Сформировать сзв м онлайн: Как заполнить СЗВ-М онлайн бесплатно на сайте ПФР в 2021 году

Содержание

Кадровый портал — Error

Организация работы и кадровые вопросы в связи с коронавирусомОбразцы основных документов в связи с коронавирусомНерабочие дни в связи с коронавирусом

Образцы заполнения кадровых документовФормы первичных учетных документовСведения о трудовой деятельности (электронная трудовая книжка)Ведение трудовых книжек в бумажном виде

Специальная оценка условий трудаНесчастный случай на производствеОбязательные медосмотры (профосмотры)Инструктажи по охране труда

Обязательные документы при проверкахКалендарь кадровика

Хранение и использование персональных данныхМеры по защите персональных данных работниковОтветственность за нарушения законодательства о персональных данных

Привлечение иностранцевОформление иностранцев

Оформление приема на работуТрудовой договор

График отпусковЗамена отпуска денежной компенсациейОформление ежегодного оплачиваемого отпускаОтпуск по беременности и родамОтпуск по уходу за ребенкомЛьготный (дополнительный) отпуск

График работыПривлечение, оформление и оплатаУчет рабочего времениВыходные и праздничные дни

Правила внутреннего трудового распорядка (ПВТР)Дисциплинарные взысканияПорядок увольнения за нарушение трудовой дисциплины

Заработная платаРайонные коэффициенты и надбавкиМатериальная ответственность работника

Оплата больничного листа (не пилотный проект)Оплата больничного листа (пилотный проект)Заполнение больничного листа работодателемРабота с электронными больничнымиПособие по беременности и родам

Порядок проведения аттестацииОграничения на увольнение из-за непрохождения аттестацииРасходы на подготовку и переподготовку кадров

Основания для увольненияПроцедура увольнения по сокращению

Перейти в telegram-чат

Кадровый портал — Error

Организация работы и кадровые вопросы в связи с коронавирусомОбразцы основных документов в связи с коронавирусомНерабочие дни в связи с коронавирусом

Образцы заполнения кадровых документовФормы первичных учетных документовСведения о трудовой деятельности (электронная трудовая книжка)Ведение трудовых книжек в бумажном виде

Специальная оценка условий трудаНесчастный случай на производствеОбязательные медосмотры (профосмотры)Инструктажи по охране труда

Обязательные документы при проверкахКалендарь кадровика

Хранение и использование персональных данныхМеры по защите персональных данных работниковОтветственность за нарушения законодательства о персональных данных

Привлечение иностранцевОформление иностранцев

Оформление приема на работуТрудовой договор

График отпусковЗамена отпуска денежной компенсациейОформление ежегодного оплачиваемого отпускаОтпуск по беременности и родамОтпуск по уходу за ребенкомЛьготный (дополнительный) отпуск

График работыПривлечение, оформление и оплатаУчет рабочего времениВыходные и праздничные дни

Правила внутреннего трудового распорядка (ПВТР)Дисциплинарные взысканияПорядок увольнения за нарушение трудовой дисциплины

Заработная платаРайонные коэффициенты и надбавкиМатериальная ответственность работника

Оплата больничного листа (не пилотный проект)Оплата больничного листа (пилотный проект)Заполнение больничного листа работодателемРабота с электронными больничнымиПособие по беременности и родам

Порядок проведения аттестацииОграничения на увольнение из-за непрохождения аттестацииРасходы на подготовку и переподготовку кадров

Основания для увольненияПроцедура увольнения по сокращению

Перейти в telegram-чат

Кадровый портал — Error

Организация работы и кадровые вопросы в связи с коронавирусомОбразцы основных документов в связи с коронавирусомНерабочие дни в связи с коронавирусом

Образцы заполнения кадровых документовФормы первичных учетных документовСведения о трудовой деятельности (электронная трудовая книжка)Ведение трудовых книжек в бумажном виде

Специальная оценка условий трудаНесчастный случай на производствеОбязательные медосмотры (профосмотры)Инструктажи по охране труда

Обязательные документы при проверкахКалендарь кадровика

Хранение и использование персональных данныхМеры по защите персональных данных работниковОтветственность за нарушения законодательства о персональных данных

Привлечение иностранцевОформление иностранцев

Оформление приема на работуТрудовой договор

График отпусковЗамена отпуска денежной компенсациейОформление ежегодного оплачиваемого отпускаОтпуск по беременности и родамОтпуск по уходу за ребенкомЛьготный (дополнительный) отпуск

График работыПривлечение, оформление и оплатаУчет рабочего времениВыходные и праздничные дни

Правила внутреннего трудового распорядка (ПВТР)Дисциплинарные взысканияПорядок увольнения за нарушение трудовой дисциплины

Заработная платаРайонные коэффициенты и надбавкиМатериальная ответственность работника

Оплата больничного листа (не пилотный проект)Оплата больничного листа (пилотный проект)Заполнение больничного листа работодателемРабота с электронными больничнымиПособие по беременности и родам

Порядок проведения аттестацииОграничения на увольнение из-за непрохождения аттестацииРасходы на подготовку и переподготовку кадров

Основания для увольненияПроцедура увольнения по сокращению

Перейти в telegram-чат

Создание материализованных представлений в Amazon Redshift

В среде хранилища данных приложениям часто требуется выполнять сложные запросы. на большие столы. Примером являются операторы SELECT, которые выполняют соединения нескольких таблиц и агрегации таблиц, содержащих миллиарды строк.Обработка этих запросов может быть дорого с точки зрения системных ресурсов и времени, необходимого для вычисления результатов.

Материализованные представления в Amazon Redshift позволяют решить эти проблемы. А материализованное представление содержит предварительно вычисленный набор результатов, основанный на SQL запрос по одной или нескольким базовым таблицам.Вы можете использовать операторы SELECT для запроса материализованного view точно так же, как вы можете запрашивать другие таблицы или представления в базе данных. Амазонка Redshift возвращается предварительно вычисленные результаты из материализованного представления, без необходимости доступа к базе столы вообще. С точки зрения пользователя результаты запроса возвращаются намного быстрее по сравнению с к при получении тех же данных из базовых таблиц.

Материализованные представления особенно полезны для ускорения предсказуемых запросов. а также повторяется. Вместо выполнения ресурсоемких запросов к большим таблицам (таким в качестве агрегаты или множественные объединения), приложения могут запрашивать материализованное представление и извлекать а предварительно вычисленный набор результатов.Например, рассмотрим сценарий, в котором набор запросов используется, чтобы заполнять информационные панели, например Amazon QuickSight. Этот вариант использования идеально подходит для материализованного представления, поскольку запросы предсказуемы. а также повторяется снова и снова.

Материализованное представление можно определить в терминах других материализованных представлений.Использовать материализованных представлений на материализованных представлениях для расширения возможностей материализованных представлений. В этом подходе существующее материализованное представление воспроизводит то же самое. роль в качестве базовой таблицы для запроса на получение данных.

Этот подход особенно полезен для повторного использования предварительно вычисленных объединений для разных агрегатов. или параметры GROUP BY.Например, возьмите материализованное представление, объединяющее информацию о клиенте. (содержащий миллионы строк) с подробной информацией о заказе товара (содержащий миллиарды из ряды). Это дорогостоящий запрос для многократного вычисления по запросу. Вы можете использовать разные Опции GROUP BY для материализованных представлений, созданных поверх этого материализованного представления. а также присоединиться к другим таблицам.Это экономит время вычислений, которое в противном случае использовалось бы для запуска дорогостоящих базовое соединение каждый раз. Таблица STV_MV_DEPS показывает зависимости материализованного представления от других материализованных представлений.

При создании материализованного представления Amazon Redshift запускает указанный пользователем оператор SQL. к собирать данные из базовой таблицы или таблиц и сохранять набор результатов.Следующий на иллюстрации представлен обзор материализованного представления Tickets_mv , которое SQL-запрос определяет с помощью двух базовых таблиц, событий , и продам .

Затем вы можете использовать эти материализованные представления в запросах, чтобы ускорить их. Кроме того, Амазонка Redshift может автоматически переписывать эти запросы для использования материализованных представлений, даже если запрос не ссылается явно на материализованное представление.Автоматическая перезапись запросов есть особенно эффективен для повышения производительности, когда вы не можете изменить свои запросы на использовать материализованные представления.

Чтобы обновить данные в материализованном представлении, вы можете использовать REFRESH MATERIALIZED ПОСМОТРЕТЬ заявление в любое время, чтобы вручную обновить материализованные представления.Amazon Redshift идентифицирует изменения которые произошли в базовой таблице или таблицах, а затем применяет эти изменения к материализованный вид. Поскольку автоматическая перезапись запросов требует материализованных представлений быть в актуальном состоянии, как владелец материализованного представления, обязательно обновляйте материализованные представления всякий раз, когда базовая таблица изменений.

Amazon Redshift предоставляет несколько методов обновления материализованных представлений для автоматического переписывание. Вы можете настроить материализованные представления с помощью опции автоматического обновления. обновить материализованные представления при обновлении базовых таблиц материализованных представлений. Это автообновление операция выполняется в то время, когда ресурсы кластера доступны, чтобы минимизировать сбои к другие рабочие нагрузки.Поскольку планирование автообновления зависит от рабочей нагрузки, вы могу иметь больший контроль над тем, когда Amazon Redshift обновляет ваши материализованные представления. Вы можете запланировать задание обновления материализованного представления с помощью API-интерфейса планировщика Amazon Redshift и интеграции с консолью. Для Дополнительные сведения о планировании запросов см. в разделе Планирование запроса в консоли Amazon Redshift.

Это особенно полезно при наличии требования соглашения об уровне обслуживания (SLA). для получения актуальных данных из материализованного представления. Вы также можете вручную обновить любой материализованный просмотры, которые можно обновлять автоматически. Для получения информации о том, как создавать материализованные представления, видеть СОЗДАТЬ МАТЕРИАЛИЗИРОВАННЫЙ ВИД.

Вы можете использовать операторы SELECT для запроса материализованного представления. Для получения информации о том, как чтобы запросить материализованные представления, см. Запрос материализованного представления. Набор результатов в конечном итоге становится устаревшим, когда данные вставляются, обновляются и удаляются в базовых таблицах. Вы можете обновить материализованный просмотреть в любое время, чтобы обновить его последними изменениями из базовых таблиц.Для информации о том, как обновить материализованные представления, см. в разделе ОБНОВЛЕНИЕ МАТЕРИАЛИЗОВАННОГО ВИДА.

Подробнее о командах SQL, используемых для создания материализованных представлений и управления ими, см. следующий темы команд:

Для получения информации о системных таблицах и представлениях для мониторинга материализованных представлений см. следующие темы:

Фаза I Клиническое исследование вируса долины Сенека (SVV-001), репликационно-компетентного пикорнавируса, в поздних солидных опухолях с нейроэндокринными особенностями

Clin Cancer Res.Авторская рукопись; доступно в PMC 2017 20 февраля.

Опубликован в окончательной отредактированной форме как:

PMCID: PMC5317273

NIHMSID: NIHMS432549

Charles M. Rudin

1 Университет Джона Хопкинса,

ore, Мэриленд Пуарье

1 Университет Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд

Нил Н. Сензер

2 Онкологический исследовательский центр Мэри Кроули, Даллас, Техас

Джозеф Стивенсон-младший.

3 Онкологический центр Каролины, Гринвилл, Южная Каролина

Дэвид Леш

4 Индианаполис, Индиана

Кевин Д. Берроуз

5 Neotropix, Inc., Малверн, Пенсильвания

P. Сешидхар Редди

5 Neotropix, Inc., Малверн, Пенсильвания

Кристин Л. Ханн

1 Университет Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд

Пол Л. Халленбек

5 Neotropix, Inc., Малверн, Пенсильвания

1 Университет Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд

2 Онкологический исследовательский центр Мэри Кроули, Даллас, Техас

3 Онкологический центр Каролины, Гринвилл, Южная Каролина

4 Индианаполис, Индиана

5 Neotropix, Inc., Малверн, Пенсильвания

Автор для корреспонденции: Чарльз М. Рудин, Комплексный онкологический центр Сидни Киммела при Джонсе Хопкинсе, Дэвид Х.Koch Cancer Research Building 2, Room 544, 1550 Orleans Street, Baltimore, MD 21231. Телефон: 410-502-0678; Факс: 410-502-0677; [email protected] Окончательная отредактированная версия этой статьи издателем доступна бесплатно на сайте Clin Cancer Res. См. другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Abstract

Purpose

Вирус долины Сенека (SVV-001) — это новый природный пикорнавирус, способный к репликации, обладающий сильным и селективным тропизмом к типам нейроэндокринных раковых клеток, включая мелкоклеточный рак легкого.Мы провели первое клиническое испытание фазы I на людях, первое в своем классе клиническое испытание этого агента у пациентов с онкологическими заболеваниями с нейроэндокринными особенностями, включая мелкоклеточный рак легкого.

Схема эксперимента

Клиническая оценка однократных внутривенных доз у пациентов с онкологическими заболеваниями с нейроэндокринными особенностями проводилась с пятью логарифмическими приращениями от 10 7 до 10 11 вп / кг. Оценивали токсичность, вирусные титры и клиренс, выработку нейтрализующих антител и опухолевый ответ.

Результаты

В общей сложности 30 пациентов прошли курс лечения SVV-001, в том числе шесть пациентов с мелкоклеточной карциномой в самой низкой дозе 10 7 п.о. / кг. SVV-001 хорошо переносился, при этом не наблюдалось токсичности, ограничивающей дозу, в любой группе доз. Клиренс вируса был зарегистрирован у всех субъектов и коррелировал во времени с развитием противовирусных антител. Доказательства in vivo внутриопухолевой репликации вируса наблюдались среди пациентов с мелкоклеточной карциномой, при этом пиковые титры вируса, по оценкам, были> 10 3 раз выше, чем введенная доза.Один пациент с ранее прогрессирующим химиорезистентным мелкоклеточным раком легкого оставался без прогрессирования в течение 10 месяцев после введения SVV-001 и жив в течение 3 лет после лечения.

Выводы

Внутривенное введение SVV-001 пациентам хорошо переносится в дозах до 10 11 vp / кг, с прогнозируемой кинетикой клиренса вируса, внутриопухолевой репликацией вируса и доказательствами противоопухолевой активности у пациентов с мелкоклеточным раком легкого. Клиническая оценка фазы II при мелкоклеточном раке легкого является оправданной и уже начата.

Введение

Мелкоклеточный рак легкого — распространенное, агрессивное и исключительно летальное злокачественное новообразование (1). Большинство случаев являются метастатическими на момент постановки диагноза, и в таких случаях средняя выживаемость с момента постановки диагноза составляет примерно 9 месяцев (2). Существует острая потребность в новых и более эффективных подходах к лечению этого заболевания (3).

Вирус долины Сенека (SVV-001) — репликационно-способный онколитический пикорнавирус, обнаруженный как контаминант лабораторного препарата аденовируса (4–7).Репликативный потенциал SVV-001 был изучен на большом количестве линий рака человека. Спектр активности наиболее высок в типах опухолей, демонстрирующих нейроэндокринные особенности, включая 13 из 23 протестированных линий SCLC (4, 8). SVV-001 демонстрирует выдающуюся активность против опухолей, обладающих высокой способностью к репликации вирусов. У мышей, несущих ксенотрансплантаты SCLC h546, дозы ≥10 8 vp / кг приводили к полному и стойкому уничтожению опухолей у 60/60 мышей (4).

Ранее предпринимались попытки разработать живые, способные к репликации противоопухолевые вирусы, главным образом на основе ретровирусных и аденовирусных векторов (см.9). Основные проблемы, связанные с онколитическими вирусными стратегиями на сегодняшний день, включают: трудности с получением высоких титров вируса; отсутствие избирательного тропизма к раковым клеткам; ранее существовавший гуморальный иммунитет у значительной части населения; возможность возврата сконструированных вирусов к патогенным диким типам; и потенциал для индукции дополнительных геномных мутаций из-за интеграции вирусной ДНК.

Доклинические анализы SVV-001 предполагают возможность преодоления всех этих барьеров (4). SVV-001 является системно биодоступным: он не инактивируется компонентами крови, не вызывает гемагглютинации ни в одной из групп крови, а уже существующие антитела встречаются редко.В отличие от других онколитических вирусов, SVV-001 может легко проникать в солидные опухоли из сосудистой системы. SVV-001 имеет цикл репликации менее 12 часов, способствуя продуктивной инфекции в опухолях до развития иммунного ответа. Наконец, пикорнавирусы не имеют возможности инсерционного мутагенеза из-за отсутствия промежуточного звена ДНК и не несут трансформирующие онкогены.

Мы стремились оценить безопасность, вирусную кинетику и вирусную динамику в первом в своем классе клиническом испытании фазы I.Из-за наблюдаемой предпочтительной проницаемости SVV-001, наблюдаемой в линиях опухолевых клеток с нейроэндокринной дифференцировкой, набор в клинические испытания был ограничен пациентами с развитыми солидными опухолями, демонстрирующими экспрессию нейроэндокринных маркеров.

Методы

Дизайн клинического исследования

Это было клиническое испытание фазы I с увеличением дозы, в котором тестировалось внутривенное введение однократной дозы SVV-001. Были изучены пять дозовых когорт с логарифмическими приращениями от 10 7 до 10 11 п.о. / кг.SVV-001 вводили в день исследования. Сопутствующее противоопухолевое лечение не применялось. Основными целями этого исследования были оценка токсичности и определение рекомендуемой дозы для тестирования фазы II. Вторичные цели включали серийную оценку титров вирусов в крови, мокроте, мазках из носа, моче и стуле, а также определение титров нейтрализующих антител на каждом уровне дозы. Неблагоприятные события были оценены и присвоена степень отнесения к SVV-001 с использованием критериев общей терминологии для нежелательных явлений Национального института рака (CTCAE) версии 3.0. Противоопухолевый ответ оценивали с помощью серийных компьютерных томографов в соответствии с критериями оценки ответа в солидных опухолях (RECIST) версии 1.0.

Приемлемость субъектов

Набор был ограничен взрослыми пациентами с развитыми солидными опухолями с нейроэндокринными особенностями (определяемыми как иммуногистохимическая экспрессия CD56, хромогранина А и / или синаптофизина), для которых не было доступных стандартных методов лечения с доказанной эффективностью, а также с восточными пациентами. Статус работы Кооперативной онкологической группы (ECOG PS) от 0 до 2.Подходящие женщины были либо в постменопаузе, либо подвергались хирургической стерилизации, а подходящие мужчины соглашались использовать контрацептивы. Лечение SVV-001 было начато по крайней мере через 4 недели после любой предшествующей противоопухолевой терапии. Критерии исключения включали костный мозг (ANC <1500 / мкл; тромбоциты <100000 / мкл) или дисфункцию органа (билирубин> 1,5 × ULN; AST / ALT> 2,5 × ULN; креатинин> 1,5 × ULN), продолжение НЯ> 1 степени как результат предшествующей терапии, наличие или наличие в анамнезе метастазов в центральную нервную систему или сопутствующей персистирующей вирусной инфекции.

Мониторинг объекта исследования

Пациенты, участвовавшие в исследовании, оценивались перед включением в исследование и на предмет токсичности во время лечения по истории болезни, физикальному обследованию, количеству крови и базовой химической панели, включая функциональные тесты печени, по крайней мере, еженедельно. Сбор носового секрета, мокроты, крови, мочи и стула для оценки титров вирусов проводился ежедневно в течение 5 дней, начиная со дня введения SVV-001, трижды в неделю на 2-й и 3-й неделях, дважды в неделю на 4-й неделе. до 6, а затем один раз в неделю до полного выведения обнаруживаемого SVV-001 с помощью ОТ-ПЦР.КТ для повторной оценки болезни выполнялась примерно каждые 8 ​​недель. Нежелательные явления были занесены в таблицу и распределены по категориям как по степени тяжести с использованием критериев CTCAE версии 3, так и по степени отнесения к исследуемому агенту. Исследователи и наблюдатели участвовали в еженедельной телефонной конференции по безопасности исследования, на которой были рассмотрены все активные объекты исследования.

Количественное определение SVV-001 в биопробах пациентов

Образцы пациентов хранили при температуре <−60 ° C. Образцы размораживали и обрабатывали (фекалии - суспензия 1:10 в PBS и осветлили центрифугированием, моча - осветлили центрифугированием, мокрота - суспензия 1: 1 в PBS и осветлили центрифугированием, мазки из носа - встряхнули в 1 мл PBS / тампон). к стерильной фильтрации с 0.Шприцевой мембранный фильтр из ПВДФ 22 мкм (Millipore).

РНК

выделяли из обработанных образцов пациентов с использованием мини-набора QIAamp Viral RNA Mini (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Число геномных копий SVV-001 определяли с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой в реальном времени (ОТ-ПЦР) с использованием набора Super-Script III Platinum One-Step qRT-PCR (Invitrogen). Реакции в четырех повторностях по 15 мкл включали: восходящий праймер (5′-CTGTCTCGGTGCACGCTTAC-3 ‘), нижестоящий праймер (5′-GATCACATTGTTGAGCACTGTGTTC-3′), зонд (5’-6FAM-CGGTTGTGTGCCGCGAC-3 стандартная система); из очищенного SVV-001 в количестве от 25 до 5 × 10 9 копий или 5 мкл образца РНК.Для кала были проведены реакции, содержащие как 5, так и 0,5 мкл РНК из-за частого присутствия ингибиторов ПЦР. Было использовано наибольшее значение числа копий, возвращенное из двух условий. Условия реакции были: 50 ° C в течение 15 минут, 95 ° C в течение 2 минут и 45 циклов при 95 ° C в течение 15 секунд и 60 ° C в течение 1 минуты.

Инфекционный титр

SVV-001 в образцах пациентов определяли с использованием анализа титра тканевой культуры в инфекционной дозе-50 (TCID 50 ) в клетках PER.C6, как описано ранее (10).После инкубации в течение 3 дней при 37 ° C вирусный цитопатический эффект (CPE) был определен как <50% жизнеспособности неинфицированных клеток с использованием раствора реагента Cell Titer 96 A Water One MTS (Promega). Из-за ингибирующей активности некоторых типов образцов на клетках PER.C6 CPE был подтвержден визуальным осмотром.

Количественное определение сывороточных нейтрализующих антител

Сывороточный нейтрализующий титр анти-SVV определяли с помощью анализа in vitro на инфекцию на клетках PER.C6. Сыворотку серийно разводили в 2 раза (от 1: 4 до 1:10 6 ) в питательной среде и смешивали 1: 1 с неочищенным вирусным лизатом SVV-001 (100 TCID 50 ).Эту смесь инкубировали в течение 1 часа при 37 ° C, а затем добавляли к равному объему 10 4 клеток PER.C6. Планшеты инкубировали 3 дня при 37 ° C. ЦПД вируса определяли, как описано ранее. Титр нейтрализации определяли как наибольшее разведение сыворотки, которое блокировало CPE в> 50% лунок в четырех повторностях.

Иммуноокрашивание ткани SVV-001

Иммуноокрашивание тканей на наличие внутриопухолевой репликации вируса проводили на фиксированных формалином парафиновых блокированных тканях с использованием мышиной сыворотки против SVV, полученной путем внутривенной инокуляции живого SVV-001 мышам CD-1.Извлечение антигена выполняли с помощью микроволны в цитратном буфере натрия до мечения первичных антител. Визуализацию проводили с использованием набора мышиного IgG Vectastain ABC (Vector Laboratories).

Результаты

Демографические данные пациентов

Всего в исследовании прошли лечение 30 пациентов. Два пациента в группе с первой дозой, оба с запущенной, химиорезистентной и подвергнутой интенсивному предварительному лечению мелкоклеточной карциномой, умерли от прогрессирующего заболевания в течение 30 дней после введения SVV-001.Оба пациента прошли вскрытие, которое показало смерть от прогрессирующего метастатического рака, без доказательств смерти, связанной с вирусной инфекцией. Несмотря на то, что эти 2 ранних смерти в ходе исследования были связаны с заболеванием, а не с терапией, после консультативного совещания с Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов набор в когорты с последующим повышением дозы был ограничен пациентами с ожидаемой выживаемостью не менее 6 месяцев для безопасности и для более точной оценки терапевтической токсичности.Это по определению препятствовало дальнейшему включению пациентов с рецидивирующим SCLC или внелегочной мелкоклеточной карциномой в когорты с увеличением дозы более 10 7 п.о. / кг: в настоящее время такие пациенты имеют медианную выживаемость менее 6 месяцев. Таким образом, только 6 пациентов с мелкоклеточной карциномой были включены в исследование, и все 6 были включены в когорту с самой низкой дозой (10 7 vp / кг). У большинства из остальных 24 пациентов были карциноидные опухоли (). Почти все пациенты, как в малых клетках, так и в других нейроэндокринных когортах, прошли интенсивное предварительное лечение (≥3-я линия).

Таблица 1

66%)
Демографические данные пациента Мелкоклеточная карцинома *
N = 6
Смешанный нейроэндокринный
N = 24
Возрастной диапазон ) 60 (32–73) 63 (36–78)
Пол Мужчина: женщина 3: 3 16: 8
Этническая принадлежность Белый 6 6 20
Цветной 0 4
ECOG PS 0 2 (33%) 10 (42%)
1 13 (54%)
2 0 1 (4%)
No.предшествующих терапий Медиана (диапазон) 2,5 (2–> 4) 1 (0–> 4)

Безопасность

SVV-001 хорошо переносился, при любой дозе DLT не наблюдалось. Повышение дозы было прекращено на уровне 10 11 vp / кг без определения максимально переносимой дозы по практическим причинам, связанным с продуцированием вирусов и достижением диапазонов доз, соответствующих значительной противоопухолевой эффективности при разрешающем раке на доклинических моделях (4).Наблюдаемая токсичность суммирована в. У нескольких пациентов, особенно в группе с наименьшей дозой, наблюдались гриппоподобные симптомы, включая субфебрильную лихорадку, недомогание, миалгии и артралгии в течение первой недели, продолжавшиеся 1-2 дня и достигавшие пика на 3-4 день после введения вируса. Эти симптомы предшествовали исчезновению вируса и развитию нейтрализующего ответа антител. После завершения запланированного увеличения дозы в общей сложности 12 пациентов прошли курс лечения на самом высоком уровне дозы для дальнейшей оценки профиля токсичности SVV-001, введенного в дозе 10 11 п.о. / кг.В расширенной когорте () не наблюдалось DLT.

Таблица 2

Сводка нежелательных явлений *

900 кг
N = 6 903 903
Токсичность Мелкоклеточная карцинома Смешанный нейроэндокрин


10 7 –10 10 вп. / кг
N = 12
10 11 вп. / кг
N = 12


1 класс 2 класс 3 класс 1 класс 2 класс Пирексия 2 (33%) 1 (17%) 0 4 (33%) 0 0 4 (33%) 1 (8%) 0
Усталость 0 0 0 5 (42%) 1 (8%) 0 2 (17%) 1 (825%) 9025 0
Головная боль 0 0 0 2 (17%) 1 (8%) 0 0 1 (8%) 0 9025pen2 0 0 0 0 0 0 0 1 (8%) 1 (8%)
Мышечные спазмы 0 0 0 0 0 0 0 1 (8%) 0
Кашель 0 0 0 0 0 0 1 (8%) 0

Хотя формально не является частью Pro По запросу Комитета по биобезопасности Джона Хопкинса были проведены обязательные оценки безопасности tocol, был проведен анализ сыворотки крови у кресла-исследователя и ведущей медсестры-исследователя в Университете Джона Хопкинса, которые не показали поддающихся обнаружению титров нейтрализующих антител, что согласуется с отсутствием передачи вируса, несмотря на близость пациента. контакт.

Вирусная динамика и выработка нейтрализующих антител

Было обнаружено, что у двух испытуемых обнаруживались нейтрализующие антитела на исходном уровне до введения SVV-001. У всех испытуемых вырабатывались нейтрализующие антитела к SVV-001 в течение первых 2 недель после введения вируса, причем скорость и титр гуморального иммунного ответа, по-видимому, увеличивались с увеличением дозы SVV-001 (). Титры нейтрализующих антител после лечения у пациентов с мелкоклеточной карциномой были выше, чем у пациентов с немелкоклеточной карциномой, получавших такую ​​же дозу, что согласуется с заметно более высокими вирусными титрами, наблюдаемыми у этих пациентов (описанными ниже).Устранение обнаруживаемого инфекционного вируса в выделениях из носа, мокроте, крови, моче и стуле наблюдалось во всех группах доз, одновременно или после нейтрализующего ответа антител.

Разработка нейтрализующих антител против SVV-001. Количественная оценка сывороточных нейтрализующих антител SVV-001 оценивалась с течением времени у всех людей, получавших SVV-001. Данные представлены на 1-й неделе (7-9-й день) и 2-й неделе (14-16-й день) и представлены в виде пикового титра нейтрализующих антител в зависимости от введенной дозы.Отдельно показана когорта пациентов с мелкоклеточной карциномой, получавших 10 7 п.н. / кг. Планки погрешностей: стандартное отклонение.

Титр вируса SVV-001 у большинства испытуемых был наивысшим в день введения SVV-001, при этом пик на 1 день увеличивался по когорте, отражая логарифмические приращения введенной дозы (). Эта картина соответствует отсутствию или, в лучшем случае, минимальной внутриопухолевой репликации вируса. Однако у пациентов с мелкоклеточными карциномами, получавших лечение на самом низком уровне дозы, наблюдалась совершенно иная картина: несколько пациентов демонстрировали заметное увеличение вирусного титра, достигающее пика на 3-4 день, на уровнях, на несколько порядков превышающих введенную дозу ( , верхний левый).У этих пациентов также наблюдалась задержка в траектории выведения вируса. Эта закономерность была очевидна у половины пролеченных пациентов с мелкоклеточной карциномой, что согласуется с наблюдениями в клеточных линиях мелкоклеточной карциномы, предполагающими, что около половины этих линий допускают репликацию вируса (4).

Титры вируса SVV-001 после в / в введения, по когортам. Оценка циркулирующего вируса SVV-001 в сыворотке крови оценивалась с течением времени с помощью количественной ОТ-ПЦР. Каждый линейный график представляет титры, измеренные у отдельного пациента.Данные представлены по введенной дозе.

Внутриопухолевая репликация вируса

Как отмечалось ранее, наблюдаемая картина пиковых вирусных титров у пациентов с мелкоклеточной карциномой свидетельствует о внутриопухолевой репликации вируса. Альтернативно, возможно, что репликация SVV-001 имела место в другой ткани или без дискретной локализации. Материал вскрытия был доступен у одного из пациентов с мелкоклеточной карциномой, который умер от прогрессирующего заболевания на 28 день после введения SVV-001.Пик титра SVV-001 у этого человека был на 3-й день и измерялся более чем 10 9 п.о. / мл крови. У пациента были обширные метастазы в печень. Иммуногистохимический анализ срезов органов, не пораженных раком, включая почки и поджелудочную железу, не выявил обнаруживаемых частиц SVV-001. Напротив, иммуноокрашивание метастатических поражений печени продемонстрировало интенсивное и специфическое внутриклеточное окрашивание вирусных частиц в опухолевых клетках, но не обнаружило наличие вируса в соседней нормальной печени ().Таким образом, внутривенное введение SVV-001 было связано с высокоспецифической внутриопухолевой инфекцией и репликацией онколитического вируса без очевидного вовлечения окружающих нормальных клеток. Кроме того, несмотря на введенную низкую дозу и выработку системных нейтрализующих антител, внутриопухолевая репликация SVV-001 у этого пациента сохранялась с продолжающимся продуцированием вирусных частиц до 4 недель после введения дозы.

Иммуногистохимическое окрашивание вирусных частиц в опухолевых и не вовлеченных тканях.Срезы тканей пациента с широко пролеченным прогрессирующим мелкоклеточным раком, который умер от прогрессирующего заболевания на 28 день после введения SVV-001 (10 7 п.о. / кг), подвергали иммуногистохимическому окрашиванию с использованием мышиной антисыворотки SVV-001 в качестве первичного антитела или неиммунная мышиная сыворотка в качестве контроля. Обширная внутриклеточная репликация вируса демонстрируется в опухолевой ткани, но не на срезах незлокачественной ткани (400 ×).

Доказательства клинической активности

Ни у одного из пролеченных пациентов не было объективного противоопухолевого ответа (частичного или полного) по критериям RECIST.Однако в когорте пациентов с мелкоклеточной карциномой, получавших 10 7 вп / кг, у одного пациента с ранее быстро прогрессирующим заболеванием после терапии цисплатином / этопозидом и иринотеканом наблюдалось стабилизация заболевания, которая сохранялась в течение десяти месяцев после инфузии SVV-001. Этот пациент остается живым более чем через 3 года после лечения SVV-001. Пять пациентов с другими нейроэндокринными опухолями испытали незначительную реакцию, включая пациента, компьютерная томография которого показана на дополнительном рисунке.Уменьшение опухоли у этого человека с плохо дифференцированной нейроэндокринной опухолью не соответствовало критериям ответа RECIST из-за стойкости заболевания в брюшной полости. У пациента с карциноидом со стабильным заболеванием, который получил серию ПЭТ-сканирований до и после терапии (не предписано протоколом), было отмечено снижение> 50% опухоли SUV после введения SVV-001. Кривые выживаемости без прогрессирования и общей выживаемости для мелкоклеточной карциномы и других групп нейроэндокринных опухолей показаны соответственно.

Общая выживаемость без прогрессирования и общая выживаемость после введения SVV-001. Графики выживаемости Каплана – Мейера представлены по типу заболевания. Все когорты доз смешанных нейроэндокринных препаратов объединены. Включены все предметы исследования. ВБП — выживаемость без прогрессирования заболевания; ОС, общая выживаемость.

Обсуждение

В этом первом исследовании фазы I на людях репликационно-компетентного онколитического пикорнавируса мы демонстрируем, что внутривенное введение SVV-001 хорошо переносится в дозах до 10 11 пар. к спектру преходящих гриппоподобных симптомов.Даже пациенты с метастатическим раком, прошедшие интенсивное предварительное лечение, смогли развить эффективный гуморальный иммунный ответ, избавившись от обнаруживаемого инфекционного SVV-001 из жидкостей организма в течение месяца после введения вируса. В совокупности эти наблюдения предполагают, что клиническое введение SVV-001 внутривенно безопасно.

Интересно, что подгруппа пациентов с мелкоклеточной карциномой продемонстрировала окончательные доказательства репликации SVV-001, при этом уровни циркулирующего свободного вируса в крови достигли пика через несколько дней после введения на уровнях, значительно превышающих количество введенных вирусных частиц.Это также было связано с заметно более высоким титром нейтрализующих антител, чем у других пациентов, получавших ту же дозу. Высокий уровень репликации вируса, специфичный для группы мелкоклеточной карциномы, подтверждает доклинические наблюдения за чувствительностью этого типа опухоли к SVV-001 (4). Стойкая продукция SVV-001 была очевидна и конкретно ограничена злокачественной опухолью у пациента с метастатической мелкоклеточной карциномой. Эти данные служат важным доказательством принципа действия этого нового противоракового агента, демонстрируя избирательность опухолевых клеток к вирусной инфекции и способность к продолжающейся внутриопухолевой репликации вируса, несмотря на системный иммунитет.

Ни один из пациентов с МКРЛ в этом исследовании не получал доз более 10 7 п.н. / кг. Доклинические эксперименты на человеческих моделях ксенотрансплантата пермиссивных опухолей, таких как SCLC, показывают, что дозы ниже 10 8 п.н. / кг, даже в контексте иммуносупрессивного мыши-хозяина, вызывают менее эффективные и менее стойкие противоопухолевые ответы, чем дозы в диапазоне 10 от 10 до 10 11 вп / кг (4). В когортах с увеличением дозы в этом исследовании мы показали, что дозы в 10000 раз выше, чем те, которые давались пациентам с мелкоклеточной карциномой в этом исследовании (т.е. 10 11 вп / кг) безопасны и хорошо переносятся. Значительный интерес представляет исследование существенно более высоких доз у пациентов с МРЛ. Чтобы оценить это, в Северо-центральной группе лечения рака было начато исследование фазы II SVV-001, в которое были включены пациенты с обширной стадией SCLC. В этом рандомизированном исследовании фазы II оценивается введение 10 11 в.п. / кг SVV-001 после химиотерапии по сравнению с плацебо у 90 субъектов (45 на группу).

Биологическая основа высокоселективной проницаемости этого онколитического вируса по отношению к подмножеству раковых клеток человека неизвестна, и она будет иметь большое значение для руководства будущей клинической разработкой этого агента.Лабораторные работы по определению основных компонентов рецептора SVV-001, пути проникновения вируса и репликации вируса продолжаются. Результаты этих исследований могут помочь направить эту терапию именно на подгруппу пациентов, которые, скорее всего, получат пользу от введения SVV-001. Ключевой особенностью недавно начатого исследования фазы II, описанного выше, будет сбор образцов для корреляционного анализа этих предполагаемых детерминант проницаемости SVV-001.

Смешанный ответ, наблюдаемый у пациента, показанный на дополнительном рисунке (заметное уменьшение одних опухолевых масс, но не других), предполагает, что гетерогенность опухоли внутри пациента также должна быть исследована в будущих клинических исследованиях этого агента.Объяснение этой гетерогенности может включать вариабельную экспрессию компонентов вирусного рецептора или вариабельный доступ вируса к опухолевым клеткам в различных микросредах. Учитывая неофициальное наблюдение снижения метаболической активности опухоли на основе серийного ПЭТ-сканирования у пациента с карциноидом, несмотря на стабильное заболевание по критериям размера, функциональную визуализацию также следует учитывать в будущих исследованиях этого цитолитического вируса.

У всех пациентов, получавших лечение в рамках этого исследования I фазы, выработались нейтрализующие антитела к SVV-001.В конечном итоге это может оказаться палкой о двух концах при разработке этого агента; обнадеживающее открытие в отношении безопасности, но оно могло ограничить возможность повторного терапевтического введения. Одним из подходов к повторному дозированию может быть введение вместе с иммунодепрессивным цитотоксическим агентом: циклофосфамид, лекарство, клинически используемое для лечения SCLC, является эффективным супрессором гуморального иммунитета (11, 12). Альтернативно, SVV-001 можно вводить вместе со специфическим ингибитором В-лимфоцитов, таким как анти-CD20-антитело ритуксимаб.Эти концепции требуют дополнительного тестирования на соответствующих иммунокомпетентных доклинических моделях.

SVV-001 — первый онколитический пикорнавирус, протестированный на людях. Этот агент имеет несколько теоретических преимуществ перед другими онколитическими вирусами, способными к репликации. Мы обнаружили, что введение SVV-001 имеет минимальную токсичность, может привести к опухоли после внутривенного введения, демонстрирует специфическую и стойкую внутриопухолевую репликацию и связано с предварительными доказательствами противоопухолевой активности у пациентов, подвергшихся тщательному предварительному лечению.Продолжение исследований, направленных на понимание основ специфичности опухоли SVV-001 и оптимизацию его клинической применимости, дает многообещающие результаты пациентам с запущенным SCLC и другими допустимыми типами опухолей.

Трансляционная релевантность

В этой статье описываются результаты первого в своем классе исследования фазы I нового онколитического пикорнавируса с селективным тропизмом для рака с нейроэндокринной дифференцировкой. Эта вирусная терапия преодолевает многие препятствия, которые ограничивали предыдущие попытки разработать онколитические вирусы, в частности, включая аденовирусные и ретровирусные векторы.Ключевые фармакодинамические корреляты включают демонстрацию того, что пикорнавирус может реплицировать in vivo после внутривенного введения, что репликация вируса конкретно ограничена опухолью и что активная репликация сохраняется до 28 дней после введения вируса. Противоопухолевая активность наблюдалась у пациентов с мелкоклеточным раком легкого. Эта работа подтолкнула к дальнейшим исследованиям II фазы этого агента как у пациентов с мелкоклеточным раком легкого, так и у педиатрических пациентов с нейроэндокринным раком.

Благодарности

Раскрытие информации о потенциальных конфликтах интересов

KDB, PSR и PLH были или являются сотрудниками Neotropix, Inc.

Ссылки

1. Джемал А., Сигель Р., Уорд Е., Хао Й., Сюй Дж. , Тун MJ. Статистика рака, 2009. CA Cancer J Clin. 2009. 59: 225–249. [PubMed] [Google Scholar] 2. Murray N, Turrisi AT., III Обзор методов первой линии лечения мелкоклеточного рака легкого. J Thorac Oncol. 2006; 1: 270–278. [PubMed] [Google Scholar] 3. Рудин С.М., Ханн С.Л., Павлин С.Д., Уоткинс Д.Н.Новые системные методы лечения мелкоклеточного рака легкого. J Natl Compr Canc Netw. 2008. 6: 315–322. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 4. Редди П.С., Берроуз К.Д., Хейлз Л.М., Ганеш С., Джонс Б.Х., Идамаканти Н. и др. Вирус долины Сенека, онколитический пикорнавирус, доставляемый системно, и лечение нейроэндокринного рака. J Natl Cancer Inst. 2007; 99: 1623–1633. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 5. Хейлз Л.М., Ноулз, штат Нью-Джерси, Редди П.С., Сюй Л., Хэй С., Халленбек, PL. Полный анализ последовательности генома вируса долины Сенека-001, нового онколитического пикорнавируса.J Gen Virol. 2008. 89: 1265–1275. [PubMed] [Google Scholar] 6. Венкатараман С., Редди С.П., Лу Дж, Идамаканти Н., Халленбек П.Л., Редди В.С. Структура вируса-001 долины Сенека: онколитический пикорнавирус, представляющий новый род. Состав. 2008. 16: 1555–1561. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 7. Венкатараман С., Редди С.П., Лу Дж, Идамаканти Н., Халленбек П.Л., Редди В.С. Кристаллизация и предварительные рентгеноструктурные исследования вируса Seneca Valley-001, нового члена семейства Picornaviridae. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun.2008. 64: 293–296. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 8. Wadhwa L, Hurwitz MY, Chevez-Barrios P, Hurwitz RL. Лечение инвазивной ретинобластомы на мышиной модели с использованием онколитического пикорнавируса. Cancer Res. 2007. 67: 10653–10656. [PubMed] [Google Scholar] 10. О’Рейли Д., Миллер Л., Лаккоу В. Титрование вирусных запасов, векторы экспрессии бакуловирусов: лабораторное руководство. Оксфорд: издательство Оксфордского университета; 1994. [Google Scholar] 11. Бродский Р.А., Джонс Р.Дж. Интенсивная иммуносупрессия с применением высоких доз циклофосфамида, но без спасения стволовых клеток при тяжелом аутоиммунитете: преимущества и недостатки.Аутоиммунитет. 2008. 41: 596–600. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 12. Перини П., Калабрезе М., Ринальди Л., Галло П. Комбинированная терапия на основе циклофосфамида для аутоиммунитета. Neurol Sci. 2008; 29 (Приложение 2): S233 – S234. [PubMed] [Google Scholar]

Разработка идеального бизнес-плана — SVV

Есть большое количество компаний, пытающихся решить сегодняшние задачи. Однако многие из этих компаний терпят неудачу из-за неубедительной бизнес-модели. Давайте посмотрим, как вы, как основатель стартапа, можете преодолеть эти проблемы и создать надежную бизнес-модель, которая будет жизнеспособной на долгие годы.

Есть ли в нем ценность?

Прежде чем разработать идеальный бизнес-план, вам необходимо выяснить, подходит ли рынок для услуги / продукта, которые вы собираетесь предложить. По данным CBInsights, «42% стартапов терпят неудачу из-за того, что они не подходят для рынка». Итак, проверка вашей идеи имеет решающее значение перед тем, как начать свой бизнес. Поговорите с друзьями и семьей. Узнайте их мнение о своей идее. Сформируйте онлайн-сообщество и спросите отзывы у своих коллег. Не тратьте время на то, чтобы заниматься бизнесом, который вам не подходит.

Я пишу эту статью не для того, чтобы рассказать вам, «как» создать идею. Скорее, как убедиться, что вы работаете в направлении устойчивого развития. Возьмем, к примеру, знаменитую Juicero, соковыжималку с подключением к Wi-Fi. В этой компании удивительно то, что сумма, которую они собрали, достигла 120 миллионов долларов США, но они все равно потерпели неудачу. Огромная причина того, почему они потерпели неудачу, заключается в том, что их продукт не подходил для рынка, он никому не нравился. Есть много причин, по которым Juicero потерпел неудачу, но одно можно было сказать наверняка: рынок не нуждался в этом.

Конкурс

Вы будете удивлены количеством стартапов, желающих изобрести следующий «смартфон». Как что? Зачем вам работать над продуктом, рынок которого уже полностью доминирует? Развивая свой бизнес, помните, что у вас будет конкуренция. Но что отличает ваш продукт / услугу от всех остальных? Ваш продукт / услуга должен быть инновационным, уникальным или существенно отличаться от всего, что уже есть на рынке.Иначе ты никогда не сможешь расти.

Начать с конца

Этот совет, безусловно, один из самых важных. Создайте цель. Представьте себе, как выглядит финишная черта. Решите, куда вы хотите, чтобы ваша компания в конечном итоге попала. Есть много компаний, которые намеревались решить следующую большую проблему! Конечно, пойди и реши. Но без четкого видения маловероятно, что ваша компания будет расти. В противном случае вы будете бесцельно блуждать без направления. Представьте, как вы хотите, чтобы ваша компания вышла, будь то IPO, M&A или просто рост.

Как будет выглядеть ваша компания через два, пять и десять лет? Составьте список целей, которых вы должны достичь, не забывая при этом свой план выхода. Успех вашей компании зависит исключительно от того, чем вы ее решите. Однако многие основатели считают деньги успехом. В этом случае рост доходов — хороший способ измерить ваш рост.

Допустим, через два года вы хотите, чтобы ваша компания окупилась, увеличив число клиентов на 10%. Составьте миссии о том, как этого добиться.Пятилетний план будет приносить прибыль в размере 12% + каждый год, а расширение команды более чем на 10%, то же самое, создаст план того, как этого добиться. У всего, что вы делаете в своей компании, должна быть причина, иначе вам будет сложно расти и поддерживать.

Быстрые указатели

Теперь я затронул некоторые ключевые области, которые помогут вам составить идеальный бизнес-план. Однако вот контрольный список, который следует учитывать при разработке бизнес-плана.

  • Краткий обзор вашего бизнеса — Создайте обзор своего бизнеса с указанием проблем современного мира и того, как ваша компания их решает.
  • Описание — Опишите свою компанию. Помните, что не следует использовать отраслевой жаргон, а лучше помнить о своем конечном потребителе. Упростите видение своей компании, чтобы люди могли легко найти отклик у ваших целей.
  • Анализ рынка — Один из самых важных моментов. Помните, что более 40% стартапов терпят неудачу из-за отсутствия потребности рынка. Внимательно изучите свой рынок, чтобы убедиться, что у вас будет жизнеспособный бизнес.
  • Структура компании — Учредитель нередко занимает множество должностей в компании.Но это тоже может быть плохо, не бойтесь нанимать и делегировать определенные должности, чтобы высвободить свое время. Хороший совет — распределите все рабочие роли и распределите людей, которые вам понадобятся для их выполнения.
  • Маркетинг и продажи — Конечно, это важный аспект, о котором следует подумать при разработке бизнес-плана. Используя большой объем информации, собранной вами в ходе маркетинговых исследований, жизненно важно разработать сильную стратегию «выхода на рынок». В противном случае ваш продукт почти мертв.
  • Финансирование — Вторая причина, по которой стартапы терпят неудачу, заключается в том, что у них заканчиваются деньги. Никогда не недооценивайте начальный капитал, необходимый для выхода на рынок (особенно в области оборудования). Будьте внимательны при расчете необходимых вам средств.
  • Финансовые прогнозы — Наконец, вам нужно будет дать представление о видении роста вашей компании. Поступая таким образом, вам нужно будет предоставить свой финансовый статус, а также прогнозы / доказательства в отношении будущих областей роста.

Заключение

Создание компании — не проблема. Есть много вещей, о которых вам нужно подумать еще до того, как отправиться в это путешествие. Многие основатели, с которыми я разговаривал, пытаются справиться со всем самостоятельно, что в конечном итоге приводит их к выгоранию. Не походите на них, составьте бизнес-план как можно лучше и работайте над достижением своих целей. План может меняться по ходу дела, на самом деле, он будет меняться, но ваши цели всегда должны оставаться неизменными.

Как угадать коды безопасности кредитной карты — Naked Security

Если вы когда-либо использовали свою кредитную карту в Интернете или по телефону, вас, вероятно, просили ввести что-то, неофициально известное как «короткий код» или «код безопасности».

Обычно это трехзначное число, физически напечатанное (но не тисненое) на правом конце полосы для подписи на обратной стороне карты.

Трех цифр недостаточно для создания пароля, и в нормальных обстоятельствах они бы не использовались.

Но для так называемых транзакций без карты , CVV или Card Verification Value, как его обычно называют, обеспечивает удобную степень защиты от одного из наиболее распространенных видов мошенничества с кредитными картами, а именно скимминга.

Скимминг — это когда мошенники используют заминированный считыватель карт, например, наклеенный на настоящий считыватель карт на банкомате или хитро зажатый в слот для карты на платежном терминале, чтобы прочитать и записать магнитную полосу на вашей карте.

Даже если у вас есть карта с чипом и PIN-кодом, магнитная полоса содержит почти достаточно информации, чтобы мошенник убедил веб-сайт, что у них есть ваша карта.

Например, ваше имя, указанное на лицевой стороне карты, «длинный код», обычно 16 цифр на лицевой стороне карты, и дата истечения срока действия — все это есть на магнитной полосе, готовой к тайному копированию и использованию. В интернете.

Таким образом, CVV действует как очень низкотехнологичный барьер для мошенничества без предъявления карты, потому что большинство веб-сайтов также требуют, чтобы вы вводили CVV, который не хранится на магнитной полосе и, следовательно, не может быть просмотрен.

Конечно, здесь есть множество оговорок, в том числе:

  • Поставщик не должен хранить ваш CVV после завершения транзакции. Полезность CVV в плане безопасности зависит от того, что он никогда не будет лежать где-нибудь там, где впоследствии может стать жертвой кибер-воров.
  • Платежная система не должна допускать слишком много предположений на вашем CVV. Благодаря неограниченному количеству предположений и трехзначному коду, даже мошенник, работающий полностью вручную, может опробовать все возможности за несколько часов.

Угадывание CVV

Исследователи из Университета Ньюкасла в Великобритании недавно решили посмотреть, насколько эффективно выполняется второе предостережение, попытавшись угадать CVV.

Первоначальные результаты были обнадеживающими: после нескольких догадок на одном и том же веб-сайте они оказывались заблокированными и не могли двигаться дальше.

Затем они попробовали так называемую распределенную атаку, используя программу для автоматической отправки запросов на оплату множеству веб-сайтов одновременно.

Вы можете видеть, к чему это идет.

Если каждый веб-сайт дает вам пять предположений, то при 200 одновременных предположениях на ряде разных веб-сайтов вы можете получить 1000 предположений (200 × 5) в быстром порядке, не вызывая блокировки ни на одном из сайтов.

А с помощью 1000 предположений вы можете охватить все возможности CCV от 000 до 999 , останавливаясь, когда вам это удастся.

Затем вы можете перейти на 201-й сайт и заказать все, что вам нравится, потому что вы «решили» CVV, даже не увидев карточку жертвы.

Другими словами, вы ожидаете, что внутренние серверы платежной системы будут отслеживать не только количество предположений CVV с каждого сайта, но и общее количество предположений с момента вашей последней успешной покупки с любого сайта.

По данным Университета Ньюкасла, Mastercard остановила такого рода распределенное угадывание, а Visa этого не сделала.

Стоит ли волноваться?

Учитывая, насколько часто случается мошенничество с кредитными картами без каких-либо уловок по угадыванию CVV, мы не думаем, что это сигнал для того, чтобы полностью отказаться от покупок в Интернете в этот праздничный сезон.

В конце концов, если какой-либо из сайтов или сервисов, которыми вы недавно пользовались, сохранял ваш CVV, даже если только для того, чтобы временно записать его во время обработки вашей транзакции, вы все равно будете подвержены риску, поэтому CVV не являются существенным препятствием для решительных мошенников.

И если вы когда-либо помещали данные своей карты на взломанный или мошеннический веб-сайт — даже (или, возможно, особенно), если транзакция так и не была завершена, — то у мошенников, вероятно, уже есть все необходимое для клонирования вашей карты.

Что делать?

Независимо от поставщика карты вам помогут несколько простых мер предосторожности:

  • Не упускайте карту из виду. Мошенники, работающие вне поля зрения, даже на несколько секунд, могут легко просмотреть вашу карту, просто пропустив ее через два считывателя: реальный для обработки транзакции, которую вы ожидаете, и ручной скиммер для копирования данных вашей карты. Они также могут сфотографировать обратную сторону карты, чтобы записать вашу подпись и CVV.
  • Попробуйте использовать слот для чипа и PIN-кода при личной оплате. Большинство считывателей чипов требуют, чтобы вы вставили карту достаточно глубоко, чтобы подключиться к чипу.Это оставляет большую часть магнитной полосы торчащей, что затрудняет просмотр деталей карты.
  • В случае сомнений найдите другого продавца или банкомат. Большинство банкоматов по-прежнему требуют, чтобы вы вставляли карту целиком, поэтому их можно оснастить наклеенными скиммерами с магнитной полосой. Если вы не уверены, почему бы не попробовать и не пошевелить? Скиммеры часто кажутся неправильными, потому что они не являются частью оригинального банкомата.
  • Выбирайте интернет-магазины, которым доверяете. Проверьте адресную строку на странице оплаты, убедитесь, что вы находитесь на зашифрованном (HTTPS) сайте, и, если вы видите какие-либо предупреждения веб-сертификатов, немедленно выйдите из системы.
  • Следите за своими заявлениями. Если в вашем банке есть служба для отправки вам сообщения, уведомляющего вас о совершении транзакции, подумайте о том, чтобы включить ее.

Что такое номер CVV кредитной карты? Где вы можете найти его?

Вы покупаете новую обувь в Интернете.

Или заказать цветы для мамы по телефону.

И вдруг вас попросят ввести «CVV» или защитный код вашей карты.

А? Что такое номер CVV кредитной карты? А где его найти?

Как найти свою кредитную карту CVV?

CVV означает «проверочная стоимость карты», а служит дополнительной функцией безопасности, когда вы совершаете покупки «без карты». — например, через Интернет или по телефону.

Его также называют кодом безопасности карты (CSC), CVV2 или CVC2, и он отображается как на кредитных, так и на дебетовых картах.

Вот где найти свою кредитную карту CVV:

  • Код безопасности Visa, Mastercard и Discover состоит из трех цифр. Он отображается на обратной стороне вашей карты справа от панели подписи. Перед ним вы можете увидеть номер счета вашей кредитной карты частично или полностью.
  • Защитный код American Express (также называемый идентификационным номером карты или CID) состоит из четырех цифр.Он отображается на лицевой стороне вашей карты, вверху справа от номера вашего счета.

Фото примеров CVV-кодов кредитных карт

Ниже приведены фотографии лицевой и оборотной сторон карт, которые используют четыре основные сети карт, с кодом безопасности, выделенным желтым цветом.

Код безопасности Amex

Лицевая сторона карты, вверху справа от номера счета.

Код безопасности Visa

Оборотная сторона карточки, справа от поля для подписи.

Код безопасности Mastercard

Оборотная сторона карточки, справа от поля для подписи.

Узнайте код безопасности

Оборотная сторона карточки, справа от поля для подписи.


Инсайдерский совет

CVV вашей карты отличается от вашего PIN-кода (личного идентификационного номера), который вы могли создать при открытии учетной записи. С дебетовыми картами вы используете свой PIN-код при снятии наличных в банкомате или совершении покупки в магазине. С кредитными картами вы используете свой PIN-код при получении аванса наличными в банкомате (что, мы надеемся, вы никогда не сделаете!), Или, с некоторыми картами, вам, возможно, придется использовать свой PIN-код для проверки транзакций лично в определенных кассовых терминалах.

Почему кредитные карты имеют коды CVV?

Ваш CVV действует как мера безопасности для транзакций без предъявления карты. Поскольку интернет-магазины не могут проверить вашу подпись, многие запрашивают ваш CVV-код, чтобы подтвердить, что вы являетесь законным владельцем кредитной карты.

Таким образом, даже если вор украдет номер вашей кредитной карты с помощью скиммера, ему или ей не повезет на сайтах, требующих CVV для покупок. CVV не хранится на магнитной полосе на обратной стороне карты — он предназначен для обозначения владения картой.

Коды

CVV также помогают защитить вас в случае утечки данных. Это связано с тем, что отраслевые правила запрещают продавцам хранить коды CVV. Таким образом, хотя вы можете сохранить номер своей карты и личную информацию на веб-сайте продавца, обычно вам нужно вводить CVV каждый раз, когда вы совершаете покупку.

Тем не менее, не все сайты требуют коды CVV. А некоторые сайты запрашивают ваш CVV только при первом заказе товаров по определенному адресу, а затем предполагают, что последующие транзакции являются законными.

Как сохранить номер кредитной карты в безопасности?

Хотя коды CVV могут показаться поводом для беспокойства, вам все же нужно быть бдительными, когда речь идет о безопасности вашей карты. Помните, что не все продавцы запрашивают коды CVV — и даже если они это сделают, мошенники потенциально могут использовать вредоносное ПО, чтобы захватить ваш код во время виртуальных транзакций.

Чтобы оставаться в безопасности при совершении покупок в Интернете, мы рекомендуем следующие меры предосторожности:

  • Подпишитесь на менеджер паролей: LastPass — это бесплатная программа, которая создает и хранит надежные уникальные пароли для каждого сайта.Такой простой — но часто упускаемый из виду — способ повысить вашу онлайн-безопасность.
  • Избегайте сохранения ваших личных данных на сайтах розничных продавцов: Конечно, это удобно, но бороться с кражей личных данных — нет. Так что потратьте лишние 30 секунд, чтобы вынимать свою кредитную карту каждый раз, когда вы совершаете покупку. (И никогда не сохраняйте свои данные на сайтах, которые не запрашивают CVV.)
  • Используйте «виртуальные кредитные карты»: Узнайте у эмитента кредитной карты, предлагает ли он виртуальные кредитные карты. Эта функция создает временные номера счетов, которые маскируют ваш настоящий номер карты, что позволяет легко избавиться от виртуального номера в случае его взлома.
  • Делайте покупки только на защищенных веб-сайтах: Перед покупками в Интернете убедитесь, что веб-сайт начинается с «https: //» — буква «s» в конце означает «безопасный» и означает, что ваша информация будет зашифрована.
  • Не переходите по ссылкам в подозрительных письмах: Один из способов получить ваш CVV-код для фишеров — отправить легитимное электронное письмо. Вам может быть предложено позвонить по номеру телефона или щелкнуть ссылку, а затем ввести данные своей кредитной карты. Следите за этими электронными письмами (распространенные предупреждающие знаки включают орфографические ошибки или опечатки) и делитесь своей информацией только в том случае, если вы связались с банком или розничным продавцом по его опубликованному электронному адресу или номеру.
  • Отслеживайте свои счета: Проверяйте свои выписки на предмет подозрительной активности, а также периодически проверяйте свои кредитные отчеты. Если ваша карта утеряна или украдена, немедленно позвоните в эмитент кредитной карты, чтобы заблокировать вашу учетную запись и запросить новую карту.

Поскольку кредитные карты обладают большей защитой, чем дебетовые карты, мы рекомендуем использовать их для любых транзакций без карты (кашля, эта Xbox, которую вы наблюдали на Amazon, кашель).

Но, несмотря на то, что лучшие кредитные карты имеют множество функций безопасности, они не идеальны.Сделайте все возможное, чтобы предотвратить мошенничество, но не забывайте время от времени проверять свои счета и выписки.

Так что оставайтесь умными — и покупайте безопасно!

Как найти код безопасности вашей кредитной карты

Защитный код вашей кредитной карты — иногда называемый CVV, CVV2, CSC или CVC — представляет собой трех- или четырехзначное число, напечатанное на лицевой или оборотной стороне вашей кредитной карты. Он отличается от номера счета вашей кредитной карты (они намного длиннее) и вашего PIN-кода (они являются личными и не отображаются на вашей кредитной карте).Чтобы помочь вам полностью понять, что вам нужно знать о коде безопасности вашей кредитной карты, обратите внимание на следующую основную информацию:

  1. Что такое защитный код кредитной карты?
  2. Почему следует защищать свой код безопасности
  3. Ваш защитный код — это не ваш PIN-код
  4. Где найти код безопасности
  5. Что делать, если вы не можете найти код безопасности

1. Что такое защитный код кредитной карты?

Коды безопасности кредитной карты — это трех- или четырехзначные числа, напечатанные на кредитной карте.От них часто требуется совершать покупки в Интернете, поскольку они помогают продавцам, у которых вы покупаете, проверить, есть ли у вас карта на момент покупки, что помогает предотвратить мошенничество.

Коды безопасности кредитной карты могут упоминаться с помощью различных сокращений, например:

  1. CVV или CVV2 (код значения проверки карты)
  2. CSC (Код безопасности карты)
  3. CVC или CVC2 (код подтверждения карты)
  4. CID (идентификационный номер карты)

2.Почему вы должны защищать свой код безопасности?

Защитный код кредитной карты — это инструмент для защиты вашего кредита, поэтому вам следует держать его под рукой. Никогда не делитесь им по телефону, по электронной почте или в текстовых сообщениях. Делая покупки в Интернете, придерживайтесь авторитетных продавцов и сайтов и остерегайтесь мошенничества, которое может запрашивать данные вашей карты.

Защита вашего кода важна, потому что, если кто-то знает номер вашей кредитной карты, дату истечения срока действия и код безопасности, они могут делать покупки в Интернете.У торговца не будет возможности узнать, что это не вы.

3. Ваш защитный код — это не ваш PIN-код

Ваш PIN-код — это ваш личный идентификационный номер; он полностью отличается от вашего защитного кода.

ПИН-код — это числовой код, который используется с дебетовыми и кредитными картами для авторизации транзакций, таких как выдача наличных или снятие наличных в банкомате. Напротив, используется код безопасности, например, чтобы продавец мог проверить, действительно ли вы являетесь владельцем карты, размещая заказ в Интернете.

Как и защитный код кредитной карты, защитите свой PIN-код при общедоступном вводе и никому не сообщайте его.

4. Где найти код безопасности

Разные эмитенты карт помещают свои коды безопасности в разные места:

На карточках Discover it® вы обычно найдете серию цифр, напечатанных на обратной стороне карточки, обычно либо на полосе для подписи, либо справа от нее. Независимо от количества цифр ваш защитный код состоит из трех последних цифр (они могут быть выделены курсивом).

5. Что делать, если вы не можете найти код безопасности

Если вы не можете найти свой защитный код или не можете прочитать его, потому что он блеклый или неразборчивый, позвоните в эмитент карты. Вы найдете номер телефона на обратной стороне карты.

Защитный код вашей кредитной карты предназначен для защиты от мошенничества. Разместите его на каждой из своих кредитных карт и будьте осторожны, когда делитесь им, чтобы снизить вероятность попадания в чужие руки.

Опубликовано 7 ноября 2016 г.

Обновлено 15 октября 2021 г.

Заявление об отказе от ответственности: Этот сайт предназначен для образовательных целей и не заменяет профессиональные консультации. Материал на этом сайте не предназначен для предоставления юридических, инвестиционных или финансовых советов и не указывает на наличие каких-либо продуктов или услуг Discover. Это не гарантирует, что Discover предлагает или одобряет продукт или услугу. За конкретным советом относительно ваших уникальных обстоятельств вы можете проконсультироваться с квалифицированным специалистом.

Рекомбинантных вакцин против вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая как платформы для экспрессии чужеродных антигенов

Вакцины против вируса ветряной оспы (VZV) индуцируют иммунитет против ветряной оспы у детей и против опоясывающего лишая у пожилых людей. Безопасность, эффективность и широкое использование вакцин VZV предполагают, что они также могут быть эффективными в качестве рекомбинантных вакцин против других инфекционных заболеваний, поражающих молодых и пожилых людей. Рассмотрены создание рекомбинантных вакцин VZV и их оценка на животных моделях.Рассмотрены потенциальные преимущества и ограничения рекомбинантных вакцин VZV.

1. Введение

Вакцины против вируса ветряной оспы (VZV) обеспечивают иммунную защиту от болезней, поражающих как молодых, так и пожилых людей. Живая аттенуированная вакцина против ветряной оспы (VARIVAX) иммунизирует детей от ветряной оспы — детской болезни, характеризующейся лихорадкой и везикулярной кожной сыпью. Вакцина VZV Zostavax защищает пожилых людей от опоясывающего лишая (опоясывающего лишая), везикулярного кожного заболевания, вызываемого реактивацией VZV латентно инфицированными нервными ганглиями.

Доказанная безопасность и эффективность вакцин против ветряной оспы и опоясывающего лишая поддерживают рекомбинантные вакцины VZV (rVZV) для индукции иммунитета не только против VZV, но и против других патогенов. Способность вакцин VZV безопасно индуцировать длительные гуморальные и клеточные иммунные ответы обеспечивает преимущества перед другими живыми аттенуированными векторами вакцины, а также перед убитыми и субъединичными вакцинами. В этом обзоре обобщены исследования по разработке и оценке векторов VZV в качестве рекомбинантных вакцин против других заболеваний.

1.1. Ветряная оспа и опоясывающий герпес

Ветряная оспа — очень заразное заболевание детей и подростков [1]. Инфекционный агент передается через аэрозоли при кашле и чихании или при прямом контакте с выделениями сыпи. После 10–14-дневного инкубационного периода возникают лихорадка и недомогание, а также характерная везикулярная сыпь на коже лица, туловища и конечностей. Ветряная оспа, как правило, является доброкачественным заболеванием у здоровых детей с симптомами, обычно полностью исчезающими в течение двух недель после начала заболевания и с последующим пожизненным иммунитетом против ветряной оспы.Однако осложнения могут включать пневмонию, ветряную оспу, гепатит, энцефалит и вторичные бактериальные инфекции. Дети с ослабленным иммунитетом, в том числе больные раком и СПИДом, особенно восприимчивы к тяжелой, иногда опасной для жизни ветряной оспе [2, 3]. Взрослые, которые избегают воздействия VZV в детстве, имеют более серьезные симптомы ветряной оспы и осложнения. Инфекция VZV у беременных в течение первых 28 недель беременности может привести к инфицированию плода и врожденным порокам [4].Позднее материнское инфицирование может вызвать ветряную оспу новорожденных. До плановой вакцинации от ветряной оспы ежегодно происходило 100–200 смертей, связанных с ветряной оспой, и 11 000 госпитализаций в США.

После разрешения основного заболевания VZV выявляет пожизненную латентную инфекцию в нервных ганглиях [5]. Позже вирус может реактивироваться, перемещаться по чувствительным нервам и повторно инфицировать кожу. Опоясывающий лишай, который возникает в основном, но не исключительно у пожилых людей, характеризуется односторонней болью и везикулярной сыпью, которые ограничиваются дерматомом, иннервируемым одним спинномозговым или черепным нервом [1].Опоясывающий лишай поражает примерно 20–30% людей с примерно одним миллионом случаев заболевания в США каждый год. Постгерпетическая невралгия, частое осложнение опоясывающего лишая, характеризуется сильной, иногда хронической болью. Пациенты с иммунодепрессивным раком и СПИДом подвержены риску тяжелой формы опоясывающего герпеса с возможным диссеминированным заболеванием [3].

Ацикловир и родственные аналоги нуклеозидов могут быть эффективными против ветряной оспы и опоясывающего лишая, особенно если их вводить на ранних стадиях развития инфекции.Однако профилактике вспышек болезни VZV способствовала разработка вакцин против VZV.

1.2. Вакцина VZV

Вакцина VZV VARIVAX индуцирует иммунитет и защиту от ветряной оспы у детей [1]. Вакцина, одобренная в США в 1995 году, является первой вакциной от вируса герпеса человека, лицензированной для клинического использования. Живая вакцина получена из клинического изолята, VZV Oka, и была аттенуирована путем пассирования в эмбрионе морской свинки и человеческих клетках WI38, хотя молекулярная основа аттенуации остается неизвестной.Первоначальная иммунизация рекомендуется детям в возрасте 12–15 месяцев, а затем повторная вакцинация в возрасте от 4 до 6 лет. Эта двухдозовая иммунизация, проводимая путем внутрикожной вакцинации, снижает заболеваемость ветряной оспой у детей на 90–95%. Вакцина против ветряной оспы в настоящее время рекомендуется в качестве обычной вакцинации детей в США, при этом ежегодно иммунизируются более 80% детей школьного возраста. Вакцинация также полезна для восприимчивых взрослых, которые подвержены риску тяжелой формы ветряной оспы. Вакцина хорошо переносится с незначительными побочными эффектами, включая болезненность в месте прививки, лихорадку и легкую сыпь.Вакцина VZV даже безопасна и эффективна для некоторых онкологических больных и некоторых пациентов с ослабленным иммунитетом, включая ВИЧ-инфицированных детей с депрессией CD4 + Т-клеток [6]. Вакцина не рекомендуется беременным женщинам. Вирус вакцины VZV «Ока» способен вызывать латентную инфекцию в нервных ганглиях и может реактивироваться, вызывая опоясывающий герпес, хотя частота, по-видимому, значительно ниже, чем частота, вызываемая вирусом VZV дикого типа [7, 8].

Вакцина против опоясывающего лишая (Zostavax) также состоит из живого ослабленного вируса VZV Oka, но вводится в дозе вируса, более чем в 10 раз превышающей дозу вакцины против ветряной оспы [9].Вакцина, вводимая путем подкожной инъекции, снижает частоту опоясывающего лишая и постгерпетической невралгии в целом на 50% и 67%, соответственно, и действует не менее 5 лет [10]. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило вакцину против опоясывающего лишая в 2006 году для людей в возрасте 50 лет и старше. Центры по контролю за заболеваниями (CDC) рекомендуют вводить эту вакцину взрослым в возрасте 60 лет и старше. Эффективность вакцины снижается с возрастом (64% у лиц 60–69 лет, 41% у лиц 70–79 лет и 18% у лиц старше 80 лет) [11].Наблюдаются лишь незначительные побочные эффекты, включая возможное раздражение в месте прививки и головную боль. Вакцина против опоясывающего лишая не одобрена для людей с ослабленным иммунитетом, хотя было показано, что она безопасна и эффективна для некоторых онкологических больных [12].

2. Вакцина VZV «Ока» как потенциальный рекомбинантный вектор вакцины

Вакцины VZV против ветряной оспы и опоясывающего лишая являются кандидатами в качестве носителей для доставки чужеродных антигенов и иммунизации против других инфекционных агентов.Вакцины VZV обладают высокой иммуногенностью, индуцируют длительные нейтрализующие антитела и клеточные иммунные ответы. Помимо доказанной безопасности, эффективности и широкого применения, вакцины обладают преимуществами в качестве вектора для экспрессии гетерологичных антигенов (1). Размер генома VZV (125 т.п.н.) позволяет стабильно вставлять несколько гетерологичных генов в определенные локусы без осуществляя репликацию вируса [28]. (2) VZV реплицируется в ядре клетки, поэтому чужеродные гены могут быть правильно сплайсированы, а вирусные антигены экспрессируются, процессируются и представляются в инфицированных клетках, как при естественной инфекции [25].(3) Компетентный к репликации вирус усиливает экспрессию чужеродного антигена — потенциальное преимущество перед векторами с дефектом репликации. (4) индуцируется защитный Т-клеточный иммунный ответ Th2-типа против VZV и чужеродного антигена [26]. (5) ДНК VZV не содержит генетических элементов, связанных с онкогенезом. (6) Диапазон хозяев VZV ограничен человеком, ограничение неконтролируемого распространения в окружающей среде. (7) Периодическая субклиническая реактивация VZV с латентного периода может обеспечить рестимуляцию иммунных ответов на VZV и чужеродные антигены, как обсуждается ниже [58].Рекомбинантная вакцина против ветряной оспы или опоясывающего лишая может идеально подходить для профилактики других заболеваний, от которых страдают дети или пожилые люди, соответственно. Вакцина rVZV обеспечивает большую безопасность в качестве вакцины для населения в целом по сравнению с другими живыми вирусными переносчиками, такими как вирус осповакцины, а вакцина против ветряной оспы является единственной живой вирусной вакциной, одобренной для лечения определенных групп рака и пациентов с ослабленным иммунитетом, включая детей с ВИЧ-инфекцией [ 13].

3. Генетические подходы к генерации rVZV

Первоначальные подходы к вставке чужеродных генов в геном VZV включали котрансфекцию чувствительных клеток меланомы человека (MeWo) геномной ДНК VZV и чужеродным геном, фланкированным гомологичными последовательностями ДНК VZV.В результате генетической рекомбинации были получены бляшки rVZV, которые были обнаружены иммуногистохимическим методом с использованием антител к продукту чужеродного гена [14]. rVZV очищали от бляшек после серийного размножения. Несмотря на успех, этот подход был трудоемким из-за клеточно-ассоциированной природы VZV, что затрудняло клональную изоляцию rVZV.

Разработка космидной системы для манипулирования геномом VZV была важным достижением в генетике VZV [15]. Геном VZV размером 125 т.п.н. клонировали в четыре перекрывающиеся космиды размером 30-45 т.п.н., которые котрансфицировали в клетки MeWo.Рекомбинация гомологичных перекрывающихся последовательностей ДНК приводит к инфицированию rVZV и вирусным бляшкам в течение десяти дней (рис. 1). Этот подход облегчает создание мутантов rVZV посредством сайт-специфического мутагенеза или встраивания чужеродных генов в отдельные космиды VZV с помощью расщепления с помощью RecA-ассистируемой эндонуклеазой рестрикции (RARE) [16] с последующей трансфекцией всех четырех космид VZV в клетки MeWo. Эффективность этой системы ограничена требованием эффективной трансфекции всех четырех космид в одну и ту же клетку и множественными событиями рекомбинации.


Усовершенствованием космидной системы была вставка всего генома VZV в бактериальную искусственную хромосому (BAC), что позволило стабильно поддерживать геном VZV в пределах E. coli (Рисунок 2) [18–20]. Инфекционный VZV может быть восстановлен после трансфекции ДНК rVZV-BAC в клетки MeWo. Последовательности ВАС были вставлены в межгенную область открытых рамок считывания (ORF) VZV 11 и 12 [18, 19] или между ORF 65 и 66 [20] и обычно фланкированы сайтами loxP , что позволяет удалить бактериальные клетки. векторные последовательности из генома VZV путем рекомбинации Cre .Недавнее достижение позволяет безмаркерное самоизрезание последовательностей ВАС после восстановления в клетках MeWo [20]. Разработка VZV-BAC обеспечивает эффективный подход для введения сайт-специфических мутаций и вставок, включая чужеродные гены, в геном VZV.


4. Вставка чужеродных генов в геном VZV

Большой размер (125 т.п.н.) ДНК VZV облегчает вставку одного или нескольких чужеродных генов в геном VZV. VZV кодирует несколько генов, которые не являются существенными для репликации in vitro и являются мишенями для встраивания чужеродных генов.Например, несколько rVZV включают чужеродный ген в ген вирусной тимидинкиназы (TK) [14, 21, 22]. Эти rVZV-вирусы реплицируются в культуре клеток так же эффективно, как и VZV дикого типа. Образование rVZV- облегчается путем отбора с помощью аналогов нуклеозидов, таких как бромдезоксиуридин. Однако вакцины против rVZV, полученные путем встраивания чужеродных генов в вирусный ген TK, могут быть клинически непригодными, поскольку эффективное противовирусное лечение инфекций VZV ацикловиром и другими аналогами нуклеозидов зависит от функциональных TK.В других случаях экзогенные гены вставляются в межгенные области ORF 12 и 13 VZV или между ORF 65 и 66.

Для вставки генов можно использовать различные методы рекомбинации, включая рекомбинацию RecA + и рекомбинацию Red . других патогенов в определенные сайты внутри космид VZV или BAC, используя преимущества гомологичных фланкирующих последовательностей VZV [20, 23]. Tn7-опосредованная сайт-специфическая транспозиция также использовалась для введения чужеродного гена в ДНК VZV-BAC [24].

Чужеродные гены внутри rVZV были экспрессированы с эндогенного промотора VZV, такого как промоторы TK или gE [14, 21]. В этих rVZV чужеродный ген экспрессируется как непосредственно ранний, ранний или поздний ген, как при естественной инфекции. В других rVZV чужеродный ген экспрессируется из промотора / энхансера предраннего гена цитомегаловируса человека (HCMV-IE) [23]. Хотя этот обычно используемый промотор индуцирует сильную экспрессию чужеродных генов, долговременная конститутивная экспрессия может привести к вредному накоплению рекомбинантного белка.

5. Рекомбинантные вакцины VZV

Несколько исследований подтверждают использование вакцинного вируса VZV в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов. Первоначально был получен rVZV, экспрессирующий мембранный гликопротеин вируса Эпштейна-Барра (EBV) (gp350 / 220) и очищенный от бляшек [14]. Промотор VZV gpI (gE) и исходные 35 аминокислот были слиты в рамке считывания с геном gp EBV, начинающимся с кодона 21. Эта конструкция, фланкированная последовательностями ДНК VZV TK, котрансфицировалась ДНК VZV Oka в клетки MeWo.Гомологичная рекомбинация последовательностей TK позволила встраивать gp EBV в ДНК VZV внутри вирусного гена TK, что подтверждается гибридизацией саузерн-блоттинга. Приблизительно 10% вирусных бляшек экспрессировали антиген gp EBV, как это было обнаружено иммуногистохимическим методом с использованием моноклональных антител против EBV. Антиген EBV был гликозилирован и представлен на клеточных плазматических мембранах аналогично экспрессии в EBV-инфицированных клетках [14]. Gp EBV был также продемонстрирован на вирионах rVZV с помощью иммунной электронной микроскопии.Благодаря инсерционной инактивации вирусного гена TK, rVZV реплицировался в инфицированных клетках MeWo в присутствии бромдезоксиуридина, и это свойство можно использовать для отбора rVZV.

rVZV Oka, экспрессирующий поверхностный антиген гепатита B (HBs), был получен путем встраивания гена HBs в ORF вирусной TK [21, 25]. Ген HBs экспрессировался с промотора VZV TK, инициировался кодоном инициации VZV TK ATG, за которым следовали кодоны для 25 аминокислот пре-S2 HBs и всего белка HBs.Конструкцию котрансфицировали ДНК VZV Oka в клетки MRC-5 (легкое человека). Вирус rVZV-HBs был обнаружен иммунофлуоресценцией с использованием моноклональных антител к HBs и очищен от бляшек. HBs были синтезированы как белки 26К и 30К в инфицированных клетках. HBs были гликозилированы N- и O-связанными гликанами и секретировались в виде белков 30К и 35К в супернатанте культуры [25]. Иммунизация морских свинок rVZV-HBs путем подкожной инокуляции индуцировала титры антител к HBs, сравнимые с титрами, индуцированными рекомбинантными HBs, генерированными в дрожжах.Кроме того, rVZV-HBs индуцировали опосредованные клетками Th2 иммунные ответы, включая гиперчувствительность замедленного типа [26].

Гликопротеин D (gD) простого герпеса 2 типа (HSV-2) был вставлен в уникальную короткую область генома VZV Oka в межгенных областях между ORF 65 и 66 с использованием генетической системы космид VZV [27]. Экспрессия gD HSV-2 более эффективно управлялась эндогенным промотором gD HSV-2, чем промотором gE VZV. GD HSV-2 экспрессировался в цитоплазме клеток и на поверхности клеток, инфицированных rVZV-HSV2gD, как показали иммунофлуоресценция и иммуноблот-анализ с использованием gD-специфических антител HSV-2.Кроме того, иммунная электронная микроскопия обнаружила gD HSV-2 на оболочке вирионов rVZV-HSV2gD. Экспрессия gD HSV-2 не влияла на репликацию вируса, поскольку VZV-HSV2gD реплицировался так же эффективно, как VZV Oka дикого типа в культуре клеток. Геном VZV не кодирует гомолог gD, что может быть связано с его видовой специфичностью для ограниченного числа линий клеток человека. Однако добавление gD HSV-2 не увеличивало пермиссивность VZV для клеток, которые он не реплицирует эффективно. Иммунизация морских свинок rVZV-HSV2gD индуцировала нейтрализующие антитела против HSV-2 и значительно снижала тяжесть заболевания, включая предотвращение паралича задних конечностей и смертности после интравагинального заражения HSV-2.В последующем исследовании был сконструирован rVZV Oka, экспрессирующий как gD, так и gB HSV-2 [28]. GD HSV-2 вставляли в ORF 13 VZV и экспрессировали с природного промотора gD HSV-2, тогда как gB HSV-2 вставляли в межгенную область ORF 65-66 и управляли ранним промотором SV40. Иммунизация морских свинок подкожной инокуляцией вызвала гуморальные и клеточные иммунные ответы против HSV-2 gB и gD, включая нейтрализующие антитела, и уменьшила вирусное выделение (> 100 раз), тяжесть заболевания и смертность после интравагинального заражения HSV-2.Однако вакцины rVZV-HSV2gD и rVZV-HSV2gBgD не предотвращали латентность и реактивацию HSV-2.

Вакцина против rVZV, экспрессирующая ген env ВИЧ-1, была сконструирована путем вставки гена env ВИЧ-1, кодирующего аминокислоты 296–463, слитые с антигеном HBs в гене TK VZV [22]. RVZV-HIVenv был выбран по устойчивости к соривудину, аналогу нуклеозида, и иммунофлуоресценции с использованием моноклонального антитела HIVenv. Иммунизация rVZV-HIVenv вызвала гуморальные и клеточные иммунные ответы против антигена gp120 ВИЧ у вакцинированных морских свинок.

Ген гемагглютинин-нейраминидазы (HN) вируса паротита (MV) был вставлен в ORF 13 VZV Oka с использованием системы VZV-BAC [23]. HN эффективно экспрессировался в цитоплазме и на поверхности клеток, инфицированных rVZV-MVHN, но не внутри оболочки очищенных вирионов. RVZV-MVHN реплицировался так же эффективно, как VZV дикого типа, и клеточный тропизм не изменялся. Иммунизация морских свинок индуцировала нейтрализующие антитела против VZV и MV. Последующее исследование показало, что гибридный белок MV (F) может быть вставлен в геном rVZV, и белок F эффективно экспрессируется в клетках, инфицированных rVZV-MVF [24].

Способность вакцины rVZV вызывать иммунитет против вируса иммунодефицита обезьян (SIV) была исследована на модели приматов, отличных от человека [29]. Ген env SIV, экспрессируемый промотором IE HCMV, был вставлен в геном VZV между ORF 65 и 66. Обезьяны-резус, иммунизированные rVZV-SIVenv путем интраназальной, интратрахеальной и внутримышечной инокуляции, генерировали антитела к VZV и env SIV, как показано с помощью ELISA. и иммунопреципитация. Однако SIV-специфические ответы цитотоксических Т-лимфоцитов или CD8 + Т-клеток не были обнаружены.После заражения патогенным SIVsmE660 животные, иммунизированные rVZV-SIV, демонстрировали повышенные титры SIV, быструю пролиферацию Т-клеток CD4 и усиленное прогрессирование обезьяньего СПИДа по сравнению с контрольными обезьянами, иммунизированными VZV дикого типа. Авторы предположили, что ограниченная способность VZV к репликации в тканях макак-резусов приводит к неэффективной индукции CD8 + Т-клеточных ответов и что пролиферация CD4 Т-клеток приводит к более высокой репликации SIV и ускоренному прогрессированию заболевания. Таким образом, нечеловеческие приматы могут не быть оптимальной животной моделью для оценки вакцин против rVZV-SIV.Этой проблемы можно избежать, используя модель обезьяньей ветряной оспы для оценки потенциальных рекомбинантных вакцин против ветряной оспы, как описано ниже.

rVZV, экспрессирующие чужеродные гены, также можно использовать для исследования молекулярных основ вирусного патогенеза. Космидную систему VZV использовали для создания rVZV Oka, экспрессирующего слитый белок, состоящий из непосредственного раннего гена ORF 63 (IE63) и его дублированного гена ORF 70, слитых в рамке считывания, чтобы гены люциферазы жуков-щелкунов [30]. Экспрессия IE63 была обнаружена в цитоплазме клеток меланомы, инфицированных rVZV-63 / 70- Luc-, с помощью конфокальной микроскопии, и вирус реплицировал in vitro так же эффективно, как VZV дикого типа.RVZV-63 / 70- Luc сохранил патогенность в модели патогенеза VZV на мышах SCIDhu. In vivo экспрессию IE63 в течение по меньшей мере 21 дня измеряли в ксенотрансплантатах кожи человека и ганглиев задних корешков, инфицированных rVZV-63 / 70- Luc , с помощью визуализации всего животного.

6. Симиан ветряная оспа, модель для оценки рекомбинантных вакцин против ветряной оспы

Исследования патогенеза VZV, противовирусной терапии и вакцин затруднены, поскольку прививка VZV лабораторным животным, от мышей до обезьян, не вызывает ветряную оспу.Однако естественное заболевание, очень напоминающее ветряную оспу человека, встречается у нечеловеческих приматов с симптомами, характеризующимися лихорадкой и везикулярной кожной сыпью [31]. Эпизоотии обезьяньей ветряной оспы спорадически возникают в помещениях, где содержатся обезьяны Старого Света [32]. При некоторых эпизоотиях клинические симптомы легкие, похожие на довольно доброкачественную ветряную оспу, обычно наблюдаемую у детей. В других случаях наблюдается более тяжелая диссеминированная ветряная оспа с симптомами, аналогичными тем, которые наблюдаются у некоторых взрослых и пациентов с ослабленным иммунитетом.

Возбудитель, вирус ветряной оспы обезьян (SVV), является вирусом герпеса приматов со свойствами, напоминающими VZV человека. Геномы SVV и VZV схожи по размеру и структуре, имеют гомологию ДНК на 70–75% и коллинеарны по организации генов [33–35]. SVV и VZV имеют антигенное родство, на что указывает способность иммунизации VZV обеспечивать иммунную защиту против острой обезьяньей ветряной оспы у обезьян после заражения SVV [36, 37]. Как и VZV, SVV вызывает скрытую инфекцию в нервных ганглиях и может реактивироваться, вызывая вторичное заболевание, подобное опоясывающему герпесу [38, 39].

Основываясь на генетическом и антигенном родстве SVV и VZV и клиническом сходстве между обезьяньей и человеческой ветряной оспой, SVV-инфекция приматов является полезной моделью на животных для изучения вирусного патогенеза и оценки эффективности противовирусных агентов и вакцин [31, 40 , 41].

Модель SVV предлагает подход к оценке рекомбинантных вакцин против ветряной оспы. Исходный рекомбинантный SVV (rSVV) был получен путем вставки гена зеленого флуоресцентного белка (GFP), экспрессируемого из промотора вируса саркомы Рауса (RSV), в межгенную область между ORF 65 и 66 SVV путем гомологичной рекомбинации [42].Встраивание гена GFP в эту область генома SVV не подавляло рост вируса в культуре клеток. RSVV-GFP был патогеном у африканских зеленых мартышек, вызывая некротический пневмонит при интратрахеальной инокуляции. Экспрессия GFP была обнаружена в инфицированных клетках, полученных из тканей легких, на 10 день после инфицирования.

Генетическая система космид SVV была использована для создания rSVV, экспрессирующего антигены SIV. Гены gag и env SIV были вставлены в ген гликопротеина C (ORF 14) SVV, и экспрессия антигена SIV в инфицированных клетках Vero была подтверждена иммунофлуоресценцией и иммуноблот-анализом с использованием моноклональных антител к SIV [43].RSVV-SIVenv и rSVV-SIVgag реплицировались в инфицированных клетках Vero так же эффективно, как и SVV дикого типа. RSVV-SIVenv и rSVV-SIVgag первоначально оценивали по коинфекции у инфицированных африканских зеленых мартышек, инокулированных интратрахеальной и подкожной инокуляцией. Вирусы были ослаблены у обезьян, на что указывало уменьшение кожной сыпи и виремии по сравнению с инфекцией SVV дикого типа [43, 44]. Ослабление, вероятно, связано с инсерционной инактивацией gC SVV, которая связана с вирулентностью VZV и вируса герпеса [45–47].Вакцины rSVV-SIVgag и SVV-SIVenv индуцировали гуморальный и клеточный иммунные ответы на антигены SIV, что выявлено анализами ELISA и ELISPOT, соответственно. У каждого из вирусов также установлена ​​вирусная латентность, на что указывает обнаружение ДНК rSVV в нервных ганглиях с помощью ПЦР-анализа.

В последующем исследовании оценивалась способность вакцин rSVV-SIVenv и rSVV-SIVgag иммунизировать макак-резус против инфекции SIV [44]. Иммунизация rSVVgag / env индуцировала антитела и клеточные иммунные ответы против SIV.Через шесть месяцев после иммунизации rSVV обезьян заражали патогенным штаммом вируса SIV SIVmac251-CX-1 путем внутривенной инокуляции. Иммунизация rSVV-SIVgag / env снижала вирусную нагрузку в плазме SIV в 100 раз у обезьян, иммунизированных rSVV-SIVgag / env, по сравнению с обезьянами, иммунизированными rSVV отрицательного контроля. Повышенная пролиферация CD4 + Т-клеток и ответные полифункциональные цитокины, специфичные для SIV, коррелировали со снижением виремии у обезьян, иммунизированных rSVV-SIVgag / env [48]. Результаты этого исследования показывают, что вакцина rVZV-HIV может быть эффективным методом вакцинации против СПИДа.

Вакцина против rVZV, экспрессирующая антигены респираторно-синцитиального вируса (RSV), может быть эффективной для иммунизации детей или пожилых людей, которые наиболее восприимчивы к респираторным заболеваниям, вызванным RSV. Чтобы оценить рекомбинантную вакцину против ветряной оспы, rSVV, экспрессирующий гликопротеин G RSV и матричный белок M2, были сконструированы с использованием космидной системы SVV [49]. Иммунизация макак-резусов вакцинами rSVV-RSVG и M2 вызвала нейтрализующие реакции антител против RSV.

Геном SVV размером 125 т.п.н. недавно был клонирован в ВАС и стабильно поддерживается в E.coli [50]. SVV BAC использовался для вставки сайт-специфических мутаций в геном SVV с использованием рекомбинации, опосредованной Red- . Генетическая система SVV BAC будет способствовать созданию rSVV, экспрессирующего чужеродные гены, и оценке кандидатных рекомбинантных вакцин.

7. Влияние ранее существовавшего иммунитета против вируса вируса вируса гепатита В и латентного периода вируса на вакцины против вируса вируса вирусной оспы

Рекомбинантная вакцина против ветряной оспы может быть эффективной для детей с серонегативным вирусом вируса вируса оспы. Тем не менее, дети старшего возраста и взрослые, как правило, являются серопозитивными по отношению к вирусу вируса гепатита C либо в результате естественного инфицирования вирусом вируса гепатита, либо в результате предшествующей вакцинации против вируса вируса.Существующие ранее антитела к VZV могут потенциально снижать эффективность вакцины против rVZV, возможно, за счет нейтрализации вакцинного вируса. Действительно, гуморальные и клеточные иммунные ответы на модельный антиген, экспрессируемый рекомбинантным HSV-1, были снижены у серопозитивных мышей по HSV-1 [51]. Однако эффективная иммунизация при таких ограничениях может быть осуществима. Предшествующий иммунитет к вектору может не препятствовать иммунным ответам на рекомбинантный антиген, когда вакцина вводится другим путем, чем при естественной инфекции.Например, подкожная иммунизация или иммунизация слизистых оболочек не ингибируется предшествующей системной инфекцией [52, 53]. Кроме того, иммуногенность некоторых рекомбинантных векторов, таких как цитомегаловирус, вирус кори и Синдбис, не зависит от ранее существовавшего иммунитета к вектору [54–56]. Влияние ранее существовавшего иммунитета на иммуногенность вакцин против rVZV не исследовалось, но это важный фактор, который необходимо учитывать для оценки безопасности и эффективности вакцины.

Вирус вакцины VZV, как и вирус VZV дикого типа, может вызывать латентную инфекцию в нервных ганглиях и может реактивироваться, вызывая опоясывающий герпес [7, 57].Однако частота реактивации вируса вакцины VZV, по-видимому, значительно ниже, чем частота заболевания, вызываемого вирусом VZV дикого типа [7]. VZV может подвергаться спорадической субклинической реактивации, приводящей к периодической рестимуляции иммунных ответов VZV и пожизненному иммунитету против VZV [58]. Субклиническая реактивация вакцинного вируса rVZV может быть преимуществом, обеспечивая спорадический иммунный импульс против как антигенов VZV, так и рекомбинантного антигена.

8. Выводы

Вирусные векторы открывают новые возможности в качестве платформ для вакцин, особенно против болезней, для которых традиционные подходы к вакцинам неэффективны.Рекомбинантные вирусные вакцины против ряда заболеваний человека в настоящее время проходят клинические испытания [59]. Большинство этих рекомбинантных вакцин используют аденовирус или поксвирус в качестве вирусных векторов. Аттенуированная, способная к репликации вакцина VZV Oka, широко применяемая, с установленным профилем безопасности и способностью индуцировать длительное действие антител и Т-клеточный иммунитет, дает возможность разработать эффективные рекомбинантные вакцины. Вакцины против rVZV можно использовать в качестве первичной вакцины или как часть стратегии гетерологичной первичной бустерной вакцинации в сочетании с ДНК-вакциной или комбинацией аденовирус / поксвирус.Вакцины против ветряной оспы и опоясывающего лишая против rVZV обеспечивают гибкость при разработке стратегий иммунизации против болезней, от которых страдают дети и пожилые люди, соответственно.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.