицируемый как CXCL10, представляет собой хемокин, продуцируемый Т-клетками, моноцитами, эндотелиальными клетками и кератиноцитами после стимуляции IFN-γ. Хемокин является высокоиндуцируемым и принадлежит к подсемейству C-X-C или альфа хемокинов, функционирующих как важный хемоаттрактант для активированных Т-клеток, моноцитов и NK-клеток.

Экспрессия IP-10 наблюдается при многих воспалительных заболеваниях Th2-типа, при этом считается, что он играет важную роль в привлечении активированных Т-клеток к участкам воспаления. Хотя IP-10 был назван белком, индуцируемым IFN-γ, было также обнаружено, что другие агенты, включая LPS, IL-1α, IL-6, TNF-α, IFN-α и IFN-β, индуцируют экспрессию IP-10 in vitro. . Кроме того, мРНК IP-10 экспрессировалась у мышей с нокаутом IFN-γ, что подтверждает, что IFN-γ не является абсолютно необходимым для экспрессии гена IP-10 n vivo .

Рисунок Это структура IP-10, созданная с использованием данных из Protein Data Bank (PDB: 1o7z).

IP-10 структурно и функционально родственен хемокину MIG (монокину, индуцированному гамма-интерфероном), также называемому CXCL9, и IFN-индуцибельным альфа-хемоаттрактантом Т-клеток (I-TAC, CXCL11). Все три хемокина (индуцированные IFN-γ) направляют миграцию и стимулируют адгезию активированных Т-клеток и NK-клеток, активируя один и тот же рецептор: CXCR3, рецептор, связанный с G-белком.Экспериментальные данные показали, что IP-10, MIG и I-TAC проявляют уникальные паттерны экспрессии при нескольких кожных заболеваниях, включая псориаз, подтверждая концепцию, что все три хемокина обладают неизбыточными функциями in vivo . Несмотря на хорошо описанную функцию привлечения лейкоцитов к участкам воспаления, IP-10 также играет роль в образовании и функционировании эффекторных клеток. Например, IP-10 увеличивает высвобождение IFN-γ из Т-клеток после стимуляции антигенами окружающей среды, такими как антигены домашних кошачьих и пылевых клещей (которые обычно вызывают цитокиновые ответы у неаллергических субъектов).

Обнаружение IP-10 с помощью продуктов U-CyTech

Продукты ELISA

ELISA IP-10 человека
ELISA IP-10 обезьян Старого Света

JCI — Эндогенные внутрипеченочные ИФН и связь с исходом лечения ВГС без ИФН

ИСТОРИЯ. Вирус гепатита С (ВГС) поражает около 170 миллионов человек во всем мире и может привести к циррозу и гепатоцеллюлярной карциноме у хронически инфицированных людей. Лечение быстро переходит от терапии на основе IFN-α к схемам без IFN-α, которые состоят из противовирусных агентов прямого действия (DAA), которые демонстрируют улучшенную эффективность и переносимость в клинических испытаниях.Вирусологический рецидив после терапии ПППД — частая причина неэффективности лечения; однако неясно, почему возникает рецидив или некоторые люди более склонны к рецидивирующей виремии.

МЕТОДЫ. Мы провели клиническое испытание с использованием DAA софосбувир плюс рибавирин (SOF / RBV) и выполнили подробный анализ экспрессии мРНК в печени и периферической крови у пациентов, которые достигли устойчивого вирусологического ответа (SVR) или имели рецидив.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Клиренс вируса во время лечения сопровождался быстрым снижением уровня IFN-стимулированных генов (ISG) в печени и крови, независимо от результата лечения.Анализ парных биопсий печени до и после лечения (EOT) у пациентов с УВО показал, что вирусный клиренс сопровождался снижением экспрессии IFN типа II и III, но неожиданно увеличивал экспрессию IFN IFNA2 типа I. Экспрессия мРНК ISG была выше в биоптатах печени EOT пациентов, достигших УВО, чем у пациентов, у которых позже возник рецидив.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Эти результаты предполагают, что восстановление внутрипеченочной передачи сигналов IFN типа I с помощью EOT может способствовать эрадикации HCV и предотвращению рецидива после отмены SOF / RBV.

ПРОБНАЯ РЕГИСТРАЦИЯ. ClinicalTrials.gov NCT01441180.

ФИНАНСИРОВАНИЕ. Очные программы Национального института аллергии и инфекционных заболеваний, Клинического центра Национального института здоровья и Национального института рака; Немецкий исследовательский фонд.

Эрик Г. Мейснер, Дэвид Ву, Ану Осинуси, Димитра Бон, Киммо Виртанева, Дэн Стердевант, Стив Порселла, Хунхуи Ван, Ева Херрманн, Джон МакХатчисон, Энтони Ф. Суффредини, Майкл Полис, Стивен Хьюитт, Людмила Прокунина-Олссон, Генри Мазур, Энтони С.Фаучи, Шьямасундаран Коттилил

Эндогенные внутрипеченочные ИФН и связь с исходом лечения ВГС без ИФН.

Набор Human TIMP-1
ТИМП-1 | Человек
Одноместный номер
Набор человеческого TGF-β1
TGF-β1 | Человек
Одноместный комплекс
Набор S-PLEX Human IL-1β
IL-1β | Человек
Одноместный номер
Набор S-PLEX NHP IL-1β
IL-1β | Примат, не являющийся человеком
Одноместный номер
Набор антител к человеческому IL-1β S-PLEX
IL-1β | Человек
Набор антител к эотаксину-3 человека S-PLEX
Эотаксин-3 | Человек
Набор антител к человеческому IFN-γ S-PLEX
IFN-γ | Человек
Набор S-PLEX Human IFN-γ
IFN-γ | Человек
Одноместный комплекс
Набор S-PLEX Human Eotaxin-3
Эотаксин-3 | Человек
Одноместный номер
Комплект S-PLEX NHP IL-6
Ил-6 | Примат, не являющийся человеком
Одноместный комплекс
Комплект S-PLEX NHP IL-2
Ил-2 | Примат, не являющийся человеком
Одноместный номер
Набор S-PLEX Human IL-12p70
Ил-12п70 | Человек
Одноместный комплекс
Набор S-PLEX Human IFN-α2a
IFN-α2a | Человек
Одноместный комплекс
Набор S-PLEX Human TNF-α
TNF-α | Человек
Одноместный номер
Набор S-PLEX Human IL-6
Ил-6 | Человек
Одноместный номер
Набор S-PLEX Human IL-2 Kit
Ил-2 | Человек
Одноместный комплекс
Набор S-PLEX Human IL-10
Ил-10 | Человек
Одноместный комплекс
Набор S-PLEX Human GM-CSF
GM-CSF | Человек
Одноместный комплекс
Иммуноонкологические анализы U-PLEX, группа 1 (hu)
Человек
Мультиплекс
Пользовательские иммуноонкологические анализы U-PLEX для группы 1 (hu)
Человек
Мультиплекс
U-PLEX CAR-T Cell Combo 1 (hu)
GM-CSF, гранзим A, гранзим B, IFN-γ, IL-2, TNF-α | Человек
Мультиплекс
U-PLEX Макрофаг M1 Combo 1 (hu)
IL-1β, IL-6, IL-12p70, IL-18, IL-23, IP-10, MCP-1, MIP-1α, TNF-α | Человек
Мультиплекс
U-PLEX Макрофаг M2 Combo 1 (hu)
Эотаксин-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, M-CSF, MDC, TARC | Человек
Мультиплекс
U-PLEX Immuno-Oncology Group 1 (hu) 111-Plex
BAFF, BAFF-R / TNFRSF13C, BCMA / TNFRSF17, BDNF, CD20, CD27, CD28, CD40L (растворимый), CD276 / B7-h4, C-пептид, CTACK, CTLA-4, ENA-78, эотаксин, эотаксин- 2, эотаксин-3, ЭПО, FGF (основной), FGF-23, FLT3L, фракталкин, ФСГ, G-CSF, грелин (активный), грелин (общий), GIP (активный), GIP (неактивный), GIP (общий ), GITR / TNFRSF18, GITRL / TNFSF18, GLP-1 (активный), GLP-1 (неактивный), GM-CSF, gp130 (растворимый), Granzyme A, Granzyme B, GRO-α, HAVCR2 / TIM-3, I -309, IFN-α2a, IFN-β, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-2, IL-2Rα, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 , IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 / IL-23p40, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17A, IL-17A / F , IL-17C, IL-17D, IL-17E / IL-25, IL-17F, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-29 / IFN-λ1, IL -31, IL-33, инсулин, IP-10, I-TAC, LAG3, лептин, лютеинизирующий гормон (LH), MCP-1, MCP-2, MCP-4, M-CSF, MDC, MIF, MIP-1α , MIP-1β, MIP-5, OX40 / TNFRSF4, PD1 (эпитоп 1), PD1 (эпитоп 2), PD-L1 (эпитоп 1), PD-L2, PlGF, PP, проинсулин, PYY (общий), RANKL / TNFSF11, SDF-1α, Tie-2, TIGIT, TLR1, TNF-α, TN F-β, TPO, TRAIL, TSLP, VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, YKL-40 | Человек
Мультиплекс
U-PLEX Биомаркер Группа 1 (мс) 29-Plex
IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-15, IL-16, IL-17A, IL -17A / F, IL-17C, IL-17E / IL-25, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27p28 / IL-30, IL-31, IL-33, IP -10, KC / GRO, MCP-1, MIP-1α, MIP-2, MIP-3α, TNF-α | Мышь
Мультиплекс
U-PLEX Вирусный комбо 1 (hu)
G-CSF, GM-CSF, IFN-α2a, IFN-β, IFN-γ, IL-1β, IL-1RA, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL -9, IL-10, IL-12p70, IP-10, MCP-1, MIP-1α, TNF-α, VEGF-A | Человек
Мультиплекс
U-PLEX Вирусный комбо 1 (NHP)
G-CSF, GM-CSF, IFN-α2a, IFN-γ, IL-1β, IL-1RA, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL -10, IL-12p70, IP-10, MCP-1, MIP-1α, TNF-α, VEGF-A | Примат, не являющийся человеком
Мультиплекс
Набор V-PLEX Plus Viral Panel 1 для людей
IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α | Человек
Мультиплекс
Набор V-PLEX Plus Viral Panel 1 NHP
IL-1β, IL-6, IL-8 | Примат, не являющийся человеком
Мультиплекс
Набор для человека V-PLEX Plus Viral Panel 2
IFN-γ, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α | Человек
Мультиплекс
Набор V-PLEX Plus Viral Panel 2 NHP
IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 | Примат, не являющийся человеком
Мультиплекс
Набор V-PLEX Plus Viral Panel 3 для людей
IFN-γ, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, TNF-α | Человек
Мультиплекс
Набор V-PLEX Plus Viral Panel 3 NHP
IFN-γ, IL-1β, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10 | Примат, не являющийся человеком
Мультиплекс
Набор для человека V-PLEX Viral Panel 1
IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α | Человек
Мультиплекс
Набор V-PLEX Viral Panel 1 NHP
IL-1β, IL-6, IL-8 | Примат, не являющийся человеком
Мультиплекс
Набор для человека V-PLEX Viral Panel 2
IFN-γ, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α | Человек
Мультиплекс
Набор V-PLEX Viral Panel 2 NHP
IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 | Примат, не являющийся человеком
Мультиплекс
Набор для человека V-PLEX Viral Panel 3
IFN-γ, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, TNF-α | Человек
Мультиплекс
Набор V-PLEX Viral Panel 3 NHP
IFN-γ, IL-1β, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10 | Примат, не являющийся человеком
Мультиплекс
Анализ эотаксина мыши U-PLEX
Эотаксин | Мышь
Одноместный комплекс
Анализ TARC для мышей U-PLEX
TARC | Мышь
Одноместный номер
Анализ U-PLEX IFN-α2a человека
IFN-α2a | Человек
Одноместный комплекс
Анализ U-PLEX NHP IL-2
Ил-2 | Примат, не являющийся человеком
Одноместный комплекс
Анализ U-PLEX NHP IL-1β
IL-1β | Примат, не являющийся человеком
Одноместный комплекс
Анализ U-PLEX NHP IL-8
Ил-8 | Примат, не являющийся человеком
Одноместный комплекс
Анализ U-PLEX NHP IL-6
Ил-6 | Примат, не являющийся человеком
Одноместный комплекс
Анализ U-PLEX NHP IFN-γ
IFN-γ | Примат, не являющийся человеком
Одноместный номер
Анализ U-PLEX NHP IL-10
Ил-10 | Примат, не являющийся человеком
Одноместный комплекс
Анализ U-PLEX NHP MIP-1β
MIP-1β | Примат, не являющийся человеком
Одноместный номер
Анализ U-PLEX NHP GM-CSF
GM-CSF | Примат, не являющийся человеком
Одноместный комплекс
Анализ U-PLEX NHP TARC
TARC | Примат, не являющийся человеком
Одноместный комплекс
Анализ U-PLEX NHP IP-10
IP-10 | Примат, не являющийся человеком
Одноместный комплекс
Анализ U-PLEX NHP на эотаксин-3
Эотаксин-3 | Примат, не являющийся человеком
Одноместный номер
Анализ U-PLEX NHP MCP-4
МСР-4 | Примат, не являющийся человеком
Одноместный комплекс
Анализ U-PLEX NHP MCP-1
МСР-1 | Примат, не являющийся человеком
Одноместный номер
Анализ U-PLEX Human MCP-1
МСР-1 | Человек
Одноместный комплекс
Анализ U-PLEX Human IP-10
IP-10 | Человек
Одноместный номер
Анализ U-PLEX Human MCP-4
МСР-4 | Человек
Одноместный комплекс
Анализ U-PLEX на человеческий эотаксин-3
Эотаксин-3 | Человек
Одноместный номер
Анализ U-PLEX человеческого IL-12p70
Ил-12п70 | Человек
Одноместный номер
Анализ человеческого эотаксина U-PLEX
Эотаксин | Человек
Одноместный комплекс
Анализ человеческого TNF-α U-PLEX
TNF-α | Человек
Одноместный комплекс
Анализ U-PLEX Human TARC
TARC | Человек
Одноместный комплекс
Анализ человеческого MIP-1β U-PLEX
MIP-1β | Человек
Одноместный номер
Анализ U-PLEX Human GM-CSF
GM-CSF | Человек
Одноместный комплекс
Анализ человеческого IL-6 U-PLEX
Ил-6 | Человек
Одноместный номер
Анализ человеческого IL-10 U-PLEX
Ил-10 | Человек
Одноместный комплекс
Анализ человеческого IL-8 U-PLEX
Ил-8 | Человек
Одноместный комплекс
Анализ человеческого IL-2 U-PLEX
Ил-2 | Человек
Одноместный комплекс
Анализ человеческого IL-1β U-PLEX
IL-1β | Человек
Одноместный комплекс
Анализ U-PLEX IFN-γ человека
IFN-γ | Человек
Одноместный номер
Анализ U-PLEX NHP IFN-α2a
IFN-α2a | Примат, не являющийся человеком
Одноместный комплекс
Анализ U-PLEX NHP TNF-α
TNF-α | Примат, не являющийся человеком
Одноместный комплекс
Анализ U-PLEX NHP IL-12p70
Ил-12п70 | Примат, не являющийся человеком
Одноместный номер
Анализ U-PLEX NHP на эотаксин
Эотаксин | Примат, не являющийся человеком
Одноместный комплекс
Анализ U-PLEX человеческого TGF-β1
TGF-β1 | Человек
Одноместный номер
Анализ U-PLEX NHP TGF-β1
TGF-β1 | Примат, не являющийся человеком
Одноместный комплекс
Анализ мышиного TGF-β1 U-PLEX
TGF-β1 | Мышь
Одноместный комплекс
Анализ GM-CSF мыши U-PLEX
GM-CSF | Мышь
Одноместный номер
U-PLEX Mouse MIP-1β Анализ
MIP-1β | Мышь
Одноместный номер
Анализ MCP-1 для мышей U-PLEX
МСР-1 | Мышь
Одноместный комплекс
Тест U-PLEX Mouse IP-10
IP-10 | Мышь
Одноместный комплекс
Анализ мышиного TNF-α U-PLEX
TNF-α | Мышь
Одноместный номер
Анализ мышиного IL-12p70 U-PLEX
Ил-12п70 | Мышь
Одноместный комплекс
Анализ мышиного IL-10 U-PLEX
Ил-10 | Мышь
Одноместный номер
Анализ мышиного IL-6 U-PLEX
Ил-6 | Мышь
Одноместный комплекс
Анализ мышиного IL-2 U-PLEX
Ил-2 | Мышь
Одноместный комплекс
Анализ мышиного IL-1β U-PLEX
IL-1β | Мышь
Одноместный номер
Анализ мышиного IFN-γ U-PLEX
IFN-γ | Мышь
Одноместный комплекс
Набор для культивирования тканей человеческого IFN-α2a
IFN-α2a | Человек
Одноместный номер
Пользовательский анализ метаболической группы 1 (мс) U-PLEX
Мышь
Мультиплекс
Анализ метаболизма группы 1 U-PLEX (мс)
Мышь
Мультиплекс
U-PLEX Биомаркер Группа 1 (мс) 50-Plex
6CKine / CCL21, BAFF, BCA-1 / BLC, CD40 / TNFRSF5, эотаксин, EPO, GM-CSF, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL -5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12 / IL-23p40, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17A, IL-17A / F, IL -17C, IL-17E / IL-25, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27p28 / IL-30, IL-31, IL-33, IP-10, KC / GRO , MCP-1, MCP-5 / CCL12, MDC, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, MIP-3α, MMP-9 (общий), NGAL / LCN2, RANTES, SDF-1α, TARC, TNF- α, TNF-RI, VEGF-A | Мышь
Мультиплекс
U-PLEX Chemokine Combo 1 (мс)
IP-10, KC / GRO, MCP-1, MDC, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, MIP-3α | Мышь
Мультиплекс
U-PLEX Chemokine Combo 2 (мс)
6CKine / CCL21, BCA-1 / BLC, MCP-5 / CCL12, RANTES, SDF-1α, TARC | Мышь
Мультиплекс
U-PLEX Интерферон Комбо 1 (мс)
IFN-α, IFN-β, IFN-γ | Мышь
Мультиплекс
U-PLEX Метаболическая группа 1 (мс) 58-Plex
BAFF, BCA-1 / BLC, BDNF, CD40 / TNFRSF5, C-пептид, эотаксин, EPO, FGF-21, грелин (активный), грелин (общий), GLP-1 (активный), GLP-1 (неактивный) , GLP-1 (общий), глюкагон, GM-CSF, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12 / IL-23p40, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17A, IL-17A / F, IL-17C, IL-17E / IL-25, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27p28 / IL-30, IL-31, IL-33, инсулин, IP-10, KC / GRO, лептин, MCP-1, MCP- 5 / CCL12, MDC, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, MIP-3α, MMP-9 (всего), PYY (всего), RANTES, TARC, TNF-α, VEGF-A | Мышь
Мультиплекс
Набор антител к эотаксину мыши U-PLEX
Эотаксин | Мышь
Набор антител против TARC мыши U-PLEX
TARC | Мышь
U-PLEX Adipokine Combo 1 (мс)
BDNF, IL-1β, IL-6, IL-10, инсулин, лептин, MCP-1, TNF-α | Мышь
Мультиплекс
Поиск продуктов
.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *