Рсв как правильно заполнить: Пример заполнения единого расчета по страховым взносам за 3 квартал 2021

Содержание

Как сделать расчет по страховым взносам в 1с 8.3?

Данные о налогах во внеоборотные фонды, например, пенсионный, медицинский, социальный или страхование, отражаются в отчете “Расчеты по страховым взносам”.

Данный отчет необходимо подавать за 1 квартал, за 9 месяцев и за год. В отчете будет формироваться информация о работниках организации за период.

С 2017 года была утверждена новая единая форма — отчет, который отображает уплату страховых взносов в налоговые органы и предоставляется в территориальные налоговые инспекции.

Для организаций, в которых численность сотрудников превышает 25 человек, отчет необходимо подавать в электронном виде.

Тарифы в программе 1С Бухгалтерия предприятия 3.0

В программе тарифа по страховым взносам можно посмотреть через пункт меню “Зарплата и кадры” — “Настройка зарплаты” и выбрать раскрывающийся список “Классификаторы”. Далее, нажав на гиперссылку “Страховые взносы”, пользователь сможет просмотреть все тарифы.

Также данный функционал можно открыть, используя пункт меню “Администрирование”: выбрать “Параметры учета” и нажать на гиперссылку “Настройка зарплаты”.

Формирование расчетов

При начислении зарплаты сотрудникам или оформления больничного листа программа формирует начисление по страховым взносам автоматически.

В документе “Начисление заработной платы” начисление страховых взносов можно посмотреть в колонке “Взносы”, и при нажатии на гиперссылку суммы откроется форма, в которой будет указана сумма начисления.

При оформлении больничного листа будут отражаться расходы за счет ФСС. Данные расходы будут отображаться в Приложении 3 раздел 1.

Формирование отчета РСВ

Чтобы сформировать отчет, необходимо перейти в пункт меню “Отчеты” и выбрать “Регламентированные отчеты”.

В окне 1С — отчетности необходимо нажать на кнопку “Создать”, после чего выбрать отчет из справочника.

Форма выбора отчета состоит из двух вкладок. На первой вкладке отображаются избранные отчеты, а на второй — весь список отчетов. На второй вкладке можно выбрать необходимые отчеты и напротив названия отчета установить звездочку, после чего данный отчет будет доступен на первой вкладке.

Отчет “Расчет по страховым взносам находится в группе “Налоговая отчетность”.

После нажатия на кнопку “Выбрать” программа предложит выбрать, за какой период сформировать отчет и по какой организации, если в программе ведется учет по нескольким организациям.

Создается чистый бланк, который заполняется после нажатия на кнопку “Заполнить”.

Так как отчет состоит из нескольких разделов, рассмотрим некоторые из них.

Раздел 1 — будут отображаться суммы к уплате, таких как:

  • страховые взносы,
  • взносы на медстраховку,
  • страховые взносы на социальное страхование.

Приложение 2 к Разделу 1 — указываются расходы за счет ФСС, суммы взносов и налоговая база на обязательное соцстрахование.

Приложение 3 к Разделу 1 — будут отображаться суммы расходов на обязательное социальное страхование.

Раздел 3 — заполняется общая информация по каждому сотруднику.

После того как отчет будет заполнен, в программе можно сделать проверку. Для этого необходимо воспользоваться кнопкой “Проверка” .

Также в программе можно сформировать отдельный отчет “Проверка расчетов страховых взносов”, который позволит пользователю дельно просмотреть информацию о начислениях.

Чтобы открыть отчет, необходимо перейти в пункт меню “Зарплата и кадры”, выбрать “Отчеты по зарплате”.

Из списка необходимо выбрать отчет “Проверка расчетов взносов”.

В отчете указать, за какой период необходимо сформировать данные, выбрать организацию и нажать на кнопку “Сформировать”.

Как правильно заполнить РСВ-1

Приказом Минздравсоцразвития России от 15.03.2012 № 232н утверждена новая форма РСВ-1. Как заполнить ее, не допустив ошибок, рассказала Елена Кулакова, эксперт «Контур-Экстерн» по подготовке отчетности в ПФР.

Как правильно заполнить титульный лист?

На титульном листе формы РСВ-1 уменьшилось количество кодов, которые необходимо заполнить: оставлены только коды ОКАТО и ОКВЭД. В связи с отменой взносов в ТФОМС не нужно указывать номер ТФОМС. Обращаем внимание, что появился новый реквизит «прекращение деятельности», который заполняется в отчете при ликвидации организации.

Какие строки заполняются при доначислении взносов?

Суммы взносов могут быть доначислены как в результате выездной проверки, так и в случае, если неточности обнаружены страхователем самостоятельно. Суммы взносов указываются в строке 120. Обращаем внимание, что строка 120 имеет прямую связь с Разделом 4 (новый раздел), в котором помесячно вносятся суммы доначисленных взносов. В форме РСВ-1 должны совпадать итоговые суммы Раздела 4 и строки 120 Раздела 1.

Появились ли в форме новые строки или разделы, поменялись ли правила заполнения?

Большинство показателей в РСВ-1 заполняется в рублях и копейках (ранее указывались рубли). При проверке отчета это позволит избежать расхождений, которые возникали из-за округлений.

Раздел 1. Заполняется в рублях и копейках.

Строка 120 – вносятся суммы доначисленных страховых взносов с начала расчетного периода.

Строка 145 –указываются суммы уплаты за предыдущие расчетные периоды.

Раздел 2. Заполняется в рублях и копейках.

Дополнительно к возрастным группам добавлены отдельные строки для иностранных граждан (строки 203, 213, 223, 233).

Появилась отдельная строка для взносов, начисленных на суммы, превышающие предельную величину базы для начисления страховых взносов (строка 252).

В отдельный блок выделены строки для взносов на обязательное медицинское страхование (строки 271-276).

Раздел 3. Заполняется в рублях и копейках (исключение составляют строки 334, 341, 342, а также подразделы 3.5 – 3.8.).

В подразделе 3.1. заполняется список инвалидов, если в организации, находящейся на основном тарифе, есть сотрудники-инвалиды (ранее это был Раздел 4.1).

Подразделы 3.2.-3.8. заполняются организациями, имеющими право на пониженные тарифы в соответствии со статьей 58 ФЗ-212.

Раздел 4. Заполняется в рублях и копейках.

В разделе 4 указываются суммы доначисленных взносов на пенсионное и медицинское страхование за периоды, в которых выявлены ошибки и доначислены страховые взносы.

Раздел 5. Заполняется в рублях и копейках.

Заполняется для сотрудников студенческих отрядов на основе сведений из справок.

Как изменился классификатор кодов тарифов плательщиков страховых взносов?

Код

Наименование тарифа

ПФР

ФФОМС

ФСС

1966 г.р. и старше

1967 г.р. и моложе

Страх. часть

Страх. часть

Накопит. часть

01*

Организации, находящиеся на основной системе налогообложения и уплачивающие взносы по основному тарифу

22.0%

16.0%

6.0%

5.1%

2.9%

52*

Организации, уплачивающие взносы по основному тарифу и находящиеся на упрощенной системе налогообложения

22.0%

16.0%

6.0%

5.1%

2.9%

53*

Организации, уплачивающие взносы по основному тарифу и единый налог на вмененный доход

22.0%

16.0%

6.0%

5.1%

2.9%

18

Сельскохозяйственные товаропроизводители

16.0%

10.0%

6.0%

2.3%

1.9%

19

Организации народных художественных промыслов

16.0%

10.0%

6.0%

2.3%

1.9%

20

Семейные (родовые) общины коренных малочисленных народов Севера, Сибири и Дальнего Востока, занимающиеся традиционными отраслями хозяйствования

16.0%

10.0%

6.0%

2.3%

1.9%

03

Общественные организации инвалидов
Организации, уставный капитал которых полностью состоит из вкладов общественных организаций инвалидов
Учреждения, созданные для достижения образовательных, культурных, лечебно-оздоровительных и иных социальных целей

16.0%

10.0%

6.0%

2.3%

1.9%

04

Организации и индивидуальные предприниматели, уплачивающие единый сельскохозяйственный налог

16.0%

10.0%

6.0%

2.3%

1.9%

06

Организации, осуществляющие деятельность в области информационных технологий

8.0%

2.0%

6.0%

4.0%

2.0%

07

Организации и индивидуальные предприниматели, применяющие УСН и уплачивающие взносы по пониженному тарифу в соответствии с п.8.ст.58 212 ФЗ.

20.0%

14.0%

6.0%

0.0%

0.0%

08

Хозяйственные общества, созданные после 13 августа 2009 года

8.0%

2.0%

6.0%

4.0%

2.0%

09

Организации и индивидуальные предприниматели, осуществляющие деятельность в области СМИ

20.8%

14.8%

6.0%

3.3%

2.9%

10

Организации-участники проекта «Сколково»

14.0%

8.0%

6.0%

0.0%

0.0%

11

Аптечные организации

20.0%

14.0%

6.0%

0.0%

0.0%

12

Организации социального обслуживания населения, научных исследований, образования, здравоохранения, культуры, искусства и массового спорта

20.0%

14.0%

6.0%

0.0%

0.0%

13

Благотворительные организации

20.0%

14.0%

6.0%

0.0%

0.0%

14

Организации, оказывающие инжиниринговые услуги

22.0%

16.0%

6.0%

5.1%

2.9%

15

Организации, производящие выплаты членам экипажей судов

0.0%

0.0%

0.0%

0.0%

0.0%

36

Организации и индивидуальные предприниматели, осуществляющие деятельность в технико-внедренческих особых экономических зонах

8.0%

2.0%

6.0%

4.0%

2.0%

* для основного тарифа с сумм, превышающих предельную величину базы для начисления страховых взносов , начисляется 10% на страховую ( солидарную ) часть .

Если вы заметили опечатку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Как заполнить РСВ-1 – Учет без забот

Опубликовано 04.07.2014 16:19
Автор: Administrator
Просмотров: 19046

Очень часто мне задают вопросы о том, как правильно сформировать отчет в ПФР в программах 1С? Где находится отчет РСВ-1 и какова правильная последовательность действий по его заполнению? На что нужно обратить внимание при проверке индивидуальных сведений и как грамотно исправить ошибки? В своей статье я постараюсь ответить на самые часто задаваемые вопросы. 

Речь пойдет о программах 1С, которые поддерживают полностью автоматический расчет заработной платы:

— 1С: Зарплата и управление персоналом 8

— 1С: Комплексная автоматизация 8

— 1С: Управление производственным предприятием 8.
Чтобы избежать ошибок при заполнении, к составлению отчета в ПФР необходимо подготовиться. Первым делом — нужно убедиться, что кадровые документы введены верно и в полном объеме. Что чаще всего забывают внести в программу? Данные об отпусках за свой счет (неоплачиваемых отпусках). А эти периоды в отчете обязательно должны выделяться отдельным строками. Оформляются они документом «Невыходы в организациях», который расположен на закладке «Расчет зарплаты» (если вместо закладки, представленной на картинке, Вы видите просто серый фон, то включить отображение такого рабочего стола можно в меню Сервис — Настройки пользователя, поставить галочку «Показывать рабочий стол» или придется искать документы по названию в том меню, которое у Вас настроено).

Заполняется документ следующим образом

Также нужно проверить, внесена ли в программу вся информация о больничных и отпусках по уходу за ребенком.

Следующий важный этап — это начисление страховых взносов. Ежемесячно в программе заполняются документы, которые это начисление выполняют. Но бывают такие ситуации, когда в расчет зарплаты вносятся небольшие изменения и взносы после этого пересчитать забывают. Как проверить, правильно ли рассчитаны страховые взносы и все ли начисления включены в базу для их расчета?

Для этой цели удобно использовать отчет «Анализ начислений сотрудникам организаций», который находится в меню

Операции — Отчеты — Анализ начислений сотрудникам организаций

Значения во всех трех графах должны быть равны, а в отчете в ПФР будет учитываться сумма, которая находится во второй графе.

Третий этап подготовки к отчету — проверка уплаченных взносов. Для того, чтобы зарегистрировать суммы, уплаченные в текущем периоде, необходимо воспользоваться документом «Расчеты по страховым взносам», который находится на закладке «Налоги». После этого суммы уплаты автоматически попадут в отчет.

Когда подготовка к отчету завершена, можно приступать непосредственно к его формированию. Для этого на закладке «ПФР» ищем пункт «Подготовка данных для ПФР» и нажимаем кнопку «Сформировать». На экране появляется несколько таблиц со списками сотрудников, начисленными суммами и строки стажей. После этого я бы рекомендовала сразу нажать кнопку «Проверка» — «Встроенной проверкой», которая расположена в нижней части экрана.

При нажатии на кнопку программа сверяет начисленные суммы и ищет грубые ошибки. В том случае, если ошибки обнаружены, необходимо первым делом их исправить, т.к. программа не выгрузит такие файлы. Замечания у неё могут быть самые разные: не сходятся суммы начисленных взносов, неправильно указан стаж и пр. Как правило, сообщения о том, что указано неправильно достаточно подробные и понятные.

После того, как ошибки исправлены или если они не обнаружены, я рекомендую всё равно просмотреть список сотрудников, особенно если их не много и проверить правильность стажей. Особенно внимательно нужно быть с сотрудницами, находящимися в декретном отпуске, и с теми людьми, кто был в отпусках за свой счет. Соответствующие периоды обязательно должны присутствовать в стаже. Также обязательно нужно проверить номера пачек и подправить их в случае необходимости.

Теперь можно нажимать на кнопку «Файлы на диск» и отправлять отчет. Если у Вас возникли вопросы или Вы не знаете, как исправить какие-то из ошибок — пишите в комментариях к статье, я постараюсь помочь. 

Понравилась статья? Подпишитесь на рассылку новых материалов 


Добавить комментарий

Пример заполнения расчета по страховым взносам в случае выплаты пособия по уходу за ребенком

Как заполнять раздел № 3 Расчета на «декретниц» и кто обязан представлять нулевой расчет, как отразить начисленную сумму пособия по уходу за ребенком до достижения им 1,5 лет и какие сведения надо указывать в подразделе № 3.2 на маму в декрете?

Ответы на эти вопросы мы дадим в настоящей статье. Для примера рассмотрим компанию, которая временно не ведет деятельность, но у нее в штате числится мама в декретном отпуске, которая получает пособие на ребенка. Также для примера возьмем, что общее количество сотрудников – 4 человека, выплаты молодой маме составили:

– за январь 3118,31

– за февраль 3142,33

– за март 3142,33.

Если в компании есть сотрудница, которая находится в отпуске по уходу за ребенком до достижения им 1,5 лет, то данные о ней вносятся в раздел № 3, но при этом подраздел № 3.2 не заполняется. Получается, что раздел № 3 состоит из двух подразделов: это подраздел № 3.1 (где указываются личные данные работника) и подраздел № 3.2 (где указывается сумма начисленных страховых взносов).

Как указано в пункте 22.2 Порядка заполнения Расчета по страховым взносам, в персонифицированных сведениях о застрахованных лицах, в которых отсутствуют данные о сумме выплат и иных вознаграждений, начисленных в пользу физического лица за последние три месяца отчетного (расчетного) периода, подраздел 3.2 раздела 3 не заполняется.

Такой же порядок заполнения будет и на работника, который находится в отпуске «за свой счет» и ему в отчетном периоде не начислялась заработная плата.

Представляем пример заполнения РСВ в случае отсутствия деятельности у компании, но у которой в штате есть «мама в декрете».

 

 

 

 

 

Как мы видим, сумму начисленных взносов на пенсионное страхование и «медицину» будут нулевые.

 

Суммы пособий отражаются по строкам, где необходимо показать превышение расходов над исчисленными страховым взносами.

 

 

 

 

 

 

 

Нулевой Расчет по страховым взносам – кто обязан его представлять?

Сразу стоит обратить внимание, что индивидуальные  предприниматели, которые работают «на себя» и у которых нет наемных работников, сдавать Расчет по страховым взносам не должны.

А вот компании, которые даже временно не ведут деятельность и у которых нет сотрудников (только один директор), обязаны представлять нулевой Расчет по страховым взносам.

Порядок заполнения формы РСВ-1: пошаговая инструкция -Статьи

22 апреля 2015 г.

Ежеквартально индивидуальные предприниматели и организации подают в ПФР отчет по форме РСВ-1, порядок заполнения которой регламентируется Правлением Пенсионного Фонда. Отчетность отображает данные по взносам на медицинское и пенсионное страхование в пределах компании. Правила оформления в наступившем году несколько изменились, что требует особого внимания от специалистов, формирующих этот тип отчетности.

Форма РСВ — один из отчетов для Пенсионного фонда

Формирование РСВ-1 в системе Контур.Экстерн

Нововведения

ФЗ № 406 от 01.12.14 на бумажные и электронные отчеты установлены разные сроки сдачи формы РСВ-1. Если для экземпляра на бумаге срок остался тем же — 1 мес. и 15 дней с момента окончания отчетного периода, то для электронных документов он стал больше на 5 дней. Таким образом, электронная отчетность за последний квартал 2014 г. была сдана до 24.02.15, в текущем году — должна быть подана до 20.05.15, 20.08.15 и 20.11.15.

Подавать декларацию РСВ-1 в бумажном виде могут только те организации, в которых работает 25 и меньше сотрудников.

В Разделе 1 появились столбцы, в которых необходимо прописывать расчеты за период 2010-2014 гг. В п. 2.1 р. 2 стало меньше строк, поскольку теперь сюда не вносятся данные по пенсионным взносам на сотрудников по возрасту.

Порядок оформления

Чтобы избегать возможных неточностей и ошибок, следует воспользоваться образцом оформления формы РСВ-1.

Все без исключения декларанты заполняют титульный и два первых листа, причем отдельный лист необходимо заполнять на каждый используемый тариф, если компания в течение отчетного периода пользовалась несколькими тарифами. Для остальных разделов существуют свои правила. Они заполняются в определенных случаях:

  • Р. 3 — при использовании декларантом пониженного тарифа (ст. 58 ФЗ № 212).
  • Р. 4 — если были внесены показатели в строку 120 р. 1.
  • Р. 5 — при осуществлении выплат работникам, которые числятся студентами учебных заведений.
  • Р. 6 — при наличии персонифицированного учета на предприятии.

Документ состоит из 6 разделов и 13 страниц.

Если данные по каким-либо показателям отсутствуют, в соответствующих клетках необходимо ставить прочерк. Документ заполняется печатными буквами.

В верхней части каждой страницы необходимо вписывать присвоенный организации регистрационный номер, в нижней — подпись налогоплательщика и дату заполнения.

Срок сдачи отчетности по форме РСВ-1 в электронном формате – не позднее 1 мес. и 20 дней после окончания отчетного периода

Начиная с текущего отчетного периода, на титульной странице не нужно указывать адрес регистрации декларанта, ОКТМО, ОГРН, ОКАТО. На титульной странице необходимо указывать такие данные:

  • код отчетного периода и год;
  • номер корректировки;
  • реквизиты компании;
  • актуальный номер телефона;
  • количество лиц, на которых выплачивается страховая сумма;
  • среднесписочное количество кадров.

Если предприятие прекращает деятельность, тут же заполняется и соответствующее поле (проставляется буква «Л»). Расчеты по страховым суммам приводятся в р. 1. Сведения о выплатах за работу на вредном производстве и при обязательном медицинском страховании необходимо вносить в графы 6-8.

Расчеты по определенным и дополнительным тарифам вносятся в Раздел 2. Взносы по ОПС необходимо прописывать на каждого сотрудника общей суммой. В подразделах 2.2, 2.3 и 2.4 указываются данные по дополнительным тарифам. П. 2.5 — новый лист в форме отчета, в который вносятся показатели персонифицированного учета. Заполнять его нужно лишь тогда, когда налогоплательщик заполняет Раздел 6.

Могут ли быть ошибки?

Если отчетность ведется в системе Контур.Экстерн, на все возможные ошибки при заполнении формы РСВ-1 сервис указывает и предлагает их исправить. Чаще они встречаются в подготовке бумажных документов. Самыми распространенными неточностями являются:

  • неправильное указание среднесписочного количества сотрудников;
  • неверные суммы выплаченных страховых взносов;
  • несоответствие даты уплаты;
  • ошибки в написании ФИО сотрудников и др.

Чтобы избежать подобных несоответствий, необходимо с максимальной внимательностью и точностью сверять данные с документами.

От правильности заполнения формы РСВ-1 зависит сумма страховых выплат

5023 просмотра.

Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) — Диагностика и лечение

Диагноз

Ваш врач может заподозрить респираторно-синцитиальный вирус на основании результатов медицинского осмотра и времени года, когда возникают симптомы. Во время обследования врач прослушает легкие с помощью стетоскопа, чтобы проверить, нет ли хрипов или других аномальных звуков.

Лабораторные тесты и визуализирующие исследования обычно не требуются. Однако они могут помочь диагностировать осложнения RSV или исключить другие состояния, которые могут вызывать аналогичные симптомы.Тесты могут включать:

  • Анализы крови для проверки количества лейкоцитов или поиска вирусов, бактерий и других микробов
  • Рентген грудной клетки для проверки воспаления легких
  • Мазок секрета изо рта или носа для проверки на наличие вируса
  • Пульсоксиметрия, безболезненный монитор кожи для определения уровня кислорода в крови ниже нормы

Лечение

Лечение респираторно-синцитиального вируса обычно включает меры самопомощи, чтобы вашему ребенку было комфортнее (поддерживающая помощь).Но при появлении серьезных симптомов может потребоваться стационарное лечение.

Поддерживающая терапия

Ваш врач может порекомендовать безрецептурные лекарства, такие как ацетаминофен (тайленол и другие), для снижения температуры. (Никогда не давайте аспирин ребенку.) Использование назальных капель с физиологическим раствором и отсасывание могут помочь очистить заложенный нос. Ваш врач может назначить антибиотики, если есть бактериальное осложнение, например бактериальная пневмония.

Сделайте так, чтобы вашему ребенку было как можно комфортнее.Предложите много жидкости и следите за признаками потери жидкости в организме (обезвоживанием), такими как сухость во рту, незначительное выделение мочи или его полное отсутствие, запавшие глаза, сильная суетливость или сонливость.

Больничная помощь

Если инфекция RSV тяжелая, может потребоваться пребывание в больнице. Лечение в больнице может включать:

  • Внутривенные (в / в) жидкости
  • Кислород увлажненный
  • А дыхательный аппарат (ИВЛ), в редких случаях

Ингалятор (бронходилататор) или стероиды не доказали свою эффективность при лечении инфекции RSV .

Клинические испытания

Изучите исследования клиники Mayo Clinic, в которых тестируются новые методы лечения, вмешательства и тесты как средства предотвращения, обнаружения, лечения или контроля этого состояния.

Образ жизни и домашние средства

Возможно, вам не удастся сократить продолжительность респираторно-синцитиальной вирусной инфекции, но вы можете попытаться облегчить некоторые признаки и симптомы.

Если у вашего ребенка RSV , сделайте все возможное, чтобы успокоить или отвлечь его или ее — обнимитесь, почитайте книгу или поиграйте в тихую игру. Другие советы по облегчению симптомов:

  • Создавайте влажный воздух для дыхания. Сохраняйте в комнате тепло, но не перегревайте. Если воздух сухой, увлажнитель или испаритель с прохладным туманом могут увлажнить воздух и помочь облегчить заложенность носа и кашель. Обязательно поддерживайте увлажнитель в чистоте, чтобы предотвратить рост бактерий и плесени.
  • Пить жидкости. Продолжайте кормить ребенка грудью или из бутылочки, как обычно. Для детей старшего возраста и взрослых держите постоянный запас прохладной воды у постели. Предложите теплые жидкости, например суп, чтобы разжижить сгущенные выделения. Ледяной лед также может успокаивать.
  • Попробуйте солевые капли для носа. Капли, отпускаемые без рецепта, — это безопасный и эффективный способ облегчить заложенность носа даже у маленьких детей. Следуйте рекомендациям врача и инструкциям на продукте.
  • Используйте безрецептурные обезболивающие. OTC болеутоляющие средства, такие как парацетамол (тайленол и др.), Могут помочь снизить температуру и облегчить боль в горле. Посоветуйтесь с врачом, чтобы подобрать дозу, соответствующую возрасту вашего ребенка.
  • Держитесь подальше от сигаретного дыма. Пассивное курение может усугубить симптомы.

Подготовка к приему

Если серьезные симптомы не приводят к обращению в отделение неотложной помощи (ER), вы, скорее всего, начнете с посещения семейного врача или врача вашего ребенка.Вот некоторая информация, которая поможет вам подготовиться к приему и узнать, чего ожидать от врача.

Что вы можете сделать

Перед встречей вы можете составить список из:

  • Любые симптомы, которые вы заметили и когда они появились, , даже если они кажутся не связанными с инфекцией верхних дыхательных путей.
  • Основная медицинская информация, , например, если ваш ребенок родился преждевременно или у него проблемы с сердцем или легкими.
  • Подробная информация об уходе за детьми, с учетом других мест, где ваша семья могла быть подвержена респираторным инфекциям.
  • Вопросы, которые следует задать врачу. Перечислите свои вопросы от наиболее важных до наименее важных на случай, если время истечет.

Вопросы, которые следует задать своему врачу, могут включать:

  • Что, вероятно, вызывает эти симптомы? Есть ли другие возможные причины?
  • Какие тесты могут потребоваться?
  • Как долго обычно длятся симптомы?
  • Какое лечение лучше всего?
  • Нужны ли лекарства? Если вы прописываете фирменное лекарство, есть ли альтернатива дженерику?
  • Что я могу сделать, чтобы моему ребенку стало лучше?
  • Могу ли я забрать домой какие-нибудь брошюры или другие печатные материалы? Какие сайты вы рекомендуете?
  • В какой степени я должен изолировать своего ребенка, когда он инфицирован?

Не стесняйтесь задавать любые дополнительные вопросы, которые могут у вас возникнуть во время приема.

Чего ожидать от врача

Ваш врач может задать вам ряд вопросов, например:

  • Когда вы впервые заметили симптомы?
  • Симптомы приходят и уходят или продолжаются?
  • Насколько серьезны симптомы?
  • Что может улучшить симптомы?
  • Что может ухудшить симптомы?
  • Кто-нибудь еще в семье болен? Какие у него симптомы?

Ваш врач задаст дополнительные вопросы в зависимости от ваших ответов, симптомов и потребностей.Подготовка и упреждение вопросов помогут вам максимально эффективно проводить время с врачом.

09 января 2021 г.

Тестирование на респираторно-синцитиальный вирус (RSV)

Источники просмотра

Источники, использованные в текущем обзоре

Bozman M, et al. Диагностика респираторно-синцитиального вируса, профилактика и лечение осложнений. Фармацевт США . 2014; 39 (7): 31-34. Доступно в Интернете по адресу http: // www.medscape.com/viewarticle/833507. По состоянию на ноябрь 2016 г.

Broadbent L, et al. Респираторно-синцитиальный вирус, постоянная медицинская дилемма. Вирусы респираторного гриппа . 2015; 9 (4): 169-178. Доступно в Интернете по адресу http://www.medscape.com/viewarticle/847350. По состоянию на ноябрь 2016 г.

(4 ноября 2014 г.) Центры по контролю и профилактике заболеваний. Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция (RSV). Доступно в Интернете по адресу http://www.cdc.gov/rsv/index.html. По состоянию на ноябрь 2016 г.

(26 июля 2016 г.) Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний.Респираторно-синцитиальный вирус (RSV). Доступно в Интернете по адресу https://www.niaid.nih.gov/topics/rsv/Pages/Default.aspx. По состоянию на ноябрь 2016 г.

(Обновлено: 13.10.2016) Крылов Л. Респираторно-синцитиальные вирусные инфекции. Medscape Болезни. Доступно в Интернете по адресу http://emedicine.medscape.com/article/971488-overview. По состоянию на ноябрь 2016 г.

(март 2015 г.) Консультации ВОЗ по разработке вакцины против респираторно-синцитиального вируса (RSV). Доступно в Интернете по адресу http://www.who.int/immunization/research/meetings_workshops/rsv_vaccine_development/en/.По состоянию на ноябрь 2016 г.

Источники, использованные в предыдущих обзорах

Томас, Клейтон Л., редактор (1997). Циклопедический медицинский словарь Табера. Компания F.A. Davis, Филадельфия, Пенсильвания [18-е издание].

Пагана, Кэтлин Д. и Пагана, Тимоти Дж. (2001). Справочник по диагностическим и лабораторным испытаниям Мосби, 5-е издание: Mosby, Inc., Сент-Луис, Миссури. (стр. 826-827).

(апрель 2003 г.). Сезон «гриппа» переходит в сезон «респираторного вируса». Медицинский центр Стэнфордского университета, LAB Letter [Электронный бюллетень].PDF-файл доступен для загрузки по адресу http://www.stanfordhospital.com/pdf/labLetterApril2003.pdf.

(28 ноября 2003 г., проверено). Респираторно-синцитиальный вирус. CDC, Национальный центр инфекционных заболеваний, отделение респираторных и кишечных вирусов [онлайн-информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/revb/respiratory/rsvfeat.htm.

Изенберг, Н. (июль 2003 г., проверено). Респираторно-синцитиальный вирус. KidsHealth for Parents, Фонд Nemours [Он-лайн информация]. Доступно на сайте http: // kidshealth.орг / родитель / инфекции / легкие / rsv.html.

(7 января 2003 г.). CDC обнаружил, что ежегодная смертность от гриппа выше, чем предполагалось ранее. CDC по связям со СМИ [он-лайн пресс-релиз]. Доступно в Интернете по адресу http://www.cdc.gov/od/oc/media/pressrel/r030107.htm.

Грэм, П. (30 октября 2003 г., обновлено). Респираторно-синцитиальный вирус (RSV). Медицинская информация MedlinePlus, Медицинская энциклопедия [он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/001564.htm.

Полак, М.(13 апреля 2004 г.). Респираторно-синцитиальный вирус (RSV): обзор, лечение и стратегии профилактики. Medscape, From Обзоры по уходу за новорожденными и младенцами [Электронный журнал]. Доступно в Интернете по адресу http://www.medscape.com/viewarticle/472399?src=search.

Эстрада, Б. (2004, 5 января). Педиатрический бюллетень, Что нового в RSV. Medscape, Infect Med 20 (11): 522, 2003. [Электронный журнал]. Доступно в Интернете по адресу http://www.medscape.com/viewarticle/465432?src=search.

Парк, J.и Барнетт, Д. (2002). Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция и врач-терапевт. Medscape, South Med J 95 (3): 353-359, 2002 [Электронный журнал]. Доступно в Интернете по адресу http://www.medscape.com/viewarticle/431615.

(© 2004). Антитела к респираторно-синцитиальному вирусу, IgG и IgM. Руководство ARUP по клиническим лабораторным исследованиям [он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.arup-lab.com/guides/clt/tests/clt_176b.jsp#1146861.

(© 2004). Респираторные вирусы.Руководство ARUP по клиническим лабораторным исследованиям [он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.arup-lab.com/guides/clt/tests/clt_177b.jsp#1146881.

(май 2003 г.). BD Directigen RSV. Бектон, Дикинсон и компания (BD) [Вставка тестового пакета].

Ву, А. (2006). Клиническое руководство по лабораторным исследованиям Титца, четвертое издание. Сондерс Эльзевир, Сент-Луис, Миссури. С. 1596-1597.

Forbes, B. et. al. (© 2007). Диагностическая микробиология Бейли и Скотта, двенадцатое издание: Mosby Elsevier Press, St.Луис, штат Миссури. ПП 730-731, 745.

Раух, Д. (26 июля 2007 г., обновлено). Респираторно-синцитиальный вирус (RSV). Медицинская энциклопедия MedlinePlus [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/001564.htm. Доступно 29.07.08.

Мозинго, Т. (2008, зима). RSV, когда это больше, чем просто холод. Здоровые дети, Американская академия педиатрии [он-лайн информация]. PDF-файл доступен для загрузки по адресу http://www.aap.org/family/healthychildren/08winter/HC-winter08-rsv.pdf. Доступно 29.07.08.

Персонал клиники Мэйо (1 августа 2007 г.). Респираторно-синцитиальный вирус. MayoClinic.com [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.mayoclinic.com/health/respiratory-syncytial-virus/DS00414. Доступно 29.07.08.

(© 2007). Респираторно-синцитиальный вирус. Американская ассоциация легких [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.lungusa.org/site/apps/nlnet/content3.aspx?c=dvLUK9O0E&b=2060721&content_id={AC999AD1-9FB2-4310-A642-FD850C2E82AC}&notoc=1.Доступно 29.07.08.

(© 2007). Информационный бюллетень о респираторно-синцитиальном вирусе. Американская ассоциация легких [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.lungusa.org/site/apps/nlnet/content3.aspx?c=dvLUK9O0E&b=2060721&content_id={DEA9A6D1-58D5-4E47-8F36-6E0AAB65B977}&notoc=1. Доступно 29.07.08.

(2008). Респираторно-синцитиальный вирус. Данные Американской ассоциации легких по легочным заболеваниям: 2008 [Информация в Интернете]. PDF-файл доступен для загрузки по адресу http://www.lungusa.org/atf/cf/%7B7a8d42c2-fcca-4604-8ade-7f5d5e762256%7D/ALA_LDD08_RSV_FINAL.PDF. Доступно 29.07.08.

(© 2012). Респираторно-синцитиальный вирус. Американская ассоциация легких [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.lungusa.org/lung-disease/respiratory-syncytial-virus/. По состоянию на январь 2012 г.

сотрудников клиники Мэйо (29 июля 2011 г.). Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), клиника Мэйо [Информация в Интернете]. Доступно в Интернете по адресу http://www.mayoclinic.com/health/respiratory-syncytial-virus/DS00414/METHOD=print. По состоянию на январь 2012 г.

Дельгадо, Дж.et. al. (Обновлено октябрь 2011 г.). Респираторно-синцитиальный вирус — RSV. ARUP Consult [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.arupconsult.com/Topics/RSV.html. По состоянию на январь 2012 г.

Крылов Л. (Обновлено 14 июня 2011 г.). Инфекция, вызванная респираторно-синцитиальным вирусом (RSV). Справочник по Medscape [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://emedicine.medscape.com/article/971488-overview. По состоянию на январь 2012 г.

Дагдейл, Д. (Обновлено 19 февраля 2011 г.). Тест на антитела к RSV. Медицинская энциклопедия MedlinePlus [Он-лайн информация].Доступно в Интернете по адресу http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003348.htm. По состоянию на январь 2012 г.

(Обновлено 31 октября 2011 г.). Узнайте о респираторно-синцитиальном вирусе. Особенности CDC [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.cdc.gov/Features/RSV/. По состоянию на январь 2012 г.

RSV и Synagis — Детская клиника

Что такое RSV?

Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) — это вирус, вызывающий легочную инфекцию, называемую бронхиолитом.Младенцы обычно заболевают RSV. Двое из трех младенцев инфицированы RSV в течение первого года жизни. RSV очень заразен. Он передается при контакте с инфицированными жидкостями из носа или рта и воздушно-капельным путем при кашле. RSV обычно возникает зимой.

Обычно RSV вызывает легкие симптомы, такие как насморк и лихорадка. Но недоношенные дети или дети с проблемами легких или сердца имеют более высокий риск серьезного заболевания, если они заразятся RSV.

Вакцины против RSV пока нет.

Что такое Synagis?

Synagis — это лекарство, которое помогает предотвратить серьезные инфекции легких, вызванные RSV. Synagis — это антитело, созданное с использованием технологии ДНК. Доношенные дети получают от матери во время беременности противовирусные вещества, называемые антителами. Эти антитела помогают бороться с RSV и другими вирусами. Но дети, рожденные недоношенными, часто не получают достаточного количества этих антител до рождения.

Это лекарство не предназначено для лечения детей, у которых уже есть RSV.

Следует ли моему ребенку получать Synagis?

Это лекарство назначают только детям в возрасте до 2 лет с высоким риском серьезных осложнений, если они должны получить RSV. Эти дети включают:

  • Некоторые недоношенные дети, родившиеся раньше, чем на 5 недель
  • детей с бронхолегочной дисплазией (БЛД), заболеванием легких, при котором младенцам требуется дополнительный кислород, поскольку легкие не работают должным образом
  • детей с другими заболеваниями, отнесенными к группе повышенного риска.

Synagis не следует давать детям, у которых ранее была тяжелая аллергическая реакция на Synagis. Если у вас есть вопросы о том, следует ли вашему ребенку получать Synagis, обратитесь к своему врачу.

Как дается Synagis?

Synagis вводится путем инъекции в мышцу ноги. Вашему ребенку следует делать прививку Synagis каждый месяц зимой и ранней весной. Synagis можно делать с другими плановыми прививками.

Каковы побочные эффекты Synagis?

Место, где был произведен выстрел, может стать красным или болезненным.У вашего ребенка есть небольшой риск рвоты или диареи. В редких случаях у детей появляются симптомы простуды, ушная инфекция, сыпь, боль или боль в горле. Как и любое лекарство, существует риск того, что оно может вызвать аллергическую реакцию.

Как я могу узнать больше?

Узнайте у своего врача о Synagis. Он или она может дать вам листок-вкладыш или предложить другие источники информации.

Внелегочные проявления тяжелой респираторно-синцитиальной вирусной инфекции — систематический обзор

Crit Care.2006; 10 (4): R107.

1

Michael Eisenhut

1 Luton & Dunstable Hospital, Lewsey Road, Luton, Bedfordshire, LU4 ODZ, UK

1 Luton & Dunstable Hospital, Lewsey Road, Лутон, Лутон, Лутон, Лутон UK

Автор, ответственный за переписку.

Поступило 12 мая 2006 г .; Изменения запрошены 13 июня 2006 г .; Пересмотрено 22 июня 2006 г .; Принято 6 июля 2006 г.

Copyright © 2006 Eisenhut; лицензиат BioMed Central Ltd.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http: // creativecommons.org / licenses / by / 2.0), что разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Реферат

Введение

Респираторно-синцитиальный вирусный (RSV) бронхиолит является наиболее важной причиной госпитализации в педиатрическое отделение интенсивной терапии младенцев с инфекциями нижних дыхательных путей. В последние годы стала очевидной важность внелегочных проявлений RSV-инфекции.Этот систематический обзор был направлен на обобщение имеющихся данных о проявлениях инфекции RSV за пределами дыхательных путей, их причинах и необходимых изменениях в клиническом ведении.

Методы

Поиск в базах данных был: Medline (с 1950 г. по настоящее время), EMBASE (с 1974 г. по настоящее время), PubMed и списки ссылок на соответствующие статьи. Обобщены результаты статей, в которых сообщалось о проявлениях инфекции RSV вне дыхательных путей у пациентов всех возрастных групп.

Результаты

Внелегочные проявления, о которых сообщалось в предыдущих обсервационных исследованиях, включали сердечно-сосудистую недостаточность с гипотензией и потребности в инотропах, связанные с повреждением миокарда, о чем свидетельствуют повышенные уровни сердечного тропонина (у 35–54% младенцев, находящихся на ИВЛ), сердечные аритмии, такие как наджелудочковая тахикардия и желудочковая тахикардия. центральное апноэ (16–21% поступлений), очаговые и генерализованные судороги, очаговые неврологические нарушения, гипонатриемия (33%), связанная с повышенной секрецией антидиуретического гормона, и гепатит (46–49% младенцев, находящихся на ИВЛ).RSV или его генетический материал были выделены из спинномозговой жидкости, миокарда, печени и периферической крови.

Заключение

Обобщенные данные указывают на системное распространение RSV во время тяжелого заболевания. Поражение мозга и миокарда может объяснить связь RSV с некоторыми случаями внезапной детской смерти. У младенцев с тяжелой инфекцией RSV необходимо контролировать сердечный ритм, артериальное давление и уровень натрия в сыворотке крови и соответствующим образом корректировать поддерживающее лечение, включая введение жидкости.

Введение

Инфекция, вызванная респираторно-синцитиальным вирусом (RSV), является наиболее частой причиной госпитализации в педиатрическое отделение интенсивной терапии (PICU) из-за дыхательной недостаточности в младенчестве [1]. Вместе с вирусом гриппа RSV также является наиболее частой причиной госпитализации взрослых с хроническими сердечными и легочными заболеваниями и острой дыхательной недостаточностью [2]. Внелегочные проявления тяжелой инфекции RSV были впервые отмечены в отчете об эпидемии, поразившей младенцев, госпитализированных в детскую больницу в Кливленде (Огайо, США).Авторы описали признаки «сепсис-синдрома» и отметили апноэ у значительной части младенцев [3]. Лица, осуществляющие уход, должны знать о проявлениях инфекции RSV за пределами дыхательных путей, потому что они могут привести к неожиданным в противном случае ухудшению состояния их пациентов. Для персонала, ухаживающего за пациентом с тяжелой инфекцией RSV, они могут вызвать проблемы как с диагностикой, так и с лечением. Осведомленность о последствиях инфекций RSV за пределами дыхательных путей особенно важна при ведении пациентов с известными сопутствующими заболеваниями [2].Важно знать, какая часть дисфункции органа является временным эффектом RSV или признаком ухудшения уже существующего заболевания органа, например, у младенцев с врожденным пороком сердца [4]. Этот систематический обзор направлен на обобщение данных о внелегочных эффектах инфекции RSV.

Методы

В этом систематическом обзоре обобщены результаты статей, в которых сообщается о проявлениях инфекции RSV вне дыхательных путей. В анализ были включены исследования у пациентов всех возрастных групп с инфекцией RSV.Исключены исследования проявлений, которые не были специфичны для RSV, но были неспецифическими иммунологическими эффектами острой вирусной инфекции. Поэтому исследование, включающее данные о влиянии респираторных вирусных инфекций на нефротический синдром [5], было исключено. Исследуемые базы данных: Medline (с 1950 г. по настоящее время), EMBASE (с 1974 г. по настоящее время) и PubMed. Для поиска в базе данных были объединены следующие ключевые слова: «респираторно-синцитиальный вирус», «RSV» и «внелегочный», «педиатрическое отделение интенсивной терапии», «педиатрическое отделение интенсивной терапии», «отделение интенсивной терапии», «отделение интенсивной терапии», « миокард, миокард, аритмия, инотропы, шок, сердечная недостаточность, гепатит, апноэ, судороги, припадки, гипонатриемия, гипонатриемия, антидиуретический гормон ‘,’ почки ‘,’ спинномозговая жидкость ‘.Также был проведен поиск в списках ссылок на соответствующие статьи.

Результаты

RSV и сердечно-сосудистая система

Первым сообщением о клинически симптоматическом поражении миокарда во время RSV-бронхиолита был случай фатального интерстициального миокардита у ребенка в 1972 году [6]. Другие ранние сообщения включают также развитие блокады сердца второй степени во время болезни. Впоследствии появилось сообщение о мультифокальной предсердной тахикардии, связанной с RSV, феноменом, который снова был отмечен в более поздней серии пациентов с RSV-ассоциированной предсердной тахикардией [7,8].Сообщалось также о других формах наджелудочковой тахикардии при инфицировании RSV; они, по-видимому, возникали у пациентов со структурно нормальным сердцем и не были связаны с гипоксией или терапией бета-агонистами [8,9]. Сообщалось также об опасных для жизни аритмиях. У одного пациента трепетание предсердий было связано с кардиогенным шоком. У этого ранее здорового пациента также были длительные периоды желудочковой тахикардии, включая пуанты. Фибрилляция желудочков развилась после попытки чрезмерной стимуляции [10].Впоследствии сообщалось о другом случае желудочковой тахикардии, требующей кардиоверсии [11]. Другим опасным для жизни осложнением может быть тампонада сердца, развивающаяся из перикардиального выпота [10,12].

Сердечно-сосудистые нарушения в форме гипотензии без сердечных аритмий также были описаны и были связаны с доказательствами повреждения миокарда, о чем свидетельствуют повышенные уровни сердечного тропонина I и T. Особенности шока были впервые описаны у семи младенцев в обсервационном исследовании 218 младенцев, госпитализированных в детскую больницу [3].Повышенные уровни сердечного тропонина были обнаружены у 35–54% младенцев с RSV-инфекцией, находящихся на ИВЛ в отделениях интенсивной терапии интенсивной терапии [13,14]. Повышенные уровни сердечного тропонина I также были обнаружены у детей с RSV-инфекцией, не требующих искусственной вентиляции легких [15]. Степень описанной сердечно-сосудистой поддержки варьировалась от введения жидких болюсов [14] до инотропной поддержки [13,16].

Первое сообщение об обнаружении RSV в миокарде у пациентов с бронхиолитом было у ребенка с комбинированным иммунодефицитом; вирус культивировали из миокарда [17].Совсем недавно RSV был снова обнаружен в миокарде с помощью ПЦР у пациента с миокардитом [18].

Проявления RSV со стороны центральной нервной системы

Острые неврологические признаки и симптомы, такие как центральное апноэ, судороги, летаргия, трудности с кормлением или глотанием, нарушения тонуса или косоглазие, нарушения спинномозговой жидкости (CSF) или электроэнцефалограммы были обнаружены у 39 человек. % ( n = 121) RSV-положительных пациентов, получающих PICU [19]. В популяции RSV-положительных пациентов, госпитализированных в общее педиатрическое отделение, то есть с более легким течением заболевания и за исключением пациентов с простыми фебрильными судорогами, неврологические осложнения были обнаружены у 1 пациента.2% пациентов ( n = 964) [20]. Рассматривая возникновение судорог как проявление энцефалопатии, другая группа обнаружила частоту приступов 1,8% ( n = 487) у пациентов с RSV-бронхиолитом, поступивших в педиатрический специализированный центр [21]. RSV был обнаружен с помощью RT-PCR в спинномозговой жидкости четырехмесячного ребенка с апатией и, по-видимому, фебрильными судорогами [22]. Аномалии спинномозговой жидкости были обнаружены в одном исследовании у 12 из 30 пациентов с РСВ, перенесших люмбальную пункцию [19].В других исследованиях были обнаружены антитела, специфичные к RSV, в спинномозговой жидкости пациентов с RSV-бронхиолитом [23,24].

Центральное апноэ

Апноэ, определяемое как остановка дыхания на срок более 20 секунд и / или брадикардия с сопутствующим цианозом или кислородной десатурацией ниже 90%, были обнаружены у 16–21% детей, госпитализированных с RSV-инфекцией [25]. Наиболее важным фактором риска, связанным с апноэ, был возраст до двух месяцев. Апноэ при поступлении увеличивало риск повторного апноэ, и у этих детей действительно значительно повышалась вероятность потребности в ИВЛ [25].В проспективном экспериментальном исследовании у младенцев изучалась реакция апноэ у младенцев с инфекцией RSV. РСВ-инфицированные младенцы сравнивались с неинфицированными младенцами в отношении рефлекторной реакции апноэ на стерильную воду, вливаемую в глотку (хеморефлекс гортани) во время сна. Данные были сопоставлены с носоглоточными уровнями IL-1β и IL-6. Как продолжительность первого апноэ, так и общая продолжительность апноэ (все апноэ) были значительно больше у пациентов с RSV, чем в контрольной группе (см. Таблицу).Обнаружена значимая отрицательная корреляция между уровнями носоглоточного IL-1β и продолжительностью апноэ [26]. Апноэ не было связано с более высоким уровнем провоспалительных цитокинов.

Таблица 1

Продолжительность апноэ в ответ на хеморефлекс гортани у младенцев

Контроль
Статус Продолжительность (с)
Первое апноэ

RSV положительный 5.0 ± 0,7 a 10,9 ± 1,8 a, b 38,0 ± 6,0 a
RSV отрицательный 3,1 ± 0,5 5,3 ± 1,0 21,0 ± 0,9
2,5 ± 0,4 3,4 ± 1,1 19,0 ± 5,0
Приступы

Типы припадков, которые, как было установлено, связаны с инфекцией RSV, включают как генерализованные тонико-клонические, так и парциальные припадки с измененным сознанием и фокально-моторными функциями или глазами отклонение [19,20].Они были обнаружены у 0,7% (при поступлении в палату) до 6,6% (при поступлении в ОИТН) пациентов. У некоторых пациентов был эпилептический статус [20]. У некоторых пациентов отмечены отклонения электроэнцефалограммы [19]. Причиной судорог у младенцев с ранее выявленной инфекцией RSV является гипонатриемия [27] (см. Ниже в разделе «Эндокринологические проявления инфекции RSV»).

Другие неврологические проявления

Косоглазие было зарегистрировано как неврологическое осложнение в двух крупных исследованиях [19,20].Он был обнаружен в виде эзотропии у четырех из 12 пациентов с неврологическими осложнениями [20]. Описаны также один случай острой аксональной полинейропатии [19] и случай с признаками энцефалита при визуализации с помощью магнитно-резонансной томографии и позитронно-эмиссионной томографии [28]. Трепетание диафрагмы, характеризующееся непроизвольными высокочастотными сокращениями диафрагмы, происходящими со скоростью от 150 до 480 сокращений в минуту, асинхронно с сердцебиением, было случайно обнаружено при просмотре записей респираторно-индукционных плетизмографов и импедансных пневмографов у трех младенцев с РСВ. инфекции, за которыми тщательно наблюдали из-за опасений по поводу апноэ [29].Трепетание диафрагмы было связано с неспособностью отучить пациентов от ИВЛ, а также с необходимостью вспомогательной вентиляции у взрослых [30].

Эндокринные эффекты RSV-бронхиолита

Антидиуретический гормон

Гипонатриемия (уровень натрия в сыворотке менее 136 ммоль / л) была обнаружена у 33% младенцев, нуждающихся в интенсивной терапии с RSV-инфекцией; 11% имели уровень натрия в сыворотке менее 130 ммоль / л [27]. В менее отобранной популяции детей, включая пациентов с более легкими заболеваниями, только 0.У 6% пациентов уровень натрия в сыворотке был менее 130 ммоль / л [31]. Это явление побудило исследовать основные эндокринные причины. Первый отчет об исследованиях гипонатриемии, связанной с инфекцией RSV, касался четырех младенцев, поступивших в палату с гипонатриемией и бронхиолитом во время вспышки RSV. У одного были очаговые припадки и гипонатриемия, он оказался положительным по RSV. У всех четырех младенцев был повышенный уровень антидиуретического гормона (АДГ). Одному был проведен синактеновый тест, который показал нормальное высвобождение кортизола [32].Дальнейшие исследования показали, что уровни АДГ были значительно выше у пациентов с бронхиолитом, чем у пациентов с апноэ или инфекциями верхних дыхательных путей с RSV. Самые высокие уровни были обнаружены у пациентов, получавших искусственную вентиляцию легких [33]. Повышенные уровни АДГ были связаны с высоким артериальным парциальным давлением CO 2 и гиперинфляцией на рентгенограмме грудной клетки. Однако в этом исследовании не было никакой связи между уровнями АДГ и уровнями натрия в сыворотке. В этом контексте гипонатриемия и гипонатриемические судороги были связаны с применением гипотонических жидкостей в дозе от 100 до 150 мл / кг в день [27].

Реакция гормона стресса

Проспективное исследование, сравнивающее младенцев, находящихся на ИВЛ с инфекцией RSV, и пациентов, поступивших в палату, показало, что у пациентов, находящихся на ИВЛ, были более высокие уровни пролактина и гормона роста и значительно более низкие уровни лептина и инсулиноподобного фактора роста-1. Уровень кортизола не отличался. Уровни лептина и пролактина составляли 57% вариации количества лимфоцитов, что было значительно ниже у пациентов с ИВЛ с инфекцией RSV [34].

Респираторно-синцитиальный вирус-ассоциированный гепатит

Повышенные уровни трансаминаз были обнаружены у 46–49% детей с РСВ-бронхиолитом на ИВЛ [35,36]. Отмечен тяжелый гепатит с уровнем аланинаминотрансферазы около 3000 МЕ / л, связанный с коагулопатией [35]. Пик уровня трансаминаз был обнаружен между двумя и четырьмя днями после госпитализации (см. Рисунок). Респираторное заболевание, судя по продолжительности вентиляции, было более тяжелым у младенцев с повышенным уровнем трансаминаз [35,36].Распространенность гепатита среди детей с врожденными пороками сердца составила 80%. Это было значительно выше, чем у детей без врожденных пороков сердца [36]. Прямая инвазия в печень у иммунокомпетентного младенца с инфекцией RSV была документально подтверждена успешным культивированием RSV из материала биопсии печени [37]. Поражение печени в виде жировых изменений было описано в смертельном случае синдрома Рея, связанного с инфекцией RSV [38].

Уровни аланинаминотрансферазы (АЛТ) у младенцев с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией, находившихся на ИВЛ в педиатрическом отделении интенсивной терапии.

Другие внелегочные проявления RSV-бронхиолита

Описано несколько других внелегочных проявлений RSV-инфекции, но большинство из них только в отдельных случаях, и ни одно из них не кажется опасным для жизни. К ним относятся гипотермия [3], экзантемы на туловище и лице в виде мелкозернистой скарлатинообразной сыпи [3,39], тромбоцитопения и конъюнктивит [40].

Поддерживающее ведение внелегочных проявлений респираторно-синцитиальной вирусной инфекции

Предыдущие серии случаев показали, что желудочковые аритмии, связанные с RSV, могут реагировать на антиаритмические препараты, такие как лидокаин и бета-блокаторы, и кардиоверсию [10].Гипотония может реагировать на простую жидкостную реанимацию [14] и, если она не приносит успеха, на инотропную поддержку в течение нескольких дней [16].

Стратегии, используемые для лечения апноэ, ассоциированного с RSV, в предыдущих исследованиях, ни одно из которых не было рандомизированным контролируемым испытанием, включали нагрузку с кофеином, постоянное положительное давление в дыхательных путях через нос, вентиляцию с отрицательным давлением, а также интубацию и механическую вентиляцию [41,42]. Прием кофеина значительно снизил частоту апноэ у семи младенцев с RSV-инфекцией.Гипонатриемические судороги успешно и безопасно купируются за счет повышения уровня натрия менее 25 ммоль / л в течение 48 часов (около 0,5 ммоль / л в час). Гипонатриемические припадки могут быть устойчивыми к противосудорожной терапии и могут потребовать более быстрой коррекции болюсом 3% физиологического раствора в дозе 3-5 мл / кг с последующим ограничением жидкости [27]. Поражение печени должно побудить клинициста исследовать структурное заболевание сердца, вызывающее ишемический гепатит.

Обсуждение

Внелегочные проявления предполагают, что RSV может инфицировать другие органы, кроме легких.Маловероятно, что системная коинфекция бактериальными патогенами является причиной большинства внелегочных проявлений. Предыдущие исследования показали, что серьезная бактериальная инфекция присутствует у 0,6–1,2% детей, поступивших с инфекцией RSV [43]. Предыдущее исследование показало, что у 63% новорожденных и у 20% младенцев с RSV, обнаруженным в назофарингеальном аспирате в PICU, РНК RSV обнаруживалась в периферической крови с помощью вложенной ОТ-ПЦР [44]. Об обнаружении РНК RSV в артериальной крови (четыре ребенка с бронхиолитом) также сообщила другая группа [45].Эти данные демонстрируют, каким образом RSV передается во внелегочные органы. Можно предположить, что апноэ и аритмии привели к неожиданным смертельным случаям у младенцев с RSV-заболеванием в сообществе, даже несмотря на то, что обнаружение нуклеиновой кислоты RSV в посмертных тканях младенцев, умерших от синдрома внезапной детской смерти, было не более распространено, чем у младенцев, которые умерли в тот же период от не связанных причин [46].

RSV и сердечно-сосудистая система

Некоторые авторы сообщений об аритмиях или сердечной недостаточности при RSV-инфекции сомневались в прямой роли вируса.Как подчеркивалось в предыдущем сообщении [47], декомпенсация правого желудочка из-за легочной гипертензии является возможной причиной повреждения миокарда, повышения сердечного тропонина и систолической гипотензии. Заболевания легких связаны с легочной гипертензией при бронхиолите [48]. Ранее сообщалось о повышении сердечного тропонина Т у пациентов с бактериальной пневмонией [49]. Напряжение правого желудочка также может вызвать аритмию [50]. Однако о прямом участии RSV свидетельствует его изоляция от ткани миокарда и сообщения о значительном выпоте в перикард.

RSV и центральная нервная система

Апноэ было наиболее частым неврологическим проявлением RSV-инфекции. Проспективное экспериментальное исследование гортанного хеморефлекса [26] ясно продемонстрировало, что существует аномальная реакция на уровне вовлеченной центральной нервной системы, а не то, что апноэ является вторичным по отношению к респираторному нарушению или только судорогам. Обнаружение RSV в CSF также поддерживает прямое вторжение в центральную нервную систему при RSV-заболевании.

RSV и эндокринная система

Отсутствие связи между уровнями АДГ и сниженными уровнями натрия в сыворотке может быть связано с гиперренинемией и особенностями вторичного гиперальдосеронизма, приводящего к задержке натрия, обнаруженным в другом исследовании [51]. Можно предположить, что может быть задействована гиповолемия внутригрудных рецепторов. Похоже, что для развития гипонатриемии необходимо наличие как повышенного уровня АДГ, так и источника безэлектролитной воды [27].Исследование, посвященное нейроэндокринной реакции на стресс, показало, что, в соответствии с предыдущими исследованиями, лимфопения не связана с повышенным уровнем кортизола, и предоставило новые данные о возможной связи низкого количества лимфоцитов с повышенным уровнем пролактина и низким уровнем лептина. Имеются убедительные доказательства роли лептина в предотвращении стресс-индуцированного апоптоза Т-лимфоцитов [52].

RSV и печень

Более высокая распространенность гепатита у детей с врожденными пороками сердца может указывать на то, что венозный застой в печени в результате недостаточности правого желудочка, вызывающей ишемический гепатит, может быть вовлечен в повышение уровня трансаминаз у некоторых из этих детей.Помимо задокументированной прямой инвазии в печень, возможный эффект цитотоксических CD8-положительных Т-лимфоцитов, не требующий наличия самого RSV, недавно был вовлечен в побочное повреждение печени при легкой инфекции вируса гриппа [53].

Программа будущих исследований

Будущие исследования должны включать рандомизированные контролируемые испытания по лечению центрального апноэ, связанного с RSV, такими лекарствами, как кофеин, которые могут предотвратить потребность в механической вентиляции легких.Отсутствуют данные о внелегочных проявлениях инфекции RSV у пожилых людей, у которых сопутствующие заболевания, такие как ишемическая болезнь сердца и цереброваскулярная недостаточность, могут подвергать их более высокому риску осложнений. В будущих исследованиях необходимо выяснить, насколько распространены внелегочные проявления, такие как аритмия и гепатит, у пациентов с легкой инфекцией RSV. Долгосрочные последующие исследования случай-контроль, включая детальную нейровизуализацию, младенцев с острыми неврологическими проявлениями RSV-инфекции, должны уточнить, есть ли потенциальные долгосрочные последствия.

Заключение

Внелегочные проявления часто встречаются у младенцев на ИВЛ с тяжелой инфекцией RSV. В этом систематическом обзоре подчеркивается, что у этих пациентов необходимо тщательно контролировать сердечный ритм и артериальное давление для выявления потенциально опасных для жизни осложнений (таблица). У пациентов, которым требуется внутривенное введение жидкости, необходимо ежедневно проверять уровень натрия в плазме, а ввод жидкости необходимо регулировать, чтобы избежать развития гипонатриемии и связанных с ней судорог.Эти требования должны быть сбалансированы с учетом возможных осложнений инвазивного мониторинга и избыточного лечения младенцев с инфекцией RSV в отделении интенсивной терапии интенсивной терапии, которые, как было установлено, связаны с увеличением затрат и заболеваемости без улучшения результатов [54].

Таблица 2

Опасные для жизни внелегочные осложнения тяжелой инфекции респираторно-синцитиальным вирусом

Пораженные органы Осложнение Ссылки
Мозг Апноэ; эпилептический статус [19,20]
Сердце Желудочковая тахикардия; мерцание желудочков; кардиогенный шок; полная блокада сердца; тампонада перикарда [7,10,12]
Мозг, печень и почки Синдром Рея [38]

Ключевые сообщения

• Внелегочные проявления часто встречаются у детей с тяжелой формой RSV.

• Опасные для жизни внелегочные проявления RSV-инфекции включают центральное апноэ, эпилептический статус, желудочковые тахикардии и фибрилляцию, блокаду сердца и тампонаду перикарда и могут быть обнаружены при адекватном мониторинге.

• Гипонатриемия, связанная с RSV, является обычным явлением, может вызывать судороги и требует адекватного приема жидкости.

Сокращения

ADH = антидиуретический гормон; CSF = спинномозговая жидкость; PICU = педиатрическое отделение интенсивной терапии; RSV = респираторно-синцитиальный вирус; ОТ-ПЦР = полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Вклад авторов

Автор является дизайнером и единственным автором данной работы.

Источники

  • Ориве ФДП, Флорес Дж. К., Тереза ​​МАГ, Нуньес А.Р., Ордонез EQ, Ласаоса ФК, Химено Дж. М., Экстремра АР, Рубио ЯС, Масиас CC и др. Острая респираторная инфекция в педиатрических отделениях интенсивной терапии. Многоцентровое проспективное исследование. An Esp Pediatr. 1998. 48: 138–142.[PubMed] [Google Scholar]
  • Carrat F, Leruez-Ville M, Tonnellier M, Baudel JL, Deshayes J, Meyer P, Maury E, Galimand J, Rouzioux C, Offenstadt G. отделение для больных с острой кардиореспираторной недостаточностью. Intensive Care Med. 2006. 32: 156–159. DOI: 10.1007 / s00134-005-2861-4. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Njoku DB, Kliegman RM. Атипичные внелегочные проявления тяжелой респираторно-синцитиальной вирусной инфекции, требующие интенсивной терапии.Clin Pediatr (Phila) 1993; 32: 455–460. [PubMed] [Google Scholar]
  • Мейс С., Боркат Г., Либман Дж. Дисфункция печени и сердечно-сосудистые нарушения. Am J Dis Child. 1985. 139: 60–65. [PubMed] [Google Scholar]
  • MacDonald NE, Wolfish N, McLaine P, Phipps P, Rossier E. Роль респираторных вирусов в обострениях первичного нефротического синдрома. J Pediatr. 1986; 108: 378–382. DOI: 10.1016 / S0022-3476 (86) 80876-9. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Пучков Г.Ф., Минкович Б.М.Респираторно-синцитиальная инфекция у ребенка, осложненная интерстициальным миокардитом со смертельным исходом. Арх Патол. 1972; 34: 70–73. [PubMed] [Google Scholar]
  • Армстронг Д.С., Менахем С. Сердечные аритмии как проявление приобретенного порока сердца, связанного с инфекцией респираторно-синцитиального вируса у детей. J Педиатр детского здоровья. 1993. 29: 309–311. [PubMed] [Google Scholar]
  • Доннерштейн Р.Л., Берг Р.А., Шехаб З., Овадия М. Сложные предсердные тахикардии и респираторно-синцитиальные вирусные инфекции у младенцев.J Pediatr. 1994; 125: 23–28. DOI: 10.1016 / S0022-3476 (94) 70116-4. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Playfor SD, Khader A. Аритмии, связанные с инфекцией респираторно-синцитиального вируса. Педиатрическая анестезия. 2005; 15: 1016–1018. DOI: 10.1111 / j.1460-9592.2005.01580.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Thomas JA, Raroque S, Scott WA, Toro-Figueroa LO, Levin DL. Успешное лечение тяжелых аритмий у младенцев с респираторно-синцитиальными вирусными инфекциями: два случая и систематический обзор литературы.Crit Care Med. 1997; 25: 880–886. DOI: 10.1097 / 00003246-199705000-00027. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Хуанг М., Бигос Д., Левин М. Желудочковая аритмия, связанная с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией. Pediatr Cardiol. 1998. 19: 498–500. DOI: 10.1007 / s002469
      9. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Hutchison JS, Joubert GIE, Whitehouse SR, Kissoon N. Перикардиальный выпот и тампонада сердца после респираторно-синцитиальной вирусной инфекции. Педиатр Emerg Care. 1994; 10: 219–221.[PubMed] [Google Scholar]
    • Checchia PA, Appel HJ, Kahn S, Smith FA, Shulman ST, Pahl E, Baden HP. Повреждение миокарда у детей с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией. Pediatr Crit Care Med. 2000; 1: 146–150. DOI: 10.1097 / 00130478-200010000-00010. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Eisenhut M, Sidaras D, Johnson R, Newland P, Thorburn K. Уровни сердечного тропонина T и поражение миокарда у детей с тяжелым респираторно-синцитиальным вирусным заболеванием легких. Acta Paediatr.2004. 93: 887–890. DOI: 10.1080 / 08035250410016203. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Moynihan JA, Brown L, Sehra R, Checchia PA. Кардиактропонин I как прогностический фактор дыхательной недостаточности у детей, госпитализированных с инфекциями респираторно-синцитиального вируса (РСВ): пилотное исследование. Am J Emerg Med. 2003. 21: 479–482. DOI: 10.1016 / S0735-6757 (03) 00163-3. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Ким К.К., Франкель Л.Р. Необходимость инотропной поддержки в подгруппе младенцев с тяжелой опасной для жизни респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией.J Investig Med. 1997. 45: 469–473. [PubMed] [Google Scholar]
    • Фишаут М., Туберген Д., Макинтош К. Клеточный ответ на респираторные вирусы с особым упором на детей с нарушениями клеточно-опосредованного иммунитета. J Pediatr. 1980; 96: 179–186. DOI: 10.1016 / S0022-3476 (80) 80799-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Bowles NE, Ni J, Kearney DL, Pauschinger M, Schultheiss HP, McCarthy R, Hare J, Bricker JT, Bowles KR, Towbin JA. Обнаружение вирусов в тканях миокарда методом полимеразной цепной реакции.Доказательства того, что аденовирус является частой причиной миокардита у детей и взрослых. J Am Coll Cardiol. 2003. 42: 466–472. DOI: 10.1016 / S0735-1097 (03) 00648-X. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Kho N, Kerrigan JF, Tong T, Browne R, Knilans J. Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция и неврологические аномалии: ретроспективное когортное исследование. J Child Neurol. 2004. 19: 859–864. [PubMed] [Google Scholar]
    • Sweetman LL, Ng Y-T, Butler IJ, Bodensteiner JB. Неврологические осложнения, связанные с респираторно-синцитиальным вирусом.Pediatr Neurol. 2005. 32: 307–310. DOI: 10.1016 / j.pediatrneurol.2005.01.010. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Ng Y-T, Cox C, Atkins J, Butler IJ. Энцефалопатия, связанная с респираторно-синцитиальным вирусным бронхиолитом. J Child Neurol. 2001. 16: 105–108. [PubMed] [Google Scholar]
    • Златева К.Т., Ван Ранст М.В. Обнаружение респираторно-синцитиального вируса подгруппы B в спинномозговой жидкости пациента с респираторно-синцитиальной вирусной пневмонией. Pediatr Infect Dis J. 2004; 23: 1065–1066.[PubMed] [Google Scholar]
    • Tjotta EA, Berg-Jensen B. Энцефалопатия, вырабатывающая антитела против респираторно-синцитиального вируса в центральной нервной системе у взрослой женщины. Tidsskr Nor Laegeforen. 1982; 102: 912–914. [PubMed] [Google Scholar]
    • Cappel R, Thiry L, Clinet G. Вирусные антитела в спинномозговой жидкости после острых инфекций ЦНС. Arch Neurol. 1975. 32: 629–631. [PubMed] [Google Scholar]
    • Kneyber MCJ, Brandenburg AH, De Groot R, Joosten KFM, Rothbarth PH, Ott A, Moll HA.Факторы риска апноэ, ассоциированного с респираторно-синцитиальным вирусом. Eur J Pediatr. 1998. 157: 331–335. DOI: 10.1007 / s004310050822. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Lindgren C, Groegaard J. Рефлекторный ответ апноэ и медиаторы воспаления у младенцев с инфекциями дыхательных путей. Acta Paediatr. 1996. 85: 798–803. [PubMed] [Google Scholar]
    • Ханна С., Тибби С.М., Дурванд А., Мердок И.А. Заболеваемость гипонатриемией и гипонатриемическими припадками при тяжелом респираторно-синцитиальном вирусном бронхиолите.Acta Paediatr. 2003. 92: 430–434. [PubMed] [Google Scholar]
    • Hirayama K, Sakazaki H, Murakami S, Yonezawa S, Fujimoto K, Seto T., Tanaka K, Hattori H, Matsuoka O, Murata R. Последовательная МРТ, ОФЭКТ и ПЭТ при респираторно-синцитиальном вирусном энцефалите . Pediatr Radiol. 1999. 29: 282–286. DOI: 10.1007 / s002470050589. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Адамс Дж. А., Забалета И. А., Сакнер М. А.. Трепетание диафрагмы у трех детей с бронхолегочной дисплазией и респираторно-синцитиальным вирусным бронхиолитом.Педиатр Пульмонол. 1995; 19: 312–316. [PubMed] [Google Scholar]
    • Hoffman R, Yahr W., Krieger B. Трепетание диафрагмы, приводящее к невозможности отлучения от искусственной вентиляции легких после операции аортокоронарного шунтирования. Crit Care Med. 1990; 18: 499–501. [PubMed] [Google Scholar]
    • Уилсон Д.Ф., Ландриган С.П., Хорн С.Д., Смаут Р.Дж. Осложнения у младенцев, госпитализированных по поводу бронхиолита или респираторно-синцитиальной вирусной пневмонии. J Pediatr. 2003. 143: 142–149. DOI: 10.1067 / S0022-3476 (03) 00514-6.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Риверс РПА, Форслинг М.Л., Олвер Р.П. Несоответствующая секреция антидиуретического гормона у младенцев с респираторными инфекциями. Arch Dis Child. 1981; 56: 358–363. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Van Steensel-Moll HA, Hazelzet JA, Vander Voort E, Neijens HJ, Hackeng WHL. Чрезмерная секреция антидиуретического гормона при инфекциях респираторно-синцитиальным вирусом. Arch Dis Child. 1990; 65: 1237–1239. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Tasker RC, Roe MF, Bloxham DM, White DK, Ross-Russell RI, O’Donnell DR.Нейроэндокринная реакция на стресс и тяжесть острого респираторно-синцитиального вирусного бронхиолита в младенчестве. Intensive Care Med. 2004. 30: 2257–2262. DOI: 10.1007 / s00134-004-2470-7. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Eisenhut M, Thorburn K. Гепатит, связанный с тяжелой респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией нижних дыхательных путей. Scand J Infect Dis. 2002; 34: 235. DOI: 10.1080 / 00365540110077191. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Eisenhut M, Thorburn K, Ahmed T.Уровни трансаминаз у вентилируемых детей с респираторно-синцитиальным вирусным бронхиолитом. Intensive Care Med. 2004. 30: 931–934. DOI: 10.1007 / s00134-004-2236-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Надаль Д., Вундерли В., Меурманн О., Бринер Дж., Хирсиг Дж. Выделение респираторно-синцитиального вируса из ткани печени и материала атрезии внепеченочных желчных путей. Scand J Infect Dis. 1990; 22: 91–93. [PubMed] [Google Scholar]
    • Гриффин Н., Килинг Дж. У., Томлинсон А. Х. Синдром Рея, связанный с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией.Arch Dis Child. 1979; 54: 74–76. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Unger A, Tapia L, Minnich LL, George Ray C. Атипичная неонатальная респираторно-синцитиальная вирусная инфекция. J Pediatr. 1982; 100: 762–764. DOI: 10.1016 / S0022-3476 (82) 80581-7. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Fujishima H, Okamoto Y, Saito I., Tsubota K. Респираторно-синцитиальный вирус и аллергический конъюнктивит. J Allergy Clin Immunol. 1995; 95: 663–667. DOI: 10.1016 / S0091-6749 (95) 70169-9. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Аль-балхи А., Клонин Х., Маринаки К., Саутхолл Д.П., Томас Д.А., Джонс П., Сэмюэлс М.П.Систематический обзор лечения апноэ, связанного с бронхиолитом, в двух центрах. Arch Dis Child. 2005; 90: 288–291. DOI: 10.1136 / adc.2003.039404. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Tobias JD. Кофеин в лечении апноэ, связанного с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией, у новорожденных и младенцев. Саут Мед Дж. 2000; 93: 294–296. [PubMed] [Google Scholar]
    • Randolph AG, Reder L, Englund JA. Риск бактериальной инфекции у ранее здоровых детей раннего возраста, инфицированных респираторно-синцитиальным вирусом, поступивших в отделение интенсивной терапии.Pediatr Infect Dis J. 2004; 23: 990–994. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Rohwedder A, Keminer O, Forster J, Schneider K, Schneider E, Werchau H. Обнаружение РНК респираторно-синцитиального вируса в крови новорожденных с помощью полимеразной цепной реакции. J Med Virol. 1998. 54: 320–327. DOI: 10.1002 / (SICI) 1096-9071 (199804) 54: 4 <320 :: AID-JMV13> 3.0.CO; 2-J. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • О’Доннелл Р., МакГарви М.Дж., Талли Дж. М., Бальфур-Линн М., Openshaw PJM. РНК респираторно-синцитиального вируса в клетках периферической крови при острой инфекции.J Pediatr. 1998. 133: 272–274. DOI: 10.1016 / S0022-3476 (98) 70234-3. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Cubie HA, Дункан Л.А., Маршалл Л.А., Смит Н.М. Обнаружение нуклеиновой кислоты респираторно-синцитиального вируса в архивной патологоанатомической ткани новорожденных. Pediatr Pathol Lab Med. 1997; 17: 927–938. DOI: 10.1080 / 107710497174372. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Konstantinides S, Geibel A, Olschewski M, Kasper W, Hruska N, Jaeckle S, Binder L. Важность сердечных тропонинов I и T в классификации риска пациентов с острой тромбоэмболией легочной артерии .Тираж. 2002; 106: 1263–1268. DOI: 10.1161 / 01.CIR.0000028422.51668.A2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Sreeram N, Watson JG, Hunter S. Сердечно-сосудистые эффекты острого бронхиолита. Acta Paediatr Scand. 1991; 80: 133–136. [PubMed] [Google Scholar]
    • Weinberg I, Cukierman T., Chajek-Shaul T. Повышение уровня тропонина T при долевой болезни легких. Postgrad Med J. 2002; 78: 244–245. DOI: 10.1136 / pmj.78.918.244. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Chen RL, Penny DJ, Greve G, Lab MJ.Вызванная растяжением региональная механоэлектрическая дисперсия и аритмия в правом желудочке анестезированных ягнят. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004; 286: 2008–2014. DOI: 10.1152 / ajpheart.00724.2003. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Gozal D, Colin AA, Jaffe M, Hochberg Z. Вода, электролиты и эндокринный гомеостаз у младенцев с бронхиолитом. Pediatr Res. 1990; 27: 204–209. [PubMed] [Google Scholar]
    • Fujita Y, Murakami M, Ogawa Y, Masuzaki H, Tanaka M, Ozaki S, Nakao K, Mimori T.Лептин подавляет вызванный стрессом апоптоз Т-лимфоцитов. Clin Exp Immunol. 2002; 128: 21–26. DOI: 10.1046 / j.1365-2249.2002.01797.x. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    • Polakos NK, Cornejo JC, Murray DA, Wright KO, Treanor JJ, Crispe IN, Topham DJ, Pierce RH. Клеточно-зависимый гепатит Купфера возникает во время гриппа. Am J Pathol. 2006; 168: 1169–1178. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Willson DF, Jiao J-H, Hendley JO, Donowitz L. Инвазивный мониторинг младенцев с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией.J Pediatr. 1996. 128: 357–362. DOI: 10.1016 / S0022-3476 (96) 70281-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

    По мере того, как COVID-19 продолжается, как никогда важно защитить уязвимых пациентов от RSV

    Поскольку мир продолжает приспосабливаться к новым нормам во время продолжающейся пандемии COVID-19, и почти все аспекты нашей жизни затронуты, у нас есть возможность переосмыслить наши стратегии здравоохранения и подходы к лечению всех болезней, особенно других респираторных заболеваний.

    COVID-19 выявил некоторые трудные истины об ограниченности ресурсов здравоохранения, доступных для борьбы с этим новым вирусом, против которого не существует вакцины и лечения. 1,2

    Значительное напряжение, вызванное COVID-19 в больницах и учреждениях неотложной помощи, подчеркнуло ценность подходов к лечению многих заболеваний, которые могут помочь снизить количество госпитализаций и ненужную нагрузку на системы здравоохранения по всему миру.

    Еще до кризиса COVID-19 респираторные заболевания, требующие лечения, были связаны с повышенными расходами для системы здравоохранения. 3 Важность лекарств и способов профилактики, программ раннего выявления заболеваний, образа жизни и диетических мер, которые могут удерживать пациентов от госпитализации, сейчас еще больше.

    Это особенно верно для некоторых из наших наиболее уязвимых пациентов, младенцев и детей, которых мы обязаны защищать от невероятно распространенной, но менее известной респираторной инфекции, называемой респираторно-синцитиальным вирусом, или RSV.

    О чем многие люди часто не знают, пока сами не станут новыми родителями (и даже тогда, к сожалению, некоторым не сообщают), так это то, что RSV является распространенным сезонным патогеном, который поразит почти всех младенцев к их второму дню рождения. 4,5 RSV является ведущей причиной острых инфекций нижних дыхательных путей, таких как бронхиолит и пневмония, у младенцев и детей младшего возраста. 6

    В то время как большинство детей с RSV будут испытывать только легкие симптомы, похожие на простуду, и их можно успешно лечить в амбулаторных условиях, некоторые случаи RSV могут быть тяжелыми и могут потребовать госпитализации. 3

    В 2015 году во всем мире было зарегистрировано около 33 миллионов случаев острой инфекции RSV LRTI, что привело к 3 миллионам госпитализаций и почти 60 000 случаев смерти детей младше пяти лет. 5

    Хотя биофармацевтическая промышленность в сотрудничестве с мировыми правительствами и исследовательскими институтами работает беспрецедентными темпами над разработкой вакцины COVID-19 и лечения вируса, мы знаем, что потребуется больше времени и исследований, прежде чем уменьшать риски, с которыми мы сталкиваемся сегодня. .

    До тех пор важно сделать все возможное, чтобы и дальше защищать себя и своих близких от респираторных заболеваний, таких как RSV. На данный момент это может означать усиление личной и семейной гигиены, социальное дистанцирование и более тщательный мониторинг потенциальных симптомов РСВ.

    Поскольку работа над вакциной COVID продолжается, мы также по-прежнему надеемся, что однажды сможем предложить новые варианты, которые помогут предотвратить RSV. Я горжусь тем, что возглавляю команду в AstraZeneca, которая изучает потенциальные новые пути профилактики RSV, вместе с нашими партнерами из Sanofi Pasteur, которые разделяют нашу приверженность улучшению результатов RSV для младенцев во всем мире — в эти беспрецедентные времена и в дальнейшем.

    MDHHS напоминает Мичиганцам об опасностях RSV и о том, как обезопасить детей в течение месяца осведомленности RSV

    MDHHS напоминает Michiganders об опасностях RSV и о том, как обезопасить детей в течение месяца осведомленности RSV

    ДЛЯ НЕМЕДЛЕННОГО ВЫПУСКА
    окт.4, 2021
    Контактное лицо: Chelsea Wuth, 517-241-2112

    ЛАНСИНГ, Мичиган — октябрь — месяц осведомленности о РСВ, и Департамент здравоохранения и социальных служб штата Мичиган (MDHHS) призывает всех принять меры для предотвращения распространения респираторно-синцитиального вируса (RSV). RSV — респираторный вирус, пик которого обычно наступает зимой, однако в этом году активность RSV была выше, чем ожидалось по всему штату, летом и ранней осенью, что также имеет тенденцию к распространению по стране.

    Каждый год в Соединенных Штатах RSV приводит примерно к 2.1 миллион амбулаторных посещений и 58 000 госпитализаций среди детей в возрасте до пяти лет. Около 177 000 госпитализаций и 14 000 смертей среди взрослых старше 65 лет.

    RSV очень заразен и распространяется воздушно-капельным путем после кашля или чихания. У взрослых и детей старшего возраста симптомы RSV обычно легкие и могут напоминать простуду. RSV может вызывать тяжелую инфекцию у некоторых людей, включая детей грудного и раннего возраста, пожилых людей, людей с заболеваниями сердца и легких или людей с ослабленным иммунитетом.Лица с симптомами простуды не должны общаться с детьми и другими людьми с высоким риском RSV.

    Важно сразу же позвонить лечащему врачу вашего ребенка, если у вашего ребенка есть какие-либо из следующих признаков или симптомов:

    • Простуда и младше шести месяцев или из группы высокого риска RSV.
    • Затрудненное дыхание:
      • Свистящее дыхание.
      • Кашель.
      • Короткие, поверхностные и быстрые вдохи.
      • Кожа между ребрами или под шеей тянется при каждом вдохе.
    • Цвет губ, языка или кожи становится синим или серым.
    • Проблемы с едой, питьем или сном.
    • Обезвоживание (уменьшение количества мокрых подгузников).

    «Можно принять простые меры для защиты вашего ребенка от RSV», — сказала д-р Наташа Багдасарян, главный медицинский директор MDHHS. «Избегайте тесного контакта с нездоровыми людьми, часто мойте руки, прикрывайте чихание, не касайтесь лица руками и часто дезинфицируйте поверхности.«

    Примите простые меры в дополнение к перечисленным выше, чтобы предотвратить распространение RSV:

    • Держите детей дома, когда они болеют.
    • Избегайте действий, связанных с близким контактом, таких как поцелуи, рукопожатия, совместное использование чашек и посуды.
    • Очищайте поверхности, к которым часто прикасаетесь, например дверные ручки, игрушки и мобильные устройства.

    Помимо детей, риску тяжелой инфекции RSV подвержены пожилые люди. Симптомы аналогичны перечисленным выше, но могут перерасти в серьезные заболевания, такие как пневмония.

    Большинство заболеваний, вызванных RSV, проходят сами по себе, и специального лечения RSV не существует. Если вы или ваш любимый человек заразились, важно следить за лихорадкой и болью, пить жидкости и поговорить со своим врачом, если у вас есть какие-либо проблемы.

    В этом году особенно важно принять меры предосторожности, поскольку COVID-19 продолжает циркулировать и имеет много схожих симптомов RSV, включая лихорадку и затрудненное дыхание. Жителям штата Мичиган настоятельно рекомендуется обратиться к своему врачу при появлении симптомов для соответствующей оценки, тестирования и лечения.

    Для получения дополнительной информации о RSV посетите CDC.gov/RSV.

    # #

    Антигенные отпечатки пальцев после первичной инфекции RSV у детей раннего возраста выявляют новые антигенные сайты и выявляют несвязанную эволюцию репертуаров человеческих антител к гликопротеинам слияния и прикрепления

    Abstract

    Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) является основной причиной пневмонии среди младенцев. Здесь мы выяснили репертуар антител после первичной инфекции RSV и проследили его эволюцию в подростковом и взрослом возрасте.Библиотеки фагового дисплея полных фрагментов генома (GFPDL), экспрессирующие линейные и конформационные эпитопы в слитом белке (F) RSV и белке прикрепления (G), использовали для объективного профилирования эпитопов сывороток младенцев до и после инфицирования RSV. Анализы F-GFPDL продемонстрировали умеренные изменения в репертуарах анти-F эпитопов после инфицирования RSV, в то время как анализ G-GFPDL выявил 100-кратное увеличение количества связанных фагов. G-реактивные эпитопы охватывают N- и C-конец эктодомена G вместе с повышенной реактивностью по отношению к центральному консервативному домену (CCD).Панели антигенных сайтов F и G были синтезированы для оценки сывороток от детей младшего возраста (<2 лет), подростков (14–18 лет) и взрослых (30–45 лет) в анализах кинетики SPR в реальном времени. Стабильное увеличение репертуара эпитопа RSV-F от детей младшего возраста к взрослым наблюдалось при использовании пептидов и белков F. Важно отметить, что несколько новых эпитопов были идентифицированы в пре-слиянии F и иммунодоминантный эпитоп в F-p27. Во всех возрастных группах связывание антител с F до слияния было в 2–3 раза выше, чем с формой после слияния.Для RSV-G ответ антител был высоким после ранней RSV-инфекции у детей, но значительно снизился у взрослых при использовании G-белков или пептидов. Это исследование выявило несвязанную эволюцию анти-F и анти-G ответов и подтверждающие доказательства эволюции RSV-G, вызванной иммунным давлением. Эти результаты могут помочь в разработке эффективных контрмер, включая вакцины.

    Сведения об авторе

    Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) является основной причиной пневмонии и бронхиолита среди младенцев и детей во всем мире.В США инфекция RSV приводит к 57 000 госпитализаций детей младшего возраста, особенно детей младше одного года. Более того, несмотря на развитие иммунитета после инфицирования RSV в детстве, люди остаются восприимчивыми к повторному инфицированию RSV верхних дыхательных путей. В текущем исследовании мы изучили репертуар антител после первичной инфекции RSV и их эволюцию у подростков и взрослых. Библиотеки фагового дисплея полных фрагментов генома (GFPDL), экспрессирующие линейные и конформационные эпитопы из слитого белка RSV (F) и белка прикрепления (G), использовали для объективного профилирования эпитопов сывороток до и после инфицирования RSV.Кроме того, для измерения связывания антител с пептидами и белками F и G использовали плазменный поверхностный резонанс (SPR). Наблюдалось устойчивое увеличение репертуара эпитопа RSV-F от детей младшего возраста к взрослым. Несколько новых эпитопов были идентифицированы в пре-слиянии F и иммунодоминантный эпитоп в F0-p27. Для RSV-G ответ антител был высоким после инфицирования RSV у детей, но снижался у взрослых. Это исследование выявило несвязанную эволюцию ответов против F и G, которые могут помочь в разработке более эффективных вакцин и методов лечения RSV.

    Образец цитирования: Fuentes S, Coyle EM, Beeler J, Golding H, Khurana S (2016) Антигенные отпечатки пальцев после первичной инфекции RSV у детей младшего возраста выявляют новые антигенные сайты и выявляют несвязанную эволюцию репертуаров человеческих антител к гликопротеинам слияния и прикрепления. PLoS Pathog 12 (4): e1005554. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005554

    Редактор: Патрик К. Уилсон, Чикагский университет, США

    Поступила: 16 декабря 2015 г .; Одобрена: 14 марта 2016 г .; Опубликован: 21 апреля 2016 г.

    Это статья в открытом доступе, свободная от всех авторских прав, и ее можно свободно воспроизводить, распространять, передавать, модифицировать, надстраивать или иным образом использовать в любых законных целях.Работа сделана доступной по лицензии Creative Commons CC0 как общественное достояние.

    Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

    Финансирование: Эта работа была поддержана внутренними фондами FDA. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

    Введение

    Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) является основной причиной пневмонии и бронхиолита среди младенцев и детей во всем мире [1]. В США инфекция RSV приводит к 57 000 госпитализаций среди детей младшего возраста, особенно детей младше одного года [2]. Многие из этих инфекций возникают в присутствии пассивно передаваемых материнских антител, хотя высокие титры нейтрализующих антител, по-видимому, улучшают течение болезни у младенцев в возрасте до 9 месяцев [3] [4, 5].Более того, несмотря на развитие иммунитета после инфицирования RSV в детстве, люди остаются восприимчивыми к повторному инфицированию RSV верхних дыхательных путей на протяжении всей жизни [4, 6, 7].

    Изоляты

    RSV можно разделить на две антигенно разные группы (A и B), при этом генетические различия наиболее широко проявляются в прикрепляющем гликопротеине G (47%) и в меньшей степени в слитном белке F (9%) [8]. Кроме того, непрерывная эволюция RSV подгруппы A порождает разнообразие, прежде всего, в гене G [9, 10].Повторные инфекции RSV происходят в основном с гетерологичными штаммами и в меньшей степени с гомологичными штаммами RSV из-за более ограниченного разнообразия [11, 12].

    Многочисленные исследования, проведенные на протяжении трех десятилетий, изучали реакцию антител до и после инфицирования RSV в разных возрастных группах (младенцы, дети, взрослые и пожилые люди). В разных лабораториях использовались разные методы (нейтрализация вируса; связывание антител с инфицированными клетками, конкуренция с мышиными МАb против белков F и G; связывание с короткими пептидами и белками с помощью ELISA).Однако было сделано мало выводов относительно наилучших коррелятов защиты, причин рецидива инфекций RSV на протяжении всей жизни и эволюции гена RSV G в циркулирующих штаммах [13–15] [16–25]. Хотя важность RSV как респираторного патогена была признана более 50 лет назад, вакцина еще не доступна из-за нескольких проблем, присущих разработке вакцины RSV. Более глубокое понимание гуморальных иммунных ответов на первичную инфекцию RSV у детей младшего возраста может предоставить важную информацию, которая может помочь разработать эффективные контрмеры, включая вакцину для этой возрастной группы и вакцинацию матерей.Ранее мы использовали библиотеки полногеномного фрагмента-фагового дисплея (GFPDL), охватывающие весь геном высокопатогенного вируса птичьего гриппа (HPAI) H5N1-A / Vietnam / 1203/2004, чтобы составить карту репертуаров антител выздоравливающих сывороток от людей, инфицированных H5N1 [ 26].

    В текущем исследовании мы генерировали GFPDL для поверхностных белков F и G РСВ, чтобы выяснить полный репертуар эпитопов антител в образцах сыворотки младенцев либо до (<9 месяцев), либо после первичной и ранней инфекции RSV (15–18 месяцев).Библиотеки фагового дисплея были сконструированы отдельно для генов RSV-F и RSV-G для отображения сегментов белка размером от 15 до 250 аминокислот и, таким образом, предсказано, что они представляют все возможные линейные и конформационные эпитопы для белков F и G. Основываясь на результатах анализа репертуара эпитопов GFPDL, мы синтезировали большие пептиды, представляющие антигенные сайты, охватывающие белки RSV-F и G, и использовали кинетический анализ на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) в реальном времени с панелями сыворотки разных возрастных групп (< 2 года; 10–14 лет; 30–45 лет), чтобы обозначить эволюцию ответов антител.Эти подходы идентифицировали преобладающие эпитопы, распознаваемые антителами, приобретенными после первичной и ранней инфекции RSV, в разных возрастных группах. Наше исследование обеспечивает комплексный антигенный фингерпринт ответов антител на белки RSV-F и G после ранней инфекции RSV. Мы идентифицировали несколько новых эпитопов в белках F и G RSV и иммунодоминантный эпитоп в F-p27, который вырезается во время процессинга F0. Наши исследования продемонстрировали несвязанную эволюцию ответов антител на белки F и G у людей.

    Результаты

    Создание и характеристика библиотек фаговых дисплеев фрагментов генома F и G (GFPDL)

    Для анализа репертуара эпитопов сывороток от людей, инфицированных RSV, GFPDL, содержащие фрагменты генов F или G длиной от 50 до 750 п.н., были созданы с> 10 6 уникальными фаговыми клонами, которые, как ожидается, будут отображать все возможные линейные и конформационные эпитопы. Секвенирование библиотек RSV-F и RSV-G GFPD подтвердило случайное распределение размера и последовательности вставок и охватило все гены F или G.Чтобы подтвердить способность библиотек фагового дисплея идентифицировать как линейные, так и конформационные эпитопы антител, мы использовали панель из 16 анти-F и анти-G MAb для картирования эпитопов с использованием RSV-F и G GFPDL, соответственно. Репрезентативный анализ эпитопа GFPDL для двух анти-F MAb и одного анти-G MAb показан на фиг. 1. D25 представляет собой конформационно-зависимое моноклональное антитело, которое связывает сайт ϕ на предварительно слитой форме RSV-F [27]. Паливизумаб — единственный лицензированный FDA продукт для профилактики RSV-инфекции у младенцев из группы высокого риска.Паливизумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, которое связывается с преимущественно линейным эпитопом в антигенном сайте II белка F, который экспонируется как до, так и после слияния форм F [28]. Пэннинг F-GFPDL с помощью паливизумаба или D25 MAb идентифицировал фрагменты с последовательностями, которые охватывали сайт II (паливизумаб) или сайт ϕ (D25) соответственно (фиг. 1A). Консенсусные иммунодоминантные эпитопные последовательности для моноклональных антител, полученные с помощью анализа GFPDL, были очень похожи на основные сайты связывания, идентифицированные с помощью рентгеновской кристаллографии (рис. 1B).Картирование MAb D25-выбранных специфических фагов показало эпитоп, охватывающий полную последовательность 62–209, которая содержит два контактных сайта, идентифицированных рентгеноструктурными исследованиями (рис. 1B). Моноклональное антитело 131-2G связывается с эпитопом, близким к центральному консервативному домену (CCD) RSV G [29]. Отбор по аффинности с использованием RSV-G GFPDL с MAb 131-2G выявил множественные фрагменты, все из которых содержат полный или часть центрального консервативного домена (рис. 1C).

    Рис. 1. Оценка библиотеки фагового дисплея фрагментов гена F и G РСВ с использованием нейтрализующих моноклональных антител.

    (A) Библиотеку фрагментов гена, отображающую случайные фрагменты и охватывающие весь ген F, использовали для картирования связывающего эпитопа моноклональных антител против F, паливизумаба и D25. На схеме сверху представлен белок F, включая расположение ранее обнаруженных антигенных областей: ϕ, I, II и IV. Выравнивания отображаемых фрагментов на фагах, выбранных Palivizumab и D25 в F-GFPDL, показаны синими и красными полосами соответственно. Толщина полосок представляет относительные частоты связанных фрагментов.Цифры внизу представляют собой аминокислотные остатки белка RSV-F. (B) Представление эпитопов антител к паливизумабу и D25, идентифицированным либо с помощью рентгеновской кристаллографии, либо с помощью GFPDL в структуре белка F до слияния (PDB Id-4JHW). Красный цвет относится к эпитопу D25, а синий — к эпитопу паливизумаба. (C) Библиотеку фрагментов гена, отображающую случайные фрагменты и охватывающие весь ген G, использовали для картирования связывающего эпитопа MAb 131-2G. Схема представляет G-белок, включая ранее идентифицированный центральный консервативный домен (CCD).(D) Консенсусные аминокислотные последовательности, идентифицированные как эпитоп, распознаваемый моноклональными антителами с использованием GFPDL или других методов.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005554.g001

    Минимальные общие эпитопные последовательности для сайтов связывания этих MAb на белках F и G, идентифицированные с помощью отбора GFPDL, сравнивали с их следами, ранее идентифицированными либо рентгеновская кристаллография, либо сканирование пептидов (рис. 1D). Хорошее соответствие между эпитопами, идентифицированными GFPDL, и ранее идентифицированными последовательностями-мишенями для этих и дополнительных MAb обеспечило важное подтверждение концепции в поддержку использования RSV F- и G-GFPDL для выяснения как линейных, так и конформационно-зависимых эпитопов MAb. и для картирования профилей эпитопов антител в поликлональных сыворотках человека.

    Картирование репертуара эпитопов антител у детей после первичной инфекции RSV

    Инфекция

    RSV возникает в очень раннем возрасте и обеспечивает лишь частичный иммунитет, и, хотя вероятность инфекции нижних дыхательных путей уменьшается с каждым последующим контактом, повторное инфицирование RSV верхних дыхательных путей является обычным явлением на протяжении всей жизни [5]. Для беспристрастного изучения ответов антител после первичной и ранней инфекции RSV использовали библиотеки RSV GFPD для определения репертуаров эпитопов поликлональных сывороточных антител против слитого белка F RSV и белка присоединения G.

    В предварительном исследовании мы оценили способность GFPDL реагировать с гипериммунной сывороткой кроликов, трижды вакцинированных RSV-F (пост-гибридная форма) или RSV-G [30] белками RSV-A2 (S1 Рис.). Сыворотки до вакцинации не реагировали с F-GFPDL, что подтверждает отсутствие неспецифического связывания. Сыворотки, вакцинированные пост-слитным белком F, связывали большое количество фагов, отображающих эпитопы, которые картировались с сайтом II F1, C-концом F1 и доминантным сайтом на C-конце F2 (S1A и S1B фиг.).Аналогичным образом, сыворотки до вакцинации не связывались с G-GFPDL, в то время как сыворотки после G-вакцинации реагировали с короткими и большими фрагментами либо выше, либо ниже центрального консервативного домена (CCD) (S1C фиг.).

    Затем мы определили способность GFPDL адсорбировать антитела, специфичные к RSV, в сыворотке кроликов. После двух раундов адсорбции с помощью GFPDL, 86–88% антител против F и 89% антител против G в сыворотке кроликов после вакцинации были адсорбированы библиотеками F- и G-фагового дисплея, соответственно, как определено. путем связывания с белками F и G с помощью SPR.Вместе ранние исследования с кроличьей иммунной сывороткой (и контрольной сывороткой до вакцинации) подтвердили использование F- и G-GFPDL RSV для анализа репертуаров поликлональных антител в сыворотке крови человека.

    Для оценки гуморального иммунного ответа после первичной инфекции RSV у людей для картирования эпитопа антител были отобраны пять детей с парными сыворотками, собранными до инфекции (в 9 месяцев) и после первичной / ранней инфекции RSV (до 15–18 месяцев). репертуары. Инфекционный статус определяли с помощью системы иммунопреципитации люциферазой (LIPS-N), которая измеряет антитела против нуклеопротеина RSV (N) [положительная инфекция RSV> 8000 световых единиц Renilla (RLU)], и с помощью теста нейтрализации уменьшения бляшек (PRNT), как ранее сообщили [31] (таблица S1).Кроме того, изотипические профили антител продемонстрировали значительные фракции антител IgA против белков F и G, составляющие 12–37% от общего количества антител (S2 рис.), Подтверждая, что сыворотки через 15/18 месяцев были получены после инфицирования RSV. Материнские антитела против RSV, которые проникают через плаценту, могут сохраняться до 9 месяцев, как сообщалось ранее [13, 15, 32].

    Объединенные сыворотки от пяти детей, которые были отрицательными по антителам против RSV-N и нейтрализующей активностью RSV в возрасте 9 месяцев и имели сероконверсию к 15-18 месяцам, были использованы для пэннинга F-GFPDL (рис. 2).Неожиданно не было значительного увеличения количества фагов F-GFPDL, связанных с объединенными сыворотками после инфицирования RSV, по сравнению с сыворотками до инфицирования (фиг. 2A). Поскольку наш пэннинг GFPDL использует белок A / G для захвата антител, связанных с фагом, мы, вероятно, упустили некоторую долю IgA-антител в эпитопном профиле антител в сыворотках после инфицирования RSV. Кроме того, вклад материнских антител в общие анти-F антитела в плазме у детей в возрасте 15–18 месяцев был значительно ниже, чем в возрасте ≤ 9 месяцев, но мы не смогли разделить материнские и материнские антитела.детские IgG-антитела в анализе GFPDL. Поликлональные сыворотки до и после инфицирования показали аналогичный репертуар эпитопов антител. Высокая частота связанных фагов показывает фрагменты, отображаемые на N-конце белка RSV-F, который включает субъединицу F2 и сайт ϕ, а также на антигенный сайт II и C-конец F (аминокислоты 400–550). (Рис. 2A). Восемнадцать уникальных антигенных сайтов, определяемых 7 большими антигенными областями (здесь называемыми от F-1 до F-7) и 11 меньшими антигенными сайтами (здесь называемыми F-1.1 — F-6.2) были идентифицированы в белке F, который включал как известные, так и новые эпитопы (рис. 2B). Количество фаговых клонов, которые были связаны сывороткой 9 месяцев против 15-18 месяцев с каждым антигенным сайтом, показано на фиг. 2C, а процент клонов, связанных с каждым антигенным сайтом, показан на фиг. 2D. Аналогичное распределение наблюдалось только при небольшом количестве пептидов, которые чаще распознавались в сыворотках детей после инфицирования RSV через 15–18 месяцев.

    Рис. 2. Выяснение профиля эпитопа антител против белка F RSV после первичной инфекции RSV у детей.

    (A) Распределение фаговых клонов после селекции по аффинности RSV-F GFPDL с сыворотками, полученными от детей в возрасте 9 месяцев (вверху) или 15–18 месяцев (внизу). Обозначение аминокислот основано на последовательности белка RSV-F. Расположение столбцов указывает на гомологию отображаемой последовательности белка RSV-F на клонах фага после селекции по аффинности. Толщина каждого столбца представляет собой частоту многократно изолированных фаговых вставок (показаны только клоны с частотой два или более).(B) Антигенные сайты в белке F RSV, распознаваемые после первичной инфекции RSV. Ранее описанные антигенные сайты (сайты ϕ, I, II и IV) показаны выше, а антигенные области, обнаруженные в этом исследовании, изображены под схемой белка F и имеют цветовую кодировку. (C) Количество клонов, которые кодировали каждый антигенный сайт до и после инфицирования RSV. (D) Распределение и частота фаговых клонов, экспрессирующих каждый из ключевых антигенных сайтов F RSV. Количество клонов, кодирующих каждый антигенный сайт, делили на общее количество клонов F-GFPDL и представляли в виде процента до и после инфицирования RSV.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005554.g002

    Места воздействия на поверхность каждого из этих антигенных сайтов в формах F до и после слияния показаны на рис. 3. Большинство ключевые мишени антител, идентифицированные F-GFPDL-анализом сывороток после инфицирования RSV, экспонируются на нативных F-структурах и, вероятно, будут представлены на вирионах RSV. Были идентифицированы два новых антигенных сайта (F2, F3), специфичных для пре-гибридной формы белка F, которые не были описаны ранее (рис.синие участки на пре-слиянии против пост-слияния F, соответственно. Судя по поверхностному представлению, антигенные сайты 2 и 3 более доступны в форме белка F до слияния по сравнению с структурой после слияния. Антигенный сайт 4 находится ближе к мембране в пре-слиянии F и может иметь меньшую доступность в пре-слитной форме F, но более легко экспонируется на короне пост-слитного F-белка (фиг. 3).

    Рис. 3. Структурное представление антигенных сайтов в форме F до и после слияния, идентифицированных с использованием GFPDL.

    Поверхностная структура тримерной формы белка F RSV (PDB Id — 4ZYP) показана белым цветом, а антигенная область в мономере (цепь A) выделена красным. Поверхностная структура тримера RSV F после слияния (PDB Id-3RRT) показана белым, а антигенные области одного мономера выделены синим цветом. Белок F RSV, используемый для кристаллографии, включает аминокислотные остатки 26-513del108-134 из полных 574 а.о. длинная последовательность белка. Кроме того, в структурах не представлены аминокислоты 98–109.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005554.g003

    Большинство эпитопов, преимущественно связанных постинфекционной сывороткой, картированной с F-1, F2.1 и С-концом белка ( антигенный сайт F-6). Антигенные сайты F-1 (часть сайта ϕ), F-3 (содержащие сайты ϕ и II) и F-3.2 (сайт II) распознавались как до, так и после инфицирования сыворотками (рис. 2C: синий против красных столбцов. ). Эти данные свидетельствуют о том, что первичная инфекция RSV на фоне ранее существовавших материнских антител не вызывала очень сильного ответа анти-F антител.Но был идентифицирован некоторый сдвиг в преобладающем эпитопе, распознаваемом после первичной инфекции RSV, с усилением связывания с N- и C-концами белка F, который включает сайт ϕ, сайт IV и проксимальный домен мембраны.

    В отличие от умеренного изменения титров анти-F-антител и репертуара эпитопов, анализ анти-G-антител с использованием G-GFPDL выявил 100-кратное увеличение количества связанных фагов сыворотками после инфицирования RSV по сравнению с доинфекционные сыворотки (рис. 4A и 4C).Связанные фаги отображали эпитопы, которые охватывали большую часть эктодомена RSV-G с двумя большими, возможно, конформационными областями, фланкирующими мотив CCD (фиг. 4A). Пять основных антигенных сайтов (здесь называемых от G-1 до G-5), содержащие девять эпитопных областей, включая некоторые новые эпитопы, идентифицированные посредством пэннинга библиотеки RSV-G GFPD, показаны на фиг. 4B. В сыворотках после инфицирования RSV было отобрано большее количество связанных фагов со вставками, покрывающими все идентифицированные антигенные сайты G (фиг. 4C). Однако большая часть фагов, обогащенных антителами после инфицирования RSV, предпочтительно связывает CCD RSV-G (антигенный сайт G-4) и N-концевую последовательность с CCD (антигенный сайт G-3) по сравнению с сыворотками до инфицирования. (Рис. 4D красный vs.синие полосы).

    Рис. 4. Выяснение профиля эпитопа антител против белка G RSV после первичной инфекции RSV у детей.

    (A) Распределение фаговых клонов после селекции по аффинности RSV-G GFPDL с сыворотками, полученными от детей в возрасте 9 месяцев (вверху) или 15–18 месяцев (внизу). Обозначение аминокислот основано на последовательности белка RSV-G. Расположение столбцов указывает на идентифицированные вставки клонов фага после аффинного отбора, картированного на белке RSV-G. Толщина каждого столбца представляет собой частоту многократно изолированных фаговых вставок (показаны только клоны с частотой два или более).(B) Антигенные сайты в белке G RSV, идентифицированные после первичной инфекции RSV с использованием анализа GFPDL, изображены под белком G и имеют цветовую кодировку. Мотив CCD показан в верхней части схемы белка F. (C) Количество клонов, которые кодировали каждый антигенный сайт до и после инфицирования RSV. (D) Частота и распределение антигенных областей представлены как процент от общего числа отобранных по аффинности фаговых клонов. Количество клонов, кодирующих каждый антигенный сайт, делили на общее количество фаговых клонов и представляли в процентах до и после инфицирования RSV.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005554.g004

    В совокупности эти результаты демонстрируют, что первичная инфекция RSV вызывает сильное повышение уровня анти-G антител. Интересно, что высококонсервативная область CCD не была основной мишенью остаточных материнских антител, но стала преобладающей мишенью сывороточных антител после инфицирования RSV.

    Кинетика связывания антител с ключевыми антигенными сайтами в белках F и G RSV с сывороткой крови детей, подростков и взрослых

    Отобранные пептиды белков RSV-F и G, представляющие ключевые антигенные сайты, идентифицированные с помощью F-GFPDL (рис. 2) и G-GFPDL (рис. 4), были химически синтезированы и протестированы на связывание антител с отдельными образцами сыворотки, как измерено с помощью резонансных единиц ( RU) в эксперименте по кинетике SPR-антител в реальном времени.В SPR в связывании участвуют как антитела IgG, так и IgA. Однако смещения в сторону связывания димерного IgA по сравнению с IgG можно избежать, обеспечив оптимальную пространственную плотность белков на чипах для однократного моновалентного взаимодействия для каждой молекулы антитела независимо от изотипа.

    Были оценены отдельные образцы сыворотки крови детей [младше 2 лет (N = 30)], подростков [10–14 лет (N = 12)] и взрослых [30–45 лет (N = 12)] ( Рис.5 и Таблица S2). Все сыворотки очень маленьких детей (<2 лет) (100%) реагировали с новым антигенным сайтом F-2.1 (а.о. 101–121), который отображается на p27 и однозначно обнаруживается только в нерасщепленном белке F0 (среднее значение RU = 130), а 58% сывороток реагируют с пептидом антигенного сайта F-5 (а.о. 425–450) (среднее значение RU = 25). Реактивность ко всем другим пептидам F находилась в диапазоне от 0% до 35% с низкими средними значениями RU (фиг. 5A и таблица S2). Все образцы в этой возрастной группе также были протестированы в PRNT, чтобы различить те, которые с наибольшей вероятностью были постинфекционными (положительные титры), и неинфицированными детьми (без нейтрализующих антител) (S3A и S3B, рис.).Профиль связывания пептида был сходным между двумя группами. Однако связывание с p27-содержащим пептидом (F 101–121) и пептидом F 425–450 было выше с сыворотками инфицированных младенцев с антителами, нейтрализующими RSV.

    Рис. 5. Анализ поверхностного плазмонного резонанса (SPR) сыворотки человека из разных возрастных групп на связывание с пептидами из разных антигенных сайтов в RSV-F и RSV-G.

    Выбранные пептиды белков RSV-F и G, представляющие антигенные сайты на фиг. 2 и 4, были химически синтезированы и протестированы на связывание с отдельными образцами сыворотки с использованием эксперимента по кинетике SPR в реальном времени.Общее связывание антител представлено в виде резонансных единиц SPR (RU). Панели A-C показывают полное связывание антител с пептидами F, а панели D-F показывают полное связывание антител с пептидами G с образцами сыворотки / плазмы от детей младше 2 лет (A и D), подростков; 10–14 лет (B и E) и взрослые 30–45 лет (C и F). Пептиды на оси X помечены субъединицей RSV-A2-F, за которой следует аминокислотная последовательность (A-C), и для белка RSV-A2-G, за которой следует аминокислотная последовательность (D-F). Статистически значимые различия реактивности антител между разными возрастными группами отображены значениями p .

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005554.g005

    Сыворотки подростков продемонстрировали расширенный профиль связывания с большим количеством пептидов, полученных из F. Все образцы (100%) связывались с антигенным сайтом F-2.1 p27 (а.о. 101–121) (среднее значение RU = 105), а также с пептидом F1.2 (а.о. 23–74), который включает часть сайта ϕ (среднее значение RU = 42) и к С-концевому пептиду F-5 (аминокислотные остатки 425–450), который охватывает ранее определенный антигенный сайт IV (среднее RU = 45). Кроме того, 67% сывороток прореагировали с пептидом F-3.1 (а.о. 176–240), который содержит большую часть сайта ϕ, сайта, который также распознается с помощью MAb D25, специфичного к сайту предварительного слияния ϕ (рис. 1).Связывание с другими пептидами F варьировалось в диапазоне от 0% до 25% положительных образцов (фиг. 5B и таблица S2).

    Сыворотки взрослых показали дальнейшее расширение репертуара связывания антител против пептидов F (фиг. 5C). Опять же, 100% образцов прореагировали с сайтом p27 F-2.1 (а.о. 101–121), но с более низкими уровнями антител (средний RU = 45) по сравнению с более молодыми возрастными группами. Большинство сывороток связывается с несколькими антигенными сайтами С-конца; F-4.1 (а.о. 310–368) и F-6.1 (а.о. 471–493) (среднее значение RU = 35 и 15 соответственно).Связывание с пептидом антигенного сайта F-5 (содержащим ранее описанный сайт IV) было измерено в 67% образцов, а связывание пептидов, которые включают сайт ϕ (а.о. 23–74 и а.о. 176–240), было замечено в 92% и 33 случаях. % взрослых образцов соответственно. Также наблюдалось увеличение связывания антител с пептидом F-3.2 (а.о. 234–287), который содержит антигенный сайт II (последовательность связывания паливизумаба), среди сывороток взрослых. Реактивность антител к пептиду F-2.1 p27 была значительно ниже у взрослых по сравнению с детьми и подростками (рис. 5C).

    Как показано на фиг. 4, анализ сывороток после инфицирования с использованием GFPDL, содержащего последовательности гена RSV-G, в первую очередь идентифицировал большие области, фланкирующие мотив CCD. Однако пептиды были синтезированы только для антигенных сайтов с максимальной длиной 50 аминокислот. Как показано на фиг. 5D и 5F, связывание с пептидами, производными от G, было более ограничено во всех возрастных группах при использовании анализа SPR по сравнению с анализом GFPDL. Все сыворотки детей младше 2 лет с подтвержденной инфекцией RSV (титры PRNT> 40) показали сильную реактивность с пептидом G в антигенном сайте G-4, который включает мотив CCD (аминокислотные остатки 169–207) (среднее значение RU = 334) ( Рис. 5D и Таблица S2).Младенцы младше 2 лет без признаков инфекции RSV (отсутствие антител, нейтрализующих RSV) показали положительную, но более низкую реактивность к пептиду G 169–207 по сравнению с сыворотками от серопозитивных детей (S3D и S3C, рис. Соответственно).

    RSV-G-специфических антител в сыворотке подростков снова были сфокусированы в области CCD и вокруг нее, причем 100% образцов реагировали с пептидом G-4 (а.о. 169–207) (среднее значение RU = 394), а также с предшествующим N-концом. пептид антигенного сайта G-3.1 (аминокислотные остатки 148–178) (среднее значение RU = 52) (рис. 5E и таблица S2).Интересно, что в то время как взрослые сыворотки реагировали с теми же пептидами антигенного сайта, что и более молодые группы (а.о. 169–207 и а.о. 148–178), общее связывание с иммунодоминантным сайтом G-4 было значительно ниже (среднее значение RU = 154) по сравнению с любым из них. Дети младше 2 лет ( p = 0 , 0009 ) или подростковая группа ( p = 0 , 0001 ) (рис. 5F и таблица S2). Вместе эти анализы SPR продемонстрировали расширение репертуара анти-F-антител и сокращение ответа анти-G-антител у взрослых по сравнению с маленькими детьми и подростками.

    SPR-анализ связывания сыворотки с формой F-белка до слияния по сравнению с формой после слияния, а также с негликозилированными по сравнению с гликозилированными G-белками

    Ряд пептидов антигенного сайта, основанный на анализе GFPDL, был протестирован с использованием SPR. Однако не все крупные конформационные антигенные сайты, идентифицированные с помощью пэннинга GFPDL, могут быть индивидуально синтезированы и проанализированы. Поэтому мы также измерили связывание отдельных образцов сыворотки из одних и тех же трех возрастных групп с различными формами правильно свернутых белков RSV-F и G.Белок F до слияния (DS-Cav1) [27, 33] и белки F после слияния экспрессировались в клетках млекопитающих. Белок G экспрессировался либо в клетках млекопитающих (гликозилированный), либо в бактериальной системе (негликозилированный), как описано ранее [30]. В предварительном исследовании мы подтвердили, что эти белки правильно уложены и могут распознаваться анти-F и анти-G специфическими МА. Как показано на фиг. S4, MAb 131-2G в равной степени связывается как с гликозилированными, так и с негликозилированными G-белками, но не с любым из F-белков (панель A).Специфичные перед слиянием MAb D25 (сайт ϕ) связывались только с F до слияния, но не с формой F после слияния или с белками G (S4B фиг.), В то время как MAb Palivizumab (сайт II) связывалось как с пре-слиянием, так и с пост-слияния с белками F, но не с белками RSV-G (фиг. S4C). Специфичность связывания MAb была важна для демонстрации того, что все четыре рекомбинантных белка отображают нативные эпитопы. Кроме того, очищенные G-белки образовывали тетрамеры [30].

    Недавно было высказано предположение, что сайт ϕ, который экспрессируется только в форме белка F до слияния [27, 33, 34], является доминирующей мишенью для нейтрализующих антител в сыворотке крови человека после инфицирования, а белок F до слияния вероятно, представляет собой нативный слитый белок, связанный с вирионом, который отвечает за передачу инфекции RSV [35].Поэтому мы сравнили связывание отдельных образцов сыворотки в трех возрастных группах с рекомбинантным F-белком до слияния и после слияния в кинетическом анализе в реальном времени на основе SPR (рис. 6A и 6B). Для большинства образцов связывание сывороточных антител с белком F до слияния было значительно выше, чем с белком F после слияния (синие кружки по сравнению с зелеными) во всех возрастных группах ( p = 0 . 0001 для детей и детей). подросток и p = 0 . 0019 для взрослых) (рис. 6А).Отношение связывания антитела F до слияния к связыванию после слияния (Max RU) составляло в среднем 3,0 для <2 лет, 2,4 для подростковой группы и 3,4 для взрослой группы (рис. 6В). Кроме того, мы обнаружили значительное увеличение уровней связывания антител с F до слияния во взрослой группе (30–45 лет) по сравнению с маленькими детьми (<2 лет) и подростками, что согласуется с расширением репертуара антител, наблюдаемым в анализ SPR пептидов антигенного сайта (рис. 5A – 5C).

    Рис. 6. Анализ реактивности очищенных белков RSV-F и RSV-G на основе SPR с сыворотками человека разных возрастных групп.

    (A) Образцы сыворотки, взятые у детей (<2 лет), подростков (10–14 лет) и взрослых (30–45 лет), были проанализированы на полное связывание с очищенным RSV-F перед слиянием (синий) или белок RSV-F (зеленый) после слияния с помощью SPR. Предварительно слитый RSV F (DS-Cav1) продуцировался в клетках 293F и кодирует аминокислоты 26–513Δ110–136. Пост-слитный белок RSV-F был получен от Sino Biologicals и кодирует аминокислоты 22–529Δ110–136. (B) Соотношение связывания сыворотки с белком F перед слиянием RSV и белком F после слияния в разных возрастных группах по SPR.(C) Связывание с негликозилированным RSV-G (синий) по сравнению с гликозилированным RSV-G (зеленый). Эктодомены RSV-A2-G (67–298) продуцировались в клетках 293F бактерий или млекопитающих. Общее связывание антител представлено в единицах резонанса SPR. Реактивность индивидуального образца к различным белкам F (A) или к белкам RSV-G (C) показана соединенными линиями. Статистически значимые различия реактивности антител между разными возрастными группами или внутри группы представлены значениями p .

    https: // doi.org / 10.1371 / journal.ppat.1005554.g006

    Мы также оценили связывание отдельных образцов сыворотки с белком RSV-G. Нативный G-белок сильно гликозилирован по N- и O-связям. Библиотеки нитевидного фагового дисплея производятся в бактериальной системе, и некоторые из экспрессируемых фагом сегментов могут быть замаскированы гликанами в нативных G-белках. Поэтому мы сравнили связывание антител с индивидуальной сывороткой с правильно уложенным рекомбинантным негликозилированным G (продуцируемым в бактериальной системе) со связыванием с полностью гликозилированным G-белком, продуцируемым в системе млекопитающих [36] (рис. 6C).Во всех возрастных группах связывание с негликозилированным G было выше, чем с гликозилированным аналогом. Что наиболее важно, самые высокие уровни связывания анти-G-антител наблюдались у детей младше 2 лет. Связывание анти-G-антитела значительно снизилось в группах подростков и взрослых, подобно снижению реактивности сывороточных антител против отдельных пептидов антигенного сайта G на рис. 5. Ранее было показано, что негликозилированный G генерирует защитный иммунитет против гомологичных и гетерологичных штаммов RSV в BALB. / c мышей.Важно отметить, что антитела, вызванные негликозилированным G, хорошо связываются с гликозилированным G [30]. Следовательно, измерения связывания анти-G-антител с использованием обеих форм G-белка позволили нам захватить полный набор функциональных антител, которые были вызваны естественными инфекциями RSV.

    В совокупности, наше исследование продемонстрировало независимую эволюцию паттернов связывания антител с белками F и G RSV после первичной / ранней вирусной инфекции у очень молодых (<2 лет), а также у подростков и взрослых возрастных групп.

    Обсуждение

    Разработка эффективной вакцины против RSV имеет первостепенное значение. В основные целевые группы населения входят младенцы в возрасте до 6 месяцев и дети до 2 лет, которые с наибольшей вероятностью страдают тяжелым заболеванием RSV и его осложнениями [5]. Кроме того, вакцинация матери для индукции достаточно высоких титров защитных антител, которые могут проникать через плаценту, может быть безопасной и эффективной стратегией для отсрочки инфицирования новорожденных и уменьшения осложнений от первичной инфекции RSV [20].Кроме того, поликлональные и моноклональные антитела, нацеленные на защитные эпитопы в белках F и G, находятся в стадии клинической разработки [27, 34, 37, 38] [39, 40]. Следовательно, важно получить глубокое понимание уже существующих антител у младенцев и их иммунных ответов после первичной инфекции RSV, чтобы определить ответы антител, которые могут лучше всего коррелировать с защитой и способствовать разработке эффективных контрмер против болезни RSV. .

    С этой целью мы использовали библиотеки полногеномного фагового дисплея (GFPDL), чтобы раскрыть репертуар поликлональных сывороточных антител младенцев без признаков инфекции RSV, а также проследить развитие профилей антител после первичного или раннего Воздействие RSV.F- и G-GFPDL обеспечивают беспристрастный комплексный подход к идентификации спектра как линейных, так и конформационных эпитопов на поверхности белков мембраны RSV, которые распознаются антителами, вызванными первичной инфекцией RSV. Первоначально мы протестировали панель из 16 MAb против RSV F и G, которая распознала как линейные, так и конформационные эпитопы, и картировала эпитопы всех этих MAb с использованием наших GFPDL (данные для репрезентативных MAb показаны на фиг.1).

    Как и ожидалось, прединфекционные сыворотки маленьких детей (≤ 9 месяцев) содержали антитела IgG как к F, так и к G, которые, как сообщалось ранее, представляли собой остаточные материнские антитела [14, 15, 32].После инфицирования RSV у этих детей развились титры нейтрализующих антител и были ответы IgA против RSV, свидетельствующие о вновь приобретенном иммунитете. Интересно, что селекция по аффинности с F-GFPDL с использованием объединенных сывороток младенцев до и после инфицирования привела к аналогичному количеству захваченных фагов. Однако мы обнаружили некоторые изменения в профилях эпитопов с увеличением частоты картирования вставок в N-концевую область, включая часть сайта ϕ (экспрессируется на предварительном слиянии F), на p27 (обнаруживается только в необработанном F0) и в С-конец F связан с сывороткой детей после первичной / ранней инфекции после RSV.Связывание с сайтом F-3.2 (нацеленным на паливизумаб) наблюдали с поликлональными антителами как до, так и после инфицирования RSV.

    В отличие от умеренного увеличения количества клонов F-связывающих фагов, пэннинг с помощью G-GFPDL с постинфекционными сыворотками привел к 100-кратному увеличению общего количества связанных фагов по всем G-областям. Наиболее выраженное увеличение было замечено в частоте картирования клонов в консервативную область CCD, содержащую антигенный сайт G-4 (а.о. 169–207), и в область, непосредственно аминоконцевую по отношению к CCD, определяемую антигенным сайтом G-3.Мы предполагаем, что материнские антитела IgG, которые проходят через плаценту, могут сохраняться у новорожденного до 9 месяцев и могут влиять на первичный иммунный ответ на первую инфекцию (или вакцинацию). Если материнские антитела более склонны к реактивности к белку F по сравнению с белком G на вирионах, во время первичных инфекций может возникнуть более сильный наивный ответ против G.

    На основе результатов GFPDL мы синтезировали большой набор пептидов, представляющих большинство ключевых антигенных сайтов в F и G, которые были распознаны объединенными сыворотками после инфицирования.Эти пептиды использовались в SPR в реальном времени для измерения связывания панелей сыворотки детей младшего возраста (<2 лет), подростков (10–14 лет) и молодых людей (30–45 лет). Самое сильное связывание в самой молодой группе было с пептидом p27 (aa 101–121) в F-2.1, при значительно более низкой реактивности против других пептидов F, включая сайты F-3.2 (сайт II) и F-5 (сайт IV). Паттерны связывания эпитопа в F-антигенных сайтах были более широкими для образцов подростков и взрослых, что свидетельствует о расширении репертуара B-клеток, которое могло быть результатом повторного воздействия RSV.О сильном связывании с новым эпитопом р27 F-2.1 ранее не сообщалось, хотя Burton и др. сообщили о сильном ответе антител на нерасщепленный белок RSV-F в сыворотках после инфицирования [41]. Поскольку p27 вырезается во время процессинга F0 в F1 / F2, он не является частью зрелого белка F на вирионах. Следовательно, сильный ответ против p27, скорее всего, был результатом воздействия на иммунную систему незрелых вирионов и / или умирающих инфицированных вирусом клеток в ходе продуктивной инфекции.Этот наблюдаемый высокий ответ антител против p27 предполагает высокую скорость мутаций, опосредованную иммунным давлением, наблюдаемую в последовательности p27 циркулирующих штаммов RSV [42]. В очень молодом возрасте реактивность против p27 может быть биомаркером недавней инфекции RSV и может быть использована для разработки серодиагностического анализа RSV. Используя анализ GFPDL, мы также идентифицировали два новых эпитопа в антигенных сайтах 2 и 3, которые специфичны для белка F до слияния по сравнению с белком F после слияния и ранее не были идентифицированы.

    Одно из возможных ограничений оценок на основе GFPDL заключается в том, что, хотя фаговый дисплей может обнаруживать как конформационные, так и линейные эпитопы на RSV-F и G, они вряд ли обнаружат паратопические взаимодействия, требующие посттрансляционных модификаций и редких четвертичных эпитопов. которые скрещивают протомеры (например, созданные тримером F или тетрамером G, экспрессируемыми на поверхности вируса). Однако в предварительном исследовании с поликлональными антителами вакцинированных кроликов 86–89% антител против F и G было удалено путем адсорбции соответствующими GPDL, что подтверждает использование F-GFPDL и G-GFPDL для анализа человеческого тела. сыворотка.Более того, связывание с правильно свернутыми белками F и G в SPR на основе кинетики в реальном времени может преодолеть эти ограничения и обеспечить дополнительную информацию о постинфекционном ответе поликлональных антител против RSV.

    Было показано, что коммерческий RSV IgG RespiGam (Medimmune), полученный из сывороток людей с высокими титрами, нейтрализующими RSV, включает антитела, нацеленные на предварительное слияние F, и эти антитела содержат большую часть нейтрализующей активности против RSV in vitro [43].Мы обнаружили, что антитела против как до, так и после слияния F были выше у взрослых по сравнению с более молодыми возрастными группами. Важно отметить, что независимо от возрастной группы связывание отдельных образцов сыворотки с белком F до слияния было в 2–3 раза выше, чем с белком F после слияния. Эти данные подтвердили, что инфекции RSV вызывают более сильные ответы против белка F до слияния с постепенным увеличением уровней анти-F антител с возрастом и общим расширением репертуара антител, вероятно, вызванным повторным воздействием RSV.

    В отличие от расширяющегося ответа анти-F с возрастом, связывание анти-G антител во всех возрастных группах было в первую очередь сосредоточено на антигенных сайтах G-4, охватывающих мотив CCD (аминокислотные остатки 169–207), и на предшествующие / перекрывающиеся участки. антигенный сайт G-3 (аминокислотные остатки 148–178) в анализе SPR. Однако есть несколько предостережений в отношении этого вывода. Анализ GFPDL выявил несколько крупных иммунодоминантных антигенных сайтов, фланкирующих мотив CCD (сайты G-2 и G-5 на фиг. 4), которые невозможно синтезировать химически или индивидуально экспрессировать.Следовательно, большая часть анти-G-связывающей активности, наблюдаемой с использованием G-GFPDL, была потеряна, когда более короткие синтетические линейные пептиды использовались в анализе связывания SPR (Фиг.4 против 5). Ранее проведенное исследование также обнаружило сильно ограниченное связывание с короткими пептидами (15-мерными), охватывающими С-конец G-белка [17].

    Другое наблюдение, сделанное в текущем исследовании, заключалось в значительном снижении уровней связывания антител с антигенным сайтом G-4 (содержащим CCD) у взрослых по сравнению с маленькими детьми и подростками (рис. 5).Чтобы подтвердить это открытие, мы также измерили связывание с интактными G белками, которые были либо негликозилированными (экспрессировались в бактериальной системе), либо полностью гликозилированы (экспрессировались с использованием клеток млекопитающих) [30]. Связывание с негликозилированным G было выше, чем с гликозилированным G, что согласуется с предыдущим исследованием [19]. Важно отметить, что мы обнаружили значительное снижение антител, связывающих анти-G-белок, в образцах взрослых по сравнению с более молодыми группами, аналогично наблюдению с пептидом G-4 (169–207). Более низкие уровни антител против G во взрослой группе нельзя просто объяснить воздействием RSV с вариантами G, поскольку домен CCD является высококонсервативным среди всех штаммов RSV.Это также наименее гликозилированная область G-белка.

    Долгосрочное поддержание гуморального иммунитета обеспечивается комбинацией плазматических клеток с долгоживущими антителами (LLPC) и В-клеток памяти (MBC) [44–46] [47, 48]. [48] ​​[16]). Falsey и др. . описали распад сывороточных антител против RSV у взрослых после естественных инфекций RSV [24]. Однако их исследование не сравнивало распад антител против белков F и G. В нашем исследовании мы выявили значительно более низкие уровни связывания анти-G у взрослых, включая антитела, нацеленные на консервативный домен CCD, что свидетельствует о дифференциальном распаде LLPC или MBC против G по сравнению с LLPC / MBC против F после инфекций RSV.Это открытие ранее не описывалось и должно быть принято во внимание при разработке вакцин для пожилых людей. [30, 49, 50]

    Эволюция RSV продемонстрировала преимущественную диверсификацию гена G со скоростью 5% мутаций по сравнению с другими генами в вирусном геноме RSV (рис. 7). Исследования молекулярной эволюции гена RSV-G в циркулирующих вирусных штаммах показали накопление мутаций с несинонимичными изменениями, главным образом, в областях N-конца и C-конца, фланкирующих мотив CCD, но не в центральной консервативной области, которая функционально необходима для прикрепление вируса к клетке (рис. 7) [9, 10, 51, 52].Ранее предполагалось, что иммунная система способствует прогрессивному накоплению аминокислотных изменений в N- и C-концах эктодомена G-белка, но постулировались и неиммунные механизмы [9, 51–53]. Наши результаты с G-GFPDL после ранней инфекции RSV продемонстрировали значительное связывание антител с антигенными областями G (G-1, G-2 и G-5), претерпевающими диверсификацию (рис. 4). Эти данные предоставляют доказательства в поддержку теории о том, что иммунное давление играет важную роль в отборе несинонимичных изменений в гене G, которые, по-видимому, не ставят под угрозу его функцию в качестве ключевого белка прикрепления.

    Рис. 7. Вклад ответа анти-G антител после первичной инфекции RSV в эволюцию вирусов RSV.

    Накопление аминокислотных вариаций в последовательности белка RSV в человеческих изолятах, собранных в 1979–2013 гг. Последовательности белков из человеческих изолятов RSV подтипа A были получены через Virus Pathogen Resource (ViPR, http://www.viprbrc.org). В анализ были включены 297 изолятов с полными последовательностями генома и однозначными аминокислотами. Последовательности были выровнены с использованием MUSCLE, и на основе выравнивания была создана консенсусная последовательность.Затем полиморфизмы из этого консенсуса оценивались путем вычисления энтропии (Hx) с помощью Bioedit. Показатели энтропии представлены на оси Y, а белки RSV — на оси X. Выравнивание антигенных сайтов в RSV-G, идентифицированных с использованием подхода GFPDL, с оценками вариабельности последовательности в белке RSV-G показано в нижней половине.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005554.g007

    В совокупности наше исследование предполагает несвязанную эволюцию ответов антител на белки F и G у людей.Значительное снижение уровня анти-G антител у взрослых может быть фактором устойчивой восприимчивости к инфекциям RSV на протяжении всей жизни. Ожидается, что разрабатываемые живые аттенуированные вакцины против RSV будут вырабатывать сбалансированные анти-F и анти-G антитела [49]. С другой стороны, несколько разрабатываемых вакцин на основе субъединиц / частиц содержат только белок F [54, 55]. Результаты наших исследований предполагают необходимость включения G-белков в будущие вакцины против RSV, чтобы усилить анти-G-ответы.Ранее мы продемонстрировали, что негликозилированный G-белок, продуцируемый бактериальной системой, вызывал более сильный защитный иммунитет против гомологичного (RSV A2) и гетерологичного (RSV B) заражения по сравнению с гликозилированным G-белком, продуцируемым в клетках млекопитающих [30]. G-белки из циркулирующих в настоящее время штаммов могут усилить защитный иммунный ответ против будущих штаммов RSV.

    Методы

    Сыворотки и моноклональные антитела

    Моноклональное антитело (MAb) Паливизумаб (анти-RSV-F) было приобретено в аптеке NIH, MAb D25 (анти-RSV-F) было подарком от Питера Квонга (VRC, NIH) и MAb 131-2G (Anti RSV-G). ) был куплен в Millipore.Образцы сыворотки крови человека были ранее получены от субъектов в возрасте 30–45 лет (взрослые) (N = 12), от 10 до 14 лет (подростки) (N = 12) и от 6 до 18 месяцев (дети) (N = 30). после информированного согласия родителей. Образцы анонимны, и разрешение на тестирование этих обезличенных образцов на наличие нейтрализующих антител RSV было получено от Комитета по исследованиям с участием людей (FDA-RIHSC) Управления по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA-RIHSC) в соответствии с протоколом исключения № 12-079B.

    Анализ LIPS для выявления специфических антител IgG к RSV-N

    Было получено

    лизатов клеток COS-1, содержащих меченный Ruc белок RSV-N (Ruc-N) или только Ruc (без вставки), и анализ LIPS был выполнен, как описано ранее [31].Положительный ответ (RLU 8000 или выше) определяли как 5 стандартных отклонений выше среднего значения, полученного с контрольными сыворотками, протестированными против антигена Ruc-N. Антисыворотки тестировали по крайней мере в двух независимых анализах и параллельно против антигена Ruc без вставки, чтобы подтвердить, что реактивность была специфичной для антигена RSV-N.

    Тест нейтрализации уменьшения зубного налета RSV (RSV-PRNT)

    RSV-PRNT выполняли, как описано ранее [36, 56]. Вкратце, серийные 4-кратные разведения инактивированной нагреванием сыворотки смешивали с вирусом (разбавленным для получения 20-50 бляшек на лунку), содержащим 10% комплемента морской свинки (Rockland Immunochemicals; Филадельфия, Пенсильвания), и инкубировали в течение 1 часа при 37 ° C. .Смеси антитело-вирус инокулировали в двух экземплярах на монослои клеток HEp-2. Конечные титры 50% в анализе PRNT были определены с использованием метода Спирмана-Кербера [56].

    Вакцинация кроликов

    Новозеландских кроликов-самок вакцинировали трижды (с интервалом 28 дней) рекомбинантными белками F (предварительное слияние) или G (негликозилированный) [30] из штамма RSV A2 (50 мкг / доза) с адъювантом Emulsigen. Сыворотки после третьей вакцинации использовали для анализа GFPDL, а также для адсорбции F-GFPDL и G-GFPDL.Сыворотки до и после адсорбции оценивали с помощью SPR на связывание с белками F и G.

    Создание библиотек фаговых дисплеев, фрагментированных целым геномом RSV (GFPDL)

    кДНК, соответствующих сегментам генов RSV-F и RSV-G штамма подтипа А2, были химически синтезированы и использованы для клонирования. fSK-9-3 представляет собой фаговый вектор на основе дисплея gIIIp, где желаемый полипептид может быть экспрессирован как слитый белок gIIIp.

    Библиотеки фаговых дисплеев

    были сконструированы индивидуально для генов RSV-F и RSV-G.Очищенную ДНК, содержащую RSV-F и RSV-G, расщепляли ДНКазой и использовали для конструирования GFPDL. Поскольку фаговые библиотеки были сконструированы из целых генов поверхностных гликопротеинов RSV-F и G, они потенциально отображают все возможные сегменты вирусного белка размером от 15 до 250 аминокислот в виде слитого белка на поверхности бактериофага.

    Отбор по аффинности фагов F- и G-GFPDL RSV с поликлональными детскими сыворотками до и после воздействия RSV

    Перед пэннингом GFPDL поликлональными сывороточными антителами компоненты сыворотки, которые могли неспецифически взаимодействовать с фаговыми белками, удаляли инкубацией с УФ-убитыми чашками Петри, покрытыми фагом M13K07.

    Для пэннинга RSV-F и RSV-G GFPDL с использованием сыворотки человека до инфицирования RSV объединяли равные объемы сыворотки от детей в возрасте 9 месяцев с титрами PRNT <40 и со значениями LIPS-N <8000 RLU. Для анализа GFPDL после воздействия RSV были объединены равные объемы сывороток человека от детей в возрасте 15/18 месяцев с титрами PRNT ≥ 40 и значениями LIPS-N> 8000 RLU. Последующий отбор по аффинности GFPDL проводили в растворе (с белком A / G), как описано ранее [26]. ДНК 768 фаговых клонов секвенировали для каждой сыворотки с индивидуальным GFPDL.

    Белки RSV-F

    Плазмида RSV F (DS-Cav1) перед слиянием, кодирующая аминокислотные остатки 26–513Δ110–136 штамма RSV-A2, была любезным подарком от Питера Квонга (VRC, NIH). Белок DS-Cav1 продуцировался в клетках 293F [27] Пост-слияние белок RSV-F кодирует аминокислотные остатки 22–529Δ110–136 штамма RSV-A2, слитого с полигистидиновой меткой, продуцируемой в клетках насекомых с уровнями эндотоксина <1 EU / мкг белка и был получен от Sino Biologicals.

    Получение рекомбинантного гликозилированного G-белка с использованием клеток 293 Flp-In

    Кодон гена

    RSV-G, оптимизированный для клеток млекопитающих, был синтезирован химическим путем.Сайты Not, I и Pac, I использовали для клонирования последовательности, кодирующей эктодомен G RSV A2 (67–298) в векторе pSecR для экспрессии млекопитающим с целью экспрессии G-белка в клетках 293Flp-In. Клетки 293-Flp-In и pOG44 (плазмида, экспрессирующая рекомбиназу Flp-In) были получены от Invitrogen (Карлсбад, Калифорния). Клеточная линия 293-Flp-In, стабильно экспрессирующая белок A2 G RSV с секреторным сигнальным пептидом из каппа-цепи IgG, была разработана, как описано ранее [57]. Вкратце, клетки 293-Flp-in котрансфицировали плазмидами, экспрессирующими рекомбиназу Flp-in и эктодомен RSV A2 G в среде DMEM (Invitrogen).Через двадцать четыре часа после трансфекции культуральную среду заменяли свежей DMEM, содержащей 150 мкг / мл гигромицина, для отбора стабильно трансфицированных клеток. Для экспрессии белка клетки поддерживали в среде для экспрессии 293 (Invitrogen), а супернатант культуры собирали каждые 3-4 дня. Супернатант очищали центрифугированием и фильтровали через фильтр 0,45 мкм перед очисткой на колонке His-Trap FF (GE healthcare).

    Получение рекомбинантного негликозилированного G-белка из

    E . кишечная палочка

    Рекомбинантный внеклеточный домен G 67–298 RSV экспрессировался в E . coli, BL21 (DE3) клеток (REG) и очищали в условиях контролируемого окислительно-восстановительного рефолдинга [30]. Уровни эндотоксина в очищенном протеине были <1 EU / мкг протеина. Оба белка были описаны ранее [30].

    Поверхностный плазмонный резонанс (SPR)

    Установившееся равновесное связывание поликлональных антител в сыворотке крови человека контролировали при 25 ° C с использованием биосенсора поверхностного плазмонного резонанса ProteOn (BioRad).Очищенные рекомбинантные белки F или G были присоединены к сенсорному чипу GLC посредством аминового связывания с 200 резонансными единицами (RU) в каналах тестового потока, и пространственная плотность белков была оптимизирована таким образом, что существует единственное моновалентное взаимодействие для каждой молекулы антитела независимо от их изотип. Для анализа пептидов в SPR химически синтезированные биотинилированные пептиды RSV-F или RSV-G были захвачены на чипах NLC. Образцы 300 мкл свежеприготовленной сыворотки при 10-кратном разведении или МАт (начиная с 1 мкг / мл) вводили со скоростью потока 50 мкл / мин (продолжительность контакта 120 с) для ассоциации, а диссоциацию проводили в течение 600 мкг / мл. второй интервал.Отклики от поверхности белка корректировали на отклик от имитационной поверхности и на отклики от инъекции только буфера. Общее связывание антител и результаты анализа данных рассчитывали с помощью программного обеспечения BioRad ProteOn manager (версия 2.0.1).

    Статистический анализ

    Статистическую значимость групповых различий определяли с использованием однофакторного дисперсионного анализа и теста множественных сравнений Бонферрони. Корреляции рассчитывались с помощью двустороннего критерия Спирмена.Значения p менее 0,05 считались значимыми с доверительным интервалом 95%.

    Заявление об этике

    Исследование CBER, FDA было проведено с деидентифицированными образцами в рамках исключения 12-079B для исследований с участием людей (RIHSC); и все проведенные анализы соответствовали допустимым обычаям в первоначальном согласии.

    Дополнительная информация

    S1 Рис. Анализ GFPDL сывороток кроликов до и после вакцинации.

    Новозеландских кроликов вакцинировали трижды (с интервалом 28 дней) рекомбинантными белками F (предварительное слияние) или G (негликозилированный) [30] из штамма RSV A2 (50 мкг / доза) с адъювантом Emulsigen.Предварительная вакцинация и иммунная сыворотка после третьей вакцинации использовались для анализа GFPDL (A) общее количество фагов F-GFPDL, захваченных до вакцинации, по сравнению с сыворотками после вакцинации (B) Распределение фаговых клонов после селекции по аффинности RSV-F GFPDL с сыворотками получили до вакцинации и после третьей вакцинации рекомбинантным пост-гибридным F-белком. Обозначение аминокислот основано на последовательности белка RSV-F. Расположение столбцов указывает на гомологию отображаемой последовательности белка RSV-F на клонах фага после селекции по аффинности.Толщина каждой полоски представляет собой частоты повторяющихся выделений фаговых вставок (показаны только клоны с частотой два или более) (C) Распределение фаговых клонов после селекции по аффинности RSV-G GFPDL с сыворотками, полученными до и после третьей вакцинации с рекомбинантным G-белком

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005554.s003

    (TIF)

    S2 Рис. Изотип полного связывания антител с белками F и G RSV у младенцев после первичной инфекции RSV.

    Изотип сывороточных антител, связанных с предварительно слитой формой белка F RSV (DS-Cav1) в (A) или белком RSV-G (B), показан для сыворотки от детей, перенесших первичную инфекцию RSV, как измерено в эксперименте SPR. .

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005554.s004

    (TIF)

    S3 Рис. Анализ поверхностного плазмонного резонанса (SPR) сывороток человека от детей младшего возраста (

    <2 лет) с предшествующей инфекцией RSV (определяемой положительным анализом нейтрализации PRNT) vs.неинфицированные (без нейтрализующих титров) для связывания с пептидами из разных антигенных сайтов в RSV-F и RSV-G.

    Выбранные пептиды белков RSV-F и G, представляющие антигенные сайты (такие же, как на фиг. 5), были химически синтезированы и протестированы на связывание с отдельными образцами сыворотки с использованием эксперимента по кинетике SPR в реальном времени. Общее связывание антител представлено в виде резонансных единиц SPR (RU). Панели A-B показывают полное связывание антител с пептидами F, а панели C-D показывают полное связывание антител с пептидами G с предшествующей инфекцией RSV (определенное положительным анализом нейтрализации PRNT) на панелях A и C vs.неинфицированные (без нейтрализующих титров) в панелях B и D.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005554.s005

    (TIF)

    S4 Фиг. Специфическое связывание анти-F и анти-G МА с рекомбинантными белками F и G.

    MAb 131-2G (анти-G) (A), D25 (только форма до слияния анти-F) (B) и паливизумаб (анти-F сайт II реагирует с формами до слияния и после слияния) ( C) анализировали на общее связывание с очищенным RSV-F перед слиянием (красный), RSV-F после слияния (синий), негликозилированным RSV-G (черный) и гликозилированным RSV-G (зеленый) белками.Общее связывание антител представлено в единицах резонанса SPR.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005554.s006

    (TIF)

    Благодарности

    Мы благодарим Стивена Рубина и Кейта Педена за их содержательный обзор рукописи. Sangeeta Kumari и Susette Audet создали данные LIPS-N и PRNT для младенцев с ранними инфекциями RSV, которые ранее использовались для создания диагностического метода LIPS-N для недавних инфекций RSV [31].

    Вклад авторов

    Задумал и спроектировал эксперименты: SK.Проведены эксперименты: SF EMC SK. Проанализированы данные: SF EMC SK. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: JB. Написал статью: HG JB SK.

    Ссылки

    1. 1. Наир Х., Нокес Д.Д., Гесснер Б.Д., Дхерани М., Мадхи С.А., Синглтон Р.Дж. и др. Глобальное бремя острых респираторных инфекций нижних дыхательных путей, вызванных респираторно-синцитиальным вирусом у детей раннего возраста: систематический обзор и метаанализ. Ланцет. 2010. 375 (9725): 1545–55. pmid: 20399493; PubMed Central PMCID: PMC2864404.
    2. 2. Stockman LJ, Curns AT, Anderson LJ, Fischer-Langley G. Госпитализации младенцев и детей раннего возраста, связанные с респираторно-синцитиальным вирусом, в США, 1997–2006 гг. Pediatr Infect Dis J. 2012; 31 (1): 5–9. pmid: 21817948.
    3. 3. Lamprecht CL, Krause HE, Mufson MA. Роль материнских антител при пневмонии и бронхиолите, вызванном респираторно-синцитиальным вирусом. J Infect Dis. 1976; 134 (3): 211–7. pmid: 977992.
    4. 4. Глезен В.П., Табер Л.Х., Франк А.Л., Касел Дж.Риск первичного заражения и повторного заражения респираторно-синцитиальным вирусом. Am J Dis Child. 1986. 140 (6): 543–6. pmid: 3706232.
    5. 5. Ламберт Л., Сагфорс А.М., Опеншоу П.Дж., Калли Ф.Дж. Иммунитет к RSV в раннем возрасте. Фронт Иммунол. 2014; 5: 466. pmid: 25324843; PubMed Central PMCID: PMC4179512.
    6. 6. Хендерсон Ф.В., Кольер А.М., Клайд В.А. младший, Денни Ф.В. Респираторно-синцитиальные вирусные инфекции, повторные инфекции и иммунитет. Проспективное продольное исследование у детей младшего возраста.N Engl J Med. 1979; 300 (10): 530–4. pmid: 763253.
    7. 7. Джонсон К. М., Блум Х. Х., Муфсон М. А., Чанок Р. М.. Естественное повторное заражение взрослых респираторно-синцитиальным вирусом. Возможно отношение к легкому заболеванию верхних дыхательных путей. N Engl J Med. 1962; 267: 68–72. pmid: 14452065.
    8. 8. Муфсон М.А., Орвелл С., Рафнар Б., Норрби Е. Два разных подтипа респираторно-синцитиального вируса человека. J Gen Virol. 1985; 66 (Pt 10): 2111–24. pmid: 2413163.
    9. 9. Тростник PA, Pringle CR.Эволюция респираторно-синцитиального вируса подгруппы А: свидетельство прогрессирующего накопления аминокислотных изменений в прикрепляющем белке. J Virol. 1995. 69 (5): 2918–25. pmid: 7707517; PubMed Central PMCID: PMC188990.
    10. 10. Тан Л., Лемей П., Хаспи Л., Вивин М.С., Янсен Нью-Джерси, ван Лун А.М. и др. Генетическая изменчивость среди полных геномов респираторно-синцитиального вируса подгруппы А человека: мосты между молекулярной эволюционной динамикой и эпидемиологией. PLoS One. 2012; 7 (12): e51439. pmid: 23236501; PubMed Central PMCID: PMC3517519.
    11. 11. Collins PL, Melero JA. Прогресс в понимании респираторно-синцитиального вируса и борьбе с ним: все еще сумасшедший после стольких лет. Исследование вирусов. 2011. 162 (1–2): 80–99. pmid: 21963675; PubMed Central PMCID: PMC3221877.
    12. 12. Agoti CN, Mwihuri AG, Sande CJ, Onyango CO, Medley GF, Cane PA и др. Генетическое родство заражающих и реинфекционных штаммов респираторно-синцитиального вируса, выявленных в когорте рожденных из сельской местности Кении. J Infect Dis. 2012. 206 (10): 1532–41.pmid: 22966119; PubMed Central PMCID: PMC3475639.
    13. 13. Мерфи Б.Р., Принц Г.А., Уолш Е.Е., Ким Х.В., Парротт Р.Х., Хемминг В.Г. и др. Диссоциация между реакциями нейтрализующих сывороток и гликопротеиновых антител младенцев и детей, получивших вакцину против инактивированного респираторно-синцитиального вируса. J Clin Microbiol. 1986. 24 (2): 197–202. pmid: 3755730; PubMed Central PMCID: PMC268874.
    14. 14. Мерфи Б.Р., Грэм Б.С., Принц Г.А., Уолш Е.Е., Чанок Р.М., Карзон Д.Т. и др.Реакция антител младенцев и детей на гликопротеины F и G респираторно-синцитиального вируса G и A в сыворотке и промывании носа иммуноглобулинами G и A после первичной инфекции. J Clin Microbiol. 1986. 23 (6): 1009–14. pmid: 3754878; PubMed Central PMCID: PMC268782.
    15. 15. Мерфи Б.Р., Аллинг Д.В., Снайдер М.Х., Уолш Е.Е., Принц Г.А., Чанок Р.М. и др. Влияние возраста и ранее существовавших антител на сывороточный ответ антител младенцев и детей на гликопротеины F и G во время респираторно-синцитиальной вирусной инфекции.J Clin Microbiol. 1986. 24 (5): 894–8. pmid: 3771779; PubMed Central PMCID: PMC269059.
    16. 16. Wagner DK, Graham BS, Wright PF, Walsh EE, Kim HW, Reimer CB и др. Реакция подкласса антител иммуноглобулина G сыворотки на гликопротеины F и G респираторно-синцитиального вируса после первичной инфекции. J Clin Microbiol. 1986. 24 (2): 304–6. pmid: 3755731; PubMed Central PMCID: PMC268896.
    17. 17. Норрби Э., Муфсон М.А., Александр Х., Хаутен Р.А., Лернер Р.А. Сайт-ориентированная серология с синтетическими пептидами, представляющими большой гликопротеин G респираторно-синцитиального вируса.Proc Natl Acad Sci U S. A. 1987. 84 (18): 6572–6. pmid: 3476962; PubMed Central PMCID: PMC299121.
    18. 18. Тростник PA. Анализ линейных эпитопов, распознаваемых первичным ответом антител человека на вариабельную область белка прикрепления (G) респираторно-синцитиального вируса. J Med Virol. 1997. 51 (4): 297–304. pmid:

      44.
    19. 19. Паломо С., Тростник ПА, Мелеро Я. Оценка специфичности антител сывороток в фазе выздоровления человека против белка прикрепления (G) респираторно-синцитиального вируса человека: влияние вариации штамма и углеводных боковых цепей.J Med Virol. 2000. 60 (4): 468–74. pmid: 10686032.
    20. 20. Munoz FM, Piedra PA, Glezen WP. Безопасность и иммуногенность вакцины слитого белка-2, очищенной от респираторно-синцитиального вируса, для беременных. Вакцина. 2003. 21 (24): 3465–7. pmid: 12850361.
    21. 21. Hall CB, Walsh EE, Long CE, Schnabel KC. Иммунитет к респираторно-синцитиальному вирусу и частота повторных инфекций. J Infect Dis. 1991. 163 (4): 693–8. pmid: 2010624.
    22. 22. Пьедра П.А., Джуэлл А.М., Крон С.Г., Атмар Р.Л., Глезен В.П.Корреляты иммунитета к госпитализации, связанной с респираторно-синцитиальным вирусом (RSV): установление минимальных защитных пороговых уровней сывороточных нейтрализующих антител. Вакцина. 2003. 21 (24): 3479–82. pmid: 12850364.
    23. 23. Уолш Э. Э., Фалси АР. Гуморальный иммунитет и иммунитет слизистых оболочек в защите от естественной респираторно-синцитиальной вирусной инфекции у взрослых. J Infect Dis. 2004. 190 (2): 373–8. pmid: 15216475.
    24. 24. Фалси А.Р., Сингх Х.К., Уолш Э. Распад сывороточных антител у взрослых после инфицирования естественным респираторно-синцитиальным вирусом.J Med Virol. 2006. 78 (11): 1493–7. pmid: 16998887.
    25. 25. Састре П., Куси М.Г., Маноха С., Шильдген О., Руис Т., Вела С. и др. Реакция сывороточных антител на белки F и N респираторно-синцитиального вируса в двух популяциях с высоким риском инфицирования: у детей и пожилых людей. J Virol Methods. 2010. 168 (1–2): 170–6. pmid: 20488207.
    26. 26. Хурана С., Сугитан А.Л. младший, Ривера Й., Симмонс С.П., Ланзавеккья А., Саллусто Ф. и др. Антигенный фингерпринт птичьего гриппа H5N1 с использованием сыворотки выздоравливающих и моноклональных антител позволяет выявить потенциальные вакцины и диагностические мишени.PLoS Med. 2009; 6 (4): e1000049. Epub 2009/04/22. pmid: 19381279; PubMed Central PMCID: PMC2661249.
    27. 27. Маклеллан Дж.С., Чен М., Джойс М.Г., Састри М., Стюарт-Джонс Г.Б., Ян Й. и др. Конструкция на основе структуры гибридной гликопротеиновой вакцины против респираторно-синцитиального вируса. Наука. 2013. 342 (6158): 592–8. pmid: 24179220; PubMed Central PMCID: PMC4461862.
    28. 28. Джонсон С., Оливер С., Принц Г.А., Хемминг В.Г., Пфарр Д.С., Ван С.К. и др. Разработка гуманизированного моноклонального антитела (MEDI-493) с высокой активностью in vitro и in vivo против респираторно-синцитиального вируса.J Infect Dis. 1997. 176 (5): 1215–24. pmid: 9359721.
    29. 29. Андерсон LJ, Hierholzer JC, Stone YO, Tsou C, Fernie BF. Идентификация эпитопов на белках респираторно-синцитиального вируса с помощью иммуноанализа конкурентного связывания. J Clin Microbiol. 1986. 23 (3): 475–80. pmid: 2420819; PubMed Central PMCID: PMC268677.
    30. 30. Fuentes S, Coyle EM, Golding H, Khurana S. Вакцина с негликозилированным G-белком защищает от заражения гомологичным и гетерологичным респираторно-синцитиальным вирусом (RSV), в то время как гликозилированный G увеличивает патологию RSV в легких и уровни цитокинов.J Virol. 2015. 89 (16): 8193–205. pmid: 26018164; PubMed Central PMCID: PMC4524247.
    31. 31. Кумари С., Крим Р.Л., Кулкарни А., Аудет С.А., Мдлули Т., Мурата Х. и др. Разработка системы иммунопреципитации люциферазой для обнаружения антител IgG против нуклеопротеина респираторно-синцитиального вируса человека. Clin Vaccine Immunol. 2014; 21 (3): 383–90. pmid: 24403526; PubMed Central PMCID: PMC3957679.
    32. 32. Welliver RC, Kaul TN, Putnam T.I, Sun M, Riddlesberger K, Ogra PL.Антительный ответ на первичную и вторичную инфекцию респираторно-синцитиальным вирусом: кинетика классоспецифичных ответов. J Pediatr. 1980. 96 (5): 808–13. pmid: 7365579.
    33. 33. McLellan JS, Chen M, Leung S, Graepel KW, Du X, Yang Y и др. Структура тримерного гликопротеина слияния RSV, связанного с нейтрализующим антителом, специфичным для предварительного слияния. Наука. 2013. 340 (6136): 1113–7. pmid: 23618766.
    34. 34. Кваккенбос М.Дж., Дил С.А., Ясуда Э., Баккер А.К., ван Гилен С.М., Люкенс М.В. и др.Создание стабильных моноклональных антител, продуцирующих B-клеточные рецепторы B-клеток памяти человека, путем генетического программирования. Природная медицина. 2010. 16 (1): 123–8. pmid: 20023635; PubMed Central PMCID: PMC2861345.
    35. 35. Ngwuta JO, Chen M, Modjarrad K, Joyce MG, Kanekiyo M, Kumar A, et al. F-специфические антитела перед слиянием определяют величину нейтрализующей активности RSV в сыворотке крови человека. Sci Transl Med. 2015; 7 (309): 309ра162. pmid: 26468324; PubMed Central PMCID: PMC4672383.
    36. 36.Fuentes S, Crim RL, Beeler J, Teng MN, Golding H, Khurana S. Разработка простого, быстрого, чувствительного, высокопроизводительного теста микронейтрализации на основе репортера люциферазы для измерения вирус-нейтрализующих антител после вакцинации и инфицирования респираторно-синцитиальным вирусом. Вакцина. 2013. 31 (37): 3987–94. pmid: 23742994; PubMed Central PMCID: PMC3779065.
    37. 37. Андерсон LJ, Bingham P, Hierholzer JC. Нейтрализация респираторно-синцитиального вируса индивидуальными и смесями моноклональных антител к белкам F и G.J Virol. 1988. 62 (11): 4232–8. pmid: 2459412; PubMed Central PMCID: PMC253856.
    38. 38. Корти Д., Бьянки С., Ванцетта Ф., Минола А., Перес Л., Агатик Дж. И др. Перекрестная нейтрализация четырех парамиксовирусов человеческим моноклональным антителом. Природа. 2013. 501 (7467): 439–43. pmid: 23955151.
    39. 39. Гилман М.С., Мойн С.М., Мас В., Чен М., Патель Н.К., Крамер К. и др. Характеристика антитела, специфичного для префузии, которое распознает четвертичный, зависимый от расщепления эпитоп на гликопротеине слияния RSV.PLoS Pathog. 2015; 11 (7): e1005035. pmid: 26161532; PubMed Central PMCID: PMC4498696.
    40. 40. Краруп А., Труан Д., Фурманова-Холленштейн П., Богерт Л., Бушье П., Бишоп И. Дж. И др. Высокостабильная вакцина перед слиянием RSV F, полученная в результате структурного анализа механизма слияния. Nat Commun. 2015; 6: 8143. pmid: 26333350; PubMed Central PMCID: PMC4569726.
    41. 41. Burton CT, Gotch F, Imami N. Быстрый качественный и количественный анализ Т-клеточных ответов у ВИЧ-1-инфицированных лиц, получивших успешную ВААРТ и серо-отрицательный контроль ВИЧ-1: одновременная оценка перфорина, IFN-гамма и IL-4 секреция.J Immunol Methods. 2006. 308 (1–2): 216–30. pmid: 16388819.
    42. 42. Тапиа Л.И., Шоу К.А., Айдян Л.О., Джуэлл А.М., Доусон Б.К., Хак Т.Р. и др. Вариабельность последовательности генов трех поверхностных белков респираторно-синцитиального вируса человека (HRSV) в Техасе. PLoS One. 2014; 9 (3): e. pmid: 24625544; PubMed Central PMCID: PMC3953119.
    43. 43. Магро М., Мас В., Чаппелл К., Васкес М., Кано О, Луке Д. и др. Нейтрализующие антитела против преактивной формы слитого белка респираторно-синцитиального вируса открывают уникальные возможности для клинического вмешательства.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2012; 109 (8): 3089–94. pmid: 22323598; PubMed Central PMCID: PMC3286924.
    44. 44. Джонс П.Д., Ада Г.Л. Гриппоспецифические секретирующие антитела клетки и В-клеточная память в легких мыши после иммунизации диким типом, адаптированным к холоду вариантом и инактивированными вирусами гриппа. Вакцина. 1987. 5 (3): 244–8. Epub 1987/09/01. pmid: 3499714.
    45. 45. Джонс П.Д., Ада Г.Л. Сохранение специфических для вируса гриппа клеток, секретирующих антитела, и B-клеточная память после инфицирования вирусом первичного мышиного гриппа.Cell Immunol. 1987. 109 (1): 53–64. Epub 1987/10/01. pmid: 3498544.
    46. 46. Хайланд Л., Сангстер М., Сили Р., Колекло С. Инфекция мышей, вызванная респираторным вирусом, вызывает постоянный гуморальный иммунный ответ. J Virol. 1994. 68 (9): 6083–6. Epub 1994/09/01. pmid: 8057487; PubMed Central PMCID: PMC237018.
    47. 47. Пурта В.Е., Теддер Т.Ф., Джонсон С., Бхаттачарья Д., Даймонд М.С. В-клетки памяти, но не долгоживущие плазматические клетки, обладают антигенной специфичностью в отношении мутантов, ускользающих от вируса.J Exp Med. 2011. 208 (13): 2599–606. Epub 2011/12/14. jem.20110740 [pii] pmid: 22162833; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMC3244041.
    48. 48. Тарлинтон Д., Гуд-Якобсон К. Разнообразие В-клеток памяти: происхождение, последствия и полезность. Наука. 2013; 341 (6151): 1205–11. Epub 2013/09/14. 341/6151/1205 [pii] pmid: 24031013.
    49. 49. Каррон Р.А., Райт П.Ф., Белше Р.Б., Тумар Б., Кейси Р., Ньюман Ф. и др. Идентификация рекомбинантного живого аттенуированного респираторно-синцитиального вируса-кандидата на вакцину, который сильно аттенуирован у младенцев.J Infect Dis. 2005. 191 (7): 1093–104. pmid: 15747245.
    50. 50. Хоркера PA, Choi Y, Oakley KE, Powell TJ, Boyd JG, Palath N, et al. Вакцины с наночастицами, содержащие мотив хемокина CX3C G-белка респираторно-синцитиального вируса (RSV), индуцируют устойчивый иммунитет, защищающий от заражения и болезней. PLoS One. 2013; 8 (9): e74905. pmid: 24040360; PubMed Central PMCID: PMC3769300.
    51. 51. Златева К.Т., Лемей П., Вандамм А.М., Ван Ранст М. Молекулярная эволюция и паттерны циркуляции респираторно-синцитиального вируса человека подгруппы а: положительно выбранные сайты в прикреплении гликопротеина g.J Virol. 2004. 78 (9): 4675–83. pmid: 15078950; PubMed Central PMCID: PMC387670.
    52. 52. Тренто А., Абрего Л., Родригес-Фернандес Р., Гонсалес-Санчес М.И., Гонсалес-Мартинес Ф., Дельфраро А. и др. Сохранение эпитопов G-белка в респираторно-синцитиальном вирусе (группа A), несмотря на широкое генетическое разнообразие: участвует ли отбор антител в эволюции вируса? J Virol. 2015; 89 (15): 7776–85. pmid: 25995258; PubMed Central PMCID: PMC4505632.
    53. 53. Град Й.Х., Ньюман Р., Зоди М., Ян Х, Мерфи Р., Ку Дж. И др.Глубокое секвенирование всего генома внутри хозяина и анализ разнообразия респираторно-синцитиальной вирусной инфекции человека выявляют динамику геномного разнообразия в отсутствие и при наличии иммунного давления. J Virol. 2014. 88 (13): 7286–93. pmid: 24741088; PubMed Central PMCID: PMC4054443.
    54. 54. Jaberolansar N, Toth I, Young PR, Skwarczynski M. Последние достижения в разработке субъединичных вакцин против RSV. Экспертные ревакцины. 2016; 15 (1): 53–68. pmid: 26506139.
    55. 55. Raghunandan R, Lu H, Zhou B, Xabier MG, Massare MJ, Flyer DC, et al.Вакцина с наночастицами F респираторно-синцитиального вируса (RSV), полученного из клеток насекомых, индуцирует антигенные антитела к сайту II и защищает от заражения RSV хлопковых крыс посредством активной и пассивной иммунизации. Вакцина. 2014. 32 (48): 6485–92. pmid: 25269094.
    56. 56. Хоторн Дж. Д., Альбрехт П. Анализ нейтрализации чувствительных бляшек для вируса парагриппа 1, 2 и 3 типов и респираторно-синцитиального вируса. J Clin Microbiol. 1981. 13 (4): 730–7. pmid: 6262372; PubMed Central PMCID: PMC273869.
    57. 57.Лу Х., Хурана С., Верма Н., Манишевиц Дж., Кинг Л., Бейгель Дж. Х. и др. Быстрая система Flp-In для экспрессии секретируемого иммуногена вакцины гемагглютинина вируса гриппа H5N1 в клетках млекопитающих. PLoS One. 2011; 6 (2): e17297. pmid: 21386997; PubMed Central PMCID: PMC3046144.
    .

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *