Рсв нулевой образец: Как заполнить РСВ нулевой в 2021 году

Фармакокинетический анализ.

Фармакокинетические параметры рассчитывали независимыми от модели методами с использованием WinNonlin (версия 5; SCI Software, Lexington, KY).Площадь под кривой «концентрация лекарственного средства-время» (AUC) и площадь под первым моментом кривой «концентрация лекарственного средства-время» (AUMC) были рассчитаны с помощью правила трапеции и экстраполированы на бесконечность (AUC от 0 ч до бесконечности [AUC _{0 –∞} ] и AUMC от 0 ч до бесконечности [AUMC _{0 – ∞} ]). Период полувыведения в β-фазе ( t _{1 / 2β} ) вычисляли, когда это было возможно, исходя из наклона конечной фазы логарифмических точек концентрации лекарственного средства в плазме крови с помощью линейной регрессии.Объем распределения в устойчивом состоянии ( V _ss ) и системный клиренс (CL) определяли по следующим формулам: V _ss = (внутривенная доза × AUMC _{0 – ∞} ) / AUC _{0 –∞} и CL = iv доза / AUC _{0 – ∞} .

Отбор крупного рогатого скота для исследования противовирусной эффективности.

Протоколы исследования были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Калифорнийского университета в Дэвисе (UC Davis). Лечение животных придерживалось У.S. государственные принципы использования и ухода за позвоночными животными (38), Руководство по уходу и использованию лабораторных животных (39), Закон о благополучии животных (40) и другие применимые государственные законы и постановления. Телята-самцы были получены с местных молочных заводов и определены как отрицательные по bRSV с помощью анализа qRT-PCR образцов мазков из носа. Телята помещали в индивидуальные хозяйства в животноводческий комплекс Калифорнийского университета в Дэвисе и позволяли им акклиматизироваться в течение не менее 4-7 дней. За четыре дня до заражения всех телят в течение 3 дней подряд лечили дозой антибиотика цетиофур натрия Naxcel (1-2 мл / 100 фунтов массы тела) внутримышечно.Телят проверяли на наличие желудочно-кишечных паразитов и эктопаразитов. Телята также проверялись на сальмонеллу, если они поступали в животноводческий комплекс с симптомами диареи. Для исследования были отобраны только телят с температурой тела в пределах нормы, которые были отрицательными по bRSV и легкими, которые выслушивались в пределах нормы. Два катетера были вставлены в яремную вену у двух телят в каждой группе для дозирования и отбора проб PK, а один яремный катетер был вставлен в яремную вену только у телят в каждой группе для дозирования.Телят размещали индивидуально, чтобы избежать контакта, который мог бы нарушить установку катетера.

Рандомизация.

Телят взвесили, провели тест титра антител (титр непрямой иммунофлуоресценции [IFA]) (кровь взяли через 2 или 3 дня после прибытия) и рассчитали средний титр антител против bRSV. Примерно за 2 дня до заражения вирусом телят рандомизировали на группы так, чтобы средний титр антител и средняя масса тела были одинаковыми в каждой группе.Информация о дозировке для групп хранилась от группы исследователей на месте до завершения исследования (исследование проводилось вслепую).

Посев на bRSV.

Запасы вируса, амплифицированные на культурах клеток BT, использовали непосредственно для инокуляции. Приблизительно 5 мл распыленного bRSV в концентрации 2 × 10 ⁴ БОЕ / мл вводили каждому теленку в течение 15-20 минут с использованием специально подобранной маски для лица, закрывающей нос и рот.

Опытный образец.(i) Исследование 1.

Восемь телят были рандомизированы в две группы (группы 1 и 2 по четыре теленка в каждой группе) на основании веса и титров антител против bRSV (). В день 0 животных инокулировали bRSV, как описано выше. В день 1 после инокуляции животным вводили GS1 в дозе 2 мг / кг (группа 1) или плацебо (группа 2) внутривенно. инъекция два раза в день (BID) в общей сложности 7 дней. Мазки из носа и образцы крови собирали ежедневно в течение 10 дней перед каждой дозой для измерения вирусной нагрузки и уровней лекарства, соответственно.На 7-й день после инокуляции были собраны образцы BALF для измерения вирусной нагрузки в легком. Физические осмотры проводились ежедневно на протяжении всего исследования для расчета баллов по клиническим симптомам. В конце исследования животных умерщвляли, и соответствующие ткани собирали для гистопатологической оценки.

План эксперимента 1. Телята были рандомизированы на 2 группы в зависимости от веса и титров антител к bRSV. В день 0 животным инокулировали распыленный bRSV, доставляемый в дыхательные пути через лицевую маску, закрывающую нос и рот.Через 24 часа после инокуляции каждой группе животных вводили GS1 в дозе 2 мг / кг или плацебо путем внутривенной инъекции BID в течение всего 7 дней. Мазки из носа и образцы крови собирали ежедневно в течение 10 дней перед каждой дозой. На 7-й день после прививки отобранным животным проводили бронхиолярный лаваж. Физические осмотры проводились ежедневно на протяжении всего исследования для расчета баллов по клиническим симптомам. На 10-й день исследования животных умерщвляли, а ткани собирали для вскрытия трупа и гистопатологии.

(ii) Исследование 2.

Шестнадцать телят были включены в исследование и рандомизированы в 3 группы (группы 1, 2 и 3) на основании веса и титров антител против bRSV (). Два теленка в группе лечения 3 (плацебо) были исключены из исследования до инокуляции из-за возможного образования тромба и / или bRSV-положительного теста qRT-PCR. Остальным животным (всего 14) в день 0 был инокулирован bRSV. Один теленок был включен в исследование, но исключен из анализа из-за вторичной инфекции. Группе 1 (4 животных) вводили GS1 в дозе 4 мг / кг / день один раз в день, начиная с 1 дня и продолжая в течение 7 дней с последующим введением носителя в течение 2 дней.Одно животное в группе 1 получало лечение, но было исключено из анализа из-за развития вторичной бактериальной инфекции. Группе 2 (6 животных) вводили только носитель в течение 2 дней, начиная с 1-го дня, с последующим введением GS1 в дозе 4 мг / кг один раз в день в течение 7 дней, начиная с 3-го дня постинфекции. Группа 3 (4 животных) служила контрольной группой плацебо и получала 9 последовательных обработок носителем, начиная с первого дня. Образцы плазмы были собраны у 3 телят (2 из группы 1 и 1 из группы 3) в день 1 и у 3 телят (2 из группа 2 и 1 из группы 3) на 3 день для количественного определения уровней лекарственного средства.Приблизительно 1 мл крови собирали перед дозой и через 0,3, 0,5, 1, 4, 8 и 24 часа после введения. Мазки из носа и образцы крови для измерения вирусной нагрузки и концентрации лекарства собирали утром перед следующей дозой для каждого животного. Физические осмотры проводились ежедневно на протяжении всего исследования для расчета баллов по клиническим симптомам. В конце исследования животных умерщвляли, а ткани собирали для гистопатологической оценки.

План эксперимента для исследования 2.Четырнадцать телят были инокулированы распыленным bRSV в день исследования 0. Группе 1 (4 животных) вводили GS1 в дозе 4 мг / кг / день один раз в день, начиная с 1 дня исследования и продолжая в течение 7 дней с последующим введением носителя в течение 2 дней. . Группе 2 (6 животных) вводили носитель в течение 2 дней, начиная с 1-го дня исследования, с последующим введением GS1 в дозе 4 мг / кг один раз в день в течение 7 дней, начиная с 3-го дня исследования. Группа 3 (4 животных) получала 9 последовательных доз. обработка транспортных средств, начиная с 1-го дня исследования.Образцы крови были взяты для выделения плазмы у 3 телят (2 из группы 1 и 1 из группы 3) в день исследования 1 и у 3 телят из дня исследования 3 (2 из группы 2 и 1 из группы 3) для количественного определения уровней лекарственного средства. Мазки из носа и образец крови брали утром перед введением дозы каждому животному для измерения вирусной нагрузки и концентрации лекарственного средства, соответственно. Физические осмотры проводились ежедневно на протяжении всего исследования для расчета баллов по клиническим симптомам. На 6 день исследования отобранным животным, у которых было достаточно хорошее состояние здоровья, был проведен бронхиальный лаваж.Животных умерщвляли на 10 или 11 день исследования, а ткани собирали для аутопсии и гистопатологии.

Измерение вирусной нагрузки.

Носовые мазки собирали путем введения стерильного ватного тампона в заднюю часть носовой полости, извлечения тампона и немедленного его помещения при перемешивании в 1 мл забуференного физиологического раствора Хенкса в стерильную пробирку с завинчивающейся крышкой на льду. Клетки назального эпителия собирали из этих назальных мазков и выделяли центрифугированием при 500 × g в течение 10 мин.Альвеолярные макрофаги легких выделяли из ЖБАЛ центрифугированием при 500 × g в течение 10 мин. Тотальную РНК выделяли из назального эпителия и альвеолярных макрофагов с помощью мини-набора RNeasy (Qiagen). Всего от 0,1 до 0,5 мкг РНК подвергали обратной транскрипции с использованием набора для обратной транскрипции высокой емкости (Applied Biosystems). qRT-PCR выполняли с использованием набора SYBR green master mix (Applied Biosystems) в системе ViiA-7 для ПЦР в реальном времени (RT-PCR) (Applied Biosystems). Амплификацию гена нуклеокапсида (N) bRSV использовали для мониторинга инфекции bRSV.Ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы крупного рогатого скота (GAPDH) амплифицировали в качестве внутреннего контроля. Плазмиду со вставкой полноразмерного гена N bRSV и другую плазмиду с геном бычьего GAPDH использовали в качестве стандартов для расчета вирусных копий и копий GAPDH в проанализированных образцах РНК. Титр бычьего RSV был представлен как количество копий N-транскриптов на 10 ⁵ копий транскриптов GAPDH.

Оценка симптомов.

Физические осмотры проводились до инфицирования (исходный уровень) и в каждый день исследования перед дозированием.Симптомы заболевания регистрировались вслепую и использовались для расчета баллов по симптомам заболевания. Этот метод ранее был подтвержден в многочисленных исследованиях (32, 34, 36). Оценка клинических симптомов была основана на совокупности наблюдений и измерений, которые включали температуру, частоту дыхания, признаки анорексии, конъюнктивита, выделения из глаз, выделения из носа, респираторный характер, одышку, дыхание через рот, кашель и аускультацию. Частоту дыхания измерял ветеринар (вслепую [не зная о группе лечения]) с помощью стетоскопа для подсчета вдохов в течение 1 минуты, отсчитывая время с секундной стрелкой на наручных часах.

Патология легких.

Телят гуманно усыпили с помощью внутривенной инъекции барбитурата. Были удалены верхние и нижние дыхательные пути и исследованы на предмет грубых повреждений. Гистопатологический анализ проводился вслепую сертифицированным ветеринарным патологом.

Статистический анализ.

Данные, собранные через 10 дней после заражения, были включены в анализ. Теленок 908 (группа 1) был исключен из анализов в исследовании 2 из-за вторичной бактериальной инфекции.Площадь под кривой рассчитывалась для каждого теленка для логарифма вирусной нагрузки ₁₀ , оценки клинических симптомов и конечных точек частоты дыхания в каждом исследовании. Перед преобразованием log ₁₀ к каждому измерению добавлялось значение 1, чтобы предотвратить ошибки, вызванные преобразованием log ₁₀ нулевых значений. AUC log ₁₀ вирусной нагрузки оценивали с помощью теста суммы рангов Вилкоксона (двусторонний тест) (значение P <0,05 считалось статистически значимым) в исследовании 1.Все остальные конечные точки оценивались с помощью модели рангового анализа ковариации (ANCOVA) (двусторонний тест) (значение P <0,05 считалось статистически значимым) с исходным уровнем в качестве ковариаты для учета различных исходных значений.

РЕЗУЛЬТАТЫ

GS1 представляет собой новый низкомолекулярный ингибитор RSV, который нацелен на белок F RSV и предотвращает проникновение вируса в клетку-хозяин, ингибируя слияние вирусной оболочки с мембраной клетки-хозяина.Соединение является мощным ингибитором человеческого RSV in vitro (среднее EC ₅₀ = 0,3 ± 0,1 нМ), но неактивно против других парамиксовирусов, таких как метапневмовирус человека, вирус парагриппа и генипавирусы (данные не показаны). Белок F RSV из bRSV на 82% идентичен белку F hRSV на 82%, а аминокислотные остатки, которые, как известно, придают лекарственную устойчивость к ингибиторам слияния в hRSV, консервативны на 100%. Чтобы определить, был ли GS1 активен против bRSV, соединение оценивали на противовирусную активность в бычьих раковинах (BT) и бычьих альвеолярных клетках типа 2 (BAT2).Среднее значение EC ₅₀ с для GS1 в клетках BT и клетках BAT2, инфицированных bRSV, составляло 0,36 ± 0,1 нМ ( n = 4) и 0,39 ± 0,3 нМ ( n = 4), соответственно (), эффективность соответствует с тем, что наблюдалось против hRSV. GS1 не был цитотоксичным в клеточных линиях, используемых для противовирусного тестирования, при самых высоких протестированных концентрациях (25 мкМ).

ТАБЛИЦА 1

Противовирусная активность GS1 для bRSV ^a

Фармакокинетический профиль многократного введения GS1 у телят.

Фармакокинетические профили многократного введения GS1 были измерены у телят-самцов голштинской породы для определения безопасности, переносимости и воздействия GS1 в плазме и дыхательных путях ().Эти данные были использованы для определения оптимального уровня дозы и частоты дозирования для последующих исследований эффективности. Стабильность GS1 была сходной в анализах микросом печени крупного рогатого скота и человека in vitro . Кроме того, GS1 показал немного более высокое связывание с белками плазмы в плазме крупного рогатого скота, чем в плазме человека (99,6% против 97,1%, соответственно). Двенадцатинедельным телятам вводили GS1 в виде повторного внутривенного введения. инъекции по 4 мг / кг / день в течение 4 дней подряд. Образцы крови собирали в выбранные моменты времени, и из образцов крови выделяли плазму для измерения концентраций соединения.Образцы мазков из носа собирали одновременно с образцами крови, образцы BALF собирали через 1 и 24 часа после введения соединения, а легочную ткань собирали через 24 часа после последней дозы при вскрытии для измерения концентраций соединения.

ТАБЛИЦА 2

Фармакокинетические свойства GS1 у телят после 4-дневного внутривенного введения один раз в день. болюсное введение (4 мг / кг)

После повторения 4 мг / кг доз GS1, период полураспада GS1 в плазме составлял 6 часов и 9 часов в день 1 и 4, соответственно.Площадь под кривой концентрация-время в течение 24-часового интервала дозирования (AUC _{0 — последние} ) составляла 15 494 нМ · ч в день 1 (диапазон от 9 723 до 19 575 нМ · ч) и 23 251 нМ · ч (диапазон 12 433 нМ · ч). до 34 069 нМ · ч) на 4-й день. Данные свидетельствуют об увеличении системного воздействия GS1 после многократных доз 4 мг / кг / день. Однако следует отметить, что только небольшое количество животных ( n = 2 на момент времени) было включено в фармакокинетический анализ; следовательно, различия не могли быть оценены статистически.Примечательно, что GS1, по-видимому, распределяется в легочной ткани. В виде отдельной однократной дозы в / в. исследования, концентрация GS1 в легочной ткани была в 145 раз выше, чем концентрация в плазме (). Более того, концентрация GS1 была заметно выше в образцах ЖБАЛ (в 15 раз) и мазках из носа (в 4 раза), чем в образцах плазмы (). Эти данные указывают на преимущественное распределение GS1 в терапевтически релевантных компартментах и ​​тканях.

ТАБЛИЦА 3

Концентрации лекарственного средства в различных компартментах через 24 ч после введения GS1 (4 мг / кг i.v. болюс) для здоровых телят

Терапевтическая эффективность GS1, вводимого два раза в день (BID).

Эффективность GS1 оценивалась в рандомизированных плацебо-контролируемых слепых исследованиях для устранения потенциальной систематической ошибки, связанной с оценкой симптомов и измерениями эффективности (). В первом исследовании (исследование 1) оценивалось двухразовое введение GS1 в дозе 2 мг / кг / доза, начатая через 24 часа после инокуляции bRSV. В исследовании участвовали 8 телят, которые были рандомизированы в группы, получавшие GS1 (группа 1 [ n = 4]) или плацебо (группа 2 [ n = 4]).Каждый день каждого животного проводился физический осмотр и регистрировались симптомы инфекции bRSV. Ежедневно собирали образцы смыва из носа для измерения вирусной нагрузки и уровней лекарственного средства. На 6-й день после инфицирования были получены образцы лаважа легких для анализа вирусной нагрузки в жидкости лаважа легких. На 11 день животных умерщвляли и собирали ткани для гистопатологии.

Все инокулированные телята заразились bRSV, что было определено с помощью положительных значений qRT-PCR из образцов смыва из носа. У большинства животных на 2-й день после прививки наблюдались клинические признаки инфекции, основанные на оценке симптомов.У телят, получавших плацебо, вирусная нагрузка и оценка симптомов увеличивались по мере развития инфекции и достигли пика между 6 и 8 днями после прививки, после чего следовало снижение до конца исследования (). Частота дыхания увеличилась в ходе исследования, хотя вирусная нагрузка и количество симптомов снизились.

Средние вирусные нагрузки, оценка симптомов и частота дыхания телят в исследовании 1. Вирусные нагрузки были количественно определены на основе мазков из носа с помощью qRT-PCR, а значения РНК bRSV были нормализованы к значениям клеточной мРНК GADPH.Суммарная оценка симптомов и частота дыхания рассчитывались на основе ежедневных физических осмотров каждого животного. Средние значения вирусной нагрузки и каждой оценки ( n = 4 на группу) нанесены на график как функция времени после инокуляции, а положительные полосы ошибок представляют собой стандартные ошибки средних значений.

Телята, получавшие GS1 дважды в день, имели пониженную вирусную нагрузку в образцах смыва из носа, более низкие показатели симптомов и более низкую частоту дыхания по сравнению с животными, получавшими плацебо (и; см. Таблицу S1 в дополнительном материале).Средние значения AUC кривой вирусной нагрузки для животных, получавших GS1, и животных, получавших плацебо, составляли 5,9 и 18,9 log ₁₀ эквивалентов bRSV / GAPDH · день / мл ( P = 0,061), соответственно. Средние значения AUC для оценки симптомов у животных, получавших GS1, и животных, получавших плацебо, составляли 366,3 и 1 912,4 балла в день ( P = 0,018), соответственно. Также было отмечено снижение частоты дыхания у обработанных животных по сравнению с животными, получавшими плацебо (293,0 против 508,6 вдохов в день / мин ( P = 0.027).

ТАБЛИЦА 4

Вирусная нагрузка, оценка симптомов и частота дыхания у телят, инфицированных bRSV, получавших GS1 или плацебо BID (исследование 1)

Патологии легких оценен.Между группой, получавшей плацебо, и группой, получавшей GS1, наблюдались четкие различия в отношении процента консолидации легких и наличия типичных поражений bRSV (см. Таблицу S3 в дополнительном материале). Средний процент консолидации легких у телят, получавших плацебо, составил 33,8% по сравнению с 0% для телят, получавших GS1. Консолидацию легкого патологоанатом оценил путем расчета процента консолидации для каждой доли и общей консолидации легкого.Бронхоинтерстициальная пневмония была обычным явлением у инфицированных телят, получавших плацебо, но не наблюдалась у животных, получавших GS1. У телят, получавших плацебо, также были признаки облитерирующего бронхиолита и гиперплазии эпителиальных клеток типа II, а у нескольких телят в срезах легких присутствовали синцитиальные клетки. У трех из четырех телят, получавших плацебо, был обнаружен bRSV в срезах легких с помощью иммуногистохимии, в то время как, напротив, ни у одного из телят, получавших GS1, антиген bRSV не был обнаружен в срезах легких.В совокупности эти результаты демонстрируют, что введение GS1 BID, начатое через 24 часа после инокуляции, снижает репликацию вируса и клинические симптомы, а также патологию заболевания, связанную с инфекцией bRSV.

Ткань легких телят в исследовании 1, получавших GS1 или плацебо. У теленка 1-3 (теленок 3 из группы 1) (получавших GS1) не было выявлено грубых повреждений с 0% консолидацией легких, за исключением очагового фиброзного спайки на грудной стенке. Кроме того, имелся мягкий нейтрофильный бронхиальный экссудат с редкими лимфоидными агрегатами в бронхиальном и бронхиолярном эпителии, и не было активной бронхопневмонии или экссудации в легких.При иммунном окрашивании легочной ткани никаких доказательств bRSV обнаружено не было. Напротив, у теленка 2–3 (теленок 3 из группы 2) (лечившегося плацебо) наблюдалась 60% консолидация легких и широко распространенная бронхоинтерстициальная пневмония с нейтрофильной экссудацией, при которой бронхиолы имели гиперпластический эпителий с очаговым некрозом и окружающим лимфоплазмоцитарным инфильтратом. Наблюдались мультифокальные эпителиальные синцитии и синцитии в альвеолярных пространствах. Иммунное окрашивание показало bRSV-положительный сигнал в легочной ткани. Описание результатов гистопатологии для отдельных животных показано в таблице S3 в дополнительном материале.

Терапевтическая эффективность GS1, вводимого QD.

После демонстрации эффективности дозирования GS1 BID было проведено второе рандомизированное плацебо-контролируемое исследование для оценки эффективности соединения, вводимого один раз в день (QD). Кроме того, это исследование также было разработано для сравнения эффективности раннего и отсроченного начала лечения GS1. Четырнадцать телят-самцов в возрасте от 4 до 6 недель были рандомизированы в три группы и инфицированы bRSV. Телятам вводили GS1 в дозе 4 мг / кг один раз в день через 24 часа (группа 1) или 72 часа (группа 2) после инокуляции bRSV или лечили плацебо (группа 3;).Лечение проводилось в течение 7 дней, и вирусная нагрузка измерялась с помощью мазков из носа, взятых ежедневно, и образцов BALF, взятых на 6 день после инокуляции и в конце исследования. Баллы клинических симптомов оценивались ежедневно, как описано для исследования 1.

Начало лечения в день 1 и день 3 с QD введения 4 мг / кг GS1 телятам, инфицированным bRSV, снижало вирусную нагрузку, а также сравнивали баллы клинических симптомов и частоту дыхания. к лечению плацебо (а). Однако величина противовирусных эффектов была выше у животных, которые получили раннее лечение в 1 день после прививки.Лечение GS1, начатое в день 1 и день 3, снизило среднюю AUC вирусной нагрузки на 94% и 50% соответственно по сравнению со значениями для лечения плацебо (AUC 8,6, 18,8 и 21,6 log ₁₀ bRSV / GAPDH эквиваленты · день / мл для начала лечения в день 1, начала лечения в день 3 и лечения плацебо, соответственно) (см. Таблицу S2 в дополнительном материале). Аналогичные тенденции наблюдались для снижения AUC оценок клинических симптомов и частоты дыхания в группах, получавших GS1, по сравнению с группой, получавшей плацебо (; данные по отдельным животным в таблице S2 в дополнительном материале).

Средние вирусные нагрузки, оценка симптомов и частота дыхания телят в исследовании 2. Вирусные нагрузки были количественно определены на основе мазков из носа с помощью qRT-PCR, а значения РНК bRSV были нормализованы по клеточной мРНК GADPH. Суммарная оценка симптомов и частота дыхания рассчитывались на основании ежедневных физических осмотров каждого животного. Средние значения для телят, получавших плацебо ( n = 3) и телят, получавших GS1 в день 1 лечения ( n = 4) (белые кружки) или на 3 день лечения ( n = 6) (серый кружки) построены как функция времени после заражения (стр.i.), а столбцы положительных ошибок представляют собой стандартные ошибки средних значений.

ТАБЛИЦА 5

Вирусная нагрузка, оценка симптомов и частота дыхания у крупного рогатого скота, инфицированного bRSV, получавшего QD GS1 или плацебо (исследование 2)

Ткань легких телят в исследовании 2, получавших GS1 или плацебо. Ткань легких теленка 1-2 (теленок 2 из группы 1) из основной группы 1 (лечение GS1 через 24 часа после инфицирования) показала минимальный мультифокальный мультилобулярный ателектаз (<1% массы легкого) и легкую двустороннюю нейтрофильную гистиоцитарную бронхопневмонию. Mycoplasma bovis был выделен из ткани, но антиген bRSV не был обнаружен иммуноокрашиванием. Ткань легкого теленка 2-6 (теленок 6 из группы 2) из ​​исследуемой группы 2 (лечение GS1 через 72 часа после инфицирования) показала минимальную фокальную многодолевую консолидацию в правой средней доле (<1% массы легкого) с региональным фокальным мультилобулярным ателектазом с минимальная гистиоцитарная нейтрофильная бронхопневмония. Mycoplasma bovis была выделена из легочной ткани, но при иммунном окрашивании оказалась отрицательной на bRSV. Ткань легкого теленка 3–3 (теленок 3 из группы 3) из исследуемой группы 3 (животное, получавшее плацебо) показала тяжелую двустороннюю антеровентральную легочную консолидацию (от 45 до 50% массы легкого). В пораженных долях легкого были обнаружены обширные мультилобулярные участки нейтрофильной бронхопневмонии с мультифокальным некрозно-гнойным бронхиолитом и очаговым некрозом. Arcanobacterium pyogenes и Mycoplasma bovis были выделены из легочной ткани, но bRSV не был обнаружен иммунным окрашиванием.Описание результатов гистопатологии для отдельных животных показано в таблице S4 в дополнительном материале.

ОБСУЖДЕНИЕ

Инфекция RSV может привести к серьезным респираторным заболеваниям у детей, пожилых людей и пациентов с ослабленным иммунитетом из группы высокого риска. В настоящее время не существует эффективных противовирусных средств для лечения RSV-инфекции в этих группах пациентов с высоким риском. Одним из ограничений разработки новых клинически эффективных противовирусных методов лечения является отсутствие животных моделей инфекции RSV с подтвержденными клиническими конечными точками, которые отражают патогенез инфекции человека.Экспериментальное заражение телят голштинской породы bRSV вызывает респираторное заболевание с аналогичной вирусной динамикой, патологией и клиническими симптомами, что и у педиатрической инфекции RSV человека, что делает эту систему-кандидат модельной для изучения эффективности противовирусных терапевтических средств.

Во время инфицирования bRSV количественную оценку вирусной нагрузки можно проводить с помощью qRT-PCR с использованием внутреннего гена хозяина (GADPH) в качестве стандарта для нормализации общего количества введенной РНК, тем самым снижая вариабельность, связанную с отбором образцов.Оптимизированная процедура мазка из носа максимизирует извлечение эпителиальных клеток носа, которые содержат значительное количество вируса по сравнению с вирусом, обнаруженным в слизистом слое. Количественная оценка вирусной нагрузки в выделениях из носа и жидкостях лаважа легких инфицированных животных в ходе инфекции выявила пиковые титры вируса между 6 и 8 днями после инокуляции с последующим снижением вирусной нагрузки.

У телят, зараженных bRSV, в течение 3 дней после прививки развиваются респираторные симптомы, пик которых наступает через 6–9 дней после прививки, после чего наблюдается снижение симптомов до исчезновения инфекции (32).Симптомы включают гиперсекрецию слизистой, спонтанный кашель, эпизодические хрипы, одышку и учащенное дыхание с высокой вирусной нагрузкой, обнаруживаемой в выделениях из носа и в образцах ЖБАЛ. Составная оценка симптомов — эффективный метод количественной оценки наблюдений, проводимых во время физических осмотров (41, 42). Составная система баллов, использованная в этом исследовании, была разработана для количественной оценки наблюдаемых физических симптомов, связанных с тяжестью заболевания. Чтобы снизить вероятность экспериментальной ошибки, вносимой субъективной оценкой, все исследования клинических симптомов проводились слепым методом независимым экспертом.Хотя существует общая корреляция между вирусной нагрузкой в ​​выделениях из носа и наблюдаемой серьезностью симптомов, оценка симптомов могла быть затруднена наличием вторичной легочной инфекции, вызванной другими патогенами крупного рогатого скота, такими как Mycoplasma bovis . У большинства животных с этим можно успешно справиться путем кондиционирования животных антибиотиками до их включения в исследования эффективности. Гистопатологическая оценка легочной ткани при вскрытии отражает оценки симптомов с признаками консолидации легких, вирус-индуцированной синцитии, бронхиолита и интерстициальной пневмонии у нелеченных животных, инфицированных bRSV (см. Таблицы S3 и S4 в дополнительном материале).

В целом, способность объективно количественно определять вирусную нагрузку, количество симптомов, респираторные параметры и патологию легких указывает на то, что инфицированные bRSV телята представляют собой надежную модель для проверки эффективности in vivo новых терапевтических средств RSV. Это контрастирует с другими моделями RSV, которые обычно используются для оценки методов лечения RSV, которые не моделируют адекватно патогенез инфекции.

Пригодность модели инфекции bRSV для оценки противовирусных препаратов была подтверждена с использованием GS1, нового низкомолекулярного ингибитора с сильной активностью in vitro против как bRSV, так и hRSV.GS1 является близким структурным аналогом GS-5806, который в настоящее время находится в стадии клинической разработки для лечения инфекции RSV (43). GS-5806 был протестирован на здоровых взрослых людях, экспериментально инфицированных клиническим штаммом RSV (20). Пероральное введение GS-5806 было начато после подтверждения инфекции RSV с помощью ПЦР-анализа образцов смыва из носа и продолжалось в течение 5 дней. Различные схемы лечения GS-5806, включая введение однократной дозы, снижали вирусную нагрузку в выделениях из носа, массу слизистой оболочки и показатели клинических симптомов.

В соответствии с фармакокинетическими параметрами, прогнозирующими противовирусную эффективность, введение GS1 один или два раза в день в течение 7 дней животным, инфицированным bRSV, снижало вирусную нагрузку и количество симптомов заболевания по сравнению с животными, получавшими плацебо. Кроме того, животные, получавшие GS1, показали улучшенную функцию дыхания, при этом частота дыхания приближалась к исходному уровню. В то время как лечение BID, начатое через 24 часа после прививки, оказало наиболее сильное влияние на вирусную нагрузку, количество симптомов и патологию легких, отсроченное введение QD, начатое через 72 часа после прививки, также показало доказательство противовирусной эффективности.Исследование легочной ткани при аутопсии продемонстрировало четкие различия в гистопатологии между животными, получавшими GS1 и плацебо, даже у животных, которые получали лекарственную терапию через 72 часа после инокуляции (см. Таблицу S4 в дополнительном материале). У животных, получавших лекарственные препараты, наблюдалась пониженная консолидация легких и минимальные признаки бронхиолита и пневмонии. Эти результаты показывают, что репликация вируса в дыхательных путях инфицированных телят вызывает болезнь и что ингибирование репликации вируса с помощью GS1 обеспечивает клиническую пользу.Важно отметить, что все режимы дозирования GS1 оказались безопасными и хорошо переносились лечившимися телятами голштинской породы.

Настоящая модель инфекции bRSV основана на аэрозольной доставке вируса через нос, которая обеспечивает инфицирование как верхних, так и нижних дыхательных путей у всех привитых животных. В то время как большинство инфекций RSV человека начинаются в верхних дыхательных путях и вызывают легкое заболевание с симптомами простуды, которые проходят без необходимости медицинского вмешательства, у некоторых лиц с высоким риском, включая относительно большую часть педиатрической популяции, инфекция будет распространяться. в нижние дыхательные пути.Инфекции нижних дыхательных путей обычно приводят к более тяжелому заболеванию и являются наиболее частой причиной бронхиолита и пневмонии, связанных с РСВ, которые часто требуют госпитализации. В соответствии с заболеванием человека, патология легких у телят, инфицированных bRSV, показала признаки бронхиолита и пневмонии, выраженные у животных, получавших плацебо, что указывает на то, что репликация bRSV в нижних дыхательных путях молодых телят вызывает серьезное респираторное заболевание.

Лечение инфекций верхних дыхательных путей противовирусными препаратами может предотвратить прогрессирование инфекции RSV в нижние дыхательные пути и потенциально снизить потребность в медицинском вмешательстве (15).Хотя текущая модель RSV крупного рогатого скота обеспечивает средства для количественной оценки конечных точек заболевания bRSV, она не моделирует кинетику прогрессирования инфекции верхних дыхательных путей в нижние, наблюдаемую у людей. Введение вируса интраназальной инокуляцией вместо доставки в виде аэрозоля могло бы обеспечить более естественный путь заражения, который мог бы отражать прогрессирование инфекции у людей, но потребовал бы существенной дополнительной оптимизации. Считается, что способ передачи естественной инфекции bRSV идентичен способу передачи у людей (44).Вирус в форме аэрозоля попадает в верхние дыхательные пути, и в результате инфекция вызывает симптомы со стороны верхних дыхательных путей, которые исчезают без медицинского вмешательства. Другие факторы, такие как экологический стресс или снижение защитных механизмов хозяина, которые ограничивают репликацию вируса в легких, увеличивают риск развития пневмонии и бронхиолита.

Одной из проблем нынешней модели является естественная изменчивость конечных точек, измеряемых в первую очередь из-за различий в допустимости экспериментальной инфекции RSV среди отдельных животных.В то время как в текущем исследовании наблюдались устойчивые тенденции в отношении противовирусной эффективности, небольшие размеры выборки и вариабельность конечных результатов снижали статистическую мощность некоторых измеренных терапевтических эффектов, наблюдаемых у обработанных животных. Хотя результат исследования можно улучшить, увеличив количество животных, включенных в исследование, это вызовет дополнительные технические проблемы, связанные с эффективным обращением с большим количеством крупных животных во время терапевтического исследования.

Дополнительной проблемой является вариабельная гомология bRSV и hRSV, требующая, чтобы соединения, разработанные для лечения hRSV, оценивались на противовирусную активность in vitro против bRSV для подтверждения перекрестной реактивности перед рассмотрением оценки in vivo на модели эффективности крупного рогатого скота. Обзор опубликованных противовирусных соединений RSV выявил несколько соединений, которые нацелены как на bRSV, так и на hRSV (см. Таблицу S5 в дополнительном материале). Было обнаружено, что ингибиторы полимеразы рибавирин и BI-D активны как против bRSV, так и против hRSV, в то время как ингибитор слияния TMC-353121, но не BMS-433771, был активен против обоих вирусов.Ингибитор нуклеокапсида RSV-604 и ингибитор полимеразы RSV YM-53403 были активны только против hRSV. Дифференциальные ответы на эти классы ингибиторов против RSV крупного рогатого скота подчеркивают необходимость оценки ингибиторов in vitro перед тестированием на модели RSV крупного рогатого скота.

Хотя GS1 обеспечивал измеримую противовирусную эффективность, приводящую к снижению вирусной нагрузки, появление устойчивых к соединениям вариантов не оценивалось. В этих исследованиях мы не выделяли репликационно-компетентный вирус из носовых выделений для измерения чувствительности вируса к GS1 после лечения.

В заключение, обработка GS1 телят голштинской породы, экспериментально инфицированных bRSV, обеспечила валидацию этой животной модели для оценки эффективности экспериментальных терапевтических средств для лечения инфекции RSV. Патофизиология заболевания в этой модели аналогична человеческой RSV-инфекции, а наличие количественных клинических конечных точек обеспечивает надежную систему для оценки эффективности терапевтических средств RSV. Лечение GS1, начатое через 3 дня после инокуляции, обеспечило измеримую противовирусную и клиническую эффективность, демонстрируя, что слияние RSV является эффективной мишенью для терапевтического противовирусного вмешательства.Эти данные согласуются с недавним исследованием, демонстрирующим клиническую эффективность GS-5806, ингибитора слияния RSV и близкого аналога GS1, у людей, экспериментально инфицированных RSV (20). Важно отметить, что, поскольку экспериментальная инфекция RSV у людей ограничивается в первую очередь верхними дыхательными путями, результаты тестирования GS1 на модели инфекции bRSV предполагают, что этот новый класс ингибиторов слияния RSV может эффективно подавлять инфекцию RSV как в верхних, так и нижних дыхательных путях. .Таким образом, результаты настоящих исследований показывают, что бычья RSV-инфекция у телят представляет собой подходящую модель на животных для оценки in vivo эффективности терапевтических средств RSV и должна способствовать продвижению доклинических испытаний и разработке новых вмешательств для лечения RSV. инфекционное заболевание.

Эпизоды респираторно-синцитиального вируса (RSV) группы A (a) и группы B (b) …

Контекст 1

… были проанализированы с использованием Stata версии 11.2 (StataCorp, США). Данные по инфекциям подвергались интервальной цензуре, и были оценены три возможных продолжительности выделения вируса, то есть минимальная, средняя и максимальная, как описано в дополнительном онлайн-материале и показано на рисунке S1. Эпизод RSV-инфекции определялся как период, в течение которого человек предоставил образцы, которые были положительными по результатам ПЦР для той же самой инфицированной группы RSV, с разделением любых двух положительных образцов не более 14 дней. Эпизоды, когда первая проба была положительной для обеих групп А и В RSV, считались одним эпизодом инфекции.Эпизоды, когда образцы не собирались в течение> 7 дней до или после эпизода инфекции, считались подвергнутыми цензуре слева или справа соответственно. Симптоматическая инфекция определялась как наличие одного или нескольких из следующих симптомов: кашель, выделения из носа / заложенность носа или затрудненное дыхание в любой момент во время эпизода инфекции. Коинфекция была назначена, когда в эпизоде ​​RSV любой образец был положительным по ПЦР на другой вирус, то есть коронавирус, риновирус или аденовирус. Также было определено наличие этих вирусов в образцах, отобранных за 14 дней до начала эпизодов RSV.Вспышка в домашнем хозяйстве была определена как период, в течение которого у членов одного домохозяйства произошло несколько отдельных эпизодов без интервала в 514 дней, в течение которого в домохозяйстве отсутствовал ПЦР-положительный образец. Доля членов домохозяйства, инфицированных во время вспышек домохозяйств, измеряла интенсивность …

Контекст 2

… всего было зарегистрировано 205 эпизодов инфекции, из которых 155 человек пережили один эпизод, 22 человека — два эпизода и два человека. переживает три эпизода (рис.1). Группа А RSV была связана с 88 эпизодами инфекции, группа B RSV — со 113, а семь эпизодов были сопутствующими инфекциями. Полностью наблюдались 177 (86,3%) эпизодов, в то время как 11 и 15 эпизодов инфекции подвергались цензуре слева и справа, соответственно, а два эпизода подвергались цензуре как слева, так и справа. Из 24 человек с двумя или более эпизодами (подозрение на повторные инфекции) 17 (70,8%) были инфицированы одной и той же группой RSV, и в остальном все, за исключением одной группы A, последовали за группой B. с RSV группа A и группа B составила 2 · 3 и 7 · 2 года соответственно.Продолжительность между эпизодами варьировала от 17 до 54 дней, в среднем 28 дней. Для 17 гомологичных инфекций секвенирование гена RSV G было успешным в 10 (59%) из 18 возможных пар образцов (у одного человека было три подозреваемых эпизода RSV). Нарушение последовательности было в основном в образцах со значением порога цикла ПЦР (C t)> 28 · 0, показателем низкой вирусной нагрузки. Только один из успешно секвенированных парных образцов показал нуклеотидные различия: 13 нуклеотидных различий, связанных с тремя несинонимичными изменениями и изменением положения стоп-кодона.Эпизоды у этого человека (идентификационный номер 1803 на рис. 2) произошли с разницей в 54 дня. Для оценки продолжительности выделения были рассмотрены все эпизоды …

Определение окна вакцинации против респираторно-синцитиального вируса (РСВ) с использованием данных о возрастной серологической распространенности для детей в Килифи, Кения

Аннотация

Фон

Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) — важная причина заболеваний нижних дыхательных путей в раннем возрасте и цель для вакцинопрофилактики.Данные о возрастной распространенности антител, специфичных к RSV, будут способствовать оптимизации доставки вакцины.

Методы

Заархивированные образцы плазмы были случайным образом отобраны в возрастных группах от 960 детей в возрасте до 145 месяцев, поступивших в педиатрические отделения больницы округа Килифи в период с 2007 по 2010 год. Образцы были протестированы на антитела к RSV с использованием неочищенного вирусного IgG ELISA. Распространенность серотипа (и 95% доверительный интервал) оценивалась как доля детей со специфическими антителами выше определенного порогового уровня.Вложенные каталитические модели использовались для изучения различных предположений о динамике антител и оценки скорости распада специфических материнских антител RSV и приобретения инфекции с возрастом, а также среднего возраста инфицирования.

Результаты

RSV составляла 100% в возрасте от 0 до <1 месяца, быстро снижаясь в течение первых 6 месяцев жизни с последующим увеличением во второй половине первого года жизни и в последующий период. Распространенность серотипа была самой низкой в ​​возрастном диапазоне 5–11 месяцев; все дети были серопозитивными в возрасте старше 3 лет.Модель, наилучшим образом подходящая к данным, дала оценки скорости инфицирования 0,78 на человека в год (95% ДИ 0,65–0,97) и 1,69 на человека в год (95% ДИ 1,27–2,04) для возрастов от 0 до <1 года и 1- <12 лет соответственно. Скорость потери материнских антител была оценена как 2,54 / год (95% ДИ 2,30–2,90), т.е. средняя продолжительность 4,7 месяца. Средний возраст первичной инфекции был оценен в 15 месяцев (95% ДИ 13–18).

Выводы

Скорость снижения распространенности материнских антител и последующее возрастное приобретение инфекции являются быстрыми, а средний возраст первичного инфицирования — ранним.Окно вакцинации узкое и предполагает оптимальное нацеливание вакцины на детей в возрасте 5 месяцев и старше для достижения высокой сероконверсии.

Образец цитирования: Ниро Дж. Ю, Комбе И. К., Санде С. Дж., Кипкуч Дж., Киюка П. К., Оньянго СО и др. (2017) Определение окна вакцинации против респираторно-синцитиального вируса (РСВ) с использованием данных о возрастной серораспространенности среди детей в Килифи, Кения. PLoS ONE 12 (5): e0177803. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177803

Редактор: Джон С.Трегонинг, Имперский колледж Лондона, ВЕЛИКОБРИТАНИЯ

Поступила: 30 января 2017 г .; Принято к печати: 3 мая 2017 г .; Опубликовано: 22 мая 2017 г.

Авторские права: © 2017 Nyiro et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Эта работа поддержана Wellcome Trust UK, номер гранта: [102975]; [084633] (https://wellcome.ac.uk/) в DJN. Спонсор не имел никакого отношения к дизайну исследования, сбору и анализу данных, принятию решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Острая респираторная инфекция (ОРИ) является ведущей причиной заболеваемости и смертности среди детей младше 5 лет во всем мире [1], а респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) является наиболее важным вирусным патогеном, ответственным за ежегодные эпидемии бронхиолита и пневмонии в эти маленькие дети [2–5].Глобальные оценки показывают, что RSV может вызывать около 0,3 миллиона случаев смерти детей младшего возраста в год, и 99% из них происходят в странах с низким уровнем дохода [1].

На сегодняшний день нет лицензированных вакцин для профилактики RSV-инфекции у младенцев и детей раннего возраста. Некоторые вакцины-кандидаты показали многообещающие результаты [6–8]. Совсем недавно было показано, что аттенуированная вакцина MEDI ΔM2-2, разработанная с использованием систем обратной генетики, сильно ограничена в репликации и более иммуногенна у детей с серонегативным РСВ, чем предыдущие ведущие живые аттенуированные вакцины-кандидаты против РСВ [9].В результате эти результаты свидетельствуют о доступности многообещающей вакцины-кандидата для детей младшего и младшего возраста в ближайшем будущем.

Основной целью вакцинации против RSV являются дети в возрасте до 6 месяцев; группа, очень восприимчивая к тяжелому заболеванию RSV [10]. Однако вакцинация этой возрастной группы осложняется, помимо прочего, наличием материнских антител [11]. Если предположить, что эффективность потенциальной вакцины значительно снижается, если ее вводить в присутствии материнских антител, отсюда следует, что возраст вакцинации следует отложить.Однако большинство первичных инфекций RSV передается в раннем возрасте [12], поэтому отсрочка вакцинации может привести к пропуску значительной части предотвратимых инфекций. Таким образом, период вакцинации или возраст должны быть установлены таким образом, чтобы иметь минимальное влияние материнских антител и чтобы большинство инфекций не произошло.

Анализ возрастного профиля серологической распространенности может дать информацию о возрастном распределении на момент приступа заболевания в данной популяции. Данные предыдущих серологических исследований RSV-специфических антител предполагают раннее приобретение RSV-специфических антител в возрасте после распада материнских антител [13, 14].Было обнаружено, что распространенность RSV быстро увеличивается с возрастом, достигающим более 90% к трем годам и достижением 100% серопозитивности к 5 годам при средней продолжительности материнского антитела, оцениваемой в 3,3 месяца [14]. Однако динамика антител к RSV может потенциально затруднить интерпретацию возрастного профиля серологической распространенности. Присутствие материнских антител в возрасте примерно до шести месяцев может препятствовать приобретению антител через инфекцию в первые несколько месяцев жизни [15, 16].Кроме того, исследования показали, что как нейтрализующие, так и общие антитела, специфичные к RSV, приобретенные во время первичной инфекции, со временем уменьшаются до уровней, существовавших до инфицирования: около одного года для общих антител и трех месяцев для функциональных антител [15, 17]. Прямой анализ профиля серологической распространенности без попытки моделирования динамики этих антител может привести к недооценке истинной скорости инфицирования и возраста первичного инфицирования.

Каталитические модели объясняют динамику антител как функцию возраста и используют стратифицированные по возрасту серологические данные для оценки силы инфекции.Простую каталитическую модель можно модифицировать, чтобы учесть различные структуры для неиммунизирующих инфекций [18] и различные формы функции силы инфекции [19–21]. Ранее каталитические модели использовались для оценки скорости распада материнских антител и скорости заражения восприимчивых людей на душу населения (сила инфекции) [19, 20, 22, 23]. Впоследствии можно установить средний возраст первичного заражения и «окно» вакцинации.

В этом исследовании мы представляем возрастную распространенность антител к RSV в сельской местности на побережье Кении.Затем мы разрабатываем три вложенные каталитические модели, которые исследуют различные предположения о динамике специфических антител к RSV. Образцы были отобраны случайным образом из педиатрических госпиталей в окружной больнице в прибрежной Кении и проверены на антитела к RSV с помощью ELISA. Данные этого исследования обеспечивают базовое понимание естественного ответа на инфекцию RSV и имеют отношение к оптимальному возрасту доставки вакцины RSV.

Материалы и методы

Место исследования и население

Мы использовали данные и архивные образцы плазмы детей в возрасте от 1 дня до 12 лет (т.е. <145 месяцев), которые были госпитализированы в педиатрические отделения больницы округа Килифи (KCH) в период с 2007 по 2010 год (включительно). Окружная больница, ранее известная как районная больница Килифи (KDH), расположена в сельской местности на побережье Кении. Кенийский институт медицинских исследований (KEMRI) -Wellcome Trust Research Program предоставляет клиническую помощь в педиатрических отделениях больниц и управляет Системой медицинского и демографического наблюдения Килифи (KHDSS), охватывающей территорию примерно в 900 км ² , которая находится в пределах 50 км к северу, 50 км к югу , и в 30 км к западу от больницы, и включает население (по данным переписи 2010 г.) примерно 260 000 [24, 25].Пациенты, поступающие в больницу, проходят стандартный медицинский осмотр, сдают кровь при поступлении и регистрируются в регистре населения KHDSS [24].

Участники исследования были отобраны случайным образом из регистра госпитализации Интегрированной системы управления данными Kilifi (KIDMS) независимо от диагноза и стратифицированы по возрасту на возрастные группы до 11 месяцев, затем 12- <15 мес., 15- <18 мес., 18- < 24 м, 24- <36 м, 36- <60 м, 60-84 м, 84- <108 м и 108 <145 м. Этих детей связывали с хранимыми образцами сыворотки, собранными при поступлении, которые извлекали, а аликвоту проверяли на наличие антител к RSV.Критериями включения было пребывание в KHDSS, госпитализация в KCH в период с 2007 по 2010 гг. И хранение пробы плазмы при поступлении. Все повторные госпитализации были исключены, то есть общее количество образцов в настоящем анализе в точности равно общему количеству участников исследования.

Для уменьшения систематической ошибки, связанной с сезонной передачей, и для обеспечения средней серологической распространенности при наличии сезонных и долгосрочных колебаний в передаче, выборка поперечного сечения охватывала период в четыре года.Каждый год был разделен на кварталы, каждый квартал содержал 60 выборок, так что в каждой из 20 возрастных групп было по 3 образца. Это дало в общей сложности 960 образцов за 4-летний период, по 240 образцов каждый год. Из 960 образцов в каждой из 20 возрастных групп было 48 образцов, 12 собираемых каждый год. Размер выборки был оценен стандартными методами, чтобы обеспечить оценку точности серотипа 50% в пределах +/- 14%.

Этическое разрешение

Все родители и опекуны дали письменное согласие на участие их детей в педиатрическом стационарном наблюдении в KCH и на хранение образцов крови для использования в будущих исследованиях.Комитет по этике KEMRI одобрил это исследование.

Лабораторные процедуры

Все пробы плазмы при поступлении были протестированы на концентрацию антител с помощью метода ELISA на основе IgG с использованием неочищенного вирусного экстракта из адаптированной в лаборатории культуры RSV A2 и специфических концентраций антител, записанных в виде логарифмических произвольных единиц, как определено с помощью процедуры местных стандартов. Оптимальные разведения для антигена RSV-A2 и сыворотки определяли титрованием в шахматном порядке. Приготовление неочищенного вирусного лизата RSV было таким, как описано ранее Ochola et al [16].Процедуру ELISA на RSV IgG выполняли, как описано ранее [16].

Образцы были проанализированы в двух экземплярах, чтобы учесть любые вариации в процессе анализа, например, вызванные ошибками пипетирования. В каждом планшете вместе с образцами запускали как высокий, так и низкий контроль. График был построен с течением времени для проверки как стандартов, так и антигена покрытия.

Объединенную стандартную сыворотку взрослых, серийно разведенную в 2-кратных разведениях от 1:50 до 1: 2800, обрабатывали в каждом планшете для построения стандартной кривой.Значениям OD стандартных разведений сывороток были присвоены значения произвольных единиц (AU). Стандартизованные произвольные единицы (и log ₁₀ преобразованных) RSV-специфического IgG для образцов оценивали путем интерполяции стандартной кривой, полученной из объединенной сыворотки взрослых (стандарт сыворотки), тестируемой в каждом прогоне ELISA.

Частотное распределение значений log ₁₀ AU для всех отобранных сывороток было выполнено для определения подходящей границы между серопозитивным и серонегативным статусом. Точка отсечения 1.5, как ранее было применено Ochola et al, [16], был использован в этом исследовании для определения серостатуса RSV, так как это пороговое значение также определяло положительные и отрицательные стороны в бимодальном распределении в этом исследовании, как показано на (Рис. 1).

Рис. 1. Графики титров антител к RSV.

Верхний ряд: точечные диаграммы уровня титра антител по возрастным группам. Нижний ряд: гистограммы титров антител по возрастным группам. Красные линии показывают пороговое значение 1,5, используемое для определения серопозитивности.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0177803.g001

Статистический анализ

Данные были проанализированы с использованием STATA версии 11 (StataCorp, College Station, Texas, USA). Пропорции выборок в каждом возрастном классе были получены с 95% доверительным интервалом.

Моделирование риска первичной инфекции RSV

Мы оценили связанный с титром риск первичной инфекции RSV и скорость потери материнских антител одновременно, используя вложенную каталитическую модель, построенную на основе простой модели.Вложенная модель позволяет исследовать различные предположения о динамике антител на уровне популяции. Мы предположили, что антитела были получены при передаче от матери или в результате инфицирования.

Каталитическая модель — это модель на уровне популяции; индивиды сгруппированы в разные состояния (отсеки) в зависимости от допущений в модели. Простая каталитическая модель имела два отсека: (i) долю восприимчивых и серонегативных в каждой возрастной группе, a , т.е. S (a) , и (ii) долю (когда-либо) инфицированных по возрасту, F ( а) .К «(когда-либо) инфицированным» относятся инфицированные и выздоровевшие. Оцениваемый параметр — это уровень инфицирования на душу населения в год (сила заражения), например если оценка дана как 0,5 на человека в год, это означает, что каждый испытывает инфекционное давление, эквивалентное 0,5 заражения в год (1 инфекция каждые 2 года). Чтобы учесть присутствие материнских антител, были введены отсек M (a) и параметр скорости распада материнских антител.В этом случае модель предполагала, что присутствие материнских антител является рефракционным по отношению к инфекции. Компартмент M (a) затем был разделен на 2, изменив распределение продолжительности материнских антител с экспоненциального на эрланговский с параметром формы, равным 2. Эта модификация означает, что более длительные материнские антитела имеют более высокие вероятности, чем более короткие. продолжительность.

Мы исследовали три основные формы структуры вложенной модели (рис.2), которые исследуют возможные эффекты временных антител RSV после первичной инфекции и, косвенно, возрастную заболеваемость на человека (т.е. возрастная сила инфекции), как описано:

Рис. 2. Структура вложенной модели для изучения данных о возрастной распространенности RSV с использованием моделей каталитической инфекции.

Компартменты в модели представляют следующие состояния популяции: M = лица с материнскими антителами (разделены на 2, M ₁ и M ₂ для улучшения соответствия), S ₀ = серонегативный после потеря материнских антител, F ₀ = постоянный серопозитивный статус после инфекции, F ₁ = временный серопозитивный статус после первичной инфекции, S ₁ = серонегативный после потери антител, приобретенных инфекцией.Когда p = 0, модель сводится к MSF, когда p = 1 и оценивается только 1 уровень заражения (λ ₀ = λ ₁ ), модель — MSFSF ₁ и с p = 1 и 2 оценками степени заражения (λ ₀ ≠ λ ₁ ) модель — MSFSF ₂ .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177803.g002

MSF.

В нулевом возрасте все люди серопозитивны в отношении приобретенных матерью антител к RSV, M-компартмент.Они теряют свой материнский серопозитивный статус с постоянной скоростью σ, попадая в восприимчивый компартмент S ₀ , в котором они заражаются с постоянной скоростью λ ₀ и попадают в класс (когда-либо) инфицированных F ₀ . В F ₀ у них возникают последующие инфекции с неизвестной частотой, пока они серопозитивны.

MSFSF

Это расширение модели MSF, где доля, p = 1, заразится со скоростью λ ₀ и попадет в отсек F ₁ , но впоследствии потеряет свой серопозитивный статус со скоростью δ и присоединится к S ₁ класс восприимчивых веществ.Из S ₁ они повторно заражаются со скоростью λ ₁ и переходят в класс F ₀ после повторного заражения и испытывают последующие инфекции, будучи серопозитивными.

MSFSF

Расширение MSFSF ₁ (λ ₀ = λ ₁ ) , но с первичной силой заражения λ ₀ не равно вторичная сила заражения λ ₁ .

Структура модели показана на (Рис. 2), а параметры описаны в Таблице 1. Представленная вложенная структура предполагает, что присутствие материнских антител влияет на инфекцию, что не обязательно так. Позже мы модифицируем это предположение, допуская инфекцию в M-компартментах. Также был изучен другой порог для серопозитивного статуса для детей в возрасте 6 месяцев и младше. Мы учли зависимость силы инфекции от возраста. В моделях MSF и MSFSF ₁ функция выбиралась ступенчато для возрастов 0–1 год и 1–12 лет.Обоснование шагов можно найти в S1 Text. Зависимость от возраста неявно присутствует в модели MSFSF ₂ . Кроме того, не учитывались процессы рождения и смерти.

Подбор параметров был выполнен с использованием оценки максимального правдоподобия (MLE) [24] в Matlab версии 7 (MathWorks, Массачусетс, США). ОДУ для модели были решены численно с использованием функции ode45 , которая основана на явной формуле Рунге-Кутта (4,5), пары Дорман-Принс. Оптимизация была выполнена с использованием функции fmincon , которая применяет нелинейную оптимизацию с ограничениями.Две модели во вложенной структуре имеют одинаковое количество оцениваемых параметров; Поскольку такое сравнение моделей было выполнено с использованием информационного критерия Акаике второго порядка (AIC _C ). Доверительные интервалы для параметров были установлены путем повторной подгонки модели к набору самонастраиваемых выборок данных. Повторная выборка была сделана 1000 раз, и 95% доверительный интервал был установлен с использованием 2,5 ^-го и 97,5 ^-го процентилей [25].

Используя оцененные параметры, мы вычислили средний возраст первичной инфекции A , используя формулу, где для 12 возрастных групп от 0 до 1 года и 8 возрастных групп от 1 до 12 лет и оптимального возраста для вакцинации Av , используя формулу модификации оригинала [26].Здесь мы определяем оптимальный возраст для вакцинации как возраст, при котором влияние материнских антител будет минимальным и большинство инфекций не произойдет, что определяется серопозитивным статусом.

Результаты

Описание участников исследования

Из регистрационного реестра было отобрано 960 детей, разделенных на 20 возрастных групп, по 48 детей в каждой группе. Четыреста одна женщина (41,8%) была женщиной. На основании первичного диагноза при выписке 298 (31.0%) поступили с инфекцией нижних дыхательных путей (ИДПТ), 181 (18,8%) с гастроэнтеритом, 174 (18,1%) с другими состояниями (проблемы с сердцем, лимфома Беркитта, эпилепсия, гидроцефалия), 145 (15,1%) с другими инфекционными заболеваниями , 57 (5,9%) малярия, 39 (4,1%) недоедание, 37 (3,9%) врожденные заболевания, 17 (1,7%) анемия, а у 12 (1,2%) диагноз не был установлен. Из тех, кому был поставлен диагноз ИНДП, у 16% (5% участников исследования) была подтвержденная антигеном инфекция RSV [27, 28].

Возрастная серологическая распространенность антител к RSV

Общая серологическая распространенность составила 65.7% (95% ДИ: 62,7–68,7). У всех детей младше 1 месяца серологическая распространенность была 100%. Распространенность серотипа снизилась с 91,7% через 1 месяц до минимума 25% через 6 месяцев. После этого наблюдался медленный рост от 6 месяцев до 9 месяцев, а затем быстрое изменение серологической распространенности с 41,7% (от 11 до <12 месяцев), 52,1% (от 12 до <15 месяцев), 56,3% (от 15 до <18 месяцев), 83,3% (от 18 до <24 месяцев), 93,8% (от 24 до <36 месяцев) и 100% (от 36 до <60 месяцев). Все дети старше 3 лет были серопозитивными. Доля серопозитивных в возрастной группе показана в таблице 2.

Оценки заболеваемости первичной инфекцией RSV, средний возраст инфицирования и оптимальный возраст для вакцинации

Мы исследовали различные допущения в трех вложенных каталитических моделях и сравнили соответствие данным; подробные результаты показаны в таблице S1 в тексте S1. Подробности процесса выбора модели описаны в S1 Text. Короче говоря, данные подтверждают использование двух классов M, а не одного, и ступенчатую функцию силы заражения, а не константу. Из трех вложенных моделей простейшая модель (MSF) наилучшим образом соответствует данным с наименьшим отрицательным логарифмическим правдоподобием и значениями AIC _C .Результаты показаны в Таблице 3 и (Рис. 3).

Модель MSF дала скорость потери материнских антител 2,54 / год (95% ДИ 2,30–2,90) и силу инфицирования 0,78 / человека в год (95% ДИ 0,65–0,97) для детей в возрасте от 0 до 1 года и 1,69 на человека в год (95% ДИ 1,27–2,04) в возрасте от 1 до 12 лет. (Рис. 4) показывает соответствие для MSF и 95% доверительный интервал, установленный в результате переоснащения модели с использованием данных начальной загрузки. Исходя из этих результатов, средняя продолжительность материнских антител ( D _M ) составляет 4.72 (95% ДИ: 4,14–5,22) месяца, рассчитанных как обратная скорость разложения. Средний возраст первичной инфекции ( A) составляет 15,1 (95% ДИ 12,7–18,5) месяцев, тогда как средний оптимальный возраст для вакцинации составляет 6,8 месяцев (95% ДИ 6,2–7,5). Модельные прогнозы пропорции серопозитивных и силы инфекции, действующей на людей разного возраста, показаны на (Рис. 5).

Рис. 4. Результаты подбора модели MSF и доверительной области.

Основная: Из трех моделей во вложенной структуре модели, модель MSF дала наилучшее соответствие данным и показана синей линией.Параметры были переоценены для получения совпадений, которые дали 95% доверительную область методом начальной загрузки, серые линии. Красные кружки показывают долю серопозитивных по возрастным группам согласно данным. Врезка: увеличение для возрастного диапазона 0–3 года.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177803.g004

Рис. 5. Модель MSF, предсказывающая пропорции серопозитивных и силу инфекции, действующие на людей разного возраста.

Темно-синие столбцы показывают долю в разных возрастных группах, у которых есть материнские антитела, а розовые столбцы показывают долю инфицированных и, следовательно, имеющих антитела, приобретенные инфекцией, согласно прогнозам модели MSF.Пунктирная синяя линия показывает ступенчатую силу функции заражения.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177803.g005

Образцы, включенные в этот анализ, были взяты у госпитализированных детей с разными диагнозами при выписке. В их число были включены дети с диагнозом НИОТ, часть которых была положительной по антигену РСВ. Чтобы проверить, привело ли включение этих образцов к какому-либо смещению, модель MSF со ступенчатой ​​силой заражения была изменена на 2 подмножества данных; исключая LRTI и положительные по антигену RSV.Оценки параметров, полученные в результате этих аппроксимаций, не отличались от оценок, полученных с использованием всех данных. Это показано на фиг. S2 в тексте S1.

Структура модели была изменена, чтобы ослабить предположение о том, что присутствие материнских антител влияет на инфекцию. Сила инфекции, действующей на детей до потери материнских антител, была оценена как 0,0 на человека в год, что указывает на то, что данные не подтверждают этот процесс инфекции (результаты не показаны). Пороговое значение для серопозитивности в возрасте 0–6 месяцев варьировалось, чтобы попытаться учесть различия между антителами, приобретенными у матери и антителами, приобретенными в результате инфекции.Мы исследовали диапазон отсечки от 1,5 до 2 с шагом 0,25. Увеличение порогового значения привело к увеличению скорости потери материнских антител и снижению силы инфекции. Оценка рекомендуемого оптимального возраста вакцинации, однако, сохранила относительно узкий интервал в 4,7–7,1 месяца с различными пороговыми значениями, что дает (таблица S2 в тексте S1).

Обсуждение

Вмешательство вакцины, вероятно, будет ключевым в борьбе с тяжелым заболеванием, связанным с инфекцией RSV.До внедрения вакцины важной исходной информацией будут эпидемиологические параметры, такие как сила заражения и средний возраст первичного инфицирования. Анализ возрастных данных о серологической распространенности может дать информацию о силе инфекции в данной популяции при отсутствии вакцинации. В этом исследовании мы представляем профиль распада материнских антител и последующее приобретение антител к RSV в зависимости от возраста среди детей в Килифи, а также оцениваем силу инфекции, средний возраст первичного инфицирования и оптимальный возраст для доставки вакцины RSV.

Использование случайно выбранных образцов плазмы стационарных пациентов детей в возрасте от 0 до 12 лет не внесло систематической ошибки в оценку серологической распространенности в этом исследовании, как можно было бы предположить. Исключение всех участников с LRTI или RSV-положительным антигеном, подтвержденным IFAT / молекулярным методом, не привело к значительным изменениям в профилях серологической распространенности. Интересно, что анализ данных о диагнозе при выписке показал, что 31% госпитализаций, выбранных для этого исследования, были вызваны ИДП, а 16% госпитализаций с ИНДП были вызваны РСВ.Это ясно показывает, что RSV является основной причиной заболеваний нижних дыхательных путей у детей в данной ситуации, что согласуется с предыдущими выводами [10, 27].

Серологическая распространенность RSV варьировала с возрастом и показала 100% -ную серопозитивность в образцах, взятых у детей первого месяца жизни, т.е. <1 месяца. Этот процент снизился до 25% в возрастной группе 6–7 месяцев, затем снова повысился до 100% в возрастной группе 3 года и оставался таковым вплоть до 12 лет. Хотя данные не распространяются на взрослых, этот профиль качественно аналогичен тому, что можно было бы наблюдать при иммунизации инфекций, таких как корь [29].В серологическом исследовании RSV, проведенном Cox et al [14] в Бразилии, был получен аналогичный профиль с набором данных, который распространился на возрастную группу 31–40 лет. Быстрый рост процента серопозитивных, наблюдаемый в наших данных, указывает на высокий уровень инфицирования среди нынешнего населения. Высокие показатели инфицирования, связанные с частыми повторными инфекциями, также наблюдались в других исследованиях [30–32], что означает, что результаты нашего анализа могут быть обобщены для других условий.

Интерпретация данных о возрастной распространенности RSV может быть затруднена по нескольким причинам.Уменьшение количества антител после первичной инфекции может означать изменение серологического статуса. Также может быть возрастная зависимость скорости заражения. Мы исследовали множество каталитических моделей, основанных на различных предположениях о свойствах антител, специфичных к RSV. Включение зависящей от возраста силы инфекции обеспечило лучшее соответствие данным с допущением или без допущения реверсии серологического статуса после первичной инфекции. Интерпретация этого результата заключается в том, что, хотя наблюдается уменьшение количества антител после первичной инфекции, скорость повторного заражения настолько высока, что данные не могут отличить модель с процессом или без него.Если, однако, вакцинация должна была снизить скорость передачи вируса, то влияние на профиль возрастной распространенности могло бы быть более выраженным и повлиять на интерпретацию таких данных.

Простейшая модель (MSF) дала оценку средней продолжительности материнских антител (D _M ) в 4,7 месяца, а средний возраст первичной инфекции (A) — в 15,1 месяца. Они не сильно отличались от D _M = 4,42 месяца и A = 14,2 месяца, полученных из модели, которая допускает уменьшение антител после первичной инфекции (модель MSFSF ₁ ).Для сравнения, сероэпидемиологическое исследование, проведенное Cox et al [14] по данным RSV из Бразилии, оценило продолжительность материнских антител в 3,3 месяца. Эта оценка была получена путем аппроксимации данных экспоненциальной функцией. Ochola et al [16] получили оценки продолжительности материнских антител в 3,7 месяца (112 дней), используя данные когорты новорожденных и методы ELISA, аналогичные настоящему исследованию. Kinyanjui et al [33] оценили продолжительность защиты материнскими антителами в диапазоне 2–4,5 месяца, используя данные госпитализаций и детерминированную модель RSV с возрастной структурой.

Amaku et al [20] сопоставили каталитическую модель с зависимой от возраста функцией силы инфекции и серологическими данными из Бразилии, те же данные использовались Cox et al [14]. По оценкам анализа, средний возраст инфицирования составлял 19,08 месяцев (95% ДИ 16,68–21,48), а сила инфекционной функции достигла пика примерно 0,9 на человека в год в возрастной группе 2 года. Окно вакцинации (определяемое как период между средней продолжительностью действия материнских антител и средним возрастом первого инфицирования), предложенное Бразильскими результатами Cox et al и Amaku et al [14, 20] 3.3–19,1 месяца, шире, чем предполагаемый по нашим результатам 4,7–15,1 месяца, хотя и примерно аналогичен. Как показал анализ возрастно-серологических данных по кори, окно вакцинации может варьироваться в зависимости от места проживания даже в пределах одного и того же уровня дохода [34]. Маклин и Андерсон [34] установили окно вакцинации против кори продолжительностью 3–13 месяцев для Сенегала (данные за 1957 г.) и окно в 6–38 месяцев для Таиланда (данные за 1967 г.).

Оценка силы инфекции, действующей на детей, у которых все еще есть материнские антитела, в 0,0 на человека в год, согласуется с исследованиями, которые показывают, что реакция младенца на IgG после первичной инфекции очень низкая [15, 16, 32], и Фактически, Ochola et al [16] показали, что изначальная скорость распада материнских антител не отличалась от скорости распада, включая младенцев, перенесших RSV-инфекцию.Оценка параметров нашей модели при исключении положительного образца LRTI и положительного образца RSV дала исходные материнские скорости распада антител 2,56 / год и 2,45 / год, не сильно отличаясь от 2,54 / год, полученных с полным набором данных. Варьирование порогового значения серопозитивности для возрастной группы 0–6 месяцев привело к продолжительности действия материнских антител, аналогичной другим исследованиям, но не привело к радикальному изменению рекомендуемого оптимального возраста вакцинации.

Оптимальное время для вакцинации детей для предотвращения инфекции — это возраст после потери материнскими антителами (которые могут помешать вакцине) и до их первой инфекции.Доля положительных на антитела к RSV начинает расти вскоре после 6 месяцев из-за инфекции как таковой; отсрочка вакцинации может привести к упущению значительного количества предотвратимых инфекций / заболеваний. Анализ профиля возрастной серологической распространенности позволяет предположить, что вакцинацию следует проводить примерно в 6 месяцев, когда серопозитивность находится на самом низком уровне. Однако при использовании более формального подхода результаты каталитических моделей предполагают период от 5 до 15 месяцев. Учитывая, что сила инфекции, оцененная для возраста 1–12 лет, вдвое больше, чем для возраста 0–1 года, что подразумевает больший риск заражения через 12 месяцев, можно предположить, что вакцинация должна проводиться между 5 и 12 месяцами.Окно вакцинации, установленное нашим анализом, перекрывается с окном вакцинации от 5 до 10 месяцев, полученным Kinyanjui et al. С использованием структурированной по возрасту детерминированной компартментальной модели RSV и данных из того же места, что и наше исследование [33]. Преимущество отсрочки вакцинации, предложенной моделью Kinyanjui et al [33], объясняется отсрочкой, позволяющей уменьшить количество материнских антител, но все еще достаточно ранней, чтобы предшествовать высокой интенсивности инфекции на втором году жизни. Кроме того, эффект снижения передачи инфекции в сообществе, возникающий в результате более поздней вакцинации младенцев (коллективный иммунитет), обеспечит косвенную защиту от инфекции у детей, слишком маленьких для вакцинации.Модель Kinyanjui et al. Кардинально отличается от модели, использованной в текущем анализе, однако обнадеживает тот факт, что рекомендуемое окно вакцинации устойчиво к различным подходам к моделированию и типам данных.

Каталитическая модель, использованная в текущем анализе, относительно проста. В структуру можно вносить изменения, чтобы учесть различную динамику антител. Однако мы обнаружили, что не было никакой дополнительной пользы от включения потери антител после первичной инфекции или допущения инфекции, когда она была серопозитивной по материнским антителам.Динамика антител, такая как ослабление, которая наблюдалась на индивидуальном уровне, не подтверждалась моделью и данными, использованными в этом анализе. Для лучшего понимания этого может быть более подходящим анализ, аналогичный тому, который был проведен Kucharski et al [35], где выходными данными модели являются титры индивидуального уровня. Настоящий анализ дополняет растущий объем данных о динамике инфицирования RSV и рекомендации по стратегиям борьбы. Младенческую вакцинацию следует делать детям в возрасте от 5 до 12 месяцев.В зависимости от продолжительности предоставляемой защиты может потребоваться оптимизация вакцинации по времени года относительно сроков эпидемии RSV. Анализ, аналогичный нынешнему, проведенный после того, как программа вакцинации вступила в силу, может помочь в количественной оценке эффективности; ожидается, что сила заражения и средний возраст первичного инфицирования уменьшатся.

Благодарности

Эта статья опубликована с разрешения директора КЭМРИ. Мы благодарим всех добровольцев исследования за предоставленные образцы исследования.Мы благодарим полевых и лабораторных сотрудников исследовательской программы KEMRI Wellcome Trust за сбор и хранение образцов. Мы также признательны Г.Ф. Medley за его комментарии к более ранним версиям рукописи.

Вклад авторов

1. Концептуализация: DJN JUN.
2. Обработка данных: JUN PKM.
3. Формальный анализ: IKK JUN TMK.
4. Получение финансирования: DJN.
5. Расследование: JUN JK PKK COO CJS.
6. Методология: JUN IKK DJN.
7. Администрация проекта: ИЮН.
8. Ресурсы: DJN.
9. Программное обеспечение: IKK.
10. Кураторство: DJN.
11. Проверка: TMK DJN.
12. Визуализация: JUN IKK.
13. Написание — черновик: JUN IKK.
14. Написание — просмотр и редактирование: CJS PKM TMK DJN COO.

Список литературы

1. 1.Наир Х., Симоэс Э.А., Рудан И., Гесснер Б.Д., Аззиз-Баумгартнер Э., Чжан Дж.С. и др. Глобальное и региональное бремя госпитализаций по поводу тяжелых острых инфекций нижних дыхательных путей у детей раннего возраста в 2010 г .: систематический анализ. Ланцет. 2013; 381 (9875): 1380–90. pmid: 23369797
2. 2. Ли М.С., Уокер Р.Э., Мендельман П.М. Медицинское бремя респираторно-синцитиального вируса и инфекции вируса парагриппа 3 типа среди детей в США. Значение для дизайна испытаний вакцин. Hum Vaccin.2005; 1 (1): 6–11. pmid: 17038832
3. 3. Куни МК, Фокс JP, Холл CE. Сиэтлский вирусный дозор. VI. Наблюдения за инфекциями и заболеваниями, вызванными парагриппом, эпидемическим паротитом, респираторно-синцитиальными вирусами и Mycoplasma pneumoniae. Am J Epidemiol. 1975; 101 (6): 532–51. pmid: 168766
4. 4. Нойола Д.Е., Артеага-Домингес Г. Вклад респираторно-синцитиального вируса, вирусов гриппа и парагриппа в развитие острых респираторных инфекций в Сан-Луис-Потоси, Мексика.Pediatr Infect Dis J. 2005; 24 (12): 1049–52. pmid: 16371864
5. 5. Чанок Р., Шамбон Л., Чанг В., Гонсалвес Феррейра Ф., Гарпуре П., Грант Л. и др. Обследование ВОЗ респираторных заболеваний у детей: серологическое исследование. Bull World Health Organ. 1967; 37 (3): 363–9. pmid: 5301380
6. 6. Райт П.Ф., Каррон Р.А., Белше Р.Б., Ши Дж.Р., Рэндольф В.Б., Коллинз П.Л. и др. Отсутствие усиленного заболевания респираторно-синцитиальным вирусом дикого типа после получения живых ослабленных респираторно-синцитиальных вирусных вакцин.Вакцина. 2007; 25 (42): 7372–8. pmid: 17868959
7. 7. Райт П.Ф., Каррон Р.А., Белше Р.Б., Томпсон Дж., Кроу Дж. Э. мл., Бойс Т.Г. и др. Оценка живого, холодного пассирования, чувствительного к температуре, респираторно-синцитиального вируса-кандидата в младенчестве. J Infect Dis. 2000; 182 (5): 1331–42. pmid: 11010838
8. 8. Каррон Р.А., Райт П.Ф., Белше Р.Б., Тумар Б., Кейси Р., Ньюман Ф. и др. Идентификация рекомбинантного живого аттенуированного респираторно-синцитиального вируса-кандидата на вакцину, который сильно аттенуирован у младенцев.J Infect Dis. 2005; 191 (7): 1093–104. pmid: 15747245
9. 9. Каррон Р.А., Луонго С., Тумар Б., Лоер К.М., Энглунд Дж. А., Коллинз П. Л. и др. Делеция гена, которая активирует экспрессию вирусного гена, дает аттенуированную вакцину против RSV с улучшенными ответами антител у детей. Sci Transl Med. 2015; 7 (312): 312ra175. pmid: 26537255
10. 10. Nokes DJ, Ngama MJ, Bett A, Abwao J, Munywoki P, English M и др. Заболеваемость и тяжесть респираторно-синцитиальной вирусной пневмонии у сельских кенийских детей выявлены в ходе стационарного наблюдения.Клинические инфекционные болезни. 2009; 49 (9): 1341–1349. pmid: 19788358
11. 11. Зигрист CA, Ламберт PH. Материнский иммунитет и реакция младенца на иммунизацию: факторы, влияющие на реакцию младенца. Dev Biol Stand. 1998; 95 (133–9. Pmid: 9855423
12. 12. Faneye A, Motayo BO, Adesanmi A, Onoja B. Оценка антител IgG против респираторно-синцитиального вируса (RSV) и связанных факторов риска тяжелых инфекций дыхательных путей у детей дошкольного возраста в Северо-Центральном регионе Нигерии.Afr J Infect Dis. 2014; 8 (2): 36–9. pmid: 25729535
13. 13. Брюссоу Х., Верчау Х., Сидоти Дж., Балло С., Рахим Х., Диррен Х. и др. Возрастная распространенность сывороточных антител к респираторно-синцитиальному вирусу у детей Эквадора и Германии. J Infect Dis. 1991; 163 (3): 679–80.
14. 14. Кокс MJ, Азеведо RS, Cane PA, Massad E, Medley GF. Сероэпидемиологическое исследование респираторно-синцитиального вируса в штате Сан-Паулу, Бразилия. J Med Virol. 1998; 55 (3): 234–9. pmid: 9624612
15. 15.Welliver RC, Kaul TN, Putnam T.I, Sun M, Riddlesberger K, Ogra PL. Антительный ответ на первичную и вторичную инфекцию респираторно-синцитиальным вирусом: кинетика классоспецифичных ответов. J Pediatr. 1980; 96 (5): 808–13. pmid: 7365579
16. 16. Очола Р., Санде С., Феган Г., Скотт П.Д., Медли Г.Ф., Кейн П.А. и др. Уровень и продолжительность RSV-специфических материнских IgG у младенцев в Килифи, Кения. PLoS One. 2009; 4 (12): e8088. pmid: 19956576
17. 17. Sande CJ, Mutunga MN, Okiro EA, Medley GF, Cane PA, Nokes DJ.Кинетика нейтрализующего ответа антител на респираторно-синцитиальные вирусные инфекции в когорте новорожденных. J Med Virol. 2013; 85 (11): 2020–5. pmid: 23983183
18. 18. Винницкий Э., Белый Р., Введение в моделирование инфекционных заболеваний. 2010: ОУП Оксфорд.
19. 19. Гренфелл Б.Т., Андерсон Р.М. Оценка возрастных показателей инфицирования на основании сообщений о случаях заболевания и серологических данных. Журнал гигиены. 1985; 95 (419–436. Pmid: 4067297
20. 20. Амаку М., Азеведо Р.С., Кастро Р.М., Массад Э., Коутиньо Ф.А.Связь между эпидемиологическими параметрами шести детских инфекций в неиммунизированном бразильском сообществе. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2009; 104 (6): 897–900. pmid: 19876563
21. 21. Моссонг Дж., Путц Л., Шнайдер Ф. Распространенность и сила заражения вирусом ветряной оспы в Люксембурге. Epidemiol Infect. 2004; 132 (6): 1121–7. pmid: 15635970
22. 22. Гриффитс Д.А. Каталитическая модель заражения корью. Прикладная статистика. 1974; 23 (3): 330–339.
23. 23.Фаррингтон CP. Моделирование сил заражения корью, эпидемическим паротитом и краснухой. Статистика в медицине. 1990; 9 (953–967. Pmid: 2218197
24. 24. Уильямс Б.Г., Дай С. Максимальная вероятность для паразитологов. Паразитология сегодня. 1994; 10 (2): 489–493.
25. 25. Зубир А.М., Боашаш Б. Бутстрап и его применение в обработке сигналов. Журнал обработки сигналов, IEEE. 1998; 15 (1): 56–76.
26. 26. Кацманн В., Дитц К. Оценка возрастных стратегий вакцинации.Теоретическая популяционная биология. 1984; 25 (2): 125–137. pmid: 6729750
27. 27. Беркли Дж. А., Мунивоки П., Нгама М., Казунгу С., Абвао Дж., Бетт А. и др. Вирусная этиология тяжелой пневмонии у младенцев и детей в Кении. ДЖАМА. 2010; 303 (20): 2051–7. pmid: 20501927
28. 28. Nokes DJ, Ngama M, Bett A, Abwao J, Munywoki P, English M и др. Заболеваемость и тяжесть респираторно-синцитиальной вирусной пневмонии у сельских кенийских детей выявлены в ходе стационарного наблюдения.Clin Infect Dis. 2009; 49 (9): 1341–9. pmid: 19788358
29. 29. Уильямс Б.Г., Каттс Ф.Т., Дай С. Политика вакцинации против кори. Эпидемиология и инфекция. 1995; 115 (603–621. Pmid: 8557092
30. 30. Ohuma EO, Okiro EA, Ochola R, Sande CJ, Cane PA, Medley GF и др. Естественная история респираторно-синцитиального вируса в когорте новорожденных: влияние возраста и перенесенной инфекции на повторное инфицирование и болезнь. Am J Epidemiol. 2012; 176 (9): 794–802. pmid: 23059788
31. 31.Холл C, Гейман Дж., Биггар Р., Коток Д., Хоган П., Дуглас Р. Дж.. Инфекции респираторно-синцитиальным вирусом внутри семьи. Медицинский журнал Новой Англии. 1976; 294 (414–419. Pmid: 173995
32. 32. Куцая А., Терос-Яаккола Т., Каккола Л., Тойвонен Л., Пелтола В., Варис М. и др. Проспективное клиническое и серологическое наблюдение в раннем детстве выявило высокий уровень субклинической инфекции RSV и относительно высокий уровень повторного инфицирования в течение первых 3 лет жизни. Epidemiol Infect.2016; 144 (8): 1622–33. pmid: 26732801
33. 33. Kinyanjui TM, House TA, Kiti MC, Cane PA, Nokes DJ, Medley GF. Индуцированный вакциной коллективный иммунитет для контроля респираторно-синцитиального вирусного заболевания в странах с низким уровнем доходов. PLoS One. 2015; 10 (9): e0138018. pmid: 263
35. 34. Маклин А.Р., Андерсон Р.М. Корь в развивающихся странах. Часть I Эпидемиологические параметры и закономерности. Эпидемиология и инфекция. 1988; 100 (111–133. Pmid: 3338500
36. 35.Кухарски А.Дж., Лесслер Дж., Рид Дж.М., Чжу Х., Цзян К.К., Гуань Ю. и др. Оценка продолжительности жизни антител к гриппу A (h4N2) на основе поперечных данных. PLoS Biol. 2015; 13 (3): e1002082. pmid: 25734701

границ | Ответы антигенных сайт-специфичных конкурентных антител на слитный белок респираторно-синцитиального вируса были связаны с вирусным клиренсом при трансплантации гемопоэтических клеток Взрослые

Введение

Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) представляет собой одноцепочечный РНК-вирус отрицательного смысла из семейства Pneumoviridae .RSV передается через фомиты и крупнокапельные аэрозоли. РСВ, традиционно считающийся наиболее частым респираторным патогеном у детей младше 5 лет, недавно был обнаружен как наиболее распространенный среди лиц с ослабленным иммунитетом (1, 2). RSV также является ведущей причиной тяжелых респираторных инфекций у детей и взрослых с ослабленной иммунной системой, при этом уровень смертности достигает 80% (3). Реципиенты трансплантации гемопоэтических клеток (HCT) очень уязвимы к тяжелым последствиям инфекции RSV с самым высоким риском смерти в течение 100 дней после трансплантации (4).Лицензированная вакцина против RSV еще не доступна из-за проблем со стабильностью, чистотой, воспроизводимостью, переносимостью и эффективностью вакцин-кандидатов (5–8). Более того, пациенты с ослабленным иммунитетом могут не реагировать адекватно на вакцинацию из-за их относительного иммунологического подавления. Текущие стратегии лечения, продемонстрировавшие свою эффективность у пациентов с ослабленным иммунитетом, включают противовирусную терапию, такую ​​как рибавирин, паливизумаб, и иммуномодуляцию с общим ВВИГ (9–11).

RSV (F) представляет собой белок класса I, который опосредует проникновение вируса в клетки-хозяева путем трансформации из метастабильной тримерной конформации до слияния (пре-F) в высокостабильную конформацию после слияния (пост-F).Антигенная топология RSV F существенно изменяется во время этого перехода. Молекулы, которые предотвращают эти структурные изменения, могут предотвратить слияние вирусов и иметь потенциал в качестве терапевтических средств для лечения инфекции RSV. Некоторые группы эпитопов, называемые антигенными сайтами, обычно консервативны как в пре-F, так и в пост-F конформации, тогда как другие обнаруживаются либо в пре-F, либо в пост-F конформации (12). Описано шесть антигенных сайтов белка F: Ø-V. Антигенный сайт Ø («ноль») присутствует на вершине тримера pre-F.Пре-F-специфические антитела (MEDI8897 и D25) распознают антигенный сайт Ø (13). Антигенный сайт I находится в конформации post-F. mAb 131-2A связывается с антигенным сайтом I после подтверждения после F (14, 15). Антигенные сайты II и IV обнаруживаются как в пре-F, так и в пост-F конформации. Паливизумаб (Synagis) — первое охарактеризованное моноклональное антитело (mAb) и в настоящее время единственное mAb, лицензированное для предотвращения тяжелой инфекции RSV у младенцев из группы высокого риска. Он распознает антигенный сайт II. mAb 101F распознает антигенный сайт IV.Хотя элементы вторичной структуры, которые образуют сайт III, присутствуют как в пре-F, так и в пост-F, они принимают различное пространственное расположение в пост-F, что приводит к более высокому сродству связывания с пре-F (16). Было показано, что сильно нейтрализующее mAb MPE8 распознает антигенный сайт III (16). Антигенный сайт V находится в пре-F конформации и расположен между сайтами Ø и III. mAb AM14 нацелено на антигенный сайт V и является сильно нейтрализующим mAb (17, 18).

RSV — это, прежде всего, ограниченный слизистой оболочкой вирус, вызывающий повреждение верхних и нижних дыхательных путей во время его многократных циклов репликации.Он может вызывать клеточные и гуморальные иммунные ответы на различных уровнях у реципиентов HCT, в зависимости от степени, в которой люди остаются с ослабленным иммунитетом после трансплантации. RSV-специфические нейтрализующие антитела играют важную роль в предотвращении тяжелой инфекции, в то время как клеточные иммунные ответы, как полагают, играют важную роль в разрушении инфицированных RSV клеток и, таким образом, излечении инфекции. Ранее не получавшие RSV, но иммунокомпетентные младенцы могут выделять RSV из верхних дыхательных путей (URT) в течение до 21 дня; Напротив, дети с ослабленным иммунитетом могут выделять RSV в течение нескольких месяцев (19, 20).В мышиной модели RSV-инфекции CD8 + T-клетки способны устранять RSV-инфекцию (14, 21–23). Ограниченные данные исследований младенцев с первичной инфекцией RSV предполагают, что клеточный иммунный ответ со специфическими цитотоксическими Т-лимфоцитами запускается в течение 10 дней после инфицирования (24, 25). Сообщалось об исследованиях гуморальных иммунных ответов после первичной инфекции RSV у детей и повторной инфекции у детей и взрослых (26–28). Хотя введение внутривенного иммуноглобулина (ВВИГ) с высокой активностью нейтрализующих антител против РСВ и паливизумаба обеспечивает защиту от тяжелой инфекции РСВ у младенцев из группы высокого риска, роль нейтрализующих антител в выздоровлении от установленной инфекции не ясна.Ранее мы продемонстрировали, что значительно более высокие уровни гуморальных антител, конкурирующих с паливизумабом, и титры нейтрализующих антител связаны с более быстрым клиренсом RSV у реципиентов HCT. Эта когорта из сорока взрослых HCT, инфицированных RSV, дала нам возможность дополнительно изучить уровни конкурентных антител, специфичных к эпитопу RSV, и определить дополнительные иммунные корреляты вирусного клиренса. Были разработаны и стандартизированы еще три анализа конкурентных антител, специфичных к эпитопу RSV, для обнаружения конкурентных антител к антигенным сайтам Ø, I и IV.Кроме того, понимание взаимосвязи между нейтрализующими антителами и эпитопной специфичностью конкурентных антител, вызванных в ответ на естественную инфекцию RSV, будет иметь решающее значение при выборе и разработке новых моноклональных антител и вакцин для предотвращения RSV.

Методы

Объекты исследования

реципиентов HCT с лабораторно подтвержденной инфекцией верхних дыхательных путей RSV при включении и отрицательными результатами рентгенографии грудной клетки были зарегистрированы в течение 72 часов после диагностики RSV и стратифицированы по уровню риска прогрессирования в нижние дыхательные пути, как описано ранее (29).С января 2012 г. по апрель 2015 г. у всех пациентов собирали сыворотку при включении (острый) и через 14–60 дней после госпитализации (в выздоравливающем) для оценки гуморального иммунного ответа. Образцы смыва из носа были собраны при регистрации на 7-й день (± 1), 14-й день (± 1) и между 21-м и 28-м днем ​​(± 1) для обнаружения вирусов в подтипах RSV / A и RSV / B с помощью реальных время, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТПЦ-ПЦР). При зачислении было проведено интервью для получения исторической информации, а медицинские записи были просмотрены для извлечения демографических и клинических данных.Институциональные наблюдательные советы онкологического центра им. М. Д. Андерсона и Медицинского колледжа Бейлора Техасского университета одобрили протокол исследования, и все участники получили письменное информированное согласие.

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в реальном времени (rtRT-PCR)

Экстракция вирусной РНК и обнаружение RSV / A и RSV / B в образцах смыва из носа с помощью rtRT-PCR в сертифицированной CLIA лаборатории диагностики респираторных вирусов (CLIA ID # 45D0

6) выполняли, как описано ранее (30).

Анализы конкурентных антител на антигенных сайтах

Четыре анализа конкурентных антител по антигенным сайтам были использованы для измерения концентраций D25-конкурирующего антитела (сайт Ø), 131-2A-конкурирующего антитела (сайт I), конкурирующего с паливизумабом антитела (сайт II) и 101F-конкурирующего антитела (сайт IV) в сыворотке, которые конкурируют с биотинилированными mAb за связывание с соответствующим антигенным сайтом слитого белка RSV. D25 и 101F были приобретены в Cambridge Biologics, LLC, Brookline, MA, USA.Паливизумаб был от MedImmune, LLC, Гейтерсбург, Мэриленд, США. 131-2A был от EMD Millipore Corporation, Темекула, Калифорния, США. mAb биотинилировали с помощью набора для биотинилирования антител Pierce ^TM (Pierce, Rockford, IL, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Источником слитого белка был RSV / A / Bernett, очищенный сахарозой (spRSV, GA1) для сайтов I, II и IV. Сто мкл spRSV (общий белок 7 мкг / мл) наносили на 96-луночный планшет Immulon 2HB (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) на 18 ч при 4 ° C.Для конкурентного анализа антител на участке Ø 100 мкл суспензии клеток HEp-2 (24 x 10 ⁴ клеток / мл) в 10% FBS / MEM высевали на 96-луночные планшеты для культивирования тканей Falcon от Corning (Питтстон, Пенсильвания, США. ). Планшеты инкубировали при 37 ° C с 5% CO ₂ и влажностью 85% в течение 24 часов с образованием монослоев. Клетки инокулировали spRSV (MOI = 0,002) и инкубировали в тех же условиях в течение 2 дней. Планшеты для всех четырех анализов блокировали на 1 час 5% -ным молоком (Carnation Instant Nonfat Dry Milk) в однократном фосфатно-солевом буфере.Сто мкл D25, 131-2A, паливизумаба и 101F в концентрации 1,25 мкг / мл в 5% молоке (для 131-2A, паливизумаба и 101F) и 5% молока в 10% определенной фетальной бычьей сыворотке в минимальном количестве Эфирную среду (для D25) добавляли в двух экземплярах с последующими 2-кратными серийными разведениями (от 12500 до 24,41 нг / мл) для построения стандартной кривой на каждом планшете. Следующие 50 мкл 2-кратных серийных разведений образцов сыворотки (от 1: 5 до 1: 2,560) в двух экземплярах добавляли в покрытые планшеты, а затем сразу же 50 мкл 100 нг / мл биотинилированных mAb (D25, 131-2A, palivizumab и 101F), полученный с помощью набора для биотинилирования антител Pierce ^TM (Pierce, Rockford, IL) в соответствии с инструкциями производителя, с последующей инкубацией в течение 1 часа.После промывки добавляли стрептавидин, конъюгированный с HRP (SeraCare Life Sciences, Gaithersburg, MD), на дополнительный час. Лунки, содержащие биотинилированное mAb без сыворотки, служили положительным контролем, представляющим максимальное связывание. Лунки без биотинилированных mAb, содержащие либо 5% молока вместо сыворотки, либо лунки, содержащие сыворотку, служили отрицательными контролями. Модель регрессии с четырьмя параметрами логистической (4PL) была использована для расчета конкурентных концентраций антител (мкг / мл) на основе динамического диапазона стандартной кривой путем интерполяции концентрации стандартов, которая соответствует значению поглощения, при котором исследуемая сыворотка образец привел к 50% ингибированию.Нижний предел обнаружения (LLoD) составлял 1,0 мкг / мл для конкурентных анализов антител в сайтах I, II и IV и 7,8 мкг / мл для конкурентных тестов антител в сайтах Ø. Образцам с концентрацией ниже LLoD было присвоено значение 0,5 и 3,9 мкг / мл соответственно.

Анализ специфической микронейтрализации белка (MN) RSV F

Образцы сыворотки и четыре mAb (D25, 131-2A, паливизумаб и 101F) были проанализированы на нейтрализующие антитела (Nt Ab) против RSV / A / Tracy и RSV / B / 18537 в клетках HEp-2 с использованием квалифицированного анализа микронейтрализации. как описано ранее (31–33).Образцы сыворотки и mAb (конечная концентрация составляла 40 мкг / мл) сначала разводили 1: 8 с последующим 2-кратным серийным разведением. Равный объем RSV / A Tracy или RSV / B 18537 добавляли к каждому разведению и инкубировали при 36 ° C с 5% CO ₂ в течение 90 минут. Сто мкл клеток HEp 2 добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета и инкубировали в течение 6–7 или 7–8 дней для анализов микронейтрализации RSV / A и RSV / B соответственно. Затем 96-луночные планшеты фиксировали и окрашивали раствором 10% формалин / 0,01% кристаллический фиолетовый в течение ~ 24 часов.После того, как 96-луночные планшеты были высушены на воздухе, они были прочитаны. Титры нейтрализующих антител определяли как конечное разведение, при котором наблюдалось 50% снижение вирусного цитопатического эффекта (CPE). Любому образцу сыворотки, дающему титр

Статистический анализ

Для демографических характеристик и клинических исходов были проанализированы непрерывные переменные и категориальные переменные.Парный тест t использовали для определения того, значительно ли различались геометрические средние титра нейтрализующих антител (GMT) (log2) или среднее геометрическое логарифмически трансформированных конкурентных концентраций антител (GMC) между образцами в острой стадии и в выздоравливающих. Тест с двумя образцами t использовался, чтобы определить, значительно ли различались концентрации нейтрализующих антител (log2) или GMC логарифмически трансформированных конкурентных антител между пациентами, инфицированными RSV / A и RSV / B, а также между реципиентами HCT, которые выделяли вирус. для <14 и ≥ 14 дней.Статистическая значимость была указана для p -значений <0,05. Коэффициенты корреляции Пирсона были рассчитаны между титрами нейтрализующих антител и сайт-специфическими конкурентными концентрациями антител. Статистический анализ выполняли с использованием SPSS Statistic 22 (IBM, Армонк, Нью-Йорк).

Результаты

Демографические и клинические параметры HCT взрослых, инфицированных RSV, были сопоставимы между исследовательскими группами

Клинические характеристики при зачислении суммированы для всех 40 взрослых HCT в таблице 1 из предыдущей публикации (29), стратифицированной по продолжительности выделения RSV (<14 или ≥14 дней) или по подтипу инфекции RSV (RSV / A или RSV / B). .Вкратце, все перечисленные переменные были сопоставимы между группами. Единственная наблюдаемая значительная разница заключалась в том, что реципиенты, которые выделяли RSV в течение ≥14 дней, с большей вероятностью получили трансплантат аллогенных стволовых клеток по сравнению с реципиентами с более короткой продолжительностью выделения вируса (18/20 против 11/20, p <0,025 ). Абсолютное количество нейтрофилов и абсолютное количество лимфоцитов находятся в пределах нормы для этих когорт. Среднее время от трансплантации до инфицирования RSV составляет 169 и 100 дней для взрослых, выделяющих RSV из URT в течение <14 и ≥14 дней, соответственно.

Таблица 1 . Уровни антител к RSV в сыворотке крови больных острой фазой и в период выздоровления взрослых HCT, инфицированных RSV

Тесты на сайт-специфические конкурентные антитела были специфичными к соответствующим конкурентным антителам

Специфичность четырех конкурентных анализов антител была подтверждена с использованием панели моноклональных антител (12,5 мкг / мл) для конкуренции с биотинилированным моноклональным антителом, специфичным к их соответствующим антигенным сайтам (рис. 1). Используя 125-кратную более высокую концентрацию, панель моноклональных антител, которые связывались с антигенными сайтами белка F, отличными от сайта, на который нацелено биотинилированное моноклональное антитело, не могла ингибировать связывание биотинилированного моноклонального антитела с его антигенным сайтом.Например, D25 ингибировал биотинилированный D25 или конкурировал с ним в анализе конкурентных антител по сайту Ø, в то время как остальные моноклональные антитела в панели не ингибировали связывание биотинилированного D25 с сайтом Ø.

Рисунок 1 . Специфичность тестов на антигенные сайт-специфические конкурентные антитела против RSV. Синий указывает на отсутствие ингибирования mAb в отношении биотинилированных mAb, специфичных к антигенному сайту RSV. Красный цвет указывает на сильное ингибирование антигенного сайта RSV.Шкала 0,0–1,5 представляет уровень ингибирования mAb от самого сильного до самого слабого. ПВЗ, паливизумаб; МВА, мотавизумаб. Представленные данные получены из 3 независимых дублирующих конкурентных анализов антител.

Моноклональные антитела с разными уровнями нейтрализующей активности

Нейтрализующую активность моноклональных антител в концентрации 40 мкг / мл оценивали в анализах микронейтрализации RSV / A и RSV / B (рис. 2). MAb D25, которое связывает антигенный сайт Ø, является наиболее сильным из mAb, используемых в конкурентных анализах антител.Паливизумаб и 101F mAb, которые связывают сайт II и сайт IV, соответственно, обладают умеренной нейтрализующей активностью антител, а 131-2A, mAb сайта I, не обладают измеряемой нейтрализующей активностью, что согласуется с ранее сообщенными результатами (34).

Рисунок 2 . Нейтрализующая сила антигенного сайт-специфического моноклонального антитела RSV. В экспериментах использовали RSV / A Tracy и RSV / B 18537. Концентрация mAb составляла 40 мкг / мл для D25, паливизумаба, 131-2A и 101F как в анализах микронейтрализации RSV / A, так и RSV / B, за исключением того, что mAb 131-2A использовали при 1.0 мг / мл в анализе микронейтрализации RSV / B. По оси Y показаны титры нейтрализующих антител RSV / A Tracy или RSV / B 18537 (log2) для различных mAb, используемых в анализе микронейтрализации. Представленные данные получены из 3 независимых дублирующих анализов микронейтрализации ± стандартное отклонение.

Сыворотка выздоравливающих сывороток имела более высокую концентрацию сайт-специфичных конкурирующих или нейтрализующих антител, чем сыворотка острой сыворотки

Значительное увеличение уровней антител к RSV (конкурентных и нейтрализующих антител) в сыворотке выздоравливающих по сравнению с сывороткой острой фазы было измерено всеми четырьмя конкурентными анализами антител и обоими анализами микронейтрализации (Таблица 1).GMC антитела, конкурирующего с D25 (таблица 1), была самой высокой как в сыворотке крови острой стадии, так и в сыворотке выздоравливающих, за ней следовали 101F-конкурирующее антитело (сайт IV), конкурирующее с паливизумабом антитело (сайт II) и 131-2A-конкурирующее антитело (сайт I) антитела. GMTs нейтрализующих антител RSV / A и RSV / B были сопоставимы. Однако кратное увеличение концентрации конкурентных антител было наибольшим для антител, конкурирующих с паливизумабом (5.6), и наименьшим — для конкурирующих антител с D25 (2.6). Кратное увеличение титров нейтрализующих антител RSV / A и RSV / B было сопоставимым (6.5).

Более высокие уровни антител были обнаружены у взрослых с HCT, выделяющих RSV

Конкурентное антитело в GMC (мкг / мл) и нейтрализующее антитело в GMT (log2) сравнивали между взрослыми HCT, выделяющими вирус из своего URT в течение <14 и ≥14 дней (таблица 2). Что касается сывороток острой фазы, не было значительных различий между двумя группами ни для сайт-специфических конкурентных антител, ни для RSV-специфических нейтрализующих антител. Однако для сывороток выздоравливающих значительно более высокие уровни (<0.01) были обнаружены как сайт-специфические конкурентные антитела, так и RSV-специфические нейтрализующие антитела у взрослых HCT, выделяющих RSV <14 дней, за исключением конкурентного антитела по сайту Ø. Кроме того, все сыворотки выздоравливающих имели более высокие уровни антител, чем сыворотки острой фазы, как для сайт-специфических конкурентных антител, так и для RSV-специфических нейтрализующих антител. Общий GMC для четырех конкурентных антител в сыворотках выздоравливающих увеличился примерно в 5 раз для взрослых HCT, выделяющих вирус <14 дней, и примерно в 2 раза.5 раз для тех, кто выделяет вирус ≥14 дней. Для взрослых HCT, выделяющих вирус <14 дней, общий GMC четырех сайт-специфических антител увеличился с 47,4 мкг / мл в сыворотке острого заболевания до 228,6 мкг / мл в сыворотке выздоравливающих. Для взрослых HCT, выделяющих вирус в течение ≥14 дней, общий GMC увеличился с 34,1 мкг / мл в сыворотке острой фазы до 91,8 мкг / мл в сыворотке выздоравливающих.

Таблица 2 . Уровни антител к RSV между инфицированными RSV HCT взрослыми, которые передавали RSV <14 дней и ≥14 дней.

Доля вклада GMC каждого сайт-специфичного конкурентного антитела в общий GMC для сывороток в острой стадии и в период выздоровления от взрослых HCT, выделяющих вирус <14 дней и ≥14 дней, проиллюстрирована на Рисунке 3.Для взрослых HCT, выделяющих вирус <14 дней, ~ 60% общего GMC составлено антителом, конкурирующим с D25, и снижается до ~ 30% в сыворотках выздоравливающих; в то время как процентное содержание 131-2A, антител, конкурирующих с паливизумабом, и антител, конкурирующих с 101F, увеличилось. Для взрослых HCT, выделяющих вирус в течение ≥14 дней, ~ 70% от общего количества GMC также составляли антитела, конкурирующие с D25, в сыворотке крови острой фазы, и процентный вклад четырех конкурентных антител не увеличивался, даже несмотря на то, что общий GMC увеличился с 34.От 1 мкг / мл в сыворотке острой фазы до 91,8 мкг / мл в сыворотке выздоравливающих.

Рисунок 3 . Процент GMC каждого антигенного сайт-специфического конкурентного антитела против RSV (мкг / мл) к общему GMC (мкг / мл) для сывороток в острой стадии и в период выздоровления от взрослых HCT, выделяющих вирус <14 дней и ≥14 дней. Ось Y представляет собой процентное соотношение GMC каждого конкурентного антитела к общему количеству GMC. Ось X - это типы сывороток: сыворотки в острой стадии или в период выздоровления от взрослых HCT, выделяющих вирус <14 дней или ≥14 дней.Общий GMC был суммой 4 конкурентных GMC антител. Процент каждого конкурентного антитела был равен делению GMC конкурентного антитела на общий GMC. GMC, средняя геометрическая концентрация. N = 40 в каждом конкурентном анализе антител.

Не наблюдалось значимых различий в уровнях антител в сыворотке крови острой фазы и выздоравливающей крови между HCT взрослых, инфицированных RSV / A, по сравнению с RSV / B

Сайт-специфическое конкурентное антитело GMC и нейтрализующее антитело GMT сравнивали у взрослых HCT, инфицированных RSV / A и RSV / B (таблица 3).Не наблюдалось значительных различий как в уровне нейтрализующих антител, так и в концентрациях сайт-специфических конкурентных антител в сыворотке крови острой стадии и выздоравливающей крови между взрослыми HCT, инфицированными RSV / A, по сравнению с RSV / B. Повышение активности антител было обнаружено в сыворотках выздоравливающих взрослых HCT, инфицированных RSV / A и RSV / B, с помощью всех 6 анализов. Кроме того, общие GMC 4 конкурентных антител были сопоставимы (133,6 против 159,9 мкг / мл) в сыворотках выздоравливающих у взрослых HCT, инфицированных RSV / A и RSV / B.Это наблюдение согласуется с тем, что антигенные сайты II и IV хорошо консервативны среди изолятов RSV в подгруппах RSV / A и RSV / B.

Таблица 3 . Уровни антител к RSV между HCT, инфицированными RSV / A и RSV / B.

Пропорция вклада GMC каждого сайт-специфичного конкурентного антитела в общий GMC для взрослых HCT, инфицированных RSV / A и B, проиллюстрирована на рисунке 4. Конкурирующее с D25 антитело составляет ~ 60% от общего GMC в сыворотке острой фазы для как RSVA, так и B инфицировали взрослых HCT и снизились до ~ 50% в сыворотке выздоравливающих; в то время как процентное содержание 131-2A, антител, конкурирующих с паливизумабом, и антител, конкурирующих с 101F, увеличивалось в сыворотках выздоравливающих взрослых пациентов, инфицированных HCT как A, так и B.

Рисунок 4 . Процент GMC каждого сайт-специфического конкурентного антитела против RSV (мкг / мл) к общему GMC (мкг / мл) для взрослых HCT, инфицированных RSV / A и B. GMC, средняя геометрическая концентрация. n = 40 в каждом конкурентном анализе антител.

Сайт-специфические конкурирующие антитела коррелируют со специфическими нейтрализующими антителами к RSV

Пирсона был рассчитан для измерения силы линейной связи между сайт-специфическими конкурентными антителами и RSV-специфическими нейтрализующими антителами.Мы наблюдали значительную положительную корреляцию между сайт-специфическими конкурентными антителами, измеренными с помощью четырех тестов сайт-специфических конкурентных антител, и нейтрализующими антителами, измеренными тестами микронейтрализации RSV / A и RSV / B. Коэффициенты корреляции варьировались от 0,33 до 0,83 для сывороток острой фазы и от 0,50 до 0,88 для сывороток выздоравливающих, при этом все корреляции были значимыми ( p <0,05) (рис. 5). Наибольшая корреляция наблюдалась между концентрацией антител, конкурирующих с 101F в сайте IV, и титрами антител, нейтрализующих RSV, а самая низкая корреляция наблюдалась между концентрацией антител, конкурирующих с сайтом Ø D25, и титрами антител, нейтрализующих RSV, у взрослых HCT, инфицированных RSV.

Рисунок 5 . Корреляция антигенного сайт-специфического конкурентного антитела против RSV и нейтрализующего антитела, специфичного к RSV. Коэффициент корреляции Пирсона был рассчитан для измерения силы линейной связи. Коэффициенты корреляции варьировались от 0,33 до 0,83 для сывороток острого заболевания и 0,50–0,88 для сывороток выздоравливающих. * Корреляция значима на уровне 0,05 (двусторонний). ** Корреляция значима на уровне 0,01 (двусторонний). n = 40 в каждом конкурентном анализе антител и анализе микронейтрализации.

Обсуждение

Углубленное понимание реакции антител человека на инфекцию RSV поможет в разработке и оценке вакцин и терапевтических средств против болезни RSV. В предыдущих исследованиях сообщалось об эпитопах, нацеленных на RSV-специфические нейтрализующие антитела в сыворотке крови человека (35, 36), а также сообщалось о специфичности и функциональных свойствах антител, вызванных естественной инфекцией RSV (17). Насколько нам известно, настоящее исследование является первым, которое описывает сайт-специфические конкурентные ответы антител на пре-F и пост-F конформации и коррелирует эти сайт-специфические конкурентные ответы антител с вирусным клиренсом и нейтрализующими реакциями антител в HCT, естественно инфицированных RSV. Взрослые.

В этом проспективном когортном исследовании конкурентные антитела пре-F и пост-F были выявлены после инфицирования RSV у взрослых HCT. Наивысшая концентрация сайт-специфических конкурентных антител в сыворотке острой фазы была против сайта Ø в пре-F конформации, что согласуется с ранее опубликованными результатами, показывающими, что префузионные F-специфические антитела преобладают в поликлональных нейтрализующих антисыворотках (36). Однако высокие уровни сайт-специфических конкурентных антител, присутствующих в группе ≥14 дней, были неэффективными для удаления вируса после того, как вирусная инфекция была установлена.Ngwuta et al. (36) использовали методы, основанные на абсорбции, для определения нейтрализующей активности, связанной с пре-F и пост-F конформациями, а также с сайтом Ø и сайтом II. Наши сайт-специфические конкурентные тесты антител измеряли концентрацию сайт-специфичных конкурентных антител, но не демонстрировали напрямую нейтрализующей активности антигенных сайт-специфичных конкурирующих антител. В целом, антитела, специфичные к RSV, играют важную роль в предотвращении инфекции и меньшую роль в выведении вирусов.Группа, которая избавилась от вируса менее чем за 14 дней, была способна вызвать более сильный гуморальный ответ, вероятно, отражающий большее иммунологическое восстановление после трансплантации стволовых клеток. Хотя мы не измеряли клеточно-опосредованный иммунитет, весьма вероятно, что у этой группы также был более устойчивый клеточный иммунный ответ, который способствовал улучшению вирусного клиренса.

Сайт I имел самую низкую концентрацию конкурентных антител, что также согласуется с результатами, опубликованными Гилманом и другими (17, 37).Наибольшее кратное увеличение было обнаружено против сайта II, что позволяет предположить, что после инфицирования RSV иммунный ответ распознает другие антигенные сайты, которые не являются уникальными для пре-F формы. Это было продемонстрировано увеличением доли GMC конкурентного антитела сайта II, сайта IV и сайта I, но не сайта Ø, к общему GMC в сыворотках выздоравливающих взрослых HCT, которые быстро избавились от вирусной инфекции. Неясно, почему антитела, которые нацелены на сайты, уникальные для формы pre-F, по-видимому, сохраняются в течение более длительного времени по сравнению с сайтами, общими для форм pre-F и post-F.Важно отметить, что большинство конкурентных антител было направлено на сайт Ø в образцах сыворотки острой фазы. Если бы подобное увеличение концентрации произошло в четырех антигенных сайтах в образцах сыворотки выздоравливающих, это привело бы к более высокому увеличению доли сайт-специфических конкурентных антител, которые имели более низкую концентрацию в образцах сыворотки острой фазы, таких как сайты II и IV. Изменение пропорции сайт-специфических конкурентных антител усугублялось более высоким LLoD (7.8 мкг / мл) для конкурентного анализа антител Ø клеточного сайта, который был значительно выше по сравнению с LLoD (1,0 мкг / мл) для других трех конкурентных тестов антител.

Мы использовали корреляцию Пирсона для определения связи между четырьмя сайт-специфическими конкурентными антителами и между концентрациями сайт-специфических антител и титрами нейтрализующих антител. Наибольшая корреляция с уровнями нейтрализующих антител, специфичных к RSV, наблюдалась с сайтами II и IV конкурентных антител.Эти результаты предполагают, что антитела против паливизумаба и эпитопов 101F ответственны за значительную часть вирусной нейтрализующей способности сывороток. Это также предполагает, что сайт-специфические конкурентные анализы антител измеряют изменения, которые напрямую связаны с изменениями уровней нейтрализующих антител. Более низкая корреляция, обнаруженная между концентрациями конкурентных антител в антигенном сайте Ø и титрами нейтрализующих антител, может быть связана с тем, что антигенный сайт Ø является наименее консервативной областью по сравнению с другими антигенными сайтами в белке F (13, 38, 39), хотя это не анализировалось. в данном исследовании.Низкая корреляция также может быть связана с относительно высоким LLoD конкурентного анализа антител по сайту Ø по сравнению с более низким LLoD для других трех сайт-специфичных конкурентных тестов антител. Кроме того, небольшие изменения в концентрации конкурентных антител в антигенном сайте Ø могут быть связаны с более значительными изменениями в активности нейтрализующих антител, что затрудняет обнаружение сильной корреляции из-за вариабельности анализа. Из четырех mAb, которые мы тестировали на нейтрализующую активность антител, mAb D25, нацеленное на сайт Ø, было наиболее сильным из mAb, за ним следовали 101F и паливизумаб; 131-2A не проявляет нейтрализующей активности, что согласуется с тем, что сообщили Phung и другие (40).Эти различные активности нейтрализующих антител предполагают, что сайты Ø, II и IV являются основной мишенью реакции нейтрализующих антител человека, а антигенный сайт I не является основной мишенью. Интересно, что несмотря на наличие сильной корреляции между концентрацией конкурентных антител по сайту I и титрами RSV-специфических нейтрализующих антител, mAb по сайту I (131-2A) не проявляли детектируемой активности нейтрализующих антител. Наблюдаемая прямая корреляция, вероятно, отражает способность взрослых HCT вызывать эффективный гуморальный ответ на антигенные сайты белка F, а не механистическую корреляцию между концентрацией конкурентных антител в сайте I и нейтрализующей активностью антител.

Влияние инфекции RSV по подгруппам вирусов (RSV / A и RSV / B) на гуморальные иммунные ответы на четыре антигенных сайта оценивалось в этом проспективном когортном исследовании. Не наблюдалось значительных различий как в уровне нейтрализующих антител, так и в концентрациях сайт-специфических конкурентных антител, измеренных между реципиентами HCT, инфицированными RSV / A, по сравнению с RSV / B. Кроме того, пропорция и общий GMC четырех конкурентных антител были сопоставимы в сыворотках выздоравливающих между взрослыми HCT, инфицированными RSV / A и RSV / B.Это наблюдение согласуется с тем, что антигенный сайт II и сайт IV хорошо консервативны между подгруппами RSV / A и RSV / B, и предполагает, что моновалентная вакцина RSV-F против инфекции RSV / A и RSV / B, вероятно, достаточна для защиты от тяжелого RSV. болезнь.

У нашего исследования есть некоторые ограничения. Небольшое количество взрослых HCT, инфицированных RSV ( n = 40), не является репрезентативным для взрослых в общей популяции. У здоровых взрослых может наблюдаться более высокий рост конкурентной концентрации антител и титра нейтрализующих антител после инфицирования RSV по сравнению со взрослыми HCT.Кроме того, мы не измеряли концентрацию конкурентных антител к сайту III и сайту V, оставшимся антигенным сайтам пре-F. Таким образом, их вклад в активность нейтрализующих антител после инфицирования RSV не был определен в этой когорте взрослых HCT, инфицированных RSV.

Таким образом, исследование выявило значительно более высокие концентрации сайт-специфических конкурентных антител F RSV (за исключением сайта Ø) у взрослых HCT, которые выделяли RSV <14 дней, по сравнению с ≥14 днями, сопоставимые концентрации конкурентных антител в сыворотках выздоравливающих между RSV / A и RSV / B инфицированные взрослые, инфицированные HCT, и значимая положительная корреляция между сайт-специфическими конкурентными антителами и активностью RSV-специфических нейтрализующих антител.В заключение, у взрослых HCT, инфицированных RSV естественным путем, сайт-специфические конкурентные ответы антител возникали на антигенных сайтах, обнаруженных как в конформациях F до слияния, так и после слияния, и были связаны с вирусным клиренсом. Данные могут предполагать, но не демонстрируют, что эти ответы антител способствуют наблюдаемому более быстрому выведению вируса. Более быстрое очищение у людей с более высокими реакциями антител может просто отражать уровень иммунной компетентности этих людей.Таким образом, наблюдаемая связь между более высокими ответами антител и более быстрым клиренсом не обязательно является причиной и следствием. Кроме того, необходима дальнейшая оценка того, как опосредованные Т-клетками ответы способствуют выведению вируса RSV. Наконец, реципиенты HCT, вероятно, выиграют от иммунопрофилактики моноклональными антителами или вакцины RSV-F, если они лицензированы для предотвращения тяжелой инфекции RSV в период их уязвимости после трансплантации.

Доступность данных

Наборы данных, созданные для этого исследования, доступны по запросу соответствующему автору.

Заявление об этике

Это исследование было проведено в соответствии с рекомендациями институциональных наблюдательных комиссий Центра рака Андерсона Университета Техаса и Медицинского колледжа Бейлора с письменного информированного согласия всех субъектов. Все субъекты дали письменное информированное согласие в соответствии с Хельсинкской декларацией. Протокол был одобрен онкологическим центром доктора медицины Андерсона Техасского университета и медицинским колледжем Бейлора.

Авторские взносы

XY, RC и PP разработали исследование.XY, OI, VA, LA, TM и PP выполнили исследование. XY, LF-S и PP проанализировали данные. DS и RC предоставили образцы. КП обработал образцы. Текст редактировали F-AP, VA, LA, TM, LF-S, KP, DS, RC и PP. XY написал первый черновик рукописи.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы высоко ценят Dr.Barney S. Graham, M.D., Ph.D (Лаборатория вирусного патогенеза, NIAID / VRC, NIH Bethesda, MD) за предоставление этих mAb D25 и AM14 против антигенных сайтов во время разработки анализа. Авторы признают вклад рецензентов в улучшение качества представления рукописи. Авторы признают возможность устного представления данных на 11-м Международном симпозиуме по респираторно-синцитиальному вирусу в 2018 г. в Эшвилле, штат Северная Каролина, США.

Список литературы

1. Цой Дж. Х., Чой Э., Канг Х. Дж., Парк К. Д., Парк С. С., Шин Х. Ю. и др.Респираторные вирусные инфекции после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у детей. J Korean Med Sci. (2013) 28: 36–41. DOI: 10.3346 / jkms.2013.28.1.36

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

2. Ло М.С., Ли Г.М., Гунавардане Н., Бурчетт С.К., Лахенауэр С.С., Леманн Л.Е. Воздействие RSV, аденовируса, гриппа и парагриппа у педиатрических пациентов, получающих трансплантацию стволовых клеток, трансплантацию твердых органов или химиотерапию рака. Педиатр-трансплант .(2013) 17: 133–43. DOI: 10.1111 / petr.12022

CrossRef Полный текст | Google Scholar

3. Анак С., Атай Д., Унувар А., Гарипардич М., Агаоглу Л., Озтюрк Г. и др. Вспышка респираторно-синцитиальной вирусной инфекции среди педиатрических пациентов с онкологическими заболеваниями и / или BMT. Pediatr Pulmonol. (2010) 45: 307–11. DOI: 10.1002 / ppul.21184

CrossRef Полный текст | Google Scholar

4. Аснер С., Стивенс Д., Педулла П., Ричардсон С.Е., Робинсон Дж., Аллен У. Факторы риска и исходы инфекций, связанных с респираторно-синцитиальным вирусом, у детей с ослабленным иммунитетом. Pediatr Infect Dis J . (2013) 32: 1073–6. DOI: 10.1097 / INF.0b013e31829dff4d

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Ким Х.В., Канчола Дж. Г., Брандт С. Д., Пайлес Г., Чанок Р. М., Дженсен К. и др. Респираторно-синцитиальное вирусное заболевание у младенцев, несмотря на предварительное введение антигенной инактивированной вакцины. Am J Epidemiol. (1969) 89: 422–34.

PubMed Аннотация | Google Scholar

7. Munoz FM, Piedra PA, Glezen WP.Безопасность и иммуногенность вакцины слитого белка-2, очищенной от респираторно-синцитиального вируса, для беременных. Вакцина . (2003) 21: 3465–7. DOI: 10.1016 / S0264-410X (03) 00352-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8. Райт П.Ф., Каррон Р.А., Белше Р.Б., Ши Дж.Р., Рэндольф В.Б., Коллинз П.Л. и др. Отсутствие усиленного заболевания респираторно-синцитиальным вирусом дикого типа после получения живых ослабленных респираторно-синцитиальных вирусных вакцин. Вакцина . (2007) 25: 7372–8. DOI: 10.1016 / j.vaccine.2007.08.014

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. Ложно AR, Walsh EE. Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция у взрослых. Clin Microbiol Rev. (2000) 13: 371–84. DOI: 10.1128 / CMR.13.3.371

CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Шиффер И.Т., Кирби К., Санмайер Б., Сторб Р., Кори Л., Бек М. Сроки и тяжесть внебольничных респираторных вирусных инфекций поднимают миелоаблативную трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток по сравнению с немиелоаблативной. Haematologica. (2009) 94: 1101–8. DOI: 10.3324 / haematol.2008.003186

CrossRef Полный текст | Google Scholar

11. Льюнгман П., Уорд К.Н., Крукс Б.Н., Паркер А., Мартино Р., Шоу П.Дж. и др. Респираторные вирусные инфекции после трансплантации стволовых клеток: проспективное исследование рабочей группы по инфекционным заболеваниям европейской группы по трансплантации крови и костного мозга. Пересадка костного мозга. (2001) 28: 479–84. DOI: 10.1038 / sj.bmt.1703139

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

13.McLellan JS, Chen M, Leung S, Graepel KW, Du X, Yang Y и др. Структура тримерного гликопротеина слияния RSV, связанного с нейтрализующим антителом, специфичным для предварительного слияния. Наука. (2013) 340: 1113–7. DOI: 10.1126 / science.1234914

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14. Андерсон Дж., Норден Дж., Сондерс Д., Томс Г.Л., Скотт Р. Анализ местных и системных иммунных ответов, индуцированных у мышей BALB / c экспериментальной респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией. J Gen Virol. (1990) 71 (Pt 7): 1561–70.

PubMed Аннотация | Google Scholar

15. Састре П., Мелеро Дж. А., Гарсия-Баррено Б., Паломо С. Сравнение аффинной хроматографии и адсорбции на рекомбинантных инфицированных клетках вируса осповакцины для истощения антител, направленных против гликопротеинов респираторно-синцитиального вируса, присутствующих в препарате иммуноглобулина человека. J Med Virol. (2005) 76: 248–55. DOI: 10.1002 / jmv.20349

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16.Корти Д., Бьянки С., Ванцетта Ф., Минола А., Перес Л., Агатик Дж. И др. Перекрестная нейтрализация четырех парамиксовирусов человеческим моноклональным антителом. Природа. (2013) 501: 439–43. DOI: 10.1038 / природа12442

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Гилман М.С., Кастелланос, Калифорния, Чен М., Нгвута Дж.О., Гудвин Э., Мойн С.М. и др. Быстрое профилирование репертуаров антител к RSV из В-клеток памяти естественно инфицированных взрослых доноров. Sci Immunol. (2016) 1: eaaj1879.DOI: 10.1126 / sciimmunol.aaj1879

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Mousa JJ, Kose N, Matta P, Gilchuk P, Crowe JE Jr. Новый нейтрализующий эпитоп, специфичный для конформации перед слиянием, на слитном белке респираторно-синцитиального вируса. Nat Microbiol. (2017) 2: 16271. DOI: 10.1038 / nmicrobiol.2016.271

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Фишаут М., Туберген Д., Макинтош К. Клеточный ответ на респираторные вирусы с особым акцентом на детей с нарушениями клеточно-опосредованного иммунитета. J Pediatr. (1980) 96: 179–86. DOI: 10.1016 / S0022-3476 (80) 80799-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Холл С.Б., Пауэлл К.Р., Макдональд Н.Э., Гала С.Л., Менегус М.Э., Суффин С.К. и др. Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция у детей с ослабленной иммунной функцией. N Engl J Med. (1986) 315: 77–81. DOI: 10.1056 / NEJM198607103150201

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21. Бангхам Ч.Р., Кэннон М.Дж., Карзон Д.Т., Асконас Б.А.Цитотоксический Т-клеточный ответ на респираторно-синцитиальный вирус у мышей. J Virol. (1985) 56: 55–9.

PubMed Аннотация | Google Scholar

22. Кэннон М.Дж., Опеншоу П.Дж., Асконас Б.А. Цитотоксические Т-клетки уничтожают вирус, но усиливают патологию легких у мышей, инфицированных респираторно-синцитиальным вирусом. J Exp Med. (1988) 168: 1163–8. DOI: 10.1084 / jem.168.3.1163

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Тейлор Г., Стотт Э. Дж., Хейл А. Дж.Цитотоксические лимфоциты в легких мышей, инфицированных респираторно-синцитиальным вирусом. J Gen Virol. (1985) 66 (Pt 12): 2533–8. DOI: 10.1099 / 0022-1317-66-12-2533

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Чиба Й, Хигашидате Й, Суга К., Хондзё К., Цуцуми Х., Огра ПЛ. Развитие клеточно-опосредованного цитотоксического иммунитета к респираторно-синцитиальному вирусу у младенцев после естественной инфекции. J Med Virol. (1989) 28: 133–9.DOI: 10.1002 / jmv.18304