Rrv: ККМ купить — самая выгодная цена на официальном сайте

Содержание

ККМ или принтер чеков. Что выбрать? Статья

ККМ или принтер чеков – в чем разница?

Предприятия, занимающиеся коммерческой деятельностью на территории РФ, в соответствии с российским законодательством обязаны отчислять налоги в бюджет. Предприниматели по собственному усмотрению выбирают удобный для них способ налогообложения: единый налог на вмененный доход (ЕНВД), либо помесячная оплата за фактический оборот.

При выборе второй схемы – оплата за фактический оборот, предпринимателю необходимо приобрести контрольно-кассовую машину (ККМ), с последующей регистрацией этой техники в территориальном налоговом органе. ККМ в автоматическом режиме регистрирует все продажи, сделки и отправляет данные по операции в налоговую инспекцию. Получателю услуги выдается распечатанный чек (фискальный чек).

Если предпринимательская деятельность осуществляется по ЕНВД, то приобретение ККМ не обязательно, однако покупатель имеет законное право потребовать чек о совершенной денежной операции.

В данном случае предприниматель может воспользоваться чековым принтером (АСПД- автоматическая система печати документов). Печать не фискального чека позволяет сократить расходы на приобретение ККМ. Чековые принтеры стоят на порядок ниже, а в использовании по сути выполняют те же функции что и контрольно-кассовые машины.

Принтер чеков

Принцип действия чековых принтеров

Автоматическая система печати документов или же принтер чеков — это оборудование для печати разного рода листовок, торговых этикеток, штрих-кодов, но в большинстве случаев — кассовых чеков. АСПД работает только совместно с компьютером или POS-системой.

  • Существует всего два принципа печати это термопечать и матричная печать. В первом случае используется термочувствительная бумага, которая при нагревании до определённой температуры темнеет, получается выжигание информации на листе.
  • В случае с матричной печатью используется красящий картридж. Нанесение информации происходит за счет использования краски, но имеет значительные минусы в обслуживании (постоянная замена картриджа) и заметно проигрывает термопечати в показателях качества нанесения информации на бумагу.

Рассмотрим несколько популярных моделей чековых принтеров:

  • Чековый принтер АТОЛ RP-326-US

    АТОЛ RP326 — это универсальный чековый принтер, обладающий оптимальным соотношением цена-качество и совместимостью с различным оборудованием и ПО. Наличие всех самых популярных разъёмов для подключения принтера к компьютеру (RS232 + USB + Ethernet) позволяет интегрировать его практически в любую инфраструктуру предприятия торговли и сферы услуг.

    • высокоскоростной печатающий механизм, рассчитанный на печать 100 километров чековой ленты;
    • ресурс работы автоотреза – 1 миллион отрезаний;
    • возможность применения стандартной ленты, что избавит от необходимости поиска специальных материалов и позволит быстро начать работу;
    • совместимость с большинством современных операционных систем;
    • устройство с компактными размерами, что позволит сэкономить рабочее пространство;
  • Чековый принтер Posiflex Aura

    Устройства серии Posiflex Aura поддерживают 5 типов входящих интерфейсов посредством различных саб-кодов (sub-codes) по номеру модели, также существует возможность подключения через USB.

    • стандартная модель принтера обладает интерфейсом USB;
    • устройство PP-6900 подключается к порту LAN POS-системы, можно подключить к порту USB POS-системы как через интерфейс USB так и посредством симуляции устройства RS232 с помощью настроек драйвера;
    • устройства серии PP-6900 совместимы с POSReady и Win 7;
    • на устройствах серии PP-6900 есть отрезчик бумаги гильотинного типа для автоматического отрезания части / всей этикетки или ручной отрезки бумаги;
    • устройства серии PP-6900 также поддерживают возможность загрузки логотипа компании пользователя для удобства использования;
  • POS принтер Citizen CT-S310II

    Лидер в своем классе CT-S310II – компактный и современный принтер для печати чеков. Имея отвечающий стандарту энергосбережения ENERGY STAR блок питания с функцией сохранения бумаги, с корпусом без галогена, произведенным из перерабатываемых материалов, CT-S310II является по-настоящему экологичным устройством. С легким в обслуживании ножом и запатентованной технологией продолжительной печати (LLP – Long Life Printing), обеспечивающей безотказную печать до 200 км, CT-S310II предлагает уникальное сочетание производительности и энергоэффективности. Высокая скорость печати до 160 мм/сек. Выбор ширины печати. Широкий выбор дополнительных опций.

    • выход бумаги сверху — идеально для розничной торговли;
    • быстрая печать чеков — до 160 мм/сек.
    • надежные инвестиции — 2 встроенных преустановленных интерфейса: serial и USB;
    • различные варианты отрезки — полная и частичная;
    • простая система оповещения — встроенный зуммер;
    • небольшая занимаемая площадь – встроенный источник питания уменьшает занимаемое принтером пространство;

Денежный ящик ШТРИХ MidiCD (ККМ Штрих, черный)

{{#each tradingPlatforms}} {{/each}} {{/if}}

Запросите оферту через форму обратной связи

{{#if tradingPlatforms.length}} {{/if}}

В наличии

  • Характеристики
  • Торговая марка: ШТРИХ
  • Тип ящика: горизонтальный
  • Тип замка: электромеханический
  • Количество отделений для купюр: 4
  • Количество отделений для монет: 5
Все характеристики

Цена интернет-магазина. Указана с НДС.

Наличие в магазинах «Комус» товара с артикулом N {{productId}}
{{region}}, состояние на {{currentTime}}

{{> pageNumberTemplate pages}} {{#if availableStocks.length}} {{#if subwayNeed }} {{/if}} {{#each availableStocks}} {{/each}} {{/if}} {{> pageNumberTemplate pages}}

В розничных магазинах «Комус» цена на данный товар может отличаться от цены Интернет-магазина.

Подробную информацию о цене и количестве товара вы можете получить,
позвонив по телефону ближайшего к Вам магазина «Комус».

Адреса всех магазинов Комус

Закрыть

Закрыть

{{/if}} {{#each products}} {{#each this}} {{/each}} {{/each}} {{#each products}} {{/each}} {{#each products}} {{/each}}

Сравнение товаров

{{> breadcrumbTemplate breadcrumbs=breadcrumbs }} {{#if (gt products.length 0)}}

Закрыть

{{else}}

Нечего сравнивать

{{/if}} {{#if (gt products.length 1)}} {{/if}} {{#each products}} {{#each fields}} {{#each this}} {{/each}} {{/each}} {{#each products}} {{/each}} {{#each products}} {{/each}}
{{#if (eqw this.forbidden true)}} {{> productAddToCartForbiddenTemplate}} {{else}} {{#if (and (neqw this.stock null) (neqw (uppercase this.stock.stockLevelStatus.code) «OUTOFSTOCK») (neqw this.price null))}} {{else}} Товар недоступен {{/if}} {{/if}}

Арт. {{this.code}} {{#if this.stock}} {{#if (neqw this.stock.stockStatusText null)}} {{{ this.stock.stockStatusText }}} {{else}} {{#if (eqw (uppercase this.stock.stockLevelStatus.code) «ONREQUEST»)}} Под заказ {{else}} {{#if (neqw (uppercase this.stock.stockLevelStatus.code) «OUTOFSTOCK»)}} В наличии {{else}} Нет в наличии {{/if}} {{/if}} {{/if}} {{/if}}

{{/each}} {{#each fields}}
{{@key}} {{this}}
Торговая марка {{#if (neqw this.trademark null)}} {{this.trademark.name}} {{/if}}
Рейтинг {{#if (eqw this.ratingWidth null)}}

{{this.averageRating}}{{#if (eqw this.averageRating null)}}0{{/if}}

{{#unless eaistPopup}} Отсутствующий товар: {{/unless}} Выберите товары для замены:
{{#if (gt @index 0)}} {{/if}} {{#if (eqw this.forbidden true)}} {{> productAddToCartForbiddenTemplate}} {{else}} {{#if (and (neqw this.stock null) (neqw (uppercase this.stock.stockLevelStatus.code) «OUTOFSTOCK») (neqw this.price null))}} {{else}} Товар недоступен {{/if}} {{/if}}

Арт. {{this.code}} {{#if this.stock}} {{#if (neqw this.stock.stockStatusText null)}} {{{ this.stock.stockStatusText }}} {{else}} {{#if (eqw (uppercase this.stock.stockLevelStatus.code) «ONREQUEST»)}} Под заказ {{else}} {{#if (neqw (uppercase this.stock.stockLevelStatus.code) «OUTOFSTOCK»)}} В наличии {{else}} Нет в наличии {{/if}} {{/if}} {{/if}} {{/if}}

{{/each}}
{{@key}} {{this}}
Торговая марка {{#if (neqw this.trademark null)}} {{this.trademark.name}} {{/if}}
Рейтинг {{#if (eqw this.ratingWidth null)}}

{{this.averageRating}}{{#if (eqw this.averageRating null)}}0{{/if}}

Центр Технического Обслуживания Кассовых Аппаратов (ЦТО ККМ)

Обслуживание онлайн касс от 1500р!
Для подробной информации звоните по телефону +7(495) 134-19-54 или по электронной почте.



Центр Технического Обслуживания (ЦТО) действует на территории Москвы и Московской области, имеет необходимые сертификаты и лицензии. Специалисты ЦТО помогут в решении вопросов сервисного сопровождения, регистрации контрольно-кассовых машин (ККМ), ремонта периферийных ККМ в рамках нормативно-правовой базы.

Все инженеры ЦТО имеют многолетний опыт ремонта и обслуживания ККМ, а их квалификация подтверждена аккредитациями и сертификатами генеральных поставщиков торгового оборудования.

ЦТО профессионально оказывает следующие услуги:
  • Бесплатные консультации, подбор оборудования кассовых аппаратов с учетом специфики Вашей деятельности
  • Подготовка необходимой документации для регистрации ККМ в государственных налоговых инспекциях, постановка и снятие с учета.
  • Продажа и бесплатная доставка (Москва) торгового оборудования: 
  • Регистрация ККМ;
  • Проведение пуско-наладочных работ;
  • Обучение и краткая инструкция по эксплуатации кассовых аппаратов, торгового оборудования;
  • Подключение ККМ, фискальных регистраторов, POS-терминалов и другого торгового оборудования к системам автоматизации торговли;
  • Техническое сопровождение и ремонт торгового оборудования, ККМ, весов, pos-терминалов;
  • Замена фискального накопителя.
Применение ККМ
Заключение договора ЦТО

Заключение договора на техническое обслуживание ККМ в нашем ЦТО предполагает гибкий подход к определению стоимости и перечня услуг оказываемых ЦТО. Выбирая квалифицированное обслуживание, Вы получаете надежного партнера для Вашего бизнеса.

Даже если Вы не являетесь клиентом Компании, мы с радостью ответим на Ваши вопросы, связанные с регистрацией, обслуживанием, настройкой и ремонтом ККМ.

Менеджер с готовностью ответит на все интересующие Вас вопросы по работе, настройке и обслуживанию ККМ в ЦТО по телефону +7(495) 134-19-54 или по электронной почте.

Ремонт ККМ или что делать если не работает кассовый аппарат?

Получить услугу по ремонту кассы, Вы можете в нашем АСЦ «Фиджи-Сервис»

В сфере товаров и услуг необходимой техникой является контрольно-кассовые аппараты. Как и любая техника, кассовый аппарат, может прийти в негодность или сломаться. Поскольку ККМ – техника подучетная, даже небольшой ремонт необходимо производить с учетом соблюдения всех требований.

Ремонт кассовой техники должен производиться только в авторизованных сервисных центрах (АСЦ). Остальные организации, не имеющие сертификат, чьи специалисты не прошли соответствующего обучения, не имеют права заниматься таким видом работ. У АСЦ есть вся необходимая база, включая техническую и ремонтную документацию, запчасти, соглашения с поставщиками ККМ (аккредитация). Ремонтом при этом считаются все действия связанные со вскрытием пломбы и проникновением внутрь кассового аппарата. Выполнение ремонта любой степени сложности производится исключительно при подписании между АСЦ и владельцем ККМ договора технического обслуживания.

Законодательством строго регламентирован процесс ремонта кассовых аппаратов. На него отводится от 36 (при условии, что заказчик и АСЦ находятся в городе) до 48 часов (в сельской местности). Так как во время ремонта нарушается целостность пломбы на кожухе, до и после него необходимо заполнять множество документов, в которых указываются не только причина ремонта и ремонтные действия, но и показания счетчиков на начало и конец операции.

Если виновником поломки кассовой техники не является хозяин аппарата или обслуживающий персонал, для сломанного аппарата предоставляется гарантийный ремонт, который действителен до истечения гарантийного срока. Такой вид ремонта проводится бесплатно. Является ли случай гарантийным – определяет АСЦ. Остальные виды ремонта владелец кассовой машины оплачивает самостоятельно.

Мелкий ремонт подразумевает только работы по смазке и настройке деталей, без замены. По окончании работ ссоставляется акт о выполненных услугах АСЦ и необходимые налоговой инспекции документы. Средний ремонт предполагает замену всех запчастей, кроме блоков и узлов. По окончании сотрудник АСЦ заполняет акт, документы для налоговой инспекции. А также, составляется накладная на передачу замененных элементов и частей ККМ.

Замена блоков или цельных узлов ККТ и является капитальным ремонтом. Это наиболее дорогостоящий вид ремонта. Оформляется этот вид ремонта также как средний ремонт.

Кассовая техника, в основном, перестает работать, если использовать ее не надлежащим образом. Каждая модель кассового аппарата имеет свои условия эксплуатации, указанные в технической документации.

Ошибка на кассе или что делать если сломалась касса?

Ошибка на кассе может выдаваться по самым разным причинам. Если поломку кассы невозможно устранить силами продавца, скорее всего, кассу придется сдать в ремонт.

Возможны также случаи с временной технической неполадкой, вызванной ошибкой кассира или сбоем связи, например. Обязанность налогоплательщика по обеспечению фискализации платежа является не исполненной, если данные о выручке отражены в системе кассового учета, но не внесены в фискальную память.
Поэтому, когда касса выдает ошибку, следует первым делом обратиться в АСЦ, который занимается обслуживанием Вашего кассового аппарата. Специалисты центра смогут дистанционно определить возможную причину поломки кассы и проинструктировать кассира о необходимых действиях.

Кассовый аппарат будет считаться сломанным, если:
  • • на кассе не печатается чек,
  • • не прописываются реквизиты компании,
  • • касса не включается,
  • • при вводе на кассовый аппарат данных, информация не сохраняется,
  • • не работает клавиатура кассы,
  • • квитанции печатаются не полностью.

Если на кассовой технике повреждена марка-пломба ИФНС, аппарат тоже можно считать недействительным.
Кстати, технически неисправной технику посчитают, даже если производственная маркировка на аппарате отсутствует, либо повреждена пломба налоговой службы.

Причины поломки кассы:
  • • Износ внутренних деталей и частей
  • • Внешнее повреждение техники
  • • Поломка фискальной памяти
  • • Перегрев принтера кассового аппарата
  • • Неисправный аккумулятор
  • • Неправильные действия кассира-операциониста
  • • Не проведен профилактический ремонт оборудования
  • • Ошибка программного обеспечения

В случае, когда кассовый аппарат был сломан с целью укрывательства и избежания налоговых выплат (с аппарата была стерта память и данные восстановлению не подлежат), виновников привлекают к административной ответственности и обязывают выплатить штраф.

На данный момент, почти все современное кассовое оборудование оснащается системой проверки неисправностей.
Запустив систему, кассир-операционист выяснит:

  • • Правильно ли подключена клавиатура
  • • Исправны индикаторы
  • • Достоверен ли блок контрольной информации
  • • Правильно ли введены данные программ
  • • Исправна ли система

Если на Вашем кассовом оборудовании система проверки не установлена делайте следующее:

  1. 1. Когда на дисплее видно, что идет обработка какой-либо команды, не выключайте аппарат. Дождитесь того момента, когда оборудование завершит операцию само.
  2. 2. Если ККМ отключилась — попробуйте подключить заново.
  3. 3. Спасательная клавиша «С» может отменить действие ненужной операции, а также уберет высвеченный на экране код ошибки.
  4. 4. Техника может быть заблокирована в том случае, если вы попытались войти в режим, предназначенный только для налогового инспектора, либо механика АСЦ. Чтобы разблокировать ККМ, следует выбрать правильный режим и пароль.
  5. 5. Не печатаются данные на чеке, если не подходит термобумага. Следует подбирать бумагу по техническим параметрам.
  6. 6. Когда ломается принтер, лучше обратиться в службу ремонта.
  7. 7. Если аппарат не включается, также позвоните в АСЦ.
  8. 8. Когда техника загрязняется, то не стоит чистить ее самостоятельно. Обязательно проконсультируйтесь по телефону со специалистом по ремонту ККМ. Он должен будет осмотреть аппарат и решить, каким образом его почистить.
  9. 9. Проверьте подключение к сети аппарата.
  10. 10. Если не работают какие-либо детали оборудования, которые взаимодействуют с кассой (например, клавиатуру, дополнительный дисплей), то проверьте разъемы для подключения, переходники, провода.

Что должен делать кассир, если кассовый аппарат не работает:

  1. 1. Кассир-операционист, прежде всего, должен сообщить своему начальнику о том, что оборудование сломалось или появилась какая-либо ошибка. Если самостоятельно исправить ошибку не удалось, то стоит обратиться в центр техобслуживания. Специалист должен осмотреть ККМ и сообщить вам о причине поломки и способе устранения.
  2. 2. Следующие действия – обращения в налоговую службу, в которой был зарегистрирован аппарат. Заметьте, что обратиться обязательно следует в том случае, когда отремонтировать оборудование не получилось без снятия пломб. Предприниматель должен собрать пакет документов. В него войдут:
    • Заявление о том, что ККМ было отправлено на ремонт. Следует указать в нем данные регистрационной карточки, показания счетчика на начало того дня, когда сломалась техника.
    • Заключение специалиста АСЦ. Обязательно его должны предоставить для подтверждения причины снятия пломбы налоговой, а также, чтобы стояла даты с момента начала и окончания ремонта.
  3. 3. После вашего заявления и бумаги с центра техобслуживания, в налоговой службе должны дать разрешение или отказ на снятие пломбы. Конечно, без участия руководителя торговой организации специалист АСЦ может и сам. Он может написать заявление в налоговую и попросить необходимое разрешение. Это следует сделать в течение 3 дней с момента появления неисправности.
  4. 4. Оплачивать работу механика, возможно, придется вам. Это в том случае, если техника сломалась по вашей вине. Если же причина другая и ремонт идет по гарантийному талону (он действует обычно не более 18 месяцев), то оплачивать его будет производитель. Специалист АСЦ сам договаривается с поставщиком оборудования.
  5. 5. В течение 15 рабочих дней после выдачи разрешения контрольно-кассовое оборудование должны привести в нормальное состояние.

Получить услугу по ремонту кассы, Вы можете в нашем АСЦ «Фиджи-Сервис»


Если у Вас возникают трудности с запуском системы проверки неисправности ККТ или же Ваш кассовый аппарат заблокирован — позвоните нашим специалистам по телефону:
+7(499) 653- 52-17
или оставьте свои данные в форме обратной связи.   Наши механики свяжутся с Вами в ближайшее время для решения неисправности Вашей ККТ

МБУК ККМ

Устав Муниципального бюджетного учреждения культуры «Канский краеведческий музей» (новая редакция) — скачать…

 

Изменение в Уставе муниципального бюджетного учреждения культуры «Канский краеведческий музей»  — скачать…

 

Постановление администрации города Канска № 509 от 07.06.2016 «Об утверждении административного регламента по предоставлению муниципальной услуги «запись на обзорные, тематические и интерактивные экскурсии» — скачать…

 

Постановление администрации города Канска№ 515 от 07.06.2016 «Об утверждении административного регламента по предоставлению муниципальной услуги «Предоставление информации о проведении ярмарок, выставок народного творчества, ремесел на территории муниципального образования» — скачать…

Оценить качество оказания услуг учреждением вы можете здесь

Календарный план мероприятий на 2021 год   скачать…

     Приложение к Плану мероприятий на 2021 год   скачать…

Краткое наименование организации

МБУК ККМ

Полное наименование

Муниципальное бюджетное учреждение культуры «Канский краеведческий музей»

Фактический адрес

663600 Россия, Красноярский край, г. Канск, ул. Московская, 51

Основное направление услуг

Осуществление собирания и хранения музейных предметов, культурно-просветительская и научно-исследовательская деятельность.

e-mail

Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

Сайт

канский музей.рф

Информация об учреждении   

«Культура 24»

мы в социальных сетях:

https://vk.com/mbukkansky

https://vk.com/kanskmuseum

http://ok.ru/profile/573516050340

 

Отдел (должность)

Телефон

ФИО

директор

3-25-40 (факс)

Малюченко Лариса Владимировна

Отдел фондов

3-56-31

 

Художественный отдел

3-22-54

Петухова Ольга Олеговна

Образовательный отдел

3-56-31

Хмырова Светлана Рудольфовна

 

Музей – многофункциональный институт социальной памяти, осуществляющий отбор, изучение, сохранение и презентацию особых групп культурных и природных объектов.

Сегодня фонды музея насчитывают более 38 тыс. музейных предметов.

 

Основное направление деятельности — хранение музейных предметов и музейных коллекций, выявление и собирание музейных предметов и музейных коллекций, публикация музейных предметов и музейных коллекций, осуществление культурно-просветительской, научно-исследовательской и образовательной деятельности.


Музей предоставляет населению следующие услуги:

·         организацию выставок;

·         организацию постоянного экспозиционного обслуживания;

·         экскурсионное обслуживание;

·         лекционное обслуживание;

·         проведение культурно-просветительских мероприятий

·         справочные, информационные и рекламно-маркетинговые услуги;

·         другие виды досуговых и сервисных услуг в сфере культуры и смежных отраслях.

Услуги музея носят интегрированный характер и могут быть представлены в различной форме (массовой, камерной, индивидуальной, интерактивной) и на демонстрационной площадке с соблюдением условий, обеспечивающих безопасность и сохранность экспонируемых предметов.


Музейно-экскурсионные комплексы: «Археология и палеонтология бассейна реки Кан», « Животный мир  Канской лесостепи», «Этнография коренного населения бассейна реки Кан», «Московско-Сибирский тракт», «Старожилы и переселенцы Канского уезда XVIII-начала XXвв», «Канск купеческий», «Канск православный», «Локомотив революции».

 

В структуре музея 3 отдела: образовательный отдел, отдел фондов и художественный отдел, который организует временные выставки произведений живописи, графики, декоративно-прикладного искусства.

 

Музей располагает научной библиотекой с фондом более 5 тысяч книг по истории Сибири, географии, этнографии, археологии, искусству и справочные издания.

 

 


 

Кому и зачем нужен ККМ-онлайн и кто может работать без него

ККМ-онлайн — это виртуальный кассовый аппарат, который представляет собой программное обеспечение, устанавливаемое на электронные устройства (персональный/переносной компьютер, мобильный телефон и другие аналогичные аппараты), принадлежащее субъекту предпринимательства, с помощью которого будут проводиться кассовые операции. В Министерстве экономики КР подробно рассказали, кому и зачем нужен ККМ-онлайн и кто может работать без него.

Зачем нужны ККМ

Как было озвучено на бюджетных слушаниях 2020-2022 годов, которые прошли в сентябре прошлого года, уровень теневой экономики в Кыргызстане составляет 24 процента от общего объема ВВП. В 2018 году в денежном эквиваленте объем теневой экономики достиг 133 млрд сомов.

В связи с этим в рамках цифровизации страны правительством КР были заложены основы по внедрению электронных систем фискализации налоговых и таможенных процедур.

24 июня текущего года принято постановление правительства №356, предусматривающее утверждение правил эксплуатации, порядка применения и регистрации ККМ-онлайн, в том числе виртуальных. Введение виртуальных контрольно-кассовых аппаратов является одним из компонентов фискализации налоговых процедур в КР и реализации концепции цифровой трансформации «Санарип Кыргызстан».

Почему виртуальный ККМ удобнее

Как рассказали в Министерстве экономики КР, минимальная стоимость аппаратной контрольно-кассовой машины или ККМ, способной передавать данные в онлайн-режиме составляет свыше 10 тысяч сомов, что в условиях текущего экономического кризиса является обременительной нагрузкой для бизнеса, в особенности для малых и средних предпринимателей, а также предпринимателей в регионах. Поэтому в целях оказания поддержки бизнесу, в частности малому и среднему, была начата работа по внедрению виртуальной ККМ (программное обеспечение, реализованное в виде клиентского приложения на операционных системах Android, iOS и Windows), которая является новым направлением и дешевой альтернативой по сравнению с аппаратными ККМ-онлайн.

Введение виртуальных контрольно-кассовых аппаратов предусматривает:

  • создание комфортных и благоприятных условий для предпринимателей;
  • защиту интересов добросовестных отечественных производителей и импортеров;
  • создание условий справедливого развития честной конкуренции;
  • внедрение современных цифровых решений в сфере законодательства;
  • введение технологий, направленных легализацию теневой экономики.

Кто может работать без применения ККМ

Согласно поставлению, на территории Кыргызстана к регистрации и применению субъектами допускаются только те экземпляры ККМ, модели которых внесены в Государственный реестр контрольно-кассовых машин

Без применения ККМ могут работать субъекты, осуществляющие деятельность по реализации:

  • газет и журналов, а также сопутствующих товаров в газетно-журнальных киосках;
  • ценных бумаг;
  • лотерейных билетов вне стационарных помещений;
  • проездных билетов и талонов для проезда в городском общественном транспорте;
  • чайной и другой продукции общественного питания в пассажирских вагонах поездов;
  • предоставление услуг индивидуального характера (гувернантки, няни, садовники, домработницы) и по выпасу скота;
  • услуги коммерческих банков, микрофинансовых организаций, кредитных союзов, специализированных финансово-кредитных организаций и платежных организаций, лицензируемых и регулируемых Национальным банком Кыргызской Республики, за исключением оказания ими обменных операций с наличной иностранной валютой;
  • услуги религиозных организаций, зарегистрированных в порядке, установленном законодательством КР, в сфере регулирования деятельности религиозных организаций, в части реализации предметов культа и религиозной литературы в культовых зданиях и уличных киосках, а также оказание услуг по проведению ритуальных, религиозных обрядов и церемоний.

При этом в постановлении правительства КР от 24 июня 2020 года № 356 утвержден перечень отдельных субъектов, имеющих право осуществлять денежные расчеты без применения ККМ до определенного срока.

Нечеловеческие резервуары вируса реки Росс: систематический обзор доказательств | Паразиты и переносчики

Идентификация резервуаров вирусов с множеством хозяев является сложной задачей из-за сложных взаимодействий, которые поддерживают и способствуют развитию патогенов и побочных эффектов. Для арбовирусов три часто используемых критерия для классификации резервуаров позвоночных включают: виремию, выделение вируса и относительно высокую распространенность антител [3]. В свете этих критериев, это исследование было направлено на обзор доказательств наличия нечеловеческих резервуаров RRV против гипотезы: сумчатые животные являются лучшими резервуарами RRV, чем плацентарные млекопитающие, которые являются лучшими резервуарами, чем птицы.

Роль сумчатых как резервуаров RRV

Результаты экспериментального заражения, выделения вируса и серологического обследования 31 вида сумчатых подтверждают гипотезу о том, что сумчатые животные являются компетентными резервуарами и, вероятно, вносят значительный вклад в передачу RRV. Однако доказательства фрагментарны и подвержены систематической ошибке выборки, что ограничивает нашу способность экстраполировать по видам, широким географическим районам, средам обитания и типам землепользования.

В экспериментальных исследованиях инфекций у сумчатых обычно развивалась сильная и продолжительная виремия.Ранее это интерпретировалось как доказательство того, что сумчатые являются лучшими резервуарами, чем другие группы видов, однако мы не обнаружили существенной разницы между средней продолжительностью виремии или пиком виремии у сумчатых, плацентарных млекопитающих или птиц. При интерпретации результатов экспериментальных исследований инфекции необходимо учитывать как минимум два фактора. Во-первых, экспериментальные исследования инфекций часто ограничиваются небольшими размерами выборки как по количеству видов, так и по количеству исследований, которые можно сравнивать.Хотя мы статистически проанализировали результаты экспериментального исследования инфекции RRV с наибольшим количеством и разнообразием видов [27], размеры выборки все еще были ограничены и, вероятно, влияли на статистическую силу результатов. В частности, разнообразие используемых методов ограничивает возможности сравнения, и нельзя сбрасывать со счетов эффект одновременного заражения другими вирусами. Во-вторых, хотя виремия играет важную роль в сохранении и передаче арбовирусов, использование только этой меры для выявления потенциальных резервуаров имеет ограниченную ценность.Например, в экспериментальных исследованиях инфекции вируса Западного Нила, другого зоонозного арбовируса, одна виремия не позволила окончательно идентифицировать резервуары позвоночных: голубых соек ( Cyanocitta cristata ), домашних зябликов ( Haemorhous mexicanus ) и домашних воробьев ( Passer domesticus ). ) были определены как наиболее компетентные резервуары на основании профиля виремии [43]. Тем не менее, последующие полевые исследования показали, что американские малиновки ( Turdus migratorius ), менее вирусный и относительно необычный вид птиц, были ответственны за большинство инфекций, вызываемых переносчиками вируса WNV, из-за предпочтений хозяина в питании [44].

Выделение вируса от естественно инфицированных хозяев интерпретируется как доказательство того, что этот вид может инфицировать комаров-переносчиков и, таким образом, инфицировать людей. Для сумчатых выделение RRV из двух свободноживущих подвижных валлаби ( M. agilis ) (из 17 протестированных) демонстрирует взаимоотношения вектор-хозяин в естественных условиях и предполагает, что этот вид способен инфицировать восприимчивые векторы, тем самым подтверждая аргумент в пользу вида как резервуара RRV.Вместе с наблюдениями Кея и др. [27] за виремией у серых кенгуру это привело к гипотезе о том, что макроподы являются важными резервуарами RRV в пределах их ареала. Однако относительная важность этой группы видов как резервуара неясна, учитывая, что RRV чаще выделяется от лошадей и воробьиных птиц, и большинство случаев RRV у людей не перекрываются с домашними ареалами макропод [13].

Во всех исследованиях сумчатые животные имели самую высокую серотипную распространенность RRV (44.3%) по сравнению с плацентарными млекопитающими (22,7%) и птицами (11,1%). Хотя эти данные информативны, их следует интерпретировать с осторожностью, поскольку очевидно, что сумчатые животные были более вероятными жертвами при отборе проб в течение десятилетия 1986–1995 гг. (Рис. 2b). Этот сдвиг в целевой группе видов последовал за результатами экспериментальных исследований инфекций, продемонстрировавших, что сумчатые животные являются компетентными усилителями RRV в 1986 году. Кроме того, без информации о возрасте особей, данные серологической распространенности следует сравнивать между исследованиями с осторожностью.

Ошибки выборки, вероятно, возникли из-за частого использования удобных методов выборки или методов «активного наблюдения» (когда сбор данных по инициативе исследователей разработан для удовлетворения конкретных информационных потребностей [45]). Акцент на сумчатых в качестве хозяев для RRV в ущерб другим видам хозяев является преждевременным и вряд ли будет одинаковым для всех видов сумчатых. Например, опоссумы с щеткой хвост были выдвинуты как городской резервуар RRV, будучи сумчатыми и живущими в непосредственной близости от людей [35], что привело к сосредоточению внимания на этом виде.Однако целенаправленное наблюдение за этим видом в период с февраля по декабрь 2005 г. в Сиднее не позволило выявить серопозитивных особей [35, 46] из 10 опоссумов, отобранных в выборку. Этого количества животных недостаточно, чтобы сделать убедительные выводы о статусе хозяина, и необходимы дальнейшие исследования [46]. Кроме того, интересно отметить, что, хотя опоссумы с щеткой хвосты являются многочисленными городскими сумчатыми животными, опоссумы-кольчатые чаще встречаются в крупных мегаполисах, включая Брисбен, Сидней, Перт, Аделаиду ​​и Хобарт [47], но только в двух исследованиях (всего было протестировано четыре особи. ) были проведены серологические оценки вида (50% серопозитивность) [48, 49].

Роль плацентарных млекопитающих как резервуаров RRV

Плацентарные млекопитающие составляют наибольшее разнообразие протестированных видов, включая копытных, хищных и мелких городских видов. Хотя плацентарные млекопитающие соответствуют трем критериям арбовирусных резервуаров как группа видов, между видами существуют значительные различия.

Копытные

Копытные животные, включая свиней, лошадей, овец и крупный рогатый скот, признаны резервуарами для других зоонозных арбовирусов [4].Что интересно для RRV, лошади — единственные копытные, которые могут усилить болезнь и действовать как резервуары. Высокие, продолжительные вирусные титры, способность инфицировать восприимчивых комаров, частые выделения вирусов и высокая распространенность серологических вирусов предполагают, что лошади могут вносить значительный вклад в текущую передачу RRV, особенно в периоды эпидемий [50], хотя неясно, играют ли они роль в продолжающаяся эндемичная циркуляция RRV. Возможное объяснение большого количества изолятов RRV от лошадей состоит в том, что они оба являются домашними видами и являются одним из единственных известных видов, у которых развиваются клинические симптомы RRV [51], и, следовательно, их образцы с большей вероятностью будут взяты, особенно если они были инфицированные и симптоматические.Популяция лошадей в Австралии может превышать 1,2 миллиона особей [52], и, хотя они редки в высоко урбанизированных средах, они многочисленны в пригородных районах, где существует один из самых высоких показателей распространенности ВПР-инфекции среди людей [53].

Напротив, RRV не был изолирован от крупного рогатого скота, свиней и овец [54,55,56], и эти виды продемонстрировали низкий уровень виремии в экспериментальных исследованиях инфекций [27] и в серологических исследованиях [55]. Большое количество сывороток крупного рогатого скота проверяется на антитела к RRV из-за использования крупного рогатого скота в качестве контрольных видов в Национальной программе мониторинга арбовирусов, которая предназначена для выявления вторжений экзотических арбовирусных инфекций, таких как вирусы блютанга [57].

Кошки и собаки

Кошки и собаки — единственные плотоядные животные, которые были признаны потенциальными резервуарными хозяевами RRV. После экспериментального заражения вирусы не были обнаружены, и только у 10% этих кошек и собак вырабатывались нейтрализующие антитела к RRV [58]. Исследования серологической распространенности домашних кошек, не инфицированных экспериментально, показали, что у них относительно низкая распространенность антител (12,1%). Низкая емкость усилителя и низкая распространенность серотипов позволяют предположить, что эти домашние виды вряд ли могут быть значительными резервуарами RRV.

Мелкие млекопитающие (
<2 кг)

Потенциальная роль мелких плацентарных млекопитающих, таких как грызуны, кролики и летучие лисицы, как резервуарных хозяев RRV неоднозначна. В экспериментальных условиях заражения Уайтхед [37] обнаружил, что грызуны способны развивать виремию выше, чем бандикуты, сумчатые животные, однако виремия была недолговечной по сравнению с сумчатыми. У кроликов наблюдались кратковременные средние пики титров.

При экспериментальном заражении у сероголовых летучих лисиц ( Pteropus poliocephalus ) не развивалась обнаружимая виремия, но они были способны инфицировать 3% реципиентов Ae.векторы vigilax [33]. Летучие лисицы представляют собой уникальную группу видов, поскольку было показано, что они являются резервуаром-хозяином для нескольких зоонозных патогенов, включая лиссавирусы генипавируса и филовирусы, часто без обнаруживаемой виремии [6, 59]. Аналогичные наблюдения были сделаны для арбовирусов. При экспериментальном заражении черных летучих лисиц ( Pt. Alecto ) вирусом японского энцефалита у всех 15 особей наблюдалась низкая виремическая реакция; однако два были способны инфицировать восприимчивых комаров [60].Только седая летучая лисица была исследована в качестве потенциального резервуарного хозяина RRV, но анализ муки крови на 20 Ae. funereus в непосредственной близости от смешанной колонии летучих лисиц в Брисбене обнаружили, что все 16 проанализированных комаров питались черными летучими лисицами и ни одного — сероголовыми летучими лисицами [33]. При рассмотрении возможности использования летучих лисиц как резервуаров RRV важно учитывать высоту, на которой питаются и перемещаются различные векторы. Известные векторы RRV, в том числе Ae.vigilax и Ae . camptorhyncus , вероятно, будут кормиться близко к земле, потенциально избегая ночевок летучих лисиц [61]. Для определения этого необходимы дальнейшие исследования анализа крови.

Учитывая их небольшой размер тела, крысы, грызуны и летучие лисицы могут считаться менее желательными в качестве пищи для переносчиков крови [62]. Однако они могут существовать в высокой плотности рядом с человеческими популяциями. Анализ крови на RRV-векторов показал, что кролики и крысы составляли до 33% от Cx annulostris кровяной муки в городских районах [63].Серологические данные, подтверждающие гипотезу о том, что мелкие млекопитающие могут играть роль в передаче RRV, в настоящее время отсутствуют из-за ограниченного числа протестированных.

Роль птиц как резервуаров RRV

Птицы являются наиболее распространенным резервуаром арбовирусов для зоонозных флавивирусов и альфавирусов во всем мире [4]; однако их вклад в качестве резервуаров RRV в значительной степени упускается из виду. На основании одних только экспериментальных данных о вирусной виремии птицы кажутся плохими усилителями RRV.Четыре вида птиц (куры, голуби, маленькие кореллы и черные утки) были экспериментально заражены RRV. В экспериментальных исследованиях инфекций у птиц был самый низкий пиковый титр и самая короткая продолжительность виремии по сравнению с сумчатыми и плацентарными млекопитающими (Таблица 3). Кроме того, голуби были одними из немногих видов, у которых не развилась обнаруживаемая виремия. Однако маленькие кореллы ( Cactua sanguinea ) были способны инфицировать 14% восприимчивых комаров Cx annuilostris , несмотря на низкую и короткую виремию.Это важно, потому что в том же исследовании лошади развили самый высокий титр, но инфицировали только 11% восприимчивых переносчиков. Возможные причины этого не обсуждались в исходной статье, но мы предполагаем, что способность позвоночных животных заражать восприимчивых комаров-переносчиков RRV может быть более актуальной мерой резервуарной емкости, чем виремия.

Изоляция RRV от птиц дополнительно увеличивает их возможности в качестве усилителей. В результате более 750 попыток выделения вируса у 104 видов были получены первые 3 изолята RRV из сердечной мышцы воробьиных птиц в Северном Квинсленде: сорока-жаворонок, мухоловка и зяблик в маске (Таблица 4).Воробьиные птицы признаны важными усилителями других арбовирусов, включая флавивирусы, такие как вирус Западного Нила [43], клещевые патогены, такие как Borrelia burgdorferi — возбудитель болезни Лайма [64] и альфавирус артрита, тесно связанный с RRV, Синдбис [65]. Действительно, выделение альфавируса Sindbis из воробьиных птиц в сочетании с генетическими исследованиями и исследованиями распространенности антител выявило птиц как резервуарных хозяев Sindbis [62].

Серологические исследования показали низкую распространенность RRV у птиц. Однако почти 40% протестированных сывороток птиц были получены от цыплят-дозорных. Куры считаются подходящими дозорами для флавивирусов, таких как энцефалит долины Мюррея, потому что они демонстрируют сильный ответ антител [66], однако экспериментальные инфекции показывают, что это не относится к RRV [27, 37]. Примечательно, что птицы с положительной серологией на RRV были свободноживущими местными видами: неясыть лягушачьей совы в Новом Южном Уэльсе [48] и австралийская олуша ( Morus serrator ), отобранные в Новой Зеландии [67].Таким образом, тенденция к отбору образцов цыплят в серологических обследованиях RRV может недооценивать показатели для птиц в целом, и будущие серологические обследования выиграют от включения большего разнообразия видов птиц.

Альтернативные свидетельства для резервуаров, не относящихся к человеку

В этом обзоре основное внимание уделяется внутренним переменным хозяина, важным для емкости резервуара. Существуют и другие доказательства, которые могут быть важны для исследования потенциальных резервуаров, таких как анализ кровяной муки и моделирование.Определение предпочтений вектора может указывать на более высокую частоту подачи и, таким образом, при наличии соответствующего резервуара более высокую скорость передачи. Исследования анализа крови изучают взаимосвязь между переносчиком и хозяином. Выбор переносчика-хозяина — сложный вопрос, с такими факторами, как размер тела хозяина, выбросы углекислого газа, обоняние, доступность, численность и генетика переносчика, влияющие на предпочтения кормления [62, 68]. Исследования кровяной муки еще более усложняются, поскольку они легко сбиваются с толку окружающей средой, в которой проводилось исследование, и поэтому эти исследования лучше всего, когда они сопровождаются измерениями численности и разнообразия животных.Из 12 работ по анализу муки из крови в Австралии только одна [69] сделала это, попросив жителей оценить количество животных. Необходимы дальнейшие исследования для изучения предпочтений переносчиков-хозяев в австралийской городской, пригородной и сельской среде и определения того, какое влияние это может иметь на способность вида действовать в качестве резервуара.

Математические модели — ценный способ описания и понимания сложных систем заболеваний, таких как RRV. Модели могут проверять предположения о системе болезней и генерировать прогнозы, которые могут использоваться для принятия управленческих решений.Для RRV в пяти исследованиях [20, 70,71,72,73] использовались методы механистического моделирования (например, модели «восприимчиво-инфекционно-восстановленные»), чтобы лучше понять динамику передачи, лежащую в основе поддержания патогена. Хотя модели различаются по параметрам, расположению и методам, все они включают сумчатый резервуар. Виды, которые были смоделированы как резервуары, — это серые кенгуру западной популяции и опоссумы с щетинками. В целом эти исследования показали, что одного хозяина недостаточно для поддержания вируса в популяциях переносчиков.Гласс [72] пришел к выводу, что, хотя сумчатые животные, такие как кенгуру и валлаби, обычно считаются наиболее важными резервуарными хозяевами, вирус долго выжил во всех моделях, когда сумчатого хозяина заменили хозяином с более коротким инфекционным периодом и более высокой рождаемостью. Кроме того, в том же исследовании сообщается, что для выживания вируса в течение четырех лет необходимы очень большие популяции хозяев (> 100 000 особей). Choi et. al. [70] аналогичным образом обнаружили, что водохранилище кенгуру не повлияло на количество инфекций среди людей из-за небольшого размера популяции в регионе.Карвер и др. [20] сообщили о значительной отрицательной взаимосвязи между численностью сумчатых водоемов и передачей RRV. Эти результаты противоречат гипотезе о предполагаемом резервуаре. Томпкинс и Слэни [73] отметили, что разные виды могут быть резервуарами в разных средах, таких как густонаселенные городские районы и охраняемые природные среды обитания, что может привести к различным циклам передачи. Эти исследования моделирования подчеркивают важность изучения альтернативных видов как потенциальных резервуаров RRV.В идеале система должна быть явно смоделирована как многоузловая, но получение необходимых данных для параметризации таких моделей является сложной задачей [74].

Вирус Росс-Ривер: патоген с множеством хозяев

Несмотря на доказательства, подтверждающие, что сумчатые являются резервуаром RRV, остаются вопросы. Недавние исследования показали высокую распространенность RRV на островах Тихого океана в отсутствие популяций сумчатых животных [29, 31], что позволяет предположить, что сумчатые животные — не единственная видовая группа, способная увеличивать распространение инфекции RRV среди сообществ.Исследования, моделирующие резервуары RRV, показали, что у патогена есть система с множеством хозяев [23, 72]. Однако ни одно из исследований, рассмотренных в этой статье, специально не рассматривало эту гипотезу. Системы с несколькими хозяевами не редкость для арбовирусов, но количественная оценка этих систем является сложной задачей, требующей скоординированного сбора данных во временных и географических масштабах для нескольких видов [3].

Чтобы понять, что RRV является патогеном с множеством хозяев, необходимо рассмотреть два вопроса. Во-первых, поскольку RRV имеет международное распространение, охватывающее различные экологические и социальные границы, важно определить экологическую передачу RRV через различные экосистемы.Расширение классификации Claflin & Webb [14] потенциальных переносчиков RRV, мест обитания и резервуаров во внутренних, городских и прибрежных регионах с целью включения циклов передачи является оправданным. Во-вторых, чтобы лучше понять емкость резервуара между различными сообществами хозяев, требуется идентификация усиливающих или разбавляющих хозяев резервуара. Принимая во внимание, что люди не считаются значительными резервуарами поддерживающего RRV вне периодов эпидемий в Австралии, это может служить эталоном для относительного сравнения серологической распространенности.Например, серологическая распространенность RRV у доноров крови показывает, что распространенность человеческого IgG колеблется от 8,38% в Австралии в 2011 году [75] до 34,4% во Французской Полинезии в период с 2011 по 2013 годы [29]. Хотя это дает только представление о количестве людей, подвергшихся воздействию, и не учитывает другие способствующие факторы, такие как продолжительность ответа антител, эти данные можно сравнить с данными серологического обследования животных для выявления видов с более высокими показателями инфицирования, чем у людей. Предпочтение вектора-хозяина может быть ключом к пониманию динамики резервуара и передачи в других зоонозных арбовирусах [3].В целом, рассмотрение RRV как патогена с множеством хозяев может разобраться в сложной экологической динамике, которая может иметь место.

Вирус реки Росс — обзор

ПЕРЕДАЧА И ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

Вирус реки Росс эндемичен для всех континентальных штатов Австралии и Папуа-Новой Гвинеи. Не поступало сообщений о передаче вируса реки Росс из островных государств Тихого океана, участвовавших в эпидемии 1979–1980 годов (Фиджи, Самоа, Тонга, Острова Кука) 5, 26, 45, 60, 70 до 2003 года, когда у путешественников, побывавших на Фиджи, стали обнаруживаться случаи эпидемического полиартрита. 46 Спорадические случаи без местной передачи вируса произошли в Европе и США у туристов и военнослужащих, возвращающихся из Австралии.

Изоляция вируса реки Росс от более чем 20 видов комаров, в частности 61 A. vigilax 25, 37 и Culex annulirostris , 24, 37 и наличие антител к вирусу почти у такого же количества видов животных, особенно млекопитающих, 22, 23 предполагают цикл млекопитающее-комар с человеком в качестве случайного хозяина.Однако улучшенные лабораторно-диагностические услуги показали, что клиническая инфекция у людей происходит круглый год, хотя большинство случаев регистрируется в конце лета и осенью, и большинство пациентов являются городскими жителями. 7, 52 Взятый вместе со взрывным распространением болезни во время эпидемии вируса реки Росс в Тихом океане с 1979 по 1980 год, 5, 26, 60, 70 , похоже, поддерживается в любом из двух циклов, млекопитающее-комар-млекопитающее или человек-комар-человек, с перемещением вируса между ними.Также были получены доказательства трансовариальной передачи вируса реки Росс у комаров Aedes . 44, 47

Пациенты могут иметь виремию в течение 7 дней после появления симптомов. 8, 60 Время инкубации от инфекции до появления симптомов может варьироваться от 1 до 27 дней, при этом 7-9 дней являются обычным интервалом в эндемичных регионах. 30

В эндемичных районах соотношение субклинической и клинической инфекции может достигать 50: 1, 7 , но во время вспышек это соотношение может быть уменьшено до 4: 1 или меньше. 5, 39 Приблизительно 1,5 процента людей, живущих в северной Австралии, ежегодно заражаются вирусом Росс-Ривер, 7 , но в некоторых районах показатели намного выше. 17, 18

Уровни инфицирования одинаковы для обоих полов, и ранние сообщения о том, что клинические заболевания чаще встречались у женщин, чем у мужчин 20, 52 не подтверждаются национальными данными Австралии за последнее десятилетие . Также наблюдалась связь между HLA-DR7 и клиническим заболеванием. 36

Было показано, что вирус Росс-Ривер проникает через плаценту у мышей 3 и человека. 6 У мышей результатом является высокая послеродовая смертность, 3 , но у людей не было обнаружено никаких доказательств заболеваемости или смертности у детей, инфицированных в утробе матери.

Резидентская возвратная виза (RRV) | Armstrong Legal

Возвращенная виза резидента (RRV) позволяет действующему или бывшему постоянному жителю Австралии или бывшему гражданину Австралии выезжать за границу.Граждане Австралии имеют стандартное право на въезд в Австралию, но любой негражданин, выезжающий за границу, должен иметь визу для возвращения в страну. RRV позволяет человеку путешествовать в Австралию и обратно до истечения срока действия визы. RRV может быть визой подкласса 157 (3 месяца) или визой подкласса 155 (1 год или 5 лет). Нет никаких ограничений на количество жилых автофургонов, которые может иметь человек.

Право на участие в RRV

Чтобы иметь право на получение RRV, лицо должно быть:

  • постоянный житель Австралии;
  • бывший постоянный житель Австралии, последняя постоянная виза которого не была аннулирована;
  • бывший гражданин Австралии, утративший гражданство или отказавшийся от него (например, лицо, ставшее гражданином страны, в которой не разрешено двойное гражданство).

Постоянные жители могут свободно выезжать за границу и возвращаться в Австралию по своей визе на жительство на срок до 5 лет с даты выдачи визы. После этого времени потребуется RRV. Если постоянный житель покидает Австралию после истечения срока его постоянной визы на жительство или истекает, пока он находится за пределами Австралии, он не сможет вернуться в качестве постоянного жителя, если у него нет RRV.

Члены семьи не могут быть включены в заявку RRV.

Требование о проживании

Если человек прожил в Австралии в общей сложности 2 года за последние 5 лет в качестве постоянного жителя или гражданина Австралии, он соответствует «требованию к проживанию» и ему может быть предоставлено 5-летнее право проезда на своем RRV.

При расчете требования 2-летний период учитывается 730 дней, а 5-летний период отсчитывается с даты подачи заявления RRV.

Требование существенных связей

Если человек не соответствует требованиям к проживанию, но может продемонстрировать «существенные связи» с Австралией, которые приносят пользу стране, ему может быть предоставлено право проезда на срок до 1 года. Лицо не должно отсутствовать в течение 5 лет подряд с момента выдачи последней постоянной визы или утраты австралийского гражданства.

Если человек находится за пределами Австралии при подаче заявления:

  • они не должны отсутствовать в стране в течение 5 или более лет подряд и иметь постоянную визу или покинуть страну в качестве постоянного жителя или гражданина; или
  • они не должны отсутствовать в стране в течение периодов, равных 5 годам между отъездом из Австралии в качестве постоянного жителя или гражданина и подачей заявления; и были постоянным жителем или гражданином менее 10 лет до подачи заявления.

Если лицо подает заявление в качестве члена семьи лица, у которого есть ЖДП, или подало заявление на получение отдельного ЖДП, ему может быть предоставлено право проезда на срок до 1 года.

Если человек не подходит ни под одну из этих категорий, но у него есть веские причины из соображений сострадания, ему может быть предоставлен трехмесячный проезд.

Любые оставшиеся возможности проезда по визе не переносятся на следующую визу. Некоторым постоянным владельцам переходных билетов отправляется напоминание об истечении срока действия туристических услуг.Владельцы визы могут проверить статус своего туристического объекта в системе проверки визовых прав онлайн (VEVO).

Существенные связи могут включать деловые, культурные, трудовые и личные связи.

Требование к символам

Для получения визы все заявители должны пройти тест на характер. В разделе 501 Закона о миграции 1958 года перечислены причины, по которым человек не может пройти тест на характер. Примеры включают где человек:

Без отмен

В заявке на RRV может быть отказано, если заявителю была аннулирована виза или предыдущая заявка была отклонена.

Обработка RRV

По состоянию на май 2021 года онлайн-заявка стоила 405 долларов, а бумажная — 485 долларов. Могут потребоваться другие расходы, если требуются проверки, такие как проверки здоровья, справки из полиции и биометрические тесты.

Заявления, соответствующие требованиям к проживанию, обычно обрабатываются в течение 5 рабочих дней с момента подачи. Для виз подкласса 155 75% заявлений обрабатываются в течение 9 дней, а 90% — в течение 3 месяцев. Для виз подкласса 157 90% заявлений обрабатываются в течение 4 месяцев.

За советом или представлением интересов по любым юридическим вопросам обращайтесь в юридический отдел Armstrong.

Первые свидетельства одновременной энзоотической и эндемической передачи вируса реки Росс при отсутствии сумчатых резервуаров на Фиджи

https://doi.org/10.1016/j.ijid.2020.02.048 Получить права и контент

Основные моменты

Инфекция, вызванная вирусом Росс-Ривер (ВРР), представляет собой зооноз, передаваемый комарами.

Эндемичная передача считалась возможной только через сумчатые водоемы.

На Фиджи нет сумчатых, но высокая серопозитивность по RRV у домашних животных составляет 48%.

RRV мог быть повторно введен или передавался на низком уровне после вспышки на Фиджи.

Эндемичный RRV в отсутствие сумчатых вызывает опасения по поводу глобального распространения.

Реферат

Предпосылки

Вирус Росс-Ривер (RRV) — зоонозный альфавирус, передающийся несколькими видами комаров.До недавнего времени эндемичная передача считалась возможной только при наличии сумчатых резервуаров.

Методы

Серологическая распространенность RRV была исследована на плацентарных млекопитающих (включая лошадей, коров, коз, свиней, собак, крыс и мышей) на Фиджи, где сумчатые животные отсутствуют. В общей сложности было собрано 302 образца сыворотки позвоночных в 86 домах из 10 общин на Западе Фиджи.

Результаты

Нейтрализующие антитела против RRV были обнаружены в 28–100% сывороток в зависимости от вида, и нейтрализация была сильной даже при высоких разведениях.

Выводы

Эти результаты маловероятны из-за перекрестных реакций. Чикунгунья — единственный другой альфавирус, который, как известно, присутствует на островах Тихого океана, но он редко передается другим людям, даже во время эпидемий. Результаты исследования, вместе с недавним сообщением о высокой серологической распространенности ВРР у людей, убедительно свидетельствуют о том, что ВРП циркулирует на Фиджи в отсутствие сумчатых резервуаров. Учитывая, что все позвоночные животные, кроме человека, присутствующие на Фиджи, имеют глобальное распространение, RRV имеет потенциал для дальнейшего расширения своего географического ареала.Дальнейший надзор за RRV и доступ к диагностике RRV будут иметь решающее значение для раннего обнаружения возникновения и вспышек.

Ключевые слова

Вирус реки Росс

Арбовирус

Зоонозы

Эндемические болезни

Новые инфекционные болезни

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

© 2020 Авторы. Опубликовано Elsevier Ltd от имени Международного общества инфекционных болезней.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Члены семейства Plxdc являются новыми рецепторами радиновируса макак-резус (RRV)

Цитата: Großkopf AK, Schlagowski S, Fricke T., Ensser A, Desrosiers (RC, 2021) Члены семейства Plxdc являются новыми рецепторами радиновируса макаки-резуса (RRV).PLoS Pathog 17 (3): e1008979. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008979

Редактор: Чжи-Мин Чжэн, Национальный институт рака, США

Поступила: 17 сентября 2020 г .; Одобрена: 4 февраля 2021 г .; Опубликовано: 3 марта 2021 г.

Авторские права: © 2021 Großkopf et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи и вспомогательных информационных файлах.

Финансирование: Работа поддержана грантами A.S.H. от Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de, HA 6013/1, HA 6013 / 4-1), Фонда Вильгельма-Сандера (www.wilhelm-sander-stiftung.de, проект 2019.027.1) и Междисциплинарного центра для клинических исследований в Эрлангене (IZKF, www.izkf.med.fau.de, грант J44), Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de), предоставляет AE CRC 796, TP B1 и EN423 / 5-1 за счет гранта AE от Междисциплинарного центра клинических исследований в Эрлангене (IZKF, www.izkf.med.fau.de, грант A81), грантом RO1 AI072004 от Национального института здоровья (NIH, www.nih.gov) RCD и базовым грантом RR00168 от NIH (www.nih.gov) Центру исследования приматов Новой Англии. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Радиновирус макака-резуса (RRV), член рода γ2-герпесвирусов или радиновирусов, тесно связан с единственным патогенным членом этого рода человека, вирусом герпеса, ассоциированным с саркомой Капоши (KSHV) [1,2 ]. Из-за высокого сходства как в организации генома, так и в биологии RRV считается модельным вирусом KSHV на животных [3] и использовался как таковой в исследованиях in vitro и in vivo . Были идентифицированы две основные группы последовательностей RRV [4], каждая из которых представлена ​​клонированным изолятом, RRV 26–95 [5] и RRV 17577 [6].Подобно KSHV-инфекции, первичная RRV-инфекция протекает бессимптомно у здоровых хозяев и приводит к пожизненной персистенции, скорее всего, в компартменте B-клеток [7].

KSHV связан с солидной опухолью эндотелиального происхождения, саркомой Капоши (СК) и двумя В-клеточными злокачественными новообразованиями, первичной выпотной лимфомой (ПЕЛ) и плазмобластным вариантом многоцентровой болезни Кастлемана (БКД), наиболее заметно в контексте иммунодефицита человека. вирусная (ВИЧ) инфекция и у лиц с ослабленным иммунитетом.Точно так же у макак-резусов, инфицированных вирусом обезьяньего иммунодефицита (SIV), развивались В-клеточные лимфомы после экспериментального инфицирования штаммом 17577 RRV [8,9], и несколько исследований коррелировали RRV-инфекцию с лимфомагенезом у животных, инфицированных SIV / SHIV [10,11]. В то время как RRV не всегда ассоциируется с солидными злокачественными новообразованиями, RRV был идентифицирован в ткани забрюшинного фиброматоза [9,12], как и вирус герпеса забрюшинного фиброматоза (RFHV) [11], и недавно был выделен из ткани гемангиомы [13].

Другой общей характеристикой KSHV и RRV является использование рецепторов в ряде типов клеток. Оба вируса взаимодействуют с членами семейства рецепторных тирозинкиназ Eph (Ephs) через их гликопротеиновый (g) H / gL комплекс для облегчения проникновения в клетки-мишени. В то время как KSHV предпочтительно взаимодействует с Ephs A-типа, в частности с EphA2 как высокоаффинным рецептором [14,15], –RRV может использовать Ephs как A-, так и B-типа [15] для входа. Эти взаимодействия были охарактеризованы на разных типах адгезивных клеток [16-19], и мы смогли недавно показать, что оба вируса могут использовать EphA7 в качестве рецептора на клетках BJAB [20], модельной линии B-лимфоцитов.В то время как для KSHV, в дополнение к рецепторам семейства Eph, несколько мембранных белков были предложены в качестве клеточных рецепторов для различных вирусных гликопротеинов, опосредующих либо прикрепление, либо проникновение в ряд клеток-мишеней (обзор в [21]), использование рецептора RRV сравнительно меньше. хорошо охарактеризован. Тем не менее, исследования с использованием нокдауна или нокаута рецептора [14,22], блокирования, опосредованного рецепторами и лигандами [15,23], и мутантов вируса, лишенных мишени Eph [23,24], показали, что как вирусы, так и, в частности, RRV могут инфицировать различные клетки частично или полностью независимо от Eph-взаимодействия, что предполагает, что RRV задействует по крайней мере один дополнительный рецептор входа, который может функционально замещать Eph-взаимодействие.Это мнение также подтверждается недавним исследованием in vivo , которое продемонстрировало, что мутант RRV, удаленный из gL и, следовательно, неспособный взаимодействовать с рецепторами Eph, по-прежнему вызывает стойкую инфекцию у RRV-наивных макак-резус после внутривенной инокуляции [24].

Таким образом, мы стремились идентифицировать дополнительные рецепторы радиновируса, которые связывают комплекс gH / gL или gH, и идентифицировали белок 2, содержащий домен плексина (Plxdc2), в качестве нового партнера по взаимодействию комплекса gH / gL RRV, но не KSHV.Ближайший гомолог к ​​Plxdc2, Plxdc1, был первоначально идентифицирован как сверхэкспрессируемый в кровеносных сосудах солидных опухолей человека [25], что привело к оригинальной терминологии, связанной с эндотелиальным маркером 7 опухоли (TEM7, Plxdc1) и родственным маркером эндотелия опухоли 7 (TEM7R, Plxdc2) [26]. ]. В целом физиологические функции Plxdc1 / 2 изучены недостаточно. Предполагая роль в развитии, Plxdc2 был описан как митоген для нейральных клеток-предшественников [27], и была продемонстрирована экспрессия Plxdc1 и Plxdc2 в развивающейся нервной системе [28,29].Кортактин, нидоген и фактор, происходящий из пигментного эпителия (PEDF), были описаны как взаимодействующие с Plxdc1 и Plxdc2 [30–32]. Однако физиологическая значимость этих взаимодействий до конца не изучена. В этом исследовании мы охарактеризовали взаимодействие Plxdc1 / 2 с гликопротеиновым комплексом gH / gL RRV и установили Plxdcs в качестве новых клеточных рецепторов входа RRV.

Результаты

Чтобы идентифицировать потенциальные клеточные рецепторы для гликопротеина H RRV, мы провели иммунопреципитацию с использованием растворимого RRV 26–95 gH, состоящего из внеклеточной части, слитой с Fc-частью человеческого IgG (RRV gH-FcStrep) в качестве приманки и целых клеток 293T. лизат в качестве добычи (рис. 1А).Полосы, присутствующие в преципитации из лизата цельных клеток 293T, но не в контрольной преципитации без лизата 293T, вырезали и анализировали с помощью LC-MS / MS. Самым распространенным белком клеточной поверхности, идентифицированным в четырех из пяти проанализированных областей, был Plxdc2, также известный как TEM7R, клеточный трансмембранный белок. Plxdc1 / TEM7, единственный гомолог Plxdc2 у людей и макак-резусов, не был обнаружен в нашем масс-спектрометрическом анализе (см. Таблицу S1 для списка пептидов, идентифицированных с помощью LC-MS / MS). Это может быть объяснено низкими уровнями экспрессии Plxdc1 в клетках 293T, предполагаемыми ранее опубликованными данными RNAseq (фиг. S1A) и подтвержденными анализом ПЦР в реальном времени (qPCR) наших клеток 293T (фиг. S1B).Поэтому Plxdc1 был включен в последующие анализы. Plxdc1 человека и резуса (ref | NM_020405.5 |; ref | XM_028836436.1 |) и Plxdc2 (ref | NM_032812.9 |; ref | XM_028826043.1 |) идентичны на 96,80% и 97,92% на уровне аминокислотной последовательности, в то время как Plxdc1 и Plxdc2 происхождения человека и резуса имеют 57,34% и 56,04% идентичности последовательностей, соответственно (полное выравнивание и соединения доменов см. На фиг. S1C).

Рис. 1. Рецепторы семейства Plxdc являются новыми партнерами по взаимодействию для RRV gH / gL.

A) Иммунопреципитация рекомбинантного растворимого RRV 26–95 gH-FcStrep в присутствии или в отсутствие лизата 293T.Осадки анализировали с помощью PAGE, окрашивали серебром, и полосы с указанной молекулярной массой (стрелки, области а-е) вырезали и анализировали масс-спектрометрией. Цифры в скобках указывают количество пептидов Plxdc2, идентифицированных с помощью ЖХ-МС / МС в каждой области. B) V5-tagged RRV 26–95 gH, RRV 17577 gH или KSHV gH, отдельно или совместно с соответствующей помеченной Flag конструкцией gL, подвергали иммунопреципитации в присутствии полноразмерных Plxdc1 или Plxdc2 человека (h) или Macaca mulatta (мм) происхождения с использованием моноклонального антитела к V5-метке.Осадки анализировали вестерн-блоттингом с указанными антителами. C-D) Связывание эктодомена C) Plxdc1 или эктодомена D) Plxdc2 в различных концентрациях с иммобилизованным RRV 26–95 gH-FcStrep / gL измеряли с помощью иммуноферментного анализа. Подгонка кривой и определение полумаксимальной концентрации связывания выполняли на основании One site-специфического связывания с уравнением Хилла-Склона в Prism6. E) Коиммунопреципитация растворимого Plxdc1-FcStrep человека или Plxdc2-FcStrep человека с RRV 26–95 gH-V5 / gL-Flag или RRV 17577 gH-V5 / gL-Flag с использованием StrepTactin sepharose в присутствии или в отсутствие человеческого полноразмерный Myc-tagged EphB3.Сокращения: IP: иммунопреципитация, IB: иммуноблоттинг, h: человек, мм: Macaca mulatta (макака-резус).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008979.g001

Коиммунопреципитация меченных V5 экспрессионных конструкций gH из KSHV и из двух изолятов RRV 26–95 и 17577 в присутствии или в отсутствие соответствующие Flag-меченые белки gL с меченными myc Plxdc1 или Plxdc2 человека или резуса (hPlxdc1-myc / hPlxdc2-myc / mmPlxdc1-myc / mmPlxdc2-myc) из трансфицированных клеток Pl 293T подтвердили взаимодействие обоих RRV gH / gdc (Рис. 1B).В то время как предсказанная молекулярная масса Plxdc1 и Plxdc2 составляет 56 кДа и 60 кДа, соответственно, мы и другие обнаруживаем Plxdc1 / 2 при кажущейся молекулярной массе ~ 100 кДа [31]. Ни KSHV gH / gL, ни RRV 17577 gH / gL не взаимодействовали обнаружимо с Plxdc1-myc, в то время как RRV 26–95 заметно связывает как Plxdc1, так и Plxdc2 в присутствии и в отсутствие gL. Измерение связывания очищенного эктодомена hPlxdc1 и hPlxdc2 с иммобилизованным RRV 26–95 gH-FcStrep / gL с помощью иммуноферментного анализа (рис. 1C и 1D) показало, что концентрация связывания составляет половину максимальной, равную 22.2 нМ для Plxdc1 и 5,2 нМ для Plxdc2, как рассчитано для одного сайт-специфического связывания без заранее определенного наклона Хилла.

Для оценки эффекта связывания Plxdc с RRV gH на взаимодействие с EphB3, высокоаффинным рецептором семейства Eph для RRV gH / gL [15], мы использовали растворимые человеческие Plxdc1 или Plxdc2, состоящие из внеклеточной части Plxdc1 или Plxdc2, слитый с Fc-частью человеческого IgG, за которым следует метка TwinStrep (hPlxdc1-FcStrep / hPlxdc2-FcStrep) в экспериментах по иммунопреципитации. Коиммунопреципитация hPlxdc1-FcStrep / hPlxdc2-FcStrep с комплексами gH-V5 / gL-Flag изолятов RRV 26–95 и 17577 в присутствии или в отсутствие myc-tagged EphB3 от трансфицированных клеток 293T продемонстрировала существование четвертичного комплекса , что указывает на способность RRV gH / gL взаимодействовать с членами обоих семейств рецепторов одновременно.Поскольку комплекс был осажден через меченные Strep Plxdc1 или Plxdc2 — и Plxdc1 / 2 сам по себе не взаимодействует с EphB3, — EphB3 будет совместно осаждаться только тогда, когда образуется комплекс между RRV gH / gL и EphB3 и Plxdc1 или Plxdc2 (рис. 1E).

В то время как взаимодействие очищенных белков и трансфицированных клеточных лизатов явно свидетельствует о функциональном взаимодействии, биологически релевантное взаимодействие для процесса входа может происходить с вирионом gH / gL. Чтобы оценить функциональность взаимодействия gH / gL-Plxdc на вирусных частицах как для RRV дикого типа, так и для Eph-связывающего отрицательного мутанта RRV, мы использовали RRV-YFP, штамм RRV 26–95, сконструированный для конститутивной экспрессии YFP при инфицировании, и RRV-YFP gH-AELAAN, Eph-связывающий отрицательный мутант RRV-YFP, который мы описали ранее (рис. 2A) [23].Чтобы проанализировать влияние конкуренции с растворимым рецептором-ловушкой Plxdc, препараты RRV-YFP wt и RRV-YFP gH-AELAAN инкубировали с серией концентраций растворимого hPlxdc2-FcStrep или контроля FcStrep до инфицирования клеток HaCaT (рис. 2B). Согласно данным РНК-Seq 36 клеточных линий (любезно предоставлено Human Protein Atlas, www.proteinatlas.org [33], получено в 2020 г.), клетки HaCaT демонстрируют самую высокую специфическую экспрессию Plxdc2 в клеточной линии среди проанализированных нераковых клеточных линий. и поэтому были выбраны для дальнейшего анализа.Растворимый hPlxdc2-FcStrep ингибировал инфекцию RRV-YFP wt до ~ 60% дозозависимым образом по сравнению с одним только FcStrep. Аналогичным образом, предварительная инкубация RRV-YFP gH-AELAAN с hPlxdc2-FcStrep снизила инфекцию примерно на 65%. Инфекция RRV-YFP wt и RRV-YFP gH-AELAAN была нормализована до ~ MOI 0,2. В параллельном сравнении ингибирование взаимодействия gH / gL-Eph, которое служило контролем, привело к ~ 50% снижению инфицирования RRV-YFP wt при концентрации 10 нМ hEphB3-Fc, в то время как 100 нМ растворимого hPlxdc2-FcStrep продемонстрировали аналогичную эффективность блокировки (рис. 2C, группа в левом столбце).Преинкубация как с hEphB3-Fc, так и с hPlxdc2-FcStrep дополнительно снижает инфекцию RRV-YFP wt на клетках HaCaT по сравнению с преинкубацией только с hEphB3-Fc или hPlxdc2-FcStrep (рис. 2C, группа в левом столбце). В то время как преинкубация с EphB3-Fc не уменьшала инфекцию RRV-YFP gH-AELAAN, преинкубация либо с hPlxdc2-FcStrep, либо с комбинацией hPlxdc2-FcStrep и hEphB3-Fc снижала инфекцию примерно на 50%, как это наблюдалось для инфекции RRV-YFP wt (рис. 2C, правая группа столбцов). Инфекция клеток SLK и фибробластов макака-резуса (RF) также немного снижалась путем предварительной инкубации вирусного инокулята с hPlxdc2-FcStrep, инфицирования SLK с помощью RRV-YFP wt до 63.5% ± 3,7% и инфицирование RF с помощью RRV-YFP wt до 73,9% ± 11,3% относительно преинкубации с FcStrep в качестве контроля. Однако этот эффект был менее выраженным, чем на HaCaT, и менее выраженным, чем эффект hPlxdc2-FcStrep на инфицирование RRV-YFP gH-AELAAN тех же типов клеток (рис. 2D). Взятые вместе, эксперименты по иммунопреципитации и блокированию подтверждают независимость взаимодействия gH-Plxdc от ранее описанного мотива взаимодействия Eph [23] и связывания EphB3.

Рис. 2. Plxdc1 / 2 действует как рецепторы входа для RRV.

A) Список рекомбинантных вирусов, полученных из ВАС, и введенных мутаций, используемых на этом рисунке. B) Дозозависимое ингибирование инфекции RRV 26–95 растворимым человеческим Plxdc2-FcStrep на клетках HaCaT. RRV-YFP wt и RRV-YFP gH-AELAAN предварительно инкубировали с hPlxdc2-FcStrep в течение 30 минут при комнатной температуре. В качестве контроля использовали только FcStrep. Экспрессию YFP как индикатор инфекции измеряли с помощью проточной цитометрии. Инфекция в присутствии 0,4 нМ FcStrep была установлена ​​на 100% (MOI ~ 0.2, трижды, столбцы ошибок представляют SD). C) Ингибирование инфекции RRV 26–95 растворимыми Plxdc2-FcStrep и EphB3-Fc на клетках HaCaT. RRV-YFP wt и RRV-YFP gH-AELAAN предварительно инкубировали с 100 нМ hPlxdc2-FcStrep, 10 нМ EphB3-Fc или комбинацией 100 нМ hPlxdc2-FcStrep и 10 нМ EphB3-Fc в течение 30 минут при комнатной температуре. В качестве контроля использовали только FcStrep. Экспрессию YFP как индикатор инфекции измеряли с помощью проточной цитометрии. Заражение FcStrep было установлено на 100% (MOI ~ 0,2, трижды, столбцы ошибок представляют SD). D) Ингибирование инфекции RRV 26–95 растворимым человеческим Plxdc2-FcStrep на клетках SLK и фибробластах макака-резуса (RF). RRV-YFP wt и RRV-YFP gH-AELAAN предварительно инкубировали с 250 нМ hPlxdc2-FcStrep в течение 30 минут при комнатной температуре. В качестве контроля использовали только FcStrep. Экспрессию YFP как индикатор инфекции измеряли с помощью проточной цитометрии. Заражение FcStrep было установлено на 100% (MOI ~ 0,05–0,1, трижды, столбцы ошибок представляют стандартное отклонение). EF. wt и RRV-YFP 26–95 gH-AELAAN (E) или RRV-YFP 17577 (F), нормализованные по копиям генома, как определено с помощью кПЦР.Микрофотографии показывают типичное инфицирование указанных пулов клеток. G) Лизаты трансдуцированных пулов клеток Raji анализировали на экспрессию EphA7-Strep и Plxdc1 / 2-Strep с помощью вестерн-блоттинга. H) Количественная оценка (E) с помощью проточно-цитометрического анализа экспрессии репортерного гена YFP как индикатора инфекции (трижды, полосы ошибок представляют SD). I) Количественная оценка (F) с помощью проточно-цитометрического анализа экспрессии репортерного гена YFP как индикатора инфекции (трижды, полосы ошибок представляют SD).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008979.g002

Чтобы установить функцию рецептора, мы выполнили эксперименты по увеличению функции с использованием эктопической сверхэкспрессии Plxdc1 / 2 (Рис. 2E – 2I). Клетки Raji трансдуцировали лентивирусами, кодирующими конструкции Plxdc1 / 2 человека, меченные TwinStrep (hPlxdc1-Strep / hPlxdc2-Strep). Меченную TwinStrep конструкцию EphA7 человека (hEphA7-Strep) использовали в качестве контроля для Eph-опосредованной инфекции RRV (фиг. 2G). EBV-положительная линия лимфобластных клеток человека допускает инфицирование только RRV 26–95 на низком уровне, даже при количествах входящего вируса, соответствующих высокой MOI на прикрепленных клетках, таких как SLK, HaCaT или RF.Следовательно, изменения восприимчивости к инфекции, опосредованные сверхэкспрессией Plxdc1 / 2, должны легко обнаруживаться и позволять четко дифференцировать вклад Plxdc1 / 2 в инфекцию RRV по сравнению с очень низкой внутренней восприимчивостью к инфекции. В самом деле, эктопическая экспрессия как hPlxdc1-, так и hPlxdc2-Strep резко увеличивает инфекцию RRV-YFP 26–95 wt с ~ 1,4% базальной инфекции до 42,9% и 28,2% инфекции, соответственно (Fig. 2E и 2H). Точно так же инфекция RRV-YFP gH-AELAAN была увеличена с 0.От 04% для клеток, трансдуцированных пустым вектором, до 32,5% и 14,4% для клеток, трансдуцированных конструкциями, кодирующими hPlxdc1-Strep и hPlxdc2-Strep, соответственно. EphA7, который ранее был описан нашей группой как критический для RRV-инфекции BJAB-лимфоцитов, увеличивал инфекцию RRV-YFP wt до 44,4%, в то время как инфицирование Eph-связывающим отрицательным мутантом RRV-YFP gH-AELAAN не затрагивалось (рис. 2E и 2H). Мы не наблюдали явных различий в инфицировании RRV-YFP 26–95, опосредованном hPlxdc1-Strep или hPlxdc2-Strep, что указывает на отсутствие четкого предпочтения рецепторов Plxdc для RRV 26–95.Инфекция RRV-YFP 17577 увеличивалась в 8,4 раза при рекомбинантной экспрессии hEphA7-Strep и в 7,9 раза при рекомбинантной экспрессии hPlxdc2-Strep, но оставалась незатронутой экспрессией hPlxdc1-Strep (фиг. 2F и 2I). Взятые вместе, наблюдаемое использование рецептора на клетках Raji, сверхэкспрессирующих hPlxdc1 / 2-Strep, посредством RRV-YFP 26–95 и RRV-YFP 17577 отражает паттерны взаимодействия Plxdc1 / 2 комплексов RRV 26–95 и RRV 17577 gH / gL, наблюдаемые в эксперименты по иммунопреципитации (рис. 1В).

На следующем этапе мы охарактеризовали связывающий мотив Plxdc на RRV gH.Поскольку взаимодействие RRV 17577 gH-Plxdc2 зависит от gL, тогда как взаимодействие RRV 26–95 gH-Plxdc2 не зависит, мы сосредоточились на N-концевом домене I gH, который, по аналогии с EBV gH / gL [34], наиболее вероятно составляет интерфейс привязки gL. Различия во взаимодействии Plxdc изолятов RRV 26–95 и 17577, а также отсутствие взаимодействия между KSHV gH / gL и рецепторами Plxdc предполагают, что мотив, который только частично консервативен между изолятами RRV и отсутствует в KSHV. Используя сравнение последовательностей (рис. 3A), мы идентифицировали предполагаемый мотив взаимодействия, охватывающий мотив из 7 или 6 аминокислот в N-концевой области RRV 26–95 gH и RRV 17577 gH, соответственно, который не является консервативным в KSHV gH.Мотив расположен рядом с мотивом Eph-взаимодействия, который мы описали ранее, и обращен в противоположном направлении в модели гомологии комплекса RRV 26–95 gH / gL, основанной на кристаллической структуре EBV gH / gL (3PHF) (рис. 3B). . Удаление этого мотива полностью аннулировало взаимодействие с Plxdcs как RRV 26–95 gH (Рис. 3C), так и RRV 17577 gH / gL (Рис. 3D). Чтобы дополнительно охарактеризовать вклад отдельных остатков в «Tyr (Y) -Glu (E) -Tyr (Y) -Asn (N) -Glu (E) -Glu (E) -Lys (K)») (RRV 26– 95), мы осуществили одиночные аминокислотные замены на аланин.Способность мутантного RRV 26–95 gH-V5 связывать меченный myc Plxdc1 / 2 человека (hPlxdc1 / 2-myc) (рис. 3E) или макака-резус происхождения (mmPlxdc1 / 2-myc) анализировали с помощью иммунопреципитация gH с помощью V5-метки и вестерн-блоттинга. В то время как несколько одиночных аминокислотных замен снижали взаимодействие RRV gH с Plxdcs до некоторой степени, остатки Tyr23 и Glu25, которые консервативны в изолятах 26-95 и 17577, по-видимому, являются критическими для взаимодействия gH с Plxdc1 и Plxdc2 человека и макака-резуса.Кроме того, замена глутамата на аланин в положении 22, которая не является консервативной между изолятами 26–95 и 17577, имела выраженный, хотя и немного более слабый эффект на взаимодействие gH-Plxdc1 / 2 (рис. 3E и 3F).

Рис. 3. Мотив аминокислотной последовательности в N-концевой области RRV 26–95 и RRV 17577 gH необходим для взаимодействия Plxdc.

A) Множественное выравнивание последовательностей N-концевой области gH KSHV и двух изолятов RRV 26–95 и 17577.Прямоугольники указывают мотивы связывания рецепторов Eph (зеленый) и рецепторов Plxdc (синий). Цифры над последовательностями представляют положения в выравнивании, звездочки указывают на консервативные аминокислоты. Отдельные аминокислотные положения даны слева и справа от соответствующей последовательности gH. B) Прогнозирование структуры комплекса RRV 26–95 gH / gL на основе гомологии на основе кристаллической структуры комплекса EBV gH / gL (номер PDB 3PHF) с использованием сервера Iterative Threading ASSembly Refinement (I-TASSER) и Алгоритмы CO-THreader (COTH) для структуры белково-белкового комплекса и многоцепочечной потоковой передачи белков.Мотив взаимодействия рецептора Eph показан зеленым, мотив взаимодействия Plxdc показан синим, gL показан красным, gH показан серым. C) Делеция мотива взаимодействия Plxdc в RRV 26–95 gH (аминокислота 21–27, «YEYNEEK») отменяет взаимодействие gH с Plxdc1 и Plxdc2. Меченый V5 gH wt или gHΔ21–27 иммунопреципитировали в присутствии полноразмерного человеческого или Macaca mulatta Plxdc1-myc или Plxdc2-myc с использованием моноклональных антител к V5-метке. Осадки анализировали вестерн-блоттингом. D) Делеция мотива взаимодействия Plxdc в RRV 17577 gH (аминокислота 21–26, «YVYDEK») отменяет взаимодействие gH с Plxdc2. V5-tagged gH wt или gHΔ21–26 коэкспрессировался с Flag-tagged RRV 17577 gL. Комплексы gH-V5 / gL-Flag иммунопреципитировали в присутствии полноразмерного человеческого или Macaca mulatta, Plxdc1-myc или Plxdc2-myc с использованием моноклональных антител к V5-метке. Осадки анализировали вестерн-блоттингом. E) Мутационное сканирование мотива взаимодействия Plxdc (аминокислота 21–27, «YEYNEEK») RRV 26–95 gH позволяет идентифицировать остатки, взаимодействующие с Plxdc1 / 2 человека.Меченные V5 мутанты gH иммунопреципитировали в присутствии полноразмерного человеческого Plxdc1-myc или Plxdc2-myc с использованием моноклональных антител к V5-метке. Осадки анализировали вестерн-блоттингом. RRV gHΔ21–27 служит отрицательным контролем. F) Мутационное сканирование мотива взаимодействия Plxdc (аминокислота 21–27, «YEYNEEK») RRV 26–95 gH идентифицирует взаимодействующие остатки Plxdc1 / 2 макака-резуса. Меченные V5 мутанты gH иммунопреципитировали в присутствии полноразмерных Macaca mulatta Plxdc1-myc или Plxdc2-myc с использованием моноклональных антител к V5-метке.Осадки анализировали вестерн-блоттингом. RRV gHΔ21–27 служит отрицательным контролем. Сокращения: IP: иммунопреципитация, IB: иммуноблоттинг, h: человек, мм: Macaca mulatta (макака-резус).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008979.g003

Для дальнейшего анализа вклада взаимодействия gH / gL-Plxdc в контекст инфекции мы сконструировали мутанты вируса, удаленные в мотиве взаимодействия из семи аминокислот в на фоне RRV-YFP 26–95 дикого типа (RRV-YFP gHΔ21–27) и на фоне штамма RRV-YFP 26–95, мутировавшего в мотив взаимодействия Eph, описанный ранее нашей группой (RRV-YFP gH- AELAAN, RRV-YFP gHΔ21-27-AELAAN) с использованием двухступенчатой ​​системы рекомбинации, опосредованной лямбда-красным [35] (рис. 4A).Эксперименты по блокированию с использованием растворимого рецептора-ловушки hPlxdc2-FcStrep на клетках HaCaT подтвердили, что делеции мотива из семи аминокислот было достаточно для отмены взаимодействия gH-Plxdc2 на вирусных частицах (рис. 4B). В то время как инфицирование RRV-YFP wt и RRV-YFP gH-AELAAN ингибировалось на ~ 60% и 70% соответственно, инфицирование RRV-YFP gHΔ21–27 и RRV-YFP gHΔ21-27-AELAAN не влияло даже на высокие концентрации растворимый hPlxdc2-FcStrep (фиг. 4B). Все заражения проводились при ~ MOI 0,05. Аналогично, мутанты RRV, отрицательные по связыванию Eph- или Plxdc-рецепторов, больше не ингибировались преинкубацией с соответствующим растворимым рецептором (hEphB3-Fc или hPlxdc2-FcStrep) в экспериментах по одиночному или двойному ингибированию на клетках HaCaT (рис. 4C).Чтобы проанализировать прямой эффект вмешательства с рецепторами Plxdc на клеточной стороне для инфекции RRV, мы выполнили опосредованный siRNA нокдаун Plxdc2 (S2 фиг.). Мы выбрали клетки 293T из-за их высокой эффективности трансфекции и подтвердили экспрессию Plxdc2 с помощью кПЦР в соответствии с нашим первоначальным масс-спектрометрическим экспериментом (рис. 1A и S1, рис.). Снижение уровня мРНК Plxdc2 на ~ 50% после трансфекции набора из 4 миРНК, направленных против Plxdc2 (фиг. S2A), привело к небольшому (17,6% ± 0,02%), но значительному снижению инфицирования RRV-YFP gH-AELAAN по сравнению с инфицированным siCtrl. клеток, что соответствовало использованию двух разных исходных материалов RRV в двух вирусных разведениях каждый (S2B и S2C фиг.).Контрольная инфекция мутантами RRV с лишенной мишенью Plxdc (RRV-YFP gHΔ21–27, RRV-YFP gHΔ21-27-AELAAN) не была затронута. Точно так же нокдаун одного Plxdc2 не приводил к снижению инфицирования RRV-YFP wt, что, вероятно, объясняется экспрессией множества рецепторов семейства Eph на 293T и относительно слабым нокдауном (S1A и S2A фиг.). Затем мы провели эксперименты по блокированию, опосредованному антителами, с использованием двух изготовленных на заказ поликлональных кроличьих сывороток (SY8512, SY8513), полученных против рекомбинантного Plxdc2-FcStrep на клетках 293T (S2D – S2F, фиг.).По сравнению с преиммунной сывороткой от тех же кроликов, сыворотка SY8512 привела к снижению на 41,3% ± 2,8% инфекции RRV-YFP wt и к снижению инфекции RRV-YFP gH-AELAAN на 60,0% ± 3,1%, в то время как инфицирование RRV- YFP gHΔ21–27 и RRV-YFP gHΔ21-27-AELAAN существенно не изменились (S2D, фиг.). Точно так же сыворотка SY8513 уменьшала инфекцию RRV-YFP wt и RRV-YFP gH-AELAAN на 34,6% ± 1,6% и 40,0% ± 5,7% по сравнению с доиммунной сывороткой. Хотя предварительная обработка клеток 293T сывороткой SY8513 не оказала значительного влияния на инфицирование RRV-YFP gHΔ21–27, она привела к 30.6% ± 6,9% снижение инфицирования Plxdc-связывающим отрицательным RRV-YFP gHΔ21-27-AELAAN (S2E фиг.). В целом, мы наблюдали слабое снижение инфицирования RRV gH-AELAAN за счет siRNA-опосредованного нокдауна экспрессии Plxdc2 и сравнительно сильное и специфическое ингибирование одной из двух кроличьих антисывороток к Plxdc2.

Рис. 4. Делеции из семи аминокислот Plxdc-связывающего мотива достаточно, чтобы отсоединить RRV 26–95 от рецепторов Plxdc.

A) Список рекомбинантных вирусов, полученных из ВАС, и введенных мутаций, используемых на этом рисунке. B) Дозозависимое ингибирование инфекции RRV 26–95 растворимым человеческим Plxdc2-FcStrep на клетках HaCaT. RRV-YFP wt, RRV-YFP gH-AELAAN, RRV-YFP gHΔ21–27 и RRV-YFP gHΔ21-27-AELAAN предварительно инкубировали с hPlxdc2-FcStrep в течение 30 минут при комнатной температуре. В качестве контроля использовали только FcStrep. Экспрессию YFP как индикатор инфекции измеряли с помощью проточной цитометрии. Инфекция в присутствии 0,4 нМ FcStrep была установлена ​​на 100% (MOI ~ 0,05, трижды, столбцы ошибок представляют стандартное отклонение). C) Ингибирование инфекции RRV 26–95 растворимыми Plxdc2-FcStrep и EphB3-Fc на клетках HaCaT.RRV-YFP wt, RRV-YFP gH-AELAAN, RRV-YFP gHΔ21–27 и RRV-YFP gHΔ21-27-AELAAN были предварительно инкубированы с 100 нМ hPlxdc2-FcStrep, 10 нМ EphB3-Fc или комбинацией 100 нМ hPlxStrecM-hPl. 10 нМ EphB3-Fc в течение 30 минут при комнатной температуре. В качестве контроля использовали только FcStrep. Экспрессию YFP как индикатор инфекции измеряли с помощью проточной цитометрии. Заражение FcStrep было установлено на 100% (MOI ~ 0,1–0,2, трижды, столбцы ошибок представляют стандартное отклонение). D) Клетки Raji трансдуцировали экспрессирующими конструкциями EphA7, Plxdc1 или Plxdc2 человека, меченными TwinStrep (hEphA7-Strep / hPlxdc1-Strep / hPlxdc2-Strep), или пустым векторным контролем, на короткое время отбирали и инфицировали RRRV-YFP wt, RRRV-YFP wt, RRRV-YFP wt, RRRV -YFP gH-AELAAN, RRV-YFP gHΔ21–27 или RRV-YFP gHΔ21-27-AELAAN, нормализованные по копиям генома, как определено с помощью qPCR.Экспрессию YFP как индикатор инфекции измеряли с помощью проточной цитометрии. Среднее значение по трем независимым группам запасов RRV указано в столбцах. Средние значения индивидуальных трехкратных инфекций для каждого набора запасов RRV даны в виде символов в соответствующих столбцах. E) Микрофотографии показывают репрезентативную инфекцию одного набора запасов RRV в (D).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008979.g004

Рецептор-специфичность, передаваемая соответствующим мотивом взаимодействия, была дополнительно проанализирована в экспериментах по сверхэкспрессии Plxdc1 / 2-Strep, опосредованной лентивирусным вектором, в лимфоцитах Raji B.EphA7 использовали в качестве контроля для Eph-опосредованной инфекции. Экспрессия Plxdc1 / 2-Strep, а также EphA7-Strep резко увеличивала чувствительность клеток Raji (рис. 4D и 4E). Инфекция RRV-YFP wt увеличивалась с 0,14 ± 0,04% на клетках Raji, трансдуцированных пустым вектором, до ~ 8,5% при сверхэкспрессии EphA7 и до ~ 17% при сверхэкспрессии Plxdc1 / 2, без явных различий между членами семейства Plxdc. Мутация мотива взаимодействия Eph в RRV-YFP gH-AELAAN полностью аннулировала увеличение восприимчивости к сверхэкспрессирующим EphA7 клеткам, в то время как мутация мотива взаимодействия Plxdc полностью аннулировала усиление восприимчивости к сверхэкспрессирующим Plxdc1 / 2 клеткам, подтверждая избирательный нокаут каждой из них. индивидуальное рецепторное взаимодействие в соответствующем мутанте.Кроме того, делеция мотива взаимодействия Eph в RRV-YFP gH-AELAAN не влияла на инфицирование клеток, сверхэкспрессирующих Plxdc1 / 2, по сравнению с инфекцией RRV-YFP wt. Напротив, мы наблюдали примерно в 2 раза более высокую инфекцию RRV-YFP gHΔ21–27 на клетках со сверхэкспрессией EphA7 по сравнению с RRV-YFP wt. Вместе эксперименты по блокированию и сверхэкспрессии указывают на независимую, а не кооперативную природу функции рецепторов Eph и Plxdc.

Для количественного анализа вклада Plxdc1 / 2-взаимодействия в инфицирование RRV различных типов клеток, инокулят мутанта, связывающего рецептор RRV-YFP wt и RRV-YFP, был нормализован до копий генома, как определено с помощью qPCR, и клетки-мишени были инокулированы одинаковое количество инкапсидированных исходных вирусных геномов для дикого вируса и каждого штамма мутантного вируса.По крайней мере, три (четыре для SLK, HaCaT, Raji, MMB1845, пять для MFB5487) независимых наборов RRV wt и мутантных стоков использовали в экспериментах по заражению при различных разведениях, чтобы компенсировать вариабельность при приготовлении маточного раствора. Для прикрепленных клеток для дальнейшего анализа были выбраны разведения, которые вызывали инфекцию RRV-YFP wt в диапазоне MOI от 0,05 до 1 на соответствующей клеточной линии. Инфекция, определяемая по процентному содержанию клеток YFP +, была нормализована к RRV-YFP wt, которая была установлена ​​на 1. Для суспензионных клеточных линий в анализ были включены эксперименты с инфекцией RRV-YFP wt более 1%.Ни одна из проанализированных адгезивных клеточных линий не показала предпочтительного использования рецепторов Plxdc по сравнению с рецепторами Eph на основании снижения специфической инфекционности Eph-связывающих и мутантов, дефицитных по Plxdc-взаимодействию (фиг. 5A). По сравнению с инфекцией RRV-YFP wt фибробластов макака-резуса (RF), RRV-YFP gHΔ21–27, RRV-YFP gH-AELAAN и RRV-YFP gHΔ21-27-AELAAN продемонстрировали снижение инфицирования на ~ 30%, 50% и 70% соответственно. Аналогичным образом, на HaCaT инфицирование RRV-YFP gH-AELAAN и RRV-YFP gHΔ21-27-AELAAN было снижено на ~ 60% и 75%, соответственно, по сравнению с RRV-YFP wt.Хотя RRV-YFP gHΔ21–27 обнаружил дефект, сравнимый с RRV-YFP gH-AELAAN в трех проанализированных независимых наборах запасов RRV, это снижение инфекционности не достигло значимости из-за одного выброса. В соответствии с уменьшением инфицирования мутантов Eph- и Plxdc-связывающих вирусов на клетках HaCaT, экспрессия EPHB3 и PLXDC2 была обнаружена в клетках HaCaT в опубликованных наборах данных (GSE95080, GSE138800) и с помощью подтверждающей количественной ПЦР наших образцов (S3A и S3B). Инжир). На клетках SLK мутация мотива взаимодействия Eph приводила к ~ 65% снижению инфицирования, в то время как инфекция RRV-YFP gHΔ21-27 была в среднем сопоставима с инфекцией RRV-YFP wt.Напротив, мы идентифицировали линии B-лимфоцитов человека и макака, которые проявляют предпочтение в использовании рецепторов для членов семейства Eph или Plxdc (рис. 5B). При нормализации до копий генома инфекция RRV-YFP gHΔ21–27 на лимфобластах Raji человека была сопоставима с инфекцией RRV-YFP wt, в то время как мутация мотива взаимодействия Eph приводила к ~ 90% снижению инфицирования, что указывает на преимущественное инфицирование через рецепторы семейства Eph. , хотя и на низком уровне, как упоминалось выше. Соответственно, за исключением EPHB4 , экспрессия всех членов семейств рецепторов Eph и Plxdc низкая или отсутствует в клетках Raji, как в опубликованном наборе данных (GSE111880), так и в нашем анализе подмножества с помощью кПЦР (S3C и S3D, рис.) .Подобно клеткам Raji, RRV-YFP gHΔ21–27 обнаруживал только незначительный дефект (~ 20% снижение инфицирования) на иммортализованных B-лимфоцитах происхождения Macaca mulatta (MMB1845), который не достиг значимости, в то время как инфицирование RRV-YFP gH- AELAAN и gHΔ21-27-AELAAN были снижены на ~ 90% по сравнению с RRV-YFP wt, что снова указывает на преимущественное инфицирование через рецепторы семейства Eph. И наоборот, делеция мотива взаимодействия Plxdc уменьшала инфицирование линии клеток B-лимфоцитов Macaca fascicularis (MFB5487) на ~ 75%, тогда как RRV-YFP gH-AELAAN демонстрировала ~ 50% дефектов, что указывает на предпочтительное использование Plxdc. взаимодействие для заражения MFB5487 RRV.Эти данные согласуются с анализом экспрессии EPHA7 , EPHB3 , PLXDC1 и PLXDC2 экспрессии в клетках Raji и MFB5487, который показал сравнительно высокие уровни экспрессии PLXDC2 в клетках MFB5487 (фиг. S3D). Мутация мотива взаимодействия Eph и Plxdc (RRV-YFP gHΔ21-27-AELAAN) привела к еще более выраженному дефекту ~ 90% на MFB5487.

Рис. 5. Вклад взаимодействия RRV 26–95 gH-Plxdc в инфекцию зависит от типа клеток и может частично зависеть от эффектов прикрепления.

A) RRV 26–95, удаленный в мотив взаимодействия Plxdc, демонстрирует пониженную специфическую инфекционность в отношении HaCaT и RF, но не SLK-клеток. Клетки-мишени инфицировали RRV-YFP wt, RRV-YFP gH-AELAAN, RRV-YFP gHΔ21-27 или RRV-YFP gHΔ21-27-AELAAN, нормализованными по копиям генома, как определено с помощью qPCR. Экспрессию YFP в качестве индикатора инфекции измеряли с помощью проточной цитометрии и нормализовали для инфекции RRV-YFP wt. Средство индивидуальной нормализованной инфекции с тремя (RF) или четырьмя (HaCaT, SLK) независимыми наборами запасов RRV дано в виде символов разного цвета.Для анализа использовали наборы с инфекцией RRV-YFP wt в диапазоне MOI 0,05–1. Среднее значение по независимым наборам запасов RRV показано черными линиями. B) RRV 26–95, удаленный в мотив взаимодействия Plxdc, проявляет пониженную специфическую инфекционность на MFB5487, но не на клетках Raji и MMB1845. Клетки-мишени инфицировали RRV-YFP wt, RRV-YFP gH-AELAAN, RRV-YFP gHΔ21-27 или RRV-YFP gHΔ21-27-AELAAN, нормализованными по копиям генома, как определено с помощью qPCR. Экспрессию YFP в качестве индикатора инфекции измеряли с помощью проточной цитометрии и нормализовали для инфекции RRV-YFP wt.Средство индивидуальной нормализованной инфекции с четырьмя (Raji, MMB1845) или пятью (MFB5487) независимыми наборами запасов RRV представлено в виде символов разного цвета. Для анализа использовали наборы с инфекцией RRV-YFP wt, превышающей 1%. Максимально достигнутая инфекция RRV-YFP wt составила 6,1% для Raji, 5,6% для MMB1845 и 3,1% для MFB5487, соответственно. Среднее значение по независимым наборам запасов RRV показано черными линиями. C) Вестерн-блоттинг клеток Raji, трансдуцированных с помощью экспрессионных конструкций Plxdc1 и Plxdc2 человека, меченных TwinStrep (hPlxdc1-Strep / hPlxdc2-Strep), или пустого векторного контроля. D) На прикрепление RRV 26–95 к трансдуцированным клеткам Raji влияет hPlxdc1-Strep, но не сверхэкспрессия hPlxdc2-Strep. Клетки, проанализированные на (C), инкубировали с холодным вирусом в указанных концентрациях при 4 ° C в течение 30 минут с последующим выделением геномной ДНК. Связанные геномы / клетки, рассчитанные на основе количественной ПЦР генома (CCR5) и вирусного локуса (ORF73 / LANA), наносили на график против входного номера вирусного генома, определенного с помощью ORF73 / LANA qPCR. E) Повторное введение мотива из семи аминокислот, критических для взаимодействия Plxdc, спасает от инфекции RRV-YFP gHΔ21–27.Трансдуцированные клетки Raji, клетки MFB5487 и HaCaT инфицировали RRV-YFP wt, RRV-YFP gH-AELAAN, RRV-YFP gHΔ21–27, RRV-YFP gHΔ21-27-AELAAN или двумя ревертантами RRV-YFP gHΔ21–27 (RRV- YFP gHΔ21-27 rev9-4 , RRV-YFPgHΔ21-27 rev10-3 ), нормализованные до копий генома, как определено с помощью qPCR. Экспрессию YFP как индикатор инфекции измеряли с помощью проточной цитометрии (трижды, столбцы ошибок представляют собой стандартное отклонение).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008979.g005

Чтобы оценить вклад потенциальных эффектов прикрепления в наблюдаемые различия в специфической инфекционности, мы проанализировали способность вирионов связывать Plxdc1 / 2 со сверхэкспрессией клеток Raji в сравнение с пустыми клетками Raji, трансдуцированными вектором (фиг. 5C и 5D).Следует отметить, что трансдукция лентивирусным вектором, кодирующим Plxdc1, неизменно приводила к более высоким уровням экспрессии белка по оценке вестерн-блоттинга, чем трансдукция с помощью Plxdc2, кодирующего лентивирусный вектор (фиг. 5C). Число связанных геномов вирусной ДНК на клетку использовали в качестве маркера прикрепления вируса. Мутация мотива взаимодействия Plxdc и Eph не оказывала явного влияния на прикрепление к клеткам Raji, трансдуцированным контрольным вектором и сверхэкспрессирующим hPlxdc2-Strep. Напротив, клетки Raji, сверхэкспрессирующие hPlxdc1-Strep, показали повышенное прикрепление RRV-YFP wt и RRV-YFP gH-AELAAN, в то время как прикрепление отрицательных по взаимодействию Plxdc мутантов RRV-YFP gHΔ21–27 и gHΔ21-27-AELAAN не усиливалось и сохранялось. сравнимо с контролем с пустым вектором и клетками, сверхэкспрессирующими hPlxdc2-Strep.

Чтобы исключить эффекты потенциальных внеплощадочных перестроек генома в RRV-YFP gHΔ21–27, мы создали два независимых ревертанта (RRV-YFP gHΔ21-27 rev9-4 и RRV-YFP gHΔ21-27 rev10-3 ). Восстановление остатков, удаленных в RRV-YFP gHΔ21–27, восстановило инфекцию на трансдуцированных hPlxdc1 / 2 клетках Raji, MFB5487 и HaCaT до уровней RRV-YFP wt, без явных различий между RRV-YFP wt, RRV-YFP gHΔ21-27 rev9-4 и RRV-YFP gHΔ21-27 rev10-3 (рис. 5E).Подобно ~ 11-кратному увеличению инфицирования RRV-YFP wt при сверхэкспрессии hPlxdc1 / 2, инфицирование ревертантами RRV-YFP gHΔ21-27 увеличивалось с 2,00% ± 0,30% (2,54% ± 0,29%) на клетках Raji, трансдуцированных пустым вектором, до 35,3% ± 1,21% (37,0% ± 0,39%) и 37,3% ± 0,68% (43,0% ± 0,99%) при сверхэкспрессии hPlxdc1 и hPlxdc2 для RRV-YFP gHΔ21-27 rev9-4 (RRV-YFP gHΔ21-27 rev10-3 ) соответственно (рис. 5E).

Наши данные о взаимодействии (рис. 1A и 1B) показывают, что по крайней мере RRV 26–95 gH может связывать Plxdc1 / 2 в отсутствие gL.Поэтому мы стремились проанализировать, зависит ли инфицирование мутантом с делецией 26–95 gL RRV (RRV-YFP ΔgL) экспрессией Plxdc1 и 2 в той же степени, что и инфекция RRV-YFP wt и RRV-YFP gH-AELAAN. Как показано ранее, сверхэкспрессия hEphA7-Strep или hPlxdc1 / 2-Strep в клетках Raji резко увеличивала инфекцию RRV-YFP wt по сравнению с клетками, трансдуцированными пустым вектором (в 22 раза для hEphA7-Strep, в 23 раза для hPlxdc1-Strep и 26- fold для hPlxdc2-Strep) (рис. 6A, 6B и S4, рис.). Инфекция RRV-YFP gH-AELAAN была увеличена с 0.25% ± 0,05% базальной инфекции на клетках, трансдуцированных пустым вектором, до 52,5% ± 2,06% и 65,5% ± 1,22%, соответственно, при сверхэкспрессии hPlxdc1-Strep или hPlxdc2-Strep, в то время как избыточная экспрессия hEphA7-Strep не оказывала выраженного влияния на инфекцию. Мы наблюдали картину, аналогичную RRV-YFP gH-AELAAN для заражения двумя независимыми клонами RRV-YFP ΔgL, RRV-YFP ΔgL 3-3 и RRV-YFP ΔgL 3-5 . В то время как сверхэкспрессия hEphA7-Strep не влияла на инфекцию RRV-YFP ΔgL, гиперэкспрессия hPlxdc1 / 2-Strep усиливала инфекцию с 0.36% ± 0,03% (0,48% ± 0,04%) на пустом векторе трансдуцировали клетки Raji до 31,1% ± 0,95% (36,3% ± 1,42%) и 35,6% ± 0,94% (42,6% ± 0,57%) при сверхэкспрессии hPlxdc1 и hPlxdc2 для RRV-YFP ΔgL 3-3 (RRV-YFP ΔgL 3-5 ), соответственно (фиг. 6B). Хотя эффект сверхэкспрессии Plxdc1 / 2 на инфекцию ΔgL RRV-YFP был немного менее выражен, чем эффект на инфекцию RRV-YFP wt и RRV-YFP gH-AELAAN, эти данные демонстрируют, что использование Plxdc1 и Plxdc2 в качестве RRV 26– 95 рецепторов входа возможны gL-независимым образом.

Рис. 6. Plxdc1 / 2-зависимая инфекция RRV 26–95 не требует gL.

A) клеток Raji трансдуцировали экспрессирующими конструкциями EphA7 человека, меченными TwinStrep, Plxdc1 и Plxdc2 (hEphA7-Strep / hPlxdc1-Strep / hPlxdc2-Strep) или пустым векторным контролем и быстро отбирали по устойчивости к антибиотикам. Лизаты трансдуцированных пулов клеток Raji анализировали на экспрессию EphA7-Strep и Plxdc1 / 2-Strep с помощью вестерн-блоттинга. B) Трансдуцированные клетки Raji, проанализированные в (A), были инфицированы RRV-YFP wt, RRV-YFP gH-AELAAN, RRV-YFP gHΔ21–27 или одним из двух клонов RRV-YFP ΔgL, нормализованных к копиям генома, как определено с помощью qPCR. .Экспрессию YFP как индикатор инфекции измеряли с помощью проточной цитометрии (трижды, столбцы ошибок представляют собой стандартное отклонение). C-E) Анализ слияния клеток: трансфицированные эффекторные клетки 293T культивировали совместно с трансдуцированными клетками-мишенями Raji, как указано. Слияние клетки с клеткой оценивали через два дня совместного культивирования. Экспрессию белка эффекторных клеток 293T, трансфицированных пустым вектором или указанными комбинациями вирусных гликопротеинов (C), или трансдуцированных клеток-мишеней Raji (D), анализировали с помощью вестерн-блоттинга.Контроли экспрессии собирали непосредственно перед началом совместного культивирования. Люциферазную активность как индикатор слияния клеток измеряли через 48 часов совместного культивирования эффекторных клеток и клеток-мишеней (E). Люциферазная активность нормализована для эффекторных клеток 293T, трансфицированных пустым вектором (n = 3, столбики ошибок представляют SD).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008979.g006

Наши данные, указывающие на то, что Plxdc-опосредованная запись RRV не зависит от gL, интересны, поскольку комплекс gH / gL / gB широко считается консервативным ядром вируса герпеса. термоядерное оборудование [21].Следовательно, мы стремились определить, находится ли слияние клетки с клеткой, опосредованное гликопротеинами RRV, на аналогичное влияние Plxdcs независимым от gL образом. Мы установили количественный анализ слияния с использованием клеток 293T, трансфицированных конструкцией фактора транскрипции VP16-Gal4 в качестве эффекторных клеток, и клеток Raji, трансдуцированных лентивирусом, кодирующим конструкцию люциферазы, управляемую элементами Gal4-ответа, в качестве клеток-мишеней (Raji-Gal4-Luc). Клетки 293T котрансфицировали вирусными гликопротеинами gH, gL и gB, как указано, в то время как стабильные клетки Raji-Gal4-Luc трансдуцировали лентивирусными векторами, кодирующими конструкции человеческого рецептора, меченные TwinStrep.В дополнение к Plxdc1 и Plxdc2, EphA7 и высокоаффинный рецептор RRV EphB3 использовали в качестве контролей для gL-зависимого рецепторного взаимодействия gH (фиг. 6C и 6D). Активность люциферазы в качестве индикатора слияния клетки с клеткой измеряли после двух дней совместного культивирования эффекторных клеток-мишеней (фиг. 6E). По сравнению с исходным уровнем контрольных трансфицированных клеток 293T, активность слияния увеличивалась в 79 раз и 45 раз в клетках 293T, экспрессирующих полный комплекс RRV 26–95 гН / гЛ / гБ при совместном культивировании с клетками Raji-Gal4-Luc, экспрессирующими Plxdc1 -Strep и Plxdc2-Strep соответственно.Активность люциферазы существенно не изменялась в отсутствие 26–95 мкл RRV. Напротив, активность слияния клеток-мишеней, экспрессирующих гликопротеин RRV 17577, была значительно увеличена (~ 18 раз) только по сравнению с пустыми векторными клетками Raji-Gal4-Luc в клетках-мишенях, трансдуцированных Plxdc2-Strep, но не Plxdc1-Strep. Для обоих, RRV 26–95 и RRV 17577, делеция мотива взаимодействия Plxdc в gH (RRV 26–95 gHΔ21-27 / RRV 17577 gHΔ21–26) реверсировала Plxdc-опосредованную активность слияния как в присутствии, так и в отсутствие gL .Слияние клеток с клетками, экспрессирующими hEphA7-Strep или hEphB3-Strep, облегчалось только экспрессией полного аппарата слияния gH / gL / gB в эффекторных клетках. Экспрессия RRV 26–95 gH / gL / gB или RRV 26–95 gHΔ21-27 / gL / gB приводит к 48-кратному (129-кратному) или 100-кратному (185-кратному) усилению активности люциферазы в совместном культивировании. эксперименты с использованием hEphA7-Strep (hEphB3-Strep) со сверхэкспрессией клеток Raji, в то время как экспрессия RRV 26–95 gH / gB или RRV 26–95 gHΔ21-27 / gB не приводила к значительному увеличению активности люциферазы по сравнению с фоном в тех же условиях.Точно так же слияние клеток Raji, сверхэкспрессирующих hEphA7-Strep или hEphB3-Strep, с клетками, экспрессирующими гликопротеин RRV 17577, только значительно увеличивалось по сравнению с фоном в присутствии gL (~ 50 раз для экспрессирующих EphA7 клеток и ~ 100 раз для EphB3-экспрессирующих клеток). клеток по сравнению с контрольными трансфицированными клетками 293T). Эти данные демонстрируют, что RRV 26–95 gH / gB, но не RRV 17577 gH / gB может индуцировать слияние клеток независимо от gL при взаимодействии с рецепторами Plxdc.

Обсуждение

В этом исследовании мы идентифицировали плексиновый домен, содержащий белки 1 и 2, как новое семейство рецепторов входа для RRV.Plxdc1 / 2 взаимодействует с комплексом gH / gL RRV в области, близкой к ранее охарактеризованному мотиву связывания для рецепторов Eph. В то время как Eph-взаимодействие, а также критический мотив связывания Eph в домене I gH консервативны между RRV и близкородственным человеческим патогенным KSHV [23], взаимодействие с Plxdc1 / 2 является исключительным для RRV и даже обнаруживает различия между изолятами 26 –95 и 17577 в качестве прототипов двух описанных клад последовательностей RRV.

Согласно нашим результатам, различия между Plxdc1 и Plxdc2 также могут существовать с точки зрения функций.Хотя сверхэкспрессия Plxdc1 и Plxdc2 в клетках Raji, которые были практически «нечувствительны» в используемых условиях, приводила к устойчивой инфекции RRV 26–95 (рис. 4D и 4E), только сверхэкспрессия Plxdc1 усиливала прикрепление RRV wt и RRV. gH-AELAAN по сравнению либо с нетрансдуцированными клетками Raji, либо с мутантами RRV с дефицитом связывания Plxdc (рис. 5D). Связано ли это в первую очередь с различиями в уровнях экспрессии, постоянно наблюдаемых между Plxdc1 и Plxdc2 при сверхэкспрессии лентивирусов, или из-за лежащих в основе функциональных различий во взаимодействии gH с этими молекулами, еще предстоит определить.

Мутация остатков Tyr23 и Glu25 в gH-домене I, которые являются консервативными между изолятами RRV 26–95 и 17577, почти устраняют взаимодействие с Plxdc2, который связывается gH / gL обоих изолятов. Хотя одни и те же остатки являются критическими для взаимодействия RRV gH 26–95 с Plxdc1, частичная консервация области оказывается недостаточной для обеспечения связывания 17577 gH с Plxdc1. Интересно, что взаимодействие 17577 gH с Plxdc2 зависит от присутствия gL в комплексе gH / gL, тогда как 26-95 gH способны связывать Plxdc1 / 2 независимо от gL.Эти данные о взаимодействии были подтверждены функциональным анализом Plxdc-опосредованной инфекции и слияния RRV 26–95 и RRV 17577. Как показано выше, инфекция RRV 26–95 усиливается за счет экспрессии Plxcd1 и Plxdc2 (рис. 2E и 2H) и аналогичным образом RRV 26–95 gH / gL или только gH способствует слиянию с Plxdc1 или Plxdc2, избыточно экспрессирующими клетки Raji (рис. 6E). Напротив, рекомбинантная сверхэкспрессия Plxdc2, но не Plxdc1 усиливала инфекцию RRV 17577 (рис. 2F и 2I), что было параллельно в нашем анализе слияния: эффекторные клетки RRV 17577 gH / gB / gL легко сливались с клетками-мишенями, сверхэкспрессирующими Plxdc2, но не в отсутствие gL или со сверхэкспрессирующими Plxcd1 клетками-мишенями (фиг. 6E).Эти особенности специфичности связывания Plxdc1 / 2 похожи на взаимодействие комплекса gH / gL с рецепторами Eph, где мутации строго консервативного мотива взаимодействия Eph достаточно для отмены связывания рецептора, но различия в аффинностях KSHV и RRV к A- и Eph RTK B-типа указывают на существование дополнительных областей в gH или gL, которые вносят вклад или модулируют взаимодействие, что подтверждается недавней кристаллической структурой KSHV gH / gL в комплексе с EphA2 [36].Влияют ли эти предпочтения в отношении различных членов семейств консервативных рецепторов, например, клеточный или тканевой тропизм, вирусное распространение или патогенность не определены. Сравнение последовательностей более двадцати изолятов RRV выявило резкие различия во внеклеточных доменах gH (58,7% аминокислотной идентичности между филогенетическими группами), а также в gL (54,4% аминокислотной идентичности между филогенетическими группами) между изолятами, которые попали в две дискретные группы. подобен 26–95 или 17577, тогда как вариации в других гликопротеинах R1, gM, gN, orf68 были минимальными между кладами [4].Однако, если эти clade-специфические вариации гликопротеина влияют на наблюдаемые различия в патогенности между штаммами RRV 26-95 и 17577, еще предстоит выяснить, но такие различия были зарегистрированы для репрезентативных изолятов (суммировано в [37]). Интересным совпадением является то, что первичная последовательность gH радиновируса японского макака (JMRV) [38] очень похожа на таковую RRV 26–95 с 96% -ной аминокислотной идентичностью, что весьма наводит на мысль о сохранении взаимодействия Plxdc. Этот вирус был обнаружен как связанный с энцефаломиелитом у макак [39], а белки, содержащие домен плексина, экспрессируются в головном мозге ([28] и https: // www.Proteinatlas.org/), подтверждающие представление об определенном нейротропизме радиновирусов RV2. Другой интересный вопрос заключается в том, сохраняется ли рецептор-связывающая функция N-концевой области gH между RRV и KSHV и, вероятно, EBV, и могут ли KSHV и EBV связываться с другим рецептором через эту область. До сих пор мы не идентифицировали соответствующие взаимодействия для KSHV, но в принципе область gH, охватывающая сайт связывания Plxdc2, присутствует в обоих вирусах, и есть соблазн предположить некоторую функциональную консервацию.

В этом плане очень интересны эволюционные факторы, которые управляют взаимодействием с различными семействами рецепторов и, как следствие, множеством взаимодействий герпесвирус-рецептор. Например, EBV и HCMV, четкая корреляция между использованием рецепторов, зависящая от вирусных партнеров по взаимодействию комплекса gH / gL, и клеточным тропизмом была продемонстрирована в различных исследованиях ([40], обзор в [41]). Однако для радиновирусов картина менее ясна. Мы продемонстрировали, что инфекция RRV выбранных клеточных линий проявляет зависимость от конкретных рецепторов, например.грамм. Инфекция Raji — в умеренной степени, которая была возможна без избыточной экспрессии рекомбинантного рецептора — зависела от взаимодействия gH / gL-Eph, в то время как инфекция MFB5487 больше зависела от взаимодействия Plxdc (рис. 5B). Кроме того, мутация мотива взаимодействия Eph не влияла на инфекцию в равной степени на все типы клеток [23]. Хотя сложность и частичная избыточность взаимодействия RRV с различными членами семейства рецепторов Eph и Plxdc усложняет вывод о прямой корреляции между экспрессией рецептора и инфекцией, данные по экспрессии выбранных рецепторов Eph по сравнению с Plxdcs соответствуют наблюдаемым предпочтениям рецепторов. на разных типах клеток (S3 рис.).Тем не менее, определенная корреляция между использованием эксклюзивных рецепторов и инфицированием определенных типов клеток не очевидна. Хотя представление о роли различных взаимодействий рецепторов в клеточном тропизме KSHV и RRV и тканевом тропизме является заманчивым и устоявшимся понятием для родственных вирусов [41–43], возможность избыточной функции не следует отбрасывать. Избыточность может быть вызвана необходимостью избежать антител, например к одному сайту связывания рецептора. Напр., in vitro инфицирование кератиноцитов человека или фибробластов макака-резуса, по-видимому, в одинаковой степени затронуто либо делецией Eph-, либо мотива взаимодействия Plxdc (Рис. 5).Чтобы в конечном итоге устранить корреляцию между тропизмом к рецептору и тканям, потребуются исследования in vivo, с использованием мутантов, не нацеленных на рецептор, для анализа тропизмов клеток и тканей. Важность исследований in vivo также подтверждается недавним отчетом, который показал, что мутант gL-null RRV все еще вызывал стойкую инфекцию в компартменте B-клеток после внутривенной инокуляции, в то время как инфицирование B-клеток in vitro было резко снижено [ 24], открытие, которое можно объяснить gL-независимым использованием Plxdc1 / 2 для инфицирования В-клеток in vivo .Как минимум, наши данные об инфицировании RRV-YFP ΔgL Plxdc1 и Plxdc2 со сверхэкспрессией клеток Raji (рис. 6B) подтверждают, что RRV может эффективно использовать Plxdc1 и Plxdc2 в качестве рецепторов входа в отсутствие gL.

Наконец, тот факт, что мутант, который был удален как в Eph, так и в мотиве взаимодействия Plxdc1 / 2, RRV-YFP gHΔ21-27-AELAAN, все еще мог реплицироваться на фибробластах макака-резуса, о чем свидетельствует тот факт, что мы способный вырастить запас вируса на этих клетках и все еще в определенной степени заразный на ряде клеточных линий (рис. 4 и 5), указывает на удивительно высокую степень избыточности путей проникновения, которые может использовать RRV, и намекает на существование дополнительных рецепторов или факторов хозяина помимо Ephs и белков, содержащих домен Plexin.

Говоря более умозрительно, очевидное перекрытие между вирусными рецепторами и ассоциированными с опухолью мембранными белками может представлять интересный объект исследования. Рецепторы Eph были впервые идентифицированы в попытке охарактеризовать тирозинкиназы, участвующие в раке [44], а измененная экспрессия при различных типах рака была продемонстрирована для нескольких членов семейства Eph (обзор в [45]). Сходным образом, Plxdc1 был впервые описан при скрининге новых членов эндотелия опухолей [25], а экспрессия как Plxdc1, так и Plxdc2 повышена в эндотелии солидных опухолей [25,26,46,47].Экспрессия Plxdc1 была описана как прогностический маркер и модулирующий фактор для различных видов рака человека [46-50]. Учитывая частичное совпадение требуемых изменений, например в метаболизме, транскрипции и передаче сигналов для роста рака и репликации вируса кажется вполне вероятным, что повышенная экспрессия или передача сигналов этих молекул благоприятны как для вирусной инфекции, так и для прогрессирования рака.

Материалы и методы

Ячейки

Эмбриональная почка человека (HEK), клетки 293T (RRID: CVCL_0063) (лаборатория Тобиаса Мозера), клетки SLK (RRID: CVCL_9569) (программа NIH AIDS Research and Reference Reagent), фибробласты макака-резуса (RF) (лаборатория проф.Rüdiger Behr) и человеческие кератиноциты HaCaT (RRID: CVCL_0038) культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с высоким содержанием глюкозы, GlutaMAX, 25 мМ HEPES (Thermo Fisher Scientific) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) (Thermo Fisher) (Thermo Fisher). и 50 мкг / мл гентамицина (PAN Biotech). Клетки iSLK (лаборатория Дона Ганема, Институты биомедицинских исследований Novartis, Эмеривилл, Калифорния, США) поддерживали в среде DMEM с добавлением 10% FCS, 50 мкг / мл гентамицина, 2,5 мкг / мл пуромицина (InvivoGen) и 250 мкг / мл G418 (Carl Рот).Клетки Raji (RRID: CVCL_0511) (лаборатория Йенса Грубера), MFB5487 (линия клональных клеток, созданная из Macaca fascicularis PBMC, увековеченных инфекцией вируса герпеса папио; любезный подарок от Ульрике Зауэрманн) и клетки MMB1845 (линия клональных клеток) создан из Macaca mulatta. PBMC, увековеченных инфекцией вируса герпеса папио; добрый подарок от Ульрике Зауэрманн) культивировали в RPMI (Thermo Fisher Scientific) с добавлением 10% FCS и 50 мкг / мл гентамицина.

Мутагенез ВАС и производство вирусов

рекомбинантов RRV (RRV-YFP gHΔ21–27, RRV-YFP ΔgL и RRV-YFP gHΔ21-27-AELAAN) были получены на основе BAC35-8 [51] и RRV gH-AELAAN [23] соответственно, с использованием двухэтапного стратегия безмаркерной λ-красной рекомбинации ВАС, описанная Tischer et al. [35]. ΔgL RRV-YFP содержит делецию 128 п.н., которая вводит сдвиг рамки считывания после аминокислоты 26 и стоп-кодон после аминокислоты 37, оставляя только шесть аминокислот исходной последовательности gL после предполагаемого сайта расщепления сигнального пептида.Ревертанты RRV-YFP gHΔ21–27 были получены на основе RRV-YFP gHΔ21–27 по тому же протоколу, который описан Tischer et al. [35]. Вкратце, рекомбинационные кассеты были созданы из матрицы pEPKanS с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с ДНК-полимеразой Phusion High Fidelity (Thermo Fisher Scientific) с использованием длинных олигонуклеотидов (Ultramers; приобретены у Integrated DNA Technologies (IDT)) (см. Таблицу S2 для полный список праймеров). Кассеты рекомбинации трансформировали в GS1783, несущий RRV-YFP, с последующей селекцией канамицина и последующей второй рекомбинацией при индуцированной 1% L (+) арабинозе (Sigma-Aldrich) экспрессии I-SceI.RRV-YFP 17577 был получен путем затворения экспрессионной кассеты RRV 26–95 CMV-YFP, фланкированной выступами, идентичными для RRV 26–95 и RRV 17577, в бакмиду RRV 17577 wt (любезный подарок от Скотта У. Вонга). Кассеты рекомбинации трансформировали в GS1783, несущий RRV 17577, и рекомбинацию проводили, как описано выше. Колонии проверяли с помощью ПЦР мутированной области с последующим анализом последовательности (Macrogen), гель-электрофорезом в импульсном поле и полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов.Для этого бакмидную ДНК выделяли стандартным щелочным лизисом из 5 мл жидких культур. Затем целостность бакмидной ДНК анализировали путем переваривания рестрикционным ферментом Xho I и разделения в гелях с 1% агарозой PFGE (Bio-Rad) и 0,5-кратным буфером TBE с помощью гель-электрофореза в импульсном поле при 6 В / см, 120 ° C. угол поля в градусах, время переключения линейно увеличивается от 1 до 5 секунд в течение 16 часов (CHEF DR III, Bio-Rad). Инфекционные рекомбинанты RRV-YFP получали, как описано ранее [23]. Короче говоря, бакмидную ДНК (NucleoBond Xtra Midi) трансфицировали в клетки 293T с помощью GenJet Ver.II (Signagen) в соответствии с инструкциями производителя. Трансфицированные клетки 293Т переносили на конфлюэнтный монослой фибробластов макаки-резуса через два дня после трансфекции и совместно культивировали до тех пор, пока не наблюдали видимый цитопатический эффект (ЦПЭ). Для получения исходных препаратов вируса конфлюэнтные первичные фибробласты макаки-резуса инокулировали инфекционным супернатантом совместных культур фибробластов 293T / макаки-резус. После нескольких циклов репликации вирусосодержащий RF супернатант осветляли центрифугированием (4750 g, 10 мин), концентрировали центрифугированием в течение ночи (4200 об / мин, 4 ° C) и осторожной аспирацией приблизительно 95% супернатанта.Осадок ресуспендировали в оставшейся жидкости в течение ночи. Запасы вирусов wt и рекомбинантных вирусов разделяли на аликвоты и хранили при -80 ° C. Мутации проверяли амплификацией ПЦР соответствующей области с последующим анализом последовательности (Macrogen). (См. Полный список праймеров и конструкций в таблице S2).

Плазмиды

Вектор pcDNA4, содержащий полноразмерные EPHB3 (ref | BC052968 |, pcDNA-EphB3-myc), векторы pcDNA6aV5, содержащие кодирующие последовательности RRV / KSHV gH и gL (ref | GQ994935.1 |, pcDNA6aV5-KSHV-gH, pcDNA3.1-KSHV-gL-Flag [14]; ref | AF210726.1 |, pcDNA6aV5-RRV-26-95-gH, pcDNA3.1-RRV-26-95-gL-Flag [15,52]; ref | AF083501.3 |, pcDNA6aV5-RRV-17577-gH, pcDNA3.1-RRV-17577-gL-Flag [15]) были описаны в другом месте. Рекомбинантные конструкции gH RRV 26-95 / RRV 17577 были созданы на основе pcDNA6aV5-RRV-26-95-gH или pcDNA6aV5-RRV-17577-gH, соответственно, с использованием сайт-направленного мутагенеза «Round the Horn». Плазмиды экспрессии pcDNA4-hPlxdc1-myc ( Homo sapiens , полноразмерный, ref | NM_020405.5 |) и pcDNA4-hPlxdc2-myc ( Homo sapiens , полноразмерный, ref | NM_032812.9 |) были созданы с помощью рестрикционного клонирования на основе ПЦР. Кодирующая последовательность растворимого эктодомена Plxdc2 человека (аминокислоты 31-453) без сигнального пептида была вставлена ​​позади гетерологичного сигнального пептида мышиного IgG-каппа в pAB61Strep с помощью рестрикционного клонирования на основе ПЦР, в результате чего был получен слитый с С-концом Fc IgG1 -слитый белок с С-концевой тандемной Strep-Tag (pPlxdc2-FcS), как описано ранее [53]. Конструкции векторов pcDNA6, содержащие кодирующую последовательность эктодомена Plxdc1 человека (aa 1–425) с тегом 6XHis (pcDNA6-ectoPlxdc1-6XHis) или кодирующую последовательность эктодомена Plxdc2 человека (aa 1–453) с тегом 6XHis (pcDNA6 -ectoPlxdc2-6XHis) были основаны на pcDNA4-hPlxdc1-myc / pcDNA4-hPlxdc2-myc, которые были амплифицированы с помощью ПЦР и лигированы с использованием сборки Гибсона на основе экзонуклеазы (Gibson Assembly Mastermix, New England Biolabs).Экспрессионные плазмиды pcDNA4-mmPlxdc1-myc ( Macaca mulatta , полноразмерный, ref | XM_028836436.1 |) и pcDNAmmPlxdc2-myc ( Macaca mulatta , полноразмерный, ref | XM_028826043.1 |) были созданы на основе PC -амплифицированные фрагменты гена gBlock (приобретенные у IDT) областей, отличающихся от человеческого PLXDC1 (nt1-1200) и PLXDC2 (nt1-1401), соответственно, и лигированы в соответствующий PCR-амплифицированный остов (pcDNA4-hPlxdc1- myc, pcDNA4-hPlxdc2-myc) посредством сборки Гибсона на основе экзонуклеазы.pLenti CMV Blast DEST (706–1) (подарок Эрика Кампо и Пола Кауфмана (плазмида Addgene № 17451)), несущие кассету экспрессии Plxdc1-TwinStrep или Plxdc2-TwinStrep человека (pLenti-CMV-Blast-Plxdc1-Strep / pLenti -CMV-Blast-Plxdc2-Strep) были основаны на pcDNA4-hPlxdc1-myc / pcDNA4-hPlxdc2-myc, которые были амплифицированы с помощью ПЦР и лигированы с использованием сборки Гибсона на основе экзонуклеаз. pLenti-CMV-Blast-EphA7-Strep был описан ранее [20]. Рекомбинантные конструкции gB RRV 26-95 / RRV 17577 получали путем вставки кодирующих последовательностей gB, которые амплифицировали с помощью ПЦР из RRV-YFP 26-95 (MN488839.2) или бакмидной ДНК RRV-YFP 17577 в PCR-амплифицированном остове pcDNA4-myc с помощью сборки Гибсона на основе экзонуклеаз. Это привело к получению полноразмерных экспрессионных конструкций gB (pcDNA4-RRV26-95-gB, pcDNA4-RRV17577-gB), за которыми следует короткая аминокислотная последовательность (LEGPSNKNSSQKRI). Лентивирусная конструкция, кодирующая репортерный ген TurboGFP-люциферазы, управляемый элементом ответа Gal4, была создана путем переноса полной кассеты Gal4-TurboGFP-люциферазы, описанной ранее [54], в каркас pLenti CMV Blast DEST (706–1), амплифицированный с помощью ПЦР.Плазмида слияния VP16 с ДНК-связывающим доменом Gal4 была описана ранее [54]. (См. Полный список праймеров и конструкций в таблице S2).

Рекомбинантные белки

Рекомбинантные растворимые слитые белки FcStrep и Plxdc2-FcStrep очищали в нативных условиях хроматографией на Strep-Tactin из супернатанта культуры клеток 293T. Клетки 293T трансфицировали с использованием полиэтиленимина «Макс» (PEI) (Polysciences) [55], как описано ранее [20], с помощью pAB61Strep или pPlxdc2-FcS. Супернатант клеточной культуры, содержащий белок, фильтровали через 0.22 мкм мембраны PES (Millipore) и пропускали через 0,5 мл матрицы Strep-Tactin Superflow (IBA Lifesciences) в колонке Omniprep с гравитационным потоком (BioRad). Связанный белок промывали приблизительно 50 мл забуференного фосфатом физиологического раствора с pH 7,4 (PBS) и элюировали фракциями по 1 мл 3 мМ дестхиобиотином (Sigma-Aldrich) в PBS. Рекомбинантный эктодомен Plxcd1 или эктодоменный белок Plxdc2 очищали в нативных условиях с помощью Ni-NTA-хроматографии из супернатанта культуры клеток 293T. Клетки 293T трансфицировали pcDNA6-ectoPlxdc1-6XHis или pcDNA6-ectoPlxdc2-6XHis с использованием трансфекции PEI.Супернатант клеточной культуры, содержащий белок, фильтровали через мембраны PES 0,22 мкм (Millipore), концентрировали с использованием VIVAFLOW 50R (Sartorius) и пропускали через 1 мл матрицы Ni-NTA Agarose (Macherey-Nagel) в колонке Omniprep с гравитационным потоком (BioRad). . Связанный белок промывали приблизительно 50 мл TBS (150 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl, pH 7,6) и элюировали фракциями по 1 мл 500 мМ имидазола в TBS. Белковые фракции объединяли, концентрировали на колонках VivaSpin (Sartorius) и наносили на Äkta Avant (GE) на колонке HiPrep 16/60 Sephacryl S300HR (GE).Для всех рекомбинантных белков фракции, содержащие белок, объединяли и выполняли замену буфера на PBS через колонки VivaSpin (Sartorius). Концентрацию белка определяли по поглощению при 280 нм. Аликвоты замораживали и хранили при -80 ° C. Рекомбинантный растворимый человеческий EphB3-Fc (5667-B3-050) был приобретен у R&D Systems.

Продукция и трансдукция лентивирусов

Для получения лентивирусных частиц чашки Петри диаметром 10 см, содержащие примерно 80% конфлюэнтных клеток 293T, трансфицировали 1.4 мкг pMD2.G (плазмида, экспрессирующая оболочку VSV-G, подарок от Didier Trono (плазмида Addgene № 12259), 3,6 мкг psPAX2 (конструкция для экспрессии Gag-Pol, подарок от Didier Trono (плазмида Addgene № 12260) и 5 ​​мкг лентивируса). экспрессирующие конструкции (pLenti CMV Blast DEST (706–1), pLenti-CMV-Blast-EphA7-Strep, pLenti-CMV-Blast-Plxdc1-Strep, pLenti-CMV-Blast-Plxdc2-Strep) с использованием PEI, как описано ранее [20 Супернатант, содержащий псевдотипированные лентивирусные частицы, собирали через 2-3 дня после трансфекции и фильтровали через 0.CA-мембраны 45 мкм (Millipore). Для трансдукции использовали исходные лентивирусы в разведении 1: 5, если не указано иное. Через 48 часов был добавлен селективный антибиотик бластицидин (Invivogen) до конечной концентрации 10 мкг / мл. После первоначального отбора концентрация бластицидина снизилась до 5 мкг / мл.

ПЦР в реальном времени (кПЦР) анализ экспрессии гена

EPH и PLXDC

Для анализа экспрессии EPHA7 , EPHB3 , PLXDC1 и PLXDC2 с помощью кПЦР собирали 1×10 6 клеток в РНКзоле (Thermo Fisher), и РНК выделяли с использованием набора Direct-zol Plus RNA (Miniprep Zymo) согласно инструкции производителя.1 мкг общей РНК использовали для синтеза кДНК с использованием набора для синтеза кДНК SensiFAST (Bioline) в соответствии с инструкциями производителя. КПЦР выполняли на цикле StepOne Plus (Thermo Fisher Scientific) в реакциях объемом 20 мкл с использованием набора SensiFAST SYBR Hi-ROX (Bioline) (условия цикла: начальная денатурация 2 мин при 95 ° C, 40 циклов: 95 ° C в течение 5 секунд и 65 ° C). C в течение 25 секунд). Относительную экспрессию рассчитывали на основе ΔCt к GAPDH . Образцы были проанализированы в трех технических повторностях, только образцы с амплификацией во всех трех повторностях были признаны положительными.См. Полный список праймеров в таблице S2.

Анализ числа копий вирусного генома на основе ПЦР в реальном времени (qPCR) и анализ прикрепления вирусов

Концентрированные образцы вируса обрабатывали ДНКseI (0,1 единиц / мкл) для удаления любой неинкапсидированной ДНК (37 ° C, в течение ночи). Впоследствии ДНКseI была инактивирована, а вирусные капсиды были разрушены путем нагревания образцов до 95 ° C в течение 30 минут. кПЦР выполняли на цикле StepOne Plus в реакциях объемом 20 мкл с использованием набора SensiFAST Probe Hi-ROX (Bioline) (условия цикла: начальная денатурация 3 минуты при 95 ° C, 40 циклов 95 ° C в течение 10 секунд и 60 ° C в течение 35 секунд).Все наборы праймер-зонд были приобретены у IDT в виде полных тестов PrimeTime qPCR (соотношение праймер: зонд = 4: 1). Образцы анализировали в трех технических повторностях. Серию из пяти 10-кратных разведений бакмидной ДНК использовали в качестве стандарта для абсолютного количественного определения копий вирусного генома на основе количественной ПЦР ORF73 RRV. Для анализов прикрепления вируса трансдуцированные клетки Raji инкубировали с ледяными разведениями вируса в указанных концентрациях, нормализованных по геномам на клетку, при 4 ° C в течение 30 минут. После трех промывок ледяной PBS геномную ДНК выделяли с использованием набора ISOLATE II Genomic DNA Kit (Bioline) в соответствии с инструкциями производителя.Копии генома использованных вводимых вирусных препаратов определяли после расщепления ДНКseI в течение ночи, как описано выше. qPCR выполняли, как описано выше, с использованием наборов праймер-зондов, специфичных для ORF73 RRV и клеточного геномного локуса (CCR5). Число вирусных копий определяли на основе серии 10-кратных разведений бакмидной ДНК, в то время как количество клеток рассчитывали на основе серии 2-кратных разведений гДНК Raji. Для анализа прикрепления все образцы были проанализированы в технических дубликатах. См. Полный список праймеров в таблице S2.

siRNA-опосредованный нокдаун

Для siRNA-опосредованного нокдауна Plxdc2 клетки 293T высевали за день до трансфекции в 6-луночные планшеты. 10 мкл раствора миРНК 5 мкМ (набор из 4x siCtrl или набор из 4x siPlxdc2), приобретенный как миРНК ON-TARGETplus от Dharmacon, трансфицировали с использованием 2 мкл реагента для трансфекции DharmaFECT 1 (Dharmacon) в соответствии с инструкциями производителя EM без антибиотиков. Через 6 часов после трансфекции добавляли свежую DMEM с добавлением 20% FCS для достижения конечной концентрации 10% FCS.Через 48 часов после трансфекции собирали клетки 293T siCtrl и 293T siPlxdc2, определяли количество клеток и клетки высевали на чашки при 50 000 клеток / см 2 для анализов на инфекцию (см. Ниже). Для определения эффективности нокдауна клетки собирали в РНКазоле через 96 часов после трансфекции и РНК выделяли с использованием набора Direct-zol RNA Miniprep Plus в соответствии с инструкциями производителя. КПЦР выполняли на цикле StepOne Plus (Thermo Fisher Scientific) в реакциях 20 мкл с 40 нг РНК / реакцию с использованием набора SensiFAST Probe Hi-ROX One-Step (Bioline) (условия цикла: 10 мин 45 ° C мин, 2 мин начальная денатурация при 95 ° C). C, 40 циклов 95 ° C в течение 5 секунд и 60 ° C в течение 20 секунд).Использовали наборы праймер-зонды, специфичные для Plxdc2 и GAPDH. Образцы анализировали в трех технических повторностях. См. Полный список праймеров в таблице S2.

Анализы на инфекцию, эксперименты по блокированию и проточная цитометрия

Для анализов на инфекцию клетки высевали при 50 000 клеток / см 2 (SLK, HaCaT, 293T), 25 000 клеток / см 2 (RF) или 200 000 клеток / мл (Raji, MFB5487, MMB1845) соответственно. Через день после посева (для линий прикрепленных клеток) или сразу после посева (для линий суспензионных клеток) клетки инфицировали указанными количествами вируса.Линии прикрепленных клеток собирали через 24 часа после инфицирования путем кратковременной трипсинизации с последующим добавлением 5% FCS в PBS для ингибирования активности трипсина. Линии суспензионных клеток собирали через 48 часов после инфицирования (24 часа после инфицирования трансдуцированных клеток Raji) пипетированием. Затем клетки осаждали центрифугированием (1200 об / мин, 10 мин), один раз промывали PBS, повторно осаждали и фиксировали в PBS с добавлением 4% формальдегида (Carl Roth). Блокирование инфицирования RRV растворимым рецептором-ловушкой оценивали путем инфицирования вирусным инокулятом, который предварительно инкубировали с указанными концентрациями растворимого EphB3-Fc, hPlxdc1-FcStrep, hPlxdc2-FcStrep или только FcStrep при комнатной температуре в течение 30 минут.Расчет молярности был основан на димерных белках. Для анализов блокирования с использованием антител против Plxdc2 использовали индивидуальные кроличьи иммунные сыворотки, полученные против рекомбинантного Plxdc2-FcStrep (Eurogentec). Клетки 293T предварительно обрабатывали разведением 1: 5 иммунной сыворотки Plxdc2 или предиммунной сывороткой соответствующего животного в DMEM с добавлением 10% FCS в течение 30 минут при 37 ° C. После предварительной инкубации вирус был добавлен в 1/5 -9 от общего объема инкубации на лунку. Сбор клеток и подготовку к анализу проточной цитометрии выполняли, как описано выше.Минимум 5 000–10 000 клеток анализировали на образец экспрессии YFP на проточном цитометре LSRII (BD Biosciences). Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения Flowing (версия 2.5).

Иммунопреципитация и вестерн-блоттинг

Аффинную очистку gH-взаимодействующих белков с использованием gH-FcStrep проводили, как описано ранее [15]. Полосы белка визуализировали после PAGE на 8–16% градиентных гелях путем окрашивания серебром с использованием набора SilverQuest Silver Staining Kit (Thermo Fisher Scientific), вырезали с помощью скальпеля, обесцвечивали и отправляли в центр масс-спектрометрии Таплина Гарвардской медицинской школы для анализ.Для анализа взаимодействия комплексов gH-V5 / gL-Flag с Plxdc1 / 2 клетки 293Т трансфицировали с использованием PEI, как описано ранее. Лизаты клеток 293T, трансфицированных соответствующими экспрессионными конструкциями для комплексов gH-V5 / gL-Flag, получали в буфере для лизиса NP40 (1% заменитель Nonidet P40 (Sigma-Aldrich), 150 мМ NaCl (Sigma-Aldrich), 50 мМ HEPES (VWR). , 1 мМ ЭДТА (Amresco) со свежей добавленной смесью ингибиторов протеазы, для общего применения (Amresco)) и содержание белка определяли методом Брэдфорда с использованием Roti-Quant (Roth) в соответствии с инструкциями производителя.20 мкг общего белка денатурировали в 1x буфере для образцов SDS (состав Морриса) при 95 ° C в течение 5 минут, разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле (PAGE) с использованием 8–16% гелей с градиентом трис-глицина полиакриламида (Thermo Fisher Scientific) с трис-глицин SDS. рабочий буфер (25 мМ Трис, 192 мМ глицин, 0,1% SDS) и перенесенный на 0,45 мкм (0,22 мкм для блотов, содержащих gL) мембраны из поливинилидендифторида (ПВДФ) (200 мА / гель, макс. 30 В, 1 час в буфере Towbin (25 мМ Трис, 192 мМ глицин) с 20% метанола) в системе с влажным резервуаром (Mini Blot Module, Thermo Fisher).Мембраны блокировали 5% сухим молочным порошком в TBS-T (5 мМ Трис, 15 мМ NaCl, 0,05% Tween20) в течение 1 часа при комнатной температуре, промывали один раз в TBS-T и инкубировали с соответствующими антителами в течение 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° C (полный список антител см. в таблице S2). После трех промывок TBS-T мембраны инкубировали с соответствующим конъюгированным с HRP вторичным антителом в 5% сухом молочном порошке в TBS-T в течение 1 часа при комнатной температуре, промывали три раза в TBS-T и отображали на ECL ChemoCam 3.2 Imager (Intas) с использованием субстрата Immobilon Forte Western HRP (Merck Millipore). Для получения комплексов gH-V5 или gH-V5 / gL-Flag количество введенного лизата между wt и мутантными конструкциями gH было нормализовано к экспрессии gH, как определено с помощью вестерн-блоттинга, и разбавлено до равного объема клеточным лизатом из нетрансфицированного 293T. клетки до иммунопреципитации. Затем лизаты инкубировали с 0,5 мкг антитела V5-tag (Bio-Rad) и сефарозой ProteinG (GenScript) в течение ночи при 4 ° C при перемешивании.После трех промывок в буфере для лизиса NP40 шарики ProteinG с предварительно связанными комплексами инкубировали в течение ночи при 4 ° C с перемешиванием с лизатом полноразмерного человеческого или Macaca mulatta Plxdc1-myc или плазмидой Plxdc2-myc, трансфицированных клетками 293T, нормализованными до Выражение Plxdc. Объемы корректировали лизатом нетрансфицированных клеток 293Т. Гранулы ProteinG собирали коротким центрифугированием и промывали 3 раза в буфере для лизиса NP40. Осадки нагревали в 2x буфере для образцов SDS (95 ° C, 5 мин) и анализировали вестерн-блоттингом, как описано выше.Для совместной иммунопреципитации растворимых конструкций Plxdc1 / 2-Strep с gH-V5 / gL-Flag и EphB3-myc супернатант клеток 293T, трансфицированных Plxdc1 / 2-FcStrep, инкубировали с шариками StrepTactinXT (IBA) в течение ночи при 4 ° C при перемешивании. . После трех промывок в буфере для лизиса NP40 шарики StrepTactinXT с предварительно связанным Plxdc1 / 2-FcStrep инкубировали в течение ночи при 4 ° C при перемешивании с равными количествами лизата полноразмерного EphB3-myc человека, RRV 26–95 gH-V5 / Экспрессионная плазмида gL-Flag или 17577 gH-V5 / gL-Flag трансфицировала клетки 293T или указанные комбинации.Объемы корректировали лизатом нетрансфицированных клеток 293Т.

Иммуноферментный анализ (ELISA)

Планшеты

F96 Maxisorp Nunc-Immuno (Thermo Fisher Scientific) покрывали рекомбинантным RRV 26–95 гH-FcStrep / мкл (описано ранее [15]) в концентрации 1 мкг / мл в PBS в течение ночи. После трех промывок PBS-T лунки блокировали 10% FBS в PBS в течение 2 часов. Инкубацию с эктодоменом Plxdc1 или эктодоменом Plxdc2 проводили в течение 2 часов при комнатной температуре в 10% FBS в PBS.Планшеты трижды промывали PBS-T. Связанный белок детектировали через C-концевую метку 6XHis с использованием антитела 6XHis MA1-135 (Invitrogen) с последующими тремя промываниями в TBS-T и инкубацией с вторичным антителом, связанным с ослиным антимышиным пероксидазой хрена (HRP) (Dianova). После трех промывок добавляли субстрат 3,3 ‘, 5,5’-тетраметилбензидин (TMB) (Thermo Fisher Scientific) и реакцию останавливали добавлением 1 М HCl. Планшеты получали на ридере для планшетов Biotek Synergy 2.

Анализ слияния

В день 1 эффекторные клетки Raji, стабильно трансдуцированные лентивирусной конструкцией, кодирующей репортер TurboGFP-люциферазы, управляемый элементом ответа Gal4 (Raji-Gal4-Luc), трансдуцировали лентивирусами, кодирующими конструкции человеческого рецептора с меткой TwinStrep, или пустым векторным контролем.Клетки 293T высевали в 96-луночные планшеты по 30 000 клеток / лунку. На 2-й день клетки-мишени 293T трансфицировали плазмидой, кодирующей ДНК-связывающий домен Gal4, слитый с трансактиватоном VP16 (VP16-Gal4), и указанными комбинациями вирусных гликопротеинов или контролем пкДНК (VP16-Gal4: 31,25 нг / лунку, gH: 12,5 нг / лунка, gL (пкДНК в комбинациях только gH / gB): 62,5 нг / лунка, gB: 18,75 нг / лунка, только пкДНК: 93,75 нг / лунка) с использованием PEI, как описано ранее. Через 24 часа после трансфекции среду на клетках-мишенях 293T полностью удаляли и заменяли на 100 мкл свежей среды DMEM с добавлением 10% FCS и 50 мкг / мл гентамицина.Подсчитывали трансдуцированные клетки Raji, клетки осаждали, ресуспендировали в свежей среде DMEM с добавлением 10% FCS и 50 мкг / мл гентамицина, и 40 000 клеток Raji, трансдуцированных рецепторными конструкциями или пустым векторным контролем, добавляли к клеткам-мишеням 293T в 50 мкл полной среды. Для всех комбинаций мишень-эффектор использовали три лунки. Через 48 часов клетки промывали один раз в PBS и лизировали в 35 мкл 1x буфера для лизиса люциферазы культуры клеток (E1531, Promega) в течение 15 минут при комнатной температуре и центрифугировали в течение 10 минут при 4 ° C.20 мкл каждого клеточного лизата использовали для измерения активности люциферазы с использованием анализа люциферазы Beetle-Juice в соответствии с инструкциями производителя на планшет-ридере Biotek Synergy 2.

Прогнозирование и анализ структуры

Прогнозирование структуры на основе гомологии было выполнено с использованием сервера Iterative Threading ASSembly Refinement (I-TASSER) при стандартных настройках для предсказания структуры RRV 26–95 gH и gL на основе кристаллической структуры комплекса EBV gH / gL (3PHF). Моделирование комплекса RRV 26–95 гH / г было дополнительно выполнено с использованием алгоритмов SPRING и CO-THreader для структуры белково-белкового комплекса и многоцепочечных протеиновых нитей без различий между определенными структурами.Полученные в результате структуры I-TASSER были согласованы с моделью gH / gL CO-THreader с помощью инструмента VMD 1.9.3 OpenGL RMSD Trajectory Tool на основе аминокислот от 25 до 62 gH (RMSD 0,344Å) и аминокислот от 2 до 100 мкл ( RMSD 2,697 Å) для создания изображенной модели. Все дальнейшие анализы и визуализации были выполнены с использованием VMD 1.9.3 OpenGL.

Математико-статистический анализ

Статистическая разница между группами определялась с помощью непарных t-критериев Стьюдента с последующей поправкой Бонферрони для множественных сравнений или обычным односторонним (рис. 2I) или двусторонним (рис. 2H и S2C и S2D рис.) Дисперсионным анализом (ANOVA) с последующей поправкой Даннета на множественные сравнения.Статистический анализ для фиг. 6E, представленный в логарифмической шкале, был выполнен на логарифмически преобразованных нормализованных данных с использованием двухфакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями с последующей поправкой Даннета для множественных сравнений. Все статистические анализы выполнялись с помощью GraphPad Prism версии 6. Для всех статистических данных *: p-значение <0,05, **: p-значение <0,01, ***: p-значение <0,001, ns: несущественно.

Исследование безопасности и иммуногенности вакцины против вируса Росс-Ривер (RRV) — Просмотр полного текста

Экспериментальная группа: когорта 1, группа лечения 1.

Рандомизация в общей сложности ок.200 субъектов в одну из четырех групп лечения в соотношении 1: 1: 1: 1, чтобы получить 1,25 мкг вакцины против RRV с / без адъюванта (Al (OH) 3) или 2,5 мкг вакцины RRV с / без адъюванта (Al (ОН) 3). Когорта 1 подразделяется на когорту 1a (n = 60, т. Е. 15 субъектов на комбинацию дозы / адъювантации), чтобы получить первую вакцинацию в день 0, при этом данные о безопасности на 7 день рассматриваются Комитетом по мониторингу данных и, следуя рекомендации DMC, получают вторая вакцинация на 21 день; Когорта 1б (n = 140, т.е. 35 субъектов на комбинацию доза / адъювантация) должны быть вакцинированы дважды с интервалом 21 день при наличии рекомендации DMC. Повторная вакцинация через 180 дней после первой вакцинации.

Биологические: обработанная формалином, УФ-инактивированная, цельновирионная, полученная из клеток Vero вакцина, не содержащая консервантов против вируса Росса (RRV), с адъювантом Al (OH) 3 или без него.

Две внутримышечные инъекции по 1,25 мкг, 2.5 мкг, 5 мкг или 10 мкг в дни 0 и 21 с последующей повторной вакцинацией через 180 дней после первой.


Экспериментальная группа: когорта 1, группа лечения 2.

То же, что и когорта 1, группа лечения 1

Биологические: обработанная формалином, УФ-инактивированная, цельновирионная, полученная из клеток Vero вакцина, не содержащая консервантов против вируса Росса (RRV), с адъювантом Al (OH) 3 или без него.

Две внутримышечные инъекции 1.25 мкг, 2,5 мкг, 5 мкг или 10 мкг в дни 0 и 21 с последующей повторной вакцинацией через 180 дней после первой.


Экспериментальная группа: когорта 1, группа лечения 3.

То же, что и когорта 1, группа лечения 1

Биологические: обработанная формалином, УФ-инактивированная, цельновирионная, полученная из клеток Vero вакцина, не содержащая консервантов против вируса Росса (RRV), с адъювантом Al (OH) 3 или без него.

Две внутримышечные инъекции 1.25 мкг, 2,5 мкг, 5 мкг или 10 мкг в дни 0 и 21 с последующей повторной вакцинацией через 180 дней после первой.


Экспериментальная группа: когорта 1, группа лечения 4.

То же, что и когорта 1, группа лечения 1

Биологические: обработанная формалином, УФ-инактивированная, цельновирионная, полученная из клеток Vero вакцина, не содержащая консервантов против вируса Росса (RRV), с адъювантом Al (OH) 3 или без него.

Две внутримышечные инъекции 1.25 мкг, 2,5 мкг, 5 мкг или 10 мкг в дни 0 и 21 с последующей повторной вакцинацией через 180 дней после первой.


Экспериментально: когорта 2, группа лечения 1.

Рандомизация в общей сложности ок. 100 субъектов в одну из двух групп лечения в соотношении 1: 1 получали 5 мкг вакцины против RRV с / без адъюванта (Al (OH) 3). Вакцинация проводится после рассмотрения данных о безопасности когорты 1а, день 7, DMC и рекомендации продолжить. Повторная вакцинация через 180 дней после первой вакцинации.

Биологические: обработанная формалином, УФ-инактивированная, цельновирионная, полученная из клеток Vero вакцина, не содержащая консервантов против вируса Росса (RRV), с адъювантом Al (OH) 3 или без него.

Две внутримышечные инъекции 1,25 мкг, 2,5 мкг, 5 мкг или 10 мкг в дни 0 и 21 с последующей повторной вакцинацией через 180 дней после первой.


Экспериментально: когорта 2, группа лечения 2.

То же, что и когорта 2, группа лечения 1

Биологические: обработанная формалином, УФ-инактивированная, цельновирионная, полученная из клеток Vero вакцина, не содержащая консервантов против вируса Росса (RRV), с адъювантом Al (OH) 3 или без него.

Две внутримышечные инъекции 1.25 мкг, 2,5 мкг, 5 мкг или 10 мкг в дни 0 и 21 с последующей повторной вакцинацией через 180 дней после первой.


Экспериментальная группа: когорта 3, группа лечения 1.

Рандомизация в общей сложности ок. 100 субъектов в одну из двух групп лечения в соотношении 1: 1 получали 10 мкг вакцины против RRV с / без адъюванта (Al (OH) 3). Вакцинация проводится после анализа данных по безопасности когорты 1b и когорты 2, день 7, DMC и рекомендации продолжить.Повторная вакцинация через 180 дней после первой вакцинации.

Биологические: обработанная формалином, УФ-инактивированная, цельновирионная, полученная из клеток Vero вакцина, не содержащая консервантов против вируса Росса (RRV), с адъювантом Al (OH) 3 или без него.

Две внутримышечные инъекции 1,25 мкг, 2,5 мкг, 5 мкг или 10 мкг в дни 0 и 21 с последующей повторной вакцинацией через 180 дней после первой.


Экспериментальная группа: когорта 3, группа лечения 2.

То же, что и когорта 3, группа лечения 1

Биологические: обработанная формалином, УФ-инактивированная, цельновирионная, полученная из клеток Vero вакцина, не содержащая консервантов против вируса Росса (RRV), с адъювантом Al (OH) 3 или без него.

Две внутримышечные инъекции 1.25 мкг, 2,5 мкг, 5 мкг или 10 мкг в дни 0 и 21 с последующей повторной вакцинацией через 180 дней после первой.


ВИЗИТ | Сайт RRV

  • Настоятельно рекомендуется бронирование. Вы можете сделать предварительный заказ ниже.

  • Привитые гости могут не носить маску. Невакцинированные гости должны надевать маски по прибытии и вне зоны отдыха.

  • Вакцинированный персонал может отказаться от ношения маски.

  • Места для сидения будут дезинфицироваться в перерывах между сиденьями.

  • Мы будем использовать компостируемые тарелки, столовые приборы и салфетки. Стеклянные предметы (фужеры и графины) обычно моют после каждого использования.

  • Заказы на вино и еду будут приниматься через форму заказа, которая находится на вашем столе.

  • Туалеты будут регулярно убираться и дезинфицироваться.

Библиотека Дегустация вин Рейс

50 долларов США на человека, партия 6 вин

Образцы вин из нашей библиотечной коллекции: наши самые достойные возраста, редкие и коллекционные вина, которые не продаются при первоначальном выпуске, а затем повторно выставляются на продажу. выпускается, когда они полностью состарены.

Обслуживание бутылок на нижней тормозной подушке
Минимальный заказ одной бутылки

Просто хотите расслабиться и насладиться бутылкой вина, небольшим количеством еды и друзьями? Вы найдете много места, чтобы расслабиться и насладиться прекрасным вином с прекрасным видом на виноградники поместья.

Дегустационный рейс «Наследие»

20 долларов США на человека, рейс из 5 вин

Мы приглашаем вас присоединиться к нам в увлекательном полете, демонстрируя наши эксклюзивные вина небольшого производства, которые демонстрируют лучшие виноградники долины Русской реки и побережья Сономы.Дегустация включает пять вин, выбранных нашим виноделом.

Забронируйте столик на обед

Забронируйте столик на обед в Russian River Vineyards сегодня.

Когда вы приедете в отель, вы можете выбрать полет для дегустации вин, вино по бокалам, вино по бутылкам или насладиться любыми другими напитками, которые у нас есть.

Некоторые из наших лучших местных музыкантов будут сопровождать вашу дегустацию вин.Расписание может быть изменено без предварительного уведомления.

«Счастливый час», четверг с 17:00 до 19:30

Пятница-воскресенье 1: 00-5: 00

С воскресенья по четверг с 12 до 17 (последняя дегустация в 16:00)

Пятница и суббота с 12:00 до 18:00 (последняя дегустация в 17:00)

Настоятельно рекомендуется бронирование.

Собаки приветствуются на наших открытых площадках.

Наши друзья в Samadhi Sanctuary Yoga & Wellness предлагают свои «Йога и вино» по воскресеньям в нашем поместье.

Наслаждайтесь умиротворяющей сессией йоги в самом сердце винодельческой страны долины Русской реки в сопровождении успокаивающей музыки гитариста Дастина Сэйлора.

28 октября

29 октября

30 октября

31 октября

4 ноября

5 ноября

6 ноября

7 ноября

12 ноября

13 ноября

14 ноября

19 ноября

20 ноября

21 ноября

26 ноября

27 ноября

28 ноября

Дастин Сэйлор

Рики Рэй
Том Дуарте
Пабло Кинтеро
Рикки Рэй
Мак и Поттер
Моррис ЛеГранд
Габриэль Уитон
Том Дуарте
Дерек Ирвинг Бергмэнат 9095 Дерек Ирвинг Бергманат Джейсон Туэйтс
Рики Рэй
Пабло Кинтеро
Джейсон Бодлович

Только йога и живая музыка: 20 долларов.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *