Заполнение рсв 1: Пример заполнения единого расчета по страховым взносам за 2 квартал 2021

Содержание

Расчёт по форме РСВ-1. Как правильно составить расчёт

Заполните бланк без ошибок за 1 минуту!

Бесплатная программа для автоматического заполнения всех документов для торговли и склада.

  • Счета на оплату
  • Счета-фактуры
  • Накладные
  • Путевые листы
  • Доверенности
  • Акты выполненных работ
  • Акты приемки, инвентаризации
  • Коммерческие предложения
  • Кассовые ордеры

Класс365 – быстрое и удобное заполнение всех первичных документов

Расчёт по начисленным и уплаченным страховым взносам на обязательное пенсионное страхование в ПФР, страховым взносам на обязательное медицинское страхование в Федеральный фонд обязательного медицинского страхования  плательщиками страховых взносов, производящими выплаты и иные вознаграждения физическим лицам.

Как упростить работу с документами и вести учет легко и непринужденно

«Класс365» — онлайн программа для всех:

  • 50 актуальных бланков документов
  • Торговый и Складской учёт
  • CRM-система для работы с клиентами
  • Банк и Касса
  • Интеграция с интернет-магазинами
  • Встроенная почта и отправка SMS

Бесплатно для одного пользователя

Как правильно заполнить форму РСВ-1

Расчетным периодом по взносам на обязательное пенсионное и медицинское страхование является календарный год. Он включает в себя четыре отчетных периода: I квартал, полугодие, девять месяцев и год (ст. 10 Федерального закона от 24 июля 2009 г. № 212-ФЗ). По итогам каждого отчетного периода организации должны составить и сдать расчет по взносам. С 2014 года действует новая форма расчета (утверждена постановлением Правления ПФР от 16 января 2014 г. № 2п.) Этим же постановлением утвержден официальный порядок заполнения расчета.

Скачать Порядок заполнения РСВ-1 >>
(Приложение № 2 к Постановлению Правления ПФР от 16 января 2014 г.)

Разделы, из которых состоит РСВ-1 ПФР

Форма РСВ-1 ПФР включает в себя титульный лист и шесть разделов:

  • Раздел 1 «Расчет по начисленным и уплаченным страховым взносам»;
  • Раздел 2 «Расчет страховых взносов по тарифу и дополнительному тарифу»;
  • Раздел 3 «Расчет соответствия условий на право применения пониженного тарифа для уплаты страховых взносов»;
  • Раздел 4 «Сумма доначисленных страховых взносов с начала расчетного периода»;
  • Раздел 5 «Сведения, необходимые для применения положений пункта 1 части 3 статьи 9 Федерального закона от 24 июля 2009 г. № 212-ФЗ…»;
  • Раздел 6 «Сведения о сумме выплат и иных вознаграждений и страховом стаже застрахованного лица».

Титульный лист, а также разделы 1 и 2 оформляются независимо от наличия расчетной базы и обязанности по уплате страховых взносов. Это относится и к тем организациям, которые в течение квартала не начисляли выплаты и взносы.

Раздел 3 заполняется, если компания применяет пониженные тарифы страховых взносов.

Раздел 4 заполняется, если в текущем отчетном периоде были доначисления взносов за предыдущие отчетные (расчетные) периоды.

Раздел 5 заполняется теми компаниями, которые производят выплаты и иные вознаграждения в пользу обучающихся в образовательных учреждениях среднего профессионального, высшего профессионального образования по очной форме обучения за деятельность в студенческом отряде (включенном в федеральный или региональный реестр молодежных и детских объединений, пользующихся государственной поддержкой).

Как автоматизировать работу с документами и не заполнять бланки вручную

Автоматическое заполнение бланков документов. Сэкономьте свое время. Избавьтесь от ошибок.

Подключитесь к КЛАСС365 и пользуйтесь полным спектром возможностей:

  • Автоматически заполнять актуальные типовые формы документов
  • Печатать документы с изображением подписи и печати
  • Создавать фирменные бланки с вашим логотипом и реквизитами
  • Составлять лучшие коммерческие предложения (в том числе по собственным шаблонам)
  • Выгружать документы в форматах Excel, PDF, CSV
  • Рассылать документы по email прямо из системы

С КЛАСС365 вы сможете не только автоматически готовить документы. КЛАСС365 позволяет управлять целой компанией в одной системе, с любого устройства, подключенного к интернету. Легко организовать эффективную работу с клиентами, партнерами и персоналом, вести торговый, складской и финансовый учет. КЛАСС365 автоматизирует всё предприятие.

Расчет по страховым взносам: особенности заполнения, порядок сдачи, частые ошибки

Уточнение персональных данных.

Персональные данные, отраженные в разделе 3 «Персонифицированные сведения о застрахованных лицах» расчета, уточняются на основании полученных от налоговиков уведомлений: об уточнении расчета, об отказе в его приеме, о том, что расчет считается непредставленным или требования о представлении пояснений.

Указанный раздел (3) расчета оформляется так:

• по каждому физлицу, по которому выявлены несоответствия, в надлежащих строках подраздела 3.1 расчета указываются персональные данные, отраженные в первоначальном расчете. При этом в строках 190–300 подраздела 3.2 в знако-местах ставят «0»: значением «0» заполняются суммовые показатели указанного подраздела, а в остальных знако-местах соответствующего поля проставляется прочерк;

• по этим же застрахованным физлицам заполняются подраздел 3.1 расчета с указанием корректных (актуальных) персональных данных и строки 190-300 подраздела 3.2 расчета, если возникла необходимость корректировки отдельных показателей подраздела 3.2 расчета.

Уточнение других сведений.

Здесь надо учитывать следующие нюансы:

• если в первоначальный расчет попали не все застрахованные физлица, то в уточненный расчет включается раздел 3 с данными по отсутствующим физлицам и одновременно производится корректировка показателей раздела 1 расчета;

• если в первоначальный расчет вкрались ошибки по отраженным сведениям о застрахованных лицах, то в «уточненку» включается опять раздел 3 со сведениями в отношении таких физлиц, в котором в строках 190–300 подраздела 3.2 расчета во всех знако-местах указывается «0», и одновременно производится корректировка показателей раздела 1 расчета.

• если нужно внести коррективы по отдельным застрахованным лицам показателей, отраженных в подразделе 3.2 расчета, то в уточненный расчет включается раздел 3 со сведениями в отношении таких физлиц с правильными показателями в подразделе 3.2 расчета, и при необходимости (в случае изменения общей суммы исчисленных взносов) надо исправить данные раздела 1 расчета.

ПИСЬМО ФНС РФ от 28.06.2017 № БС-4-11/[email protected]
«О представлении уточненных расчетов»

Документ включен в СПС «КонсультантПлюс»

Заполнение РСВ за 1 квартал 2021 года: рекомендации

С 2021 года во всех регионах вводятся прямые выплаты – ФСС сам назначает и выплачивает работникам пособия, поэтому работодатель больше не может уменьшать страховые взносы. Это следует учесть при заполнении расчета по страховым взносам за отчетные периоды 2021 года.

Начиная с РСВ за 1 квартал 2021 года в разделе 1:

  • не заполняется строка 070 приложения 2, а также приложения 3 и 4;
  • не указывается признак «2» в строке 090 приложения 2;
  • строка 080 приложения 2 заполняется только при возмещении фондом расходов за периоды, истекшие до 2021 года.

Напомним, организации и ИП должны сдавать расчет, если производят выплаты и иные вознаграждения физлицам. Если за последние три месяца выплат физлицам не было, нужно подать нулевой расчет, включив в него титульный лист, разд. 1 и 3.

Титульный лист, разд. 1, подразделы 1.1 и 1.2 Приложения 1 к разд. 1, Приложение 2 к разд. 1 и разд. 3 заполняют все, кто за последние три месяца производил выплаты физлицам. Остальные разделы, подразделы и приложения нужно заполнить только при определенных обстоятельствах.

В расчете не должно быть значений со знаком «минус». Если какой-то показатель отсутствует, в соответствующем поле должен быть проставлен «0» (для количественного или суммового значения) или прочерк (для текста, кода). Если расчет подготовлен на компьютере и распечатан, прочерки в незаполненных полях могут отсутствовать.

Код расчетного периода за 1 квартал года «21».

Перед сдачей РСВ рекомендуется проверить показатели по контрольным соотношениям – это поможет избежать ошибок и несоответствий.

Если в поданном расчете есть ошибки, противоречия в данных разных разделов или указаны недостоверные персональные данные физлиц, налоговая пришлет уведомление о непредставлении расчета. Необходимо устранить ошибки и направить РСВ повторно в установленные сроки: 5 рабочих дней со дня отправки электронного уведомления или 10 дней с момента отправки уведомления на бумаге.

За несвоевременную подачу расчета по страховым взносам или нарушение способа подачи страхователям грозит ответственность.

Документ: Письмо ФНС России от 29.01.2021 N БС-4-11/[email protected]


Отчетность за 1 квартал 2021 года

Заполните форму и получите сборник материалов «Отчетность за 1 квартал 2021 года» бесплатно! Подборка включает инструкции по заполнению РСВ, 6-НФДЛ, декларации по налогу на прибыль, по НДС, отчетности по региональным налогам и т.д.

Расчет по страховым взносам в 2021 году

Новая форма РСВ 2021 вступает в силу в феврале 2021 года — предоставлять отчёт за 2020 год нужно уже по ней. Приказ ФНС № ЕД-7-11/[email protected], который внёс изменения, был опубликован 15 октября 2020 года на официальном сайте налоговой службы.

Расчёт по страховым взносам теперь заполняется по новым стандартам: изменения коснулись титульного листа и кодов, было добавлено новое приложение. Нововведения в первую очередь актуальны для IT-компаний, в особенности — добавленное приложение 5.1.

В этой статье мы рассмотрим основные изменения, которые внёс октябрьский Приказ ФНС.




Новый РСВ с I квартала 2021 года
С чем связаны нововведения

В документ внесли изменения в связи со вступлением в силу ряда Федеральных законов: N 265-ФЗ от 31 июля 2020 г., N 102-ФЗ от 1 апреля 2020 г, N 5-ФЗ от 28 января 2020 г. Эти законы вносят поправки, в частности, в Налоговый кодекс РФ: введение среднесписочной численности в отчёт РСВ, снижение налоговой ставки IT-компаний и т.д. На основе этих законов и был издан соответствующий Приказ ФНС.


Что изменилось в декларации

Все нововведения в документ можно разделить на три группы:


  1. Дополнения на титульном листе.


  2. Добавление новых кодов.


  3. Введение нового приложения.


Титульный лист декларации был дополнен новой строкой — «Среднесписочная численность (чел.)». Это связано с тем, что отдельный отчёт о количестве работников был отменён (п. 3 ст. 80 НК РФ).

Среднесписочная численность, которая теперь будет выставляться на титульном листе расчёта по страховым взносам, определяется по нормам, описанным в Приказе Росстата от 27.11.2019 № 711. Это означает, что сам порядок определения количества работников не изменился.

Отменённый отдельный отчёт подавался не позднее 20 января, в составе РСВ сведения нужно подавать не позднее 1 февраля. Это правило действует с начала 2021 года, а значит подавать расчёт нужно уже в составе декларации.

Новые коды были добавлены в XXI раздел Приказа ФНС N ММВ-7-11/[email protected], где указан порядок заполнения персонифицированных сведений о застрахованных лицах. Они были добавлены в приложения № 5 и 7.

Коды 20 и 21 уже использовались в заполнении приложений № 1 и 2 к разделу 1 за полугодие 2020 года (Письма ФНС № БС-4-11/[email protected] от 09.06.2020 и БС-4-11/[email protected] от 07.04.2020). Однако, изменения в форму были привнесены только со вступлением в силу нового приказа.

В Приложение № 5 «Коды тарифа плательщика страховых взносов» было добавлено следующее:


20 Плательщики страховых взносов, признаваемые субъектами малого или среднего предпринимательства в соответствии с Федеральным законом от 24 июля 2007 года N 209-ФЗ «О развитии малого и среднего предпринимательства в Российской Федерации» (Собрание законодательства Российской Федерации, 2007, N 31, ст. 4006; 2020, N 24, ст. 3743)
21 Плательщики страховых взносов, применяющие пониженные тарифы страховых взносов в соответствии с Федеральным законом от 8 июня 2020 года N 172-ФЗ «О внесении изменений в часть вторую Налогового кодекса Российской Федерации» (Собрание законодательства Российской Федерации, 2020, N 24, ст. 3746)
22 Плательщики страховых взносов, осуществляющие деятельность по проектированию и разработке изделий электронной компонентной базы и электронной (радиоэлектронной) продукции; применяется начиная с отчётного периода первый квартал 2021 года.

В Приложении № 7 «Коды категории застрахованного лица» было добавлено следующее:


МС Физические лица, которым с части выплат и вознаграждений, определяемой по итогам каждого календарного месяца как превышение над величиной минимального размера оплаты труда, установленного федеральным законом на начало расчётного периода, исчисляются страховые взносы плательщиками, признаваемыми субъектами малого или среднего предпринимательства в соответствии с Федеральным законом от 24 июля 2007 года N 209-ФЗ «О развитии малого и среднего предпринимательства в Российской Федерации»
КВ Физические лица, с выплат и вознаграждений которым исчисляются страховые взносы плательщиками в соответствии с Федеральным законом от 8 июня 2020 года N 172-ФЗ «О внесении изменений в часть вторую Налогового кодекса Российской Федерации»
ЭКБ Физические лица, с выплат и вознаграждений которым исчисляются страховые взносы организациями, осуществляющими деятельность по проектированию и разработке изделий электронной компонентной базы и электронной (радиоэлектронной) продукции; применяется начиная с отчётного периода первый квартал 2021 года

Для иностранных граждан также были добавлены соответствующие коды, но под другими названиями:


  • МС → ВЖМС и ВПМС;


  • КВ → ВЖКВ и ВПКВ;


  • ЭКБ → ВЖЭК и ВПЭК.


В Приложении 6 код для обозначения свидетельства о предоставлении временного убежища на территории Российской Федерации был изменён с 18 на 19.

Приложение 5.1 было добавлено в 1 раздел расчёта. Приложение добавлено для плательщиков, указанных в пп. 3 и пп. 18 п. 1 ст. 427 НК РФ. К ним относятся IT-компании, которые разрабатывают и реализуют программы или базы данных, а также компании, которые проектируют и разрабатывают электронную продукцию или компонентную базу.

Представителям данных видов деятельности заполнять приложение 5.1 нужно для того, чтобы подтвердить своё право на использование пониженного тарифа. Чтобы получить льготы, организациям также нужно соответствовать трём условиям:


  1. Среднесписочная численность сотрудников за расчётный период должна быть не меньше 7 человек.


  2. Основной вид деятельности должен приносить не менее 90% общего дохода.


  3. IT-компании должны иметь госаккредитацию, а проектировщики и разработчики электронной продукции должны быть включёнными в соответствующий реестр.


Важно: заполнять новое приложение в расчёте за 2020 год не нужно.

В приложении 5.1 в поле 001 указывается код плательщика 1 для IT-компаний, код 2 — для компаний, которые проектируют или разрабатывают электронную продукцию или компонентные базы.

Строка 060 в этом приложении заполняется только плательщиками из пп. 3 п.1 ст. 427 НК РФ. Все остальные строки нужно заполнять и тем, кто указывает код плательщика 1 и тем кто указывает код плательщика 2.


Как заполнить строку 090 в расчёте по страховым взносам

В разных частях расчёта номера строк могут повторятся. Строка 090 встречается во всех разделах — 1, 2 и 3, — и приложениях к ним.

В приложении 2 к разделу 1 в строке 090 указывается сумма страховых взносов, подлежащих к уплате. Показателем, которые нужно указывать в строке, является разница между исчисленными страховыми взносами и производственными расходами, увеличенная на сумму возмещённых расходов.

Упрощённая формула выглядит следующим образом:

Стр. 190 прил. 2 разд. 1 = (стр. 060 прил. 2 разд. 1 — стр. 070 прил. 2 разд. 1) + стр. 080 прил. 2 разд. 1

Признак строки 090 может принимать значение:


  • 1, если сумма, исчисленная по формуле, больше или равно нулю;


  • 2, если сумма, исчисленная по формуле, меньше нуля.


Подробные разъяснения по заполнению дала ФНС в Приказе от 18.09.2019 N ММВ-7-11/[email protected]


Образец заполнения строки 090 для приложения 2 к разделу 1

Как заполнить приложение 9 к разделу 1 расчёта по страховым взносам

Приложение 9 к разделу 1 заполняется в соответствии с разъяснениями ФНС, изложенными в Письме от 13 февраля 2020 г. № БС-4-11/243. В приложении заполняются сведения, необходимые для применения пп. 1 п. 3 ст. 422 НК РФ, то есть выплат, которые не включаются в базу для исчисления страховых взносов.

Выплаты, которые получают ученики профессиональных и высших образовательных организаций за деятельность в студенческом отряде, не облагаются страховыми взносами. Студенческий отряд должен быть включён в реестр молодёжных и детских объединений, а выплаты должны осуществляться по трудовым договорам или по договорам ГПХ.

Приложение 9 разделено на четыре части:


  1. Итоги выплат.


  2. Сведения об обучающихся.


  3. Сведения о форме обучения.


  4. Сведения о студенческом отряде.


Отдельные вопросы вызывают строки 010 и 080. В Письме ФНС данные конкретные разъяснения: в строках отражается база для исчисления страховых взносов на обязательное социальное страхование. Сумма отражается в пределах установленной предельной величины базы с начала расчётного периода, за последние три месяца расчётного периода, а также с трёх последних месяцев расчётного периода.



Изменилась декларация, но не изменился срок подачи документа: расчёт по страховым взносам в 2021 году должен быть отправлен в контролирующий орган не позднее 1 февраля.

Новую декларацию можно посмотреть и скачать здесь → «Форма расчёта по страховым взносам». Заполнить и отправить её можно в сервисе «Астрал.Отчёт 5.0» для сдачи отчётности по актуальным формам во все контролирующие органы.


Форма РСВ-1 ПФР действующая до 4 квартала 2010 года. Расчет по начисленным и уплаченным страховым взносам | Образец — бланк — форма

Расчет по начисленным и уплаченным страховым взносам на обязательное пенсионное страхование в Пенсионный фонд Российской Федерации, страховым взносам на обязательное медицинское страхование в Федеральный фонд обязательного медицинского страхования и территориальные фонды обязательного медицинского страхования плательщиками страховых взносов, производящими выплаты и иные вознаграждения физическим лицам, форма РСВ-1 ПФР.

Перейти к новой форме расчета РСВ-1 ПФР действующей с 1 квартала 2011 года.

Составляется и представляется ежеквартально (нарастающим итогом) до 1-го числа второго календарного месяца, следующего за отчетным периодом, в территориальный орган Пенсионного фонда Российской Федерации (далее — ПФР) по месту регистрации.

Расчет по начисленным и уплаченным страховым взносам на обязательное пенсионное страхование в Пенсионный фонд Российской Федерации (далее — ОПС), страховым взносам на обязательное медицинское страхование в Федеральный фонд обязательного медицинского страхования и территориальные фонды обязательного медицинского страхования плательщиками страховых взносов (далее — ОМС), производящими выплаты и иные вознаграждения физическим лицам (далее — Расчет) заполняется шариковой или перьевой ручкой, черным либо синим цветом. Возможна его распечатка на принтере.

Расчет представляется на бумажном носителе или в электронной форме, в соответствии с законодательством Российской Федерации.

Расчет на бумажном носителе может быть представлен плательщиком страховых взносов в территориальный орган Пенсионного фонда Российской Федерации (далее — ПФР) лично или через его представителя, направлен в виде почтового отправления с описью вложения. Расчет в электронной форме в установленном формате может быть передан лично или по телекоммуникационным каналам связи с электронной цифровой подписью.

При отправке Расчета по почте днем его представления считается дата отправки почтового отправления с описью вложения. При передаче Расчета по телекоммуникационным каналам связи днем его представления считается дата его отправки.

Расчет представляется на бланке установленной формы плательщиком страховых взносов (далее — плательщик) в территориальный орган ПФР по месту учета ежеквартально до 1 числа второго месяца, следующего за отчетным. В случае, когда последний день срока приходится на день, признаваемый в соответствие с законодательством Российской Федерации выходным и (или) нерабочим праздничным днем, днем окончания срока считается ближайший следующий за ним рабочий день.

Основанием для заполнения Расчета являются данные бухгалтерского учета.

2. При заполнении Расчета учитывается следующее.
В каждую строку и соответствующие ей графы вписывается только один показатель. В случае отсутствия каких-либо показателей, предусмотренных Расчетом, в строке и соответствующей графе ставится прочерк. Все значения денежных показателей отражаются в полных рублях. Сумма менее 50 копеек отбрасывается, а сумма 50 копеек и более округляется до полного рубля.
Если на страницах Расчета, которые должны быть представлены плательщиком, какие-либо таблицы им не заполняются, то в полях этих таблиц ставится прочерк.

Для исправления ошибок следует перечеркнуть неверное значение показателя, вписать правильное значение показателя и поставить подпись плательщика или его представителя под исправлением, с указанием даты исправления. Все исправления заверяются печатью организации (штампом — для иностранных организаций) или подписью индивидуального предпринимателя, физического лица, не признаваемого индивидуальным предпринимателем, или их представителей.
Не допускается исправление ошибок с помощью корректирующего или иного аналогичного средства.

После заполнения Расчета проставляется сквозная нумерация заполненных страниц в поле «Стр.».

3. В верхней части каждой заполняемой страницы Расчета указывается регистрационный номер плательщика, присвоенный ему в территориальном органе ПФР по месту постановки на учет.

4. Титульный лист, Разделы 1 и 2 Расчета заполняются всеми плательщиками, Разделы 3 и 4 Расчета заполняются плательщиками, применяющими пониженные тарифы в отношении выплат, начисленных в пользу отдельных работников в соответствии с пунктом 2 ст.57 и ст.58 Федерального закона от 24.07.2009 №212-ФЗ «О страховых взносах на обязательное пенсионное страхование в Пенсионный фонд Российской Федерации, Фонд социального страхования, Федеральный фонд обязательного медицинского страхования и территориальные фонды обязательного медицинского страхования» (далее – Федеральный закон № 212-ФЗ), Раздел 5 заполняется при наличии у плательщика недоимки (переплаты) по страховым взносам, образовавшейся по состоянию на 31.12.2009 включительно.

5. Достоверность и полнота сведений, указанных в Расчете, подтверждаются плательщиками или их представителями в соответствии с пунктом 3 Раздела II настоящего Порядка.

6. Раздел «Заполняется работником ПФР» содержит сведения о представлении Расчета (способ представления, количество страниц расчета, количество листов подтверждающих документов или их копий, приложенных к Расчету, дата представления, фамилию и инициалы имени и отчества работника ПФР, принявшего расчет, его подпись).

7. В случае, если Расчет заполнен с нарушением настоящего порядка или форматов представления данных Расчет территориальными органами ПФР не принимается.

Как заполнить РСВ за полугодие 2020 года при применении пониженных тарифов (15%) и при освобождении от уплаты страховых взносов за II квартал?

Организации и ИП, которые применяют пониженные тарифы, как и остальные плательщики взносов, заполняют Расчет по форме, утвержденной Приказом ФНС России от 18.09.2019 N ММВ-7-11/[email protected]

Потребуется заполнить два приложения 1 и два первых листа приложения 2 – для выплат, облагаемых по обычным и пониженным тарифам. В разделе 3 такие выплаты надо показать в отдельных подразделах 3.2.1.

Выплаты, облагаемые по общему тарифу, отражаются в приложениях 1 и 2 с кодом тарифа 01. Код категории застрахованного лица в подразделе 3.2.1 – НР, у иностранцев – ВЖНР или ВПНР.

Для выплат, облагаемых по тарифу 15%, нужно заполнить приложение 1 и первый лист приложения 2 с кодом тарифа 20. В разделе 3 такие выплаты отражаются в подразделе 3.2.1 с кодом категории застрахованного лица МС, а для иностранцев – ВЖМС или ВПМС (Контрольные соотношения).

См. Пример. Расчет по взносам за полугодие 2020 года при пониженных тарифах 

Если применяется тариф 0%, на выплаты за апрель – июнь заполняется приложение 1 и первый лист приложения 2 с кодом тарифа 21 (пп. 5.4, 10.1 Порядка заполнения Расчета).

В разделе 3 расчета за полугодие ставится код категории застрахованного лица КВ, а для иностранцев – ВЖКВ или ВПКВ.

См. Пример. Расчет по взносам за полугодие 2020 года при тарифе 0%

Напомним, РСВ за полугодие сдается в обычный срок – не позднее 30 июля 2020 года.

На заметку: ФНС разъяснила, как малому и среднему бизнесу платить страховые взносы с выплат временно пребывающим иностранцам после 1 апреля 2020 года. Читайте об этом в обзоре на нашем сайте.

Читайте подробнее

Какие листы в РСВ не нужно заполнять с отчетности за 2021 год

ФНС уточнила порядок заполнения расчета по страховым взносам, начиная с отчетности за первый квартал 2021 года.

Напомним, с 2021 года приказом ФНС от 15.10.2020 № ЕД-7-11/[email protected] утверждена новая форма расчета по страховым взносам.

В своем письме от 29.01.2021 № БС-4-11/[email protected] ФНС обращает внимание, что с 1 января 2021 года во всех регионах введен механизм «прямых выплат» социальных пособий.

Это значит, что социальные выплаты работникам (пособия на случай временной нетрудоспособности и в связи с материнством) с 1 января 2021 года должны осуществляться территориальными органами ФСС. Соответственно, страховые взносы с выплат работникам, начисленные с 1 января 2021 года, не могут быть уменьшены работодателями на суммы расходов на выплату страхового обеспечения.

Особенности назначения и выплаты органами ФСС социальных пособий, а также возмещения работодателям расходов на определенные выплаты в период с 1 января по 31 декабря 2021 года определяются постановлением Правительства РФ от 30.12.2020 № 2375.

В связи с этим, при составлении расчета по страховым взносам начиная с отчетности за I квартал 2021 года не нужно заполнять:

  • строку 070 «Произведено расходов на выплату страхового обеспечения» приложения 2 к разделу 1 расчета;
  • приложение 3 «Расходы по обязательному социальному страхованию на случай временной нетрудоспособности и в связи с материнством и расходы, осуществляемые в соответствии с законодательством Российской Федерации» к разделу 1 расчета;
  • приложение 4 «Выплаты, произведенные за счет средств, финансируемых из федерального бюджета» к разделу 1 расчета.

Также необходимо учитывать, что:

  • строка 080 «Возмещено ФСС расходов на выплату страхового обеспечения» приложения 2 к разделу 1 расчета может быть заполнена при возмещении ФСС расходов за периоды, истекшие до 01.01.2021;
  • при заполнении строки 090 «Сумма страховых взносов, подлежащая уплате (сумма превышения произведенных расходов над исчисленными страховыми взносами)» приложения 2 к разделу 1 расчета не указывается признак «2».

RSV: симптомы, причины, профилактика, лечение

Что такое респираторно-синцитиальный вирус (RSV)?

Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) — распространенный и очень заразный вирус, поражающий дыхательные пути большинства детей в возрасте до двух лет.

У большинства младенцев и маленьких детей инфекция вызывает не что иное, как простуду. Но для небольшого процента случаев инфицирование RSV может привести к серьезным, иногда опасным для жизни проблемам, таким как пневмония или бронхиолит, воспаление легких дыхательных путей.

Симптомы RSV

RSV-инфекция может вызывать симптомы, похожие на простуду, включая кашель и насморк, которые обычно длятся от 1 до 2 недель.

Когда обращаться к врачу: Если вы заметили какой-либо из следующих симптомов RSV, обратитесь к врачу вашего ребенка:

Если ваш ребенок очень устал, часто дышит или у него посинели губы или ногти, позвоните в службу 911 или немедленно отправляйтесь в скорую помощь.

Причины и факторы риска RSV

Респираторно-синцитиальный вирус распространяется по воздуху, например, после кашля или чихания, и при прямом контакте, например прикосновении.

Вероятность серьезной инфекции наиболее высока для:

  • Недоношенные дети
  • Дети младше 2 лет, родившиеся с заболеваниями сердца или легких
  • Младенцы и дети младшего возраста, чья иммунная система ослаблена из-за болезни или лечения
  • Дети в возрасте от 8 до 10 недель

Диагноз RSV

Чтобы диагностировать RSV, врач вашего ребенка, вероятно, изучит их историю болезни и проведет физический осмотр, в том числе послушает легкие.

Ваш врач может провести несколько анализов, если ваш ребенок очень болен или чтобы исключить другие проблемы. Тесты на РСВ включают:

  • Анализы крови и мочи на наличие бактериальной инфекции и отсутствие обезвоживания у ребенка
  • Рентген грудной клетки для поиска любых признаков пневмонии
  • Тесты соскоба материала, взятого у вашего ребенка нос или рот

Профилактика RSV

Меры, которые вы можете предпринять, чтобы избежать и предотвратить RSV, включают:

  • Избегайте целовать ребенка, если у вас симптомы простуды.
  • Очистить и продезинфицировать твердые поверхности.
  • Не позволяйте никому курить рядом с малышом.
  • По возможности держите ребенка подальше от людей, в том числе братьев и сестер, с симптомами простуды.
  • Держите малыша подальше от толпы.
  • Попросите людей вымыть руки, прежде чем они дотронутся до вашего ребенка.
  • Ограничьте время, в течение которого младенцы из группы высокого риска и маленькие дети остаются в дневных учреждениях, особенно с поздней осени до ранней весны, когда RSV наиболее распространен.
  • Часто мойте руки, особенно после контакта с любым человеком, у которого есть симптомы простуды.

Вакцины от респираторно-синцитиального вируса нет. Но лекарство под названием паливизумаб может предотвратить инфекции RSV и защитить детей из группы высокого риска от серьезных осложнений инфекции RSV. Если ваш ребенок находится в группе повышенного риска, ваш врач может делать ему ежемесячную прививку в пик сезона RSV.

Лечение RSV

Хотя паливизумаб может помочь предотвратить серьезные осложнения RSV-инфекции, врачи не используют его для лечения RSV. Никакие лекарства не лечат сам вирус.Таким образом, уход за ребенком с инфекцией RSV включает в себя лечение симптомов и то, как она влияет на дыхательную систему вашего ребенка.

За большинством младенцев и маленьких детей можно ухаживать дома:

  • Удалите липкую назальную жидкость шприцем с грушей и каплями физиологического раствора.
  • Используйте испаритель холодного тумана, чтобы поддерживать влажность воздуха и облегчить дыхание.
  • Давайте ребенку немного жидкости в течение дня.
  • Используйте не аспириновые жаропонижающие средства, такие как ацетаминофен.Проверьте этикетку и внимательно следуйте всем инструкциям.

Младенцам с более серьезными случаями может потребоваться госпитализация, где их лечение может включать:

  • Кислород
  • Внутривенное введение жидкостей
  • Лекарства для открытия дыхательных путей

Респираторно-синцитиальный вирус (RSV)

О респираторно-синцитиальном вирусе (RSV)

Ключевые факты о респираторно-синцитиальном вирусе

  • Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) обычно поражает детей в возрасте 2 лет и младше.
  • Инфекции, связанные с РСВ, у детей в возрасте до 5 лет ежегодно вызывают более 2 миллионов обращений к врачу или в отделения неотложной помощи.
  • RSV является основной причиной содержания в больнице младенцев в возрасте до 1 года.

RSV — распространенный респираторный вирус. Это означает, что он влияет на ваши легкие и дыхательные пути. Люди любого возраста могут заразиться RSV. У детей старшего возраста и взрослых он чаще всего вызывает симптомы со стороны верхних дыхательных путей («простуду»). Он может вызывать серьезные инфекции легких (например, бронхиолит и пневмонию) у очень маленьких детей, а также у детей или взрослых с другими серьезными проблемами со здоровьем.Эти проблемы включают сердечные заболевания, с которыми родился пациент, или болезни мышц и нервов.

RSV может передаваться только между людьми. Насколько серьезны симптомы, зависит от типа вируса (или штамма ), которым заражается пациент. Есть штаммы А и В. RSV. Вирус передается от человека к человеку воздушно-капельным путем изо рта или носа, содержащих вирус. RSV может жить не менее получаса на руках и несколько часов на различных поверхностях. RSV вызывает эпидемии каждый год, обычно зимой и ранней весной.Когда начинаются эти эпидемии и как долго они продолжаются, зависит от региона.

Как RSV влияет на ваше тело

RSV может поражать любую часть дыхательных путей:

  • Нос
  • Горло
  • Дыхательное горло или гортань
  • Дыхательные трубки или бронхов
  • Легкое

Раздражение (также называемое воспалением ) может быть сильным.

Инфекция

RSV является наиболее серьезной, когда она поражает небольшие дыхательные трубки (называемые бронхиолами ) в легких.Это состояние называется острым бронхиолитом. RSV также может вызвать пневмонию — инфекцию в остальной части легкого. Поскольку часто бывает трудно различить два заболевания, вызываемые RSV, медицинские работники часто используют термин инфекция нижних дыхательных путей . RSV является наиболее частой причиной этого состояния у младенцев.

Бронхиолит, вызванный RSV, вызывает сильное воспаление внутри бронхов и бронхиол. Он раздражает их внутреннюю оболочку (или эпителий ) и заставляет ее опухать.Это разрушает составляющие его клетки, в том числе те, которые выводят слизь из легких. Когда слизь и разрушенные клетки забивают дыхательные трубки, пациенты не могут дышать так же легко. Пробки заполняют воздушные мешочки (называемые альвеол i) на концах дыхательных трубок (или альвеол ). Альвеолы ​​перемещают кислород из легких в кровь. Если они заблокированы, в организм пациента поступает меньше кислорода.

Воспаление также вызывает сокращение мышц вокруг дыхательных трубок ( бронхоспазм ).Это закрывает дыхательные пути и затрудняет дыхание. Поскольку дети с RSV дышат намного быстрее и тяжелее, чем обычно, они теряют много жидкости через легкие и могут легко обезвоживаться.

Насколько серьезен RSV?

  • У большинства людей (включая младенцев) обычно появляются лишь легкие симптомы простуды с заложенным или насморком и некоторым кашлем.
  • Примерно от 25% до 40% больных младенцев и детей будут иметь бронхиолит или пневмонию, и примерно от 5% до 20% из них потребуется пребывание в больнице, включая интенсивную терапию.
  • Большинству детей, которые обращаются в больницу по поводу RSV (особенно в реанимации), исполнилось 6 месяцев или меньше.
  • Поскольку люди не становятся полностью невосприимчивыми к RSV после заражения, они могут заразиться им снова и снова.
  • Пожилые люди и люди с хроническим заболеванием сердца и легких или с ослабленной иммунной системой подвергаются высокому риску развития тяжелых симптомов в случае повторного заражения RSV.

Симптомы RSV

RSV имеет много разных симптомов. Они варьируются от легких до опасных для жизни.Какие симптомы и насколько они серьезны, зависят от многих факторов, включая штамм вируса и наличие у пациента других медицинских проблем.

Симптомы RSV следующие:

  • Заложенный нос или насморк, легкий кашель и субфебрильная температура обычно появляются вначале как в легких, так и в более тяжелых случаях.
  • Лающий кашель, который может означать сильный отек голосовых связок и вокруг них.
  • Лихорадка, низкая (менее 101 ° F [38,3 ° C]) * или высокая (выше 103 ° F [39.5 ° C]) **
  • Проблемы с дыханием при одной или нескольких из этих форм:
    • Тахипноэ (учащенное дыхание). Сколько вдохов в минуту дети делают, зависит от их возраста. Однако, когда младенцы (даже самые маленькие) дышат более 60 раз в минуту, это ненормально. Для пациентов, которые уже дышат чаще, даже когда они здоровы (например, младенцы с заболеванием легких из-за недоношенного рождения), тахипноэ определяется как на 10-20 вдохов в минуту больше, чем обычно.
    • Втягивание грудной клетки. Грудь ребенка «прогибается» между ребрами и под ними.
    • Расширение носа. Ноздри ребенка «расширяются» с каждым вдохом.
  • Свистящее дыхание (высокий свистящий звук при выдохе ребенка).
  • Проблемы с питьем.
  • Чувство усталости ( летаргия ) или вспыльчивость ( раздражительность ).
  • Голубоватый цвет вокруг рта, губ и ногтей ( цианоз ).
  • Остановка дыхания (или апноэ ) — частый симптом бронхиолита, вызванного RSV, среди младенцев, особенно рожденных недоношенными.

* Очень больные дети могут действительно иметь низкую температуру (ниже 99,5 ° F [37,5 ° C]), несмотря на теплую одежду и одеяла.

** У маленьких недоношенных детей даже ректальная температура выше 100 ° F (37,8 ° C), вероятно, является ненормальной.

Что вызывает RSV?

RSV вызывается вирусом, который распространяется, когда инфицированный человек кашляет или чихает. Вирус попадает в организм через нос или рот. Часто попадает через глаза. Это может произойти, когда люди протирают глаза после прикосновения к поверхности, покрытой RSV, от кашля или чихания.

Каковы факторы риска RSV?

Эти ситуации повышают вероятность заражения человека RSV:

  • Места, переполненные людьми, которые могут быть инфицированы
  • Контакт с другими детьми (например, в детских садах) или со старшими братьями или сестрами, обучающимися дома

Эти люди подвержены более высокому риску тяжелых форм RSV:

  • Младенцы младше 6 месяцев (и особенно младше 3 месяцев)
  • Младенцы, рожденные недоношенными
  • Младенцы, рожденные с пороком сердца (называемым врожденным пороком сердца)
  • Младенцы с нервно-мышечными расстройствами (такими как атрофия)
  • Младенцы, дети или взрослые с ослабленной иммунной системой из-за состояния, такого как первичный иммунодефицит или лечения, которое они получают (например, пациенты, проходящие химиотерапию)
  • Люди с иммунодефицитом, в том числе с некоторыми трансплантированными органами, лейкемией, или ВИЧ / СПИД
  • Взрослые с астмой, застойной сердечной недостаточностью или хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ)
  • Пациенты с синдромом Дауна

Диагностика RSV

Инфекция

RSV часто обнаруживается с помощью теста.Тем не менее, во многих случаях RSV подтверждается только при осмотре пациента врачом.

Помимо симптомов, вызываемых RSV, он может ухудшить и другие состояния пациента. Эти состояния включают астму и ХОБЛ.

Когда вам следует обратиться к врачу?

Позвоните своему провайдеру, если вы или ваш ребенок:

  • Проблемы с дыханием;
  • Имеет плохой аппетит или менее активен;
  • Обостряются симптомы простуды; или
  • Имеет неглубокий кашель, который продолжается днем ​​и ночью.

Как диагностируется RSV

Легкие инфекции RSV обычно вызывают проблемы только в верхних дыхательных путях (нос и горло). Легкие случаи имеют те же симптомы, что и простуда, и не требуют лабораторных анализов.

Когда RSV вызывает инфекцию нижних дыхательных путей (например, острый бронхиолит или пневмония), врач обычно диагностирует это. Медицинские работники осматривают пациентов и задают им или их опекунам вопросы о болезни. Эти случаи RSV начинаются как заболевание верхних дыхательных путей, которое ухудшается в течение нескольких дней.У пациентов возникает все больше и больше проблем с дыханием. Они начинают хрипеть и слышать потрескивание в обоих легких.

Медицинские работники могут заподозрить бронхиолит из-за RSV, если в сообществе было много случаев заболевания. Хотя RSV может возникнуть в любое время, это гораздо более вероятно в более холодные месяцы. Однако точное время сезона RSV варьируется в зависимости от страны. Вы можете узнать, когда начался сезон RSV, в Центрах по контролю и профилактике заболеваний (CDC) или в местном отделе здравоохранения.

Если пациентам с RSV необходимо остаться в больнице, им будет проведен тест для подтверждения вируса. Это полезно, потому что таких пациентов можно безопасно изолировать, что предотвратит распространение RSV на других пациентов.

Несколько высокоточных тестов RSV могут дать надежные результаты в течение нескольких часов. Медицинские работники возьмут небольшой образец носовой слизи пациента. Пациентам, у которых развивается тяжелое заболевание, потребуется больше тестов, чтобы убедиться, что у них нет других заболеваний.Эти тесты включают:

  • Рентген грудной клетки , чтобы убедиться в отсутствии признаков пневмонии. Если есть, пациенту будут назначены антибиотики.
  • Анализы крови , чтобы проверить наличие бактериальной инфекции и убедиться, что младенец получает достаточно жидкости (это очень важно)
  • Посев крови и мочи для тяжелобольных младенцев (младенцы с RSV-бронхиолитом также могут иметь инфекции тракта)
  • Пульсоксиметрия , где датчик в виде повязки с красным светом наматывается на палец руки или ноги больного ребенка.Устройство проверяет наличие достаточного количества кислорода в крови пациента

Лечение RSV

RSV-бронхиолит не имеет установленного плана лечения, особенно если пациент лечится дома. Основное лечение младенцев — обеспечить им комфорт и снизить температуру с помощью ацетаминофена. Воспитатели могут очистить нос ребенка от слизи с помощью шприца с грушей. Это поможет им на время вздохнуть с облегчением. Лучше делать это непосредственно перед тем, как ребенок ест, чтобы ему было легче пить.

В зависимости от степени тяжести заболевания лица, осуществляющие уход, могут попробовать множество методов лечения. Они не излечивают саму инфекцию RSV, но они могут помочь пациентам почувствовать себя лучше, ослабив симптомы и убедившись, что другое заболевание не развивается.

Лица, осуществляющие уход, могут использовать одно или несколько из этих методов лечения:

  • Гидратация. Младенцы, особенно молодые, очень легко могут испытывать недостаток жидкости в организме. Дома матери могут продолжать кормление грудью или из бутылочки. Лицам, осуществляющим уход, может потребоваться давать их в нескольких небольших количествах.Если пациенты не могут пить, их нужно будет положить в больницу. Там они будут вводить жидкость через трубку либо в вену, либо в горло.
  • Кислород. Низкий уровень кислорода ( или гипоксемия ) часто встречается при бронхиолите, вызванном RSV. Младенцы могут получать кислород через короткие трубки, идущие в их ноздри. Это поможет им меньше работать, чтобы дышать, и предотвратит чрезмерную усталость их дыхательных мышц.
  • Бронходилататоры. Эти лекарства открывают дыхательные пути пациента.Пациенты могут принимать их с помощью небулайзера, который превращает лекарство в туман, которым они могут дышать ( вдох ). Если пациенты сильно хрипят, они могут использовать дозированный ингалятор (небольшую канистру, в которую распыляется определенное количество лекарства). Ингалятор может поставляться со спейсером, камерой, которая соединяется с ингалятором. Это задержит туман на мгновение, чтобы ребенок мог полностью вдохнуть его. Эти препараты помогают некоторым пациентам. Другие не получают от них никакого облегчения или не получают от них никакого облегчения. Но поскольку наркотики безопасны, их стоит попробовать.
  • Рацемический адреналин. Пациенты могут принимать это лекарство с помощью небулайзера, чтобы на некоторое время уменьшить отек дыхательных путей.
  • Системные кортикостероиды. Лекарства, такие как преднизон и дексаметазон, могут уменьшить воспаление, но не изменят течение инфекции.
  • Антибиотики. Эти лекарства не влияют на инфекцию RSV, но они могут понадобиться при наличии бактериальной инфекции. Эти вторичные инфекции включают инфекции уха (или отит ), пневмонию и инфекции мочевыводящих путей.
  • Рибавирин. Это единственный противовирусный препарат, одобренный для лечения RSV. Пациенты используют небулайзер несколько раз в день для ингаляции препарата. Продолжать принимать препарат может быть неудобно, и он оказывает лишь небольшое влияние на RSV. По этим причинам он используется только для небольшого числа пациентов из группы высокого риска.
Управление RSV

Если до заражения РСВ пациенты были здоровы, они обычно полностью поправляются. Однако RSV может быть тяжелым, опасным для жизни или даже смертельным для групп высокого риска.

Люди, подвергшиеся воздействию RSV, обычно проявляют первые симптомы через 2–8 дней (обычно через 4–6) после контакта с вирусом. Они будут чувствовать себя плохо от 3 до 7 дней. Сколько времени потребуется им на выздоровление, зависит от того, насколько серьезным было их заболевание и от их общего состояния здоровья.

Пациенты смогут передавать RSV другим людям ( заразны ) в течение примерно 8 дней. Однако некоторые пациенты (например, с ослабленной иммунной системой) могут быть заразными в течение нескольких недель.

Долгосрочные эффекты

У некоторых младенцев, заразившихся RSV в течение первых 6 месяцев (и особенно первых 3 месяцев) жизни, в более позднем возрасте развиваются хрипы и астма. Как это происходит, точно не известно. Считается, что дети, рожденные с определенными генетическими особенностями, могут подвергаться большему риску.

Предотвращение RSV

RSV очень заразен. Таким образом, чрезвычайно важно принять все необходимые меры предосторожности, чтобы другие дети и взрослые не заразились им.

Самые эффективные средства защиты тоже простые:

  • Избегайте людных мест.
  • Избегайте тесного контакта с инфицированными людьми (например, поцелуев).
  • Избегайте совместного использования чашек, бутылочек или игрушек, которые могли контактировать с вирусом. (Вирус может жить на поверхности в течение нескольких часов.)
  • Тщательно вымойте руки водой с мылом в течение не менее 20 секунд после контакта с инфицированным человеком.

Пациенты из группы высокого риска могут получать ежемесячные прививки препарата паливизумаб.Это убережет их от тяжелого заболевания RSV. Если болезнь уже началась, уколы не подействуют.

Ресурсы

Американская ассоциация легких рекомендует пациентам и лицам, осуществляющим уход, присоединиться к сообществу поддержки «Жизнь с легочными заболеваниями», чтобы общаться с другими людьми, страдающими этим заболеванием. Чтобы поговорить с квалифицированным специалистом в области легких, позвоните на горячую линию легких Американской ассоциации легких по телефону 1-800-LUNGUSA. Они могут помочь ответить на ваши вопросы и связать вас с дополнительной поддержкой.

Представляем набор инструментов RSV для врачей и медработников!

Фонд CHEST в сотрудничестве с Preemie Parent Alliance и Национальной коалицией по охране здоровья детей грудного возраста создал набор инструментов для RSV. Пособие наполнено информацией, которая поможет как поставщикам медицинских услуг, так и лицам, обеспечивающим уход, защищать интересы младенцев, подверженных риску заражения RSV. Поставщики услуг должны делиться этими материалами с опекунами своих младенцев и консультироваться с ними при защите интересов ваших младенцев.

Вопросы, которые следует задать своему врачу

Если вы сделаете записи перед визитом и возьмете с собой надежного члена семьи или друга, это может помочь вам во время первой встречи с вашим поставщиком медицинских услуг. Вот несколько примеров вопросов, которые могут относиться к вашей ситуации:

  • Подвержен ли мой ребенок риску тяжелой инфекции RSV?
  • Подходит ли мой ребенок к паливизумабу?
  • Какова продолжительность сезона RSV в нашем городе / штате?
  • Нужны ли моему ребенку какие-либо лекарства (например, бронходилататоры) при простуде?
  • Можно ли младенцам пить, пока они больны?
  • Могут ли заболеть и другие мои дети?
  • Разрешить родителям поцеловать ребенка?
  • Моему ребенку поставили диагноз RSV.Можем ли мы пойти на день рождения его кузена?
  • У моего ребенка РСВ, но он не очень болен. Можно ли отвезти его к моей матери? Она проходит курс химиотерапии от рака груди.
  • У моей малышки был бронхиолит, вызванный RSV, когда ей было 6 месяцев. У нее будет астма, когда она вырастет?

Аттенуированный вирус парагриппа человека типа 1, экспрессирующий слитый (F) гликопротеин респираторно-синцитиального вируса (РСВ) из добавленного гена: эффекты предварительной стабилизации и упаковки RSV F

Респираторно-синцитиальный вирус человека (RSV) является наиболее распространенной причиной тяжелых инфекций дыхательных путей у младенцев и детей раннего возраста во всем мире.Вирус парагриппа человека типа 1 (HPIV1) также вызывает тяжелые респираторные заболевания у детей, особенно круп. Оба вируса не имеют вакцин. Здесь мы описываем доклиническую разработку бивалентной вакцины RSV / HPIV1 на основе рекомбинантного вектора HPIV1, ослабленного стабилизированной мутацией, который экспрессирует белок F RSV, модифицированный для повышения стабильности в префузионной (пре-F) конформации с помощью ранее описанной дисульфидной связи. (DS) и мутации гидрофобного заполнения полостей (Cav1). RSV F экспрессировался из первого или второго положения гена как полноразмерный белок или как химерный белок с его трансмембранным и цитоплазматическим доменами (TMCT), замещенными доменами HPIV1 F в попытке направить упаковку в векторных частицах.Все конструкции были восстановлены с помощью обратной генетики. Версии TMCT RSV F были упакованы в частицы rHPIV1 намного эффективнее, чем их полноразмерные аналоги. У хомяков присутствие гена F RSV и, в частности, версий TMCT ослаблялось и приводило к снижению иммуногенности. Однако вектор, экспрессирующий полноразмерный F RSV из положения pre-N, был иммуногенным в отношении RSV и HPIV1. Он предоставил независимые от комплемента высококачественные RSV-нейтрализующие антитела с титрами, аналогичными титрам RSV дикого типа, и обеспечил защиту от заражения RSV.Векторы продемонстрировали стабильную экспрессию RSV F in vitro и in vivo В заключение, аттенуированный вектор rHPIV1, экспрессирующий предварительно F-стабилизированную форму RSV F, продемонстрировал многообещающую иммуногенность и должен быть далее разработан в качестве интраназальной детской вакцины. ВАЖНОСТЬ RSV и HPIV1 являются основными вирусными причинами острых респираторных заболеваний у детей, от которых нет вакцин или подходящих противовирусных препаратов. Гликопротеин F RSV является основным антигеном нейтрализации RSV.Мы использовали вектор rHPIV1, несущий стабилизированную аттенуирующую мутацию, для экспрессии гликопротеина F RSV, несущего аминокислотные замены, которые увеличивают его стабильность в пре-F форме, наиболее иммуногенной форме, которая вызывает высокофункциональные вируснейтрализующие антитела. RSV F экспрессировался из положения гена pre-N или NP вектора rHPIV1 как полноразмерный белок или как химерная форма с его доменом TMCT, полученным из HPIV1 F. Модификация TMCT значительно увеличивала упаковку RSV F в частицы вектора, но также увеличивалась аттенюация вектора in vivo , что приводило к снижению иммуногенности.Напротив, полноразмерный F RSV, экспрессируемый из положения pre-N, был иммуногенным, вызывая независимые от комплемента RSV-нейтрализующие антитела и обеспечивая защиту от заражения RSV.

Ключевые слова: вирус парагриппа человека 1 типа; интраназальная вакцина; живая аттенуированная вакцина; вакцины для слизистых оболочек; детская вакцина; префузия F; респираторно-синцитиальный вирус; вакцина.

Дизайн на основе структуры гибридной гликопротеиновой вакцины против респираторно-синцитиального вируса

Science.Авторская рукопись; доступно в PMC 2015 10 июня.

Опубликован в окончательно отредактированном виде как:

PMCID: PMC4461862

NIHMSID: NIHMS695088

, 1 , 1, # , 901 , 1, # , 1, # , 1, # , 1, # , 1 , 1 , 1 , 1 , , 1 , 1 , 1 , 1 , 1 , 2 , 3 , 3 , 3 , 4 , 4 , 1 1 , 1 , 1, * и 1, *

Джейсон С.McLellan

1 Исследовательский центр вакцин, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд 20892, США

Ман Чен

1 Исследовательский центр вакцин Национального института аллергии и инфекционных заболеваний Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд 20892, США

М. Гордон Джойс

1 Центр исследования вакцин, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд 20892, США

Маллика Састри

1 Центр исследования вакцин, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения, Бетезда, Мэриленд 20892, США

Гийом Б.E. Stewart-Jones

1 Центр исследования вакцин, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд 20892, США

Yongping Yang

1 Центр исследований вакцин Национального института аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения, Бетезда, Мэриленд 20892, США

Баошань Чжан

1 Центр исследования вакцин, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения, Бетезда, Мэриленд 20892, США

лей Чен

1 Исследовательский центр вакцин, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд 20892, США

Санджай Шриватсан

1 Исследовательский центр вакцин, Национальный институт аллергии и инфекционных болезней Национальные институты здравоохранения, Bethesda, MD 20892, США

Anqi Zheng

1 Vacc Исследовательский центр Инне, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения, Бетезда, Мэриленд, 20892, США

Тунцин Чжоу

1 Центр исследований вакцин, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения, Бетезда , MD 20892, США

Кевин У.Graepel

1 Исследовательский центр вакцин, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд 20892, США

Азад Кумар

1 Исследовательский центр вакцин Национального института аллергии и инфекционных заболеваний National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892, USA

Syed Moin

1 Центр исследования вакцин, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения, Bethesda, MD 20892, США

Jeffrey C.Boyington

1 Исследовательский центр вакцин, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд 20892, США

Гво-Ю Чуанг

1 Исследовательский центр вакцин Национального института аллергии и инфекций Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892, USA

Cinque Soto

1 Центр исследования вакцин, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения, Bethesda, MD 20892, США

Ulrich Baxa

2 Лаборатория электронной микроскопии, Программа передовых технологий, SAIC-Frederick, Inc, Национальная лаборатория исследований рака имени Фредерика, Фредерик, Мэриленд 21702, США

Arjen Q.Баккер

3 AIMM Therapeutics, Academic Medical Center, Амстердам, Нидерланды

Hergen Spits

3 AIMM Therapeutics, Academic Medical Center, Амстердам, Нидерланды

Tim Beaumont

3 Academic Medical Therapeutics , Амстердам, Нидерланды

Zizheng Zheng

4 Национальный институт диагностики и разработки вакцин для инфекционных заболеваний, Сямэньский университет, Сямэнь, 361005, Китай

Ningshao Xia

4 Национальный институт диагностики и разработки вакцин Diseases, Сямэньский университет, Сямэнь, 361005, Китай

Sung-Youl Ko

1 Центр исследования вакцин, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд 20892, США

Джон-Пол Тодд

1 Центр исследования вакцин, Национальный институт Альянса лергия и инфекционные заболевания, Национальные институты здравоохранения, Бетезда, Мэриленд 20892, США

Шринивас Рао

1 Центр исследования вакцин, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения, Бетезда, Мэриленд 20892, США

Барни С.Graham

1 Исследовательский центр вакцин, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд 20892, США

Питер Д. Квонг

1 Исследовательский центр вакцин Национального института аллергии и инфекций Diseases, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд 20892, США

1 Центр исследования вакцин, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд 20892, США

2 Лаборатория электронной микроскопии, Программа передовых технологий, SAIC-Frederick, Inc, Национальная лаборатория исследований рака Фредерика, Фредерик, MD 21702, США

3 AIMM Therapeutics, Academic Medical Center, Амстердам, Нидерланды

4 Национальный институт диагностики и разработки вакцин in Infectious Diseases, Xiamen University, Xiamen, 361005, China

# Авторы RS внесло равный вклад

Окончательная отредактированная версия этой статьи издателем доступна по адресу Science

Эта статья была исправлена. См. Исправление в томе 342 на странице 931.

См. Другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Abstract

Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) является основной причиной госпитализации детей в возрасте до пяти лет. Мы стремились разработать вирусный антиген, который обеспечивает большую защиту, чем доступные в настоящее время вакцины, и сосредоточен на антигенном сайте Ø, метастабильном сайте, специфичном для состояния до слияния гликопротеина слияния (F) RSV, поскольку этот сайт является мишенью для чрезвычайно мощного нейтрализующего RSV антитела.Конструкция на основе структуры позволила получить стабилизированные версии RSV F, которые сохраняли антигенный сайт Ø при воздействии экстремальных значений pH, осмоляльности и температуры. Шесть структур F-кристаллов RSV предоставили данные на атомном уровне о том, как введенные остатки цистеина и заполненные гидрофобные полости улучшили стабильность. Иммунизация O-стабилизированными вариантами RSV F у мышей и макак вызвала уровни RSV-специфической нейтрализующей активности, во много раз превышающие защитный порог.

Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) — одно из последних оставшихся широко распространенных детских заболеваний без одобренной вакцины.По оценкам, он является причиной 6,7% смертей среди детей в возрасте от 1 месяца до 1 года и вызывает повышенную смертность среди пожилых людей на уровнях, сопоставимых с уровнем вируса гриппа ( 1 ). Хотя инфекция RSV не вызывает полностью защитного иммунитета, антитела против гликопротеина слияния RSV (F) могут предотвратить тяжелое заболевание у людей, что продемонстрировано пассивной профилактикой с помощью F-направленного антитела, паливизумаба (Synagis ® ) ( 2 ).

Доказанный успех паливизумаба ( 3 ) стимулировал усилия по созданию вакцины, направленные на получение защитных антител, направленных на F RSV.Эти усилия были осложнены конформационным разнообразием RSV F ( 4 8 ), слитого белка типа I, который объединяет вирусные мембраны и мембраны клетки-хозяина за счет использования разницы в энергии сворачивания между двумя существенно разными состояния: метастабильное состояние, принятое до взаимодействия вируса с клеткой (префузия), и стабильное состояние, которое возникает после слияния вирусной и клеточной мембран (постфузия). В обоих состояниях наблюдаются эпитопы, нацеленные на нейтрализующие антитела, и постфузионный RSV F разрабатывается в качестве кандидата на вакцину ( 6 , 9 ).Однако недавно было обнаружено, что основная мишень нейтрализующих RSV антител, вызванных естественной инфекцией, находится в основном в конформации RSV F до слияния ( 10 ). Антитела, такие как 5C4 ( 7 ), AM22 и D25 ( 11 , 12 ), значительно более эффективны, чем паливизумаб, и целевой антигенный сайт Ø, метастабильный сайт, расположенный в дистальном отделе мембраны. вершина тримера RSV F перед слиянием ( 7 ).

Для усиления выработки аналогичных эффективных антител мы сконструировали растворимые варианты RSV F со стабильно экспонированным антигенным сайтом Ø. Эти варианты были охарактеризованы антигенно и кристаллографически и протестированы на иммуногенность на мышах и нечеловеческих приматах (макаках-резусах).

Стратегия вакцины на основе структуры

Мы и другие разработали антигенность ( 13 17 ) с помощью структурного дизайна эпитопов, распознаваемых нейтрализующими матрицу антителами.Например, кристаллическая структура мотавизумаба (варианта паливизумаба), связанного с его эпитопом гликопротеина F ( 18 ), позволила нам создать каркасы эпитопа, которые стабильно представляли эпитоп мотавизумаба на гетерологичных белках ( 19 ). Хотя каркасы мотавизумаба-эпитопа могут вызывать иммунные ответы, распознающие F, существенной нейтрализующей активности не индуцировалось ( 19 ). Мы предположили, что вместо одиночного эпитопа, распознаваемого одним матричным антителом, было бы выгодно представить «суперсайт» ( 20 ), содержащий набор перекрывающихся эпитопов, распознаваемых множеством антител.Еще предпочтительнее, чтобы такое место было сверхчувствительным к нейтрализации. Эти соображения привели к стратегии «чувствительного к нейтрализации сайта»: (i) идентифицировать вирусный сайт, на который нацелены множественные антитела с чрезвычайно мощной нейтрализующей активностью, (ii) определить структуру сайта в комплексе с репрезентативным антителом, (iii) ) для создания стабильного представления сайта в отсутствие распознающего антитела и (iv) для получения защитных ответов с высоким титром посредством иммунизации сконструированными антигенами, которые стабильно представляют чувствительный к нейтрализации сайт (рис.S1).

Разработка антигенов RSV F

Антигенный сайт Ø был выбран в качестве сайта-мишени из-за его распознавания RSV-нейтрализующими антителами, которые в 10-100 раз более эффективны, чем паливизумаб ( 7 , 11 , 12 ). Ранее мы определили структуру антигенного сайта Ø в комплексе с антителом D25 ( 7 ). Определение структуры включало добавление домена тримеризации фибритина Т4 («фолдон») ( 21 , 22 ) к С-концу фектодомена RSV ( 5 ) и связывание префузии. -специфическое антитело D25.Хотя эти подходы стабилизировали антигенный сайт Ø, связывание D25 стерически блокировало целевой сайт. Чтобы стабильно представить антигенный сайт Ø в отсутствие D25, мы сохранили C-концевой домен тримеризации и объединили его с другими средствами стабилизации, включая введение пар цистеина или гидрофобных замен, заполняющих полости.

β-углеродные остатки сериновых остатков 155 и 290 отстоят друг от друга на 4,4 Å в структуре F RSV, связанной с D25 ( 7 ) и на 124,2 Å в структуре после слияния ( 5 ) (и рис.S2). Двойной мутант (DS) S155C-S290C образовывал стабильные тримеры F RSV, экспрессируемые в концентрации 1,4 мг / л, с сохраненным антигенным сайтом Ø и гомогенным, по оценке с помощью отрицательной электронной микроскопии (рис. S3) ( 23 , 24 ). Другие внутрицепочечные модификации цистеина, такие как модификации между областями F RSV, которые не перестраиваются между состояниями до и после слияния (например, S403C и T420C), не стабилизировали антигенный сайт Ø (). Мы также протестировали потенциальные межцепочечные модификации двойного цистеина, но ни одна из них не экспрессировалась на уровнях, достаточных для обнаружения ELISA (таблица S1) ( 25 ).

Конструирование тримеров RSV F, стабилизированных по Ø растворимого сайта

Более 100 вариантов RSV F, содержащих домен тримеризации фибритина Т4 (фолдон), были сконструированы для обеспечения большей стабильности антигенного сайта Ø (таблица S1). Здесь показана структура тримера RSV F в его конформации, связанной с D25, с смоделированным C-концевым присоединенным фолдоном. Тример отображается с двумя из трех протомеров F 1 F 2 в представлении молекулярной поверхности (окрашены в коричневый и розовый цвет), а третий протомер F 1 F 2 в виде ленты.Лента окрашена в серый цвет в областях, где она относительно закреплена между пре- и постфузией, тогда как N- и C-концевые остатки, которые перемещаются более чем на 5 Å между пре- и пост-конформациями, окрашены в синий и зеленый цвета, соответственно. Мутации, совместимые с экспрессией RSV F и начальным распознаванием D25 (таблица S1), но недостаточно стабильные для очистки RSV F как гомогенного тример (), помечены и показаны в виде палочек (окрашены в черный цвет). На вставках показаны увеличенные стабилизирующие мутации в виде палочки (окрашены в красный цвет) для вариантов DS, Cav1 и TriC, все из которых в достаточной степени стабилизируют антигенный сайт Ø, чтобы обеспечить очистку в виде гомогенного тримера ().

Таблица 1

Антигенные и физические характеристики сконструированных вариантов гликопротеина F RSV.

0,88 S155C-S290C (ДС) 1000 88 8 88 <0.1 1788 Совокупный A
Механизм
стабилизация
RSV F вариант Олигомерный
состояние #
Доходность
(мг / л) *
Значение антитела K D (нМ) @ Физические характеристики
(реакционная способность фракционного D25)


Площадка Ø Участок I Участок II $ Зона IV Температура (°) pH Осмоляльность
(мМ)
Freeze-
оттепель











D25 AM22 5C4 131-2a Палив Мота 101F 50 70 3.5 10,0 10 3000 10 и
Заполнение полости K87F-V90L Агрегат 0,3 > 1000 > 1000 > 1000 7,6 1,7 0,17 1,6 НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ
F137W-F140W Нет.Д. <0,1 НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ Нет Нет Нет Нет
F137W-F140W-F488W Нет <0,1 НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ
S190F-V207L ​​(Cav1) Тример 2.2 0,23 <0,10 9,3 > 1000 43 <0,01 2,9 0,8 0,1 0,7 0,8 1,0 0,7 0,6
S190F-V296F Совокупный 0.4 > 1000 > 1000 > 1000 4,2 1,7 <0,01 1,6 НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ
V2085L-V220L Агрегат > 1000 > 1000 > 1000 2,8 0,99 0,014 0.69 НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ
D486H-E487- 900-F48
D489H (TriC)
Тример 0,8 0,012 1,0 34 > 1000 31 0,48 4.0 0,8 0,1 0,1 0,8 1,3 0,6 0,1
F488W Тример 1,7 0,087 0,25 27 > 1000 32 0,1 0,18 0, 7 1,1 0,5 0

Тример 1,4 0.29 <0,01 35 3,4 2,8 0,043 2,2 0,3 0 0,1 0,8 1,3 0,8 0,3
T357C-N371C N.Д. <0,1 НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ
S403C-T420C Совокупность 0,3 > 1000 > 1000 3,3 0,05 1.85 НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ

<0.1 > 1000 > 1000 > 1000 7,2 3,1 0,11 1,64 Нет Нет Нет Нет Нет НЕТ НЕТ

> 1000 > 1000 > 1000 3,5 1,7 0,11 1,64 Нет Нет Нет Нет Нет НЕТ НЕТ
I506K Совокупный <0,1 > 1000 > 1000 > 1000 4,6 1,7 0.054 1,39 НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ

0.1 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 9,5 0,57 12,7 НЕТ НЕТ НЕТ Н / Д НЕТ НЕТ
Комбинации DS-Cav1 Тример 1.9 0,15 <0,01 13 > 1000 23 0,041 3,2 0,9 0 0,8 0,9 1,0 0,8 0,7
DS-TriC Тример 0.6 0,17 <0,01 33 2,0 4,8 0,055 3,1 0,9 0 0,3 0,9 0,5 0,9 0,5
Cav1-TriC Тример 0.2 0,99 0,086 5,1 > 1000 33 0,17 3,1 0,9 0,1 0,3 0,8 0,6 0,5 0
Комбинации DS-Cav1-TriC Тример 1.3 0,17 0,02 18 > 1000 20 0,10 3,2 0,9 0,1 0,6 0,9 0,6 0,6 0

Мы проанализировали структуру F RSV, связанного с D25, для гидрофобных полостей, уникальных для конформации F RSV, связанной с D25, которые примыкают к областям, которые различаются в состояниях до и после слияния ( 26 ).Несколько таких полостей были идентифицированы в дистальной мембране «головы» структуры предварительного слияния, близко к сайту связывания D25, и мы разработали гидрофобные замены для заполнения этих полостей. Было предсказано, что замены S190F и V207L ​​будут принимать преобладающие конформации боковых цепей с минимальными конфликтами, в то время как K87F, V90L, V220L и V296F показали меньшую стерическую совместимость. Мы оценили влияние заполнения этих полостей парами изменений. Пара S190F-V207L ​​(Cav1) () образовывала стабильные тримеры F RSV, экспрессируемые в 2.2 мг / л, и оставшийся антигенный сайт Ø (). Между тем, варианты K87F-V90L, S190F-V296F и V207L-V220L показали повышенное сохранение узнавания D25, но экспрессировались при уровне менее 0,1 мг / л ().

Другие полости, которые мы идентифицировали по направлению к центру префузионного RSV F, были близки к гибридному пептиду, оси тримеров и кислому участку, содержащему остатки Asp486, Glu487 и Asp489. Мы смоделировали несколько замен, заполняющих полость, включая F137W, F140W и F488W, и проанализировали эти замены в сочетании с D486H, E487Q и D489H ().Из шести испытанных комбинаций только две (F488W и D486H-E487Q-F488W-D489H) экспрессировали уровни очищенного тримера RSV F более 0,1 мг / л и сохранили распознавание D25. Вариант D486H-E487Q-F488W-D489H (TriC) образовывал стабильные тримеры F RSV, экспрессируемые при 0,8 мг / л, и сохранял антигенный сайт Ø (и).

Мы также проверили влияние дестабилизации постфузионной конформации на сохранение антигенного сайта Ø. Замена V178N, которая, как прогнозируется, вводит гликан, связанный с N, , совместимый с префузионной, но не постфузионной конформацией F, по-видимому, не стабилизирует антигенный сайт Ø, как и V185E или I506K, которые, как предполагалось, помещают глутаминовую кислоты или лизина внутрь шестиконтактного пучка после слияния ().Всего было сконструировано более 100 вариантов RSV F (таблица S1), экспрессированных в 96-луночном формате трансфекции ( 27 ) (фиг. S4) и протестированных с помощью ELISA культуральных супернатантов на связывание с D25 и мотавизумабом. (рис. S5 и S6). Пятнадцать конструкций были совместимы со связыванием D25, шесть из которых сохраняли узнавание D25 в течение по меньшей мере 7 дней при 4 ° C, и три из них можно было очистить как гомогенные тримеры, которые сохраняли антигенный сайт Ø (и фиг. S7). В целом, мы наблюдали сильную корреляцию между сохранением связывания D25 в течение как минимум 7 дней при 4 ° C в 96-луночных супернатантах и ​​выходом очищенных тримеров после крупномасштабной экспрессии и очистки (рис.S5).

Комбинаторная оптимизация стабильности Ø сайта

Варианты DS, Cav1 и TriC показали множество физических и антигенных свойств. Вариант DS был наименее устойчивым к изменению pH и температуры, но был более устойчивым в тримерном состоянии, в то время как низкий уровень непрерывного превращения тримеров в агрегат наблюдался для Cav1 и TriC при эксклюзионной хроматографии. Комбинации трех вариантов улучшили сохранение реактивности D25 в экстремальных физических условиях, что полезно для производства.В целом, комбинация DS-Cav1 оказалась оптимальной с точки зрения выхода тримеров и физической стабильности к экстремальным температурам, pH, осмоляльности и замораживанию-оттаиванию () и была гомогенной, что было оценено с помощью электронной микроскопии с отрицательным окрашиванием (рис. S2).

Кристаллографический анализ

Чтобы предоставить информацию на атомном уровне, мы определили кристаллические структуры сайтов Ø-стабилизированных вариантов RSV F (). Все варианты DS, Cav1, DS-Cav1 и DS-Cav1-TriC кристаллизовались в аналогичном 1,5 М винном растворе с pH 9.5, и эти кубические кристаллы дифрагировали рентгеновские лучи с разрешением 3,2, 3,1, 3,1 и 2,8 Å соответственно (таблица S2). Растворы для молекулярных замен были получены с использованием связанной с D25 структуры RSV F в качестве модели поиска, и они выявили единственный протомер RSV F в асимметричной единице с тримерной осью F, выровненной вдоль кристаллографической тройки. Тетрагональные кристаллы Cav1 и кубические кристаллы DS-Cav1 были также получены в условиях 1,7 М сульфата аммония, pH 5,5, и они дифрагировали с разрешением 2.4 Å и 3,0 Å соответственно (таблица S2). Молекулярная замена показала, что тетрагональная решетка имеет полный тример RSV F в асимметричном звене и тесно связана с кубическими решетками тартрата. В целом эти структуры показали, что сконструированные варианты F RSV по существу находятся в конформации, связанной с D25 ( 28 ).

Кристаллические структуры тримеров RSV F, сконструированные для сохранения антигенного сайта Ø

( AC ) Показаны шесть структур для вариантов RSV F, помеченных стабилизирующей мутацией (DS, Cav1, DS-Cav1 и DS-Cav1-TriC ) и кристаллической решетки (кубической или тетрагональной). (A) Тримеры RSV F показаны в виде Ca-червя, окрашенного в соответствии с коэффициентом атомной подвижности, с областями более высокой гибкости в более теплых цветах (красный) и областями с меньшей гибкостью в более холодных цветах (синий). Недостающие области показаны пунктирными линиями. Они возникают в С-концевой области, проксимальной к мембране, где мотив фолдона не виден, за исключением структуры DS-Cav1-TriC (крайняя правая). В структуре ДС две петли в области головы также неупорядочены. ( B ) Антигенный сайт Ø протомера RSV F отображается на ленточной диаграмме, при этом структура D25-связанного RSV F серого цвета, а различные варианты окрашены в желтый (DS), светлый и темно-синий (Cav1), светлый и темный. зеленый (DS-Cav1) и черный (DS-Cav1-TriC).Остатки, соответствующие антигенному сайту Ø, выделены черным на изображении слева, а вторичные структурные элементы показаны на втором изображении слева. Стабилизирующие мутации помечены и показаны в виде палочек (окрашены в красный цвет). Перпендикулярный вид представлен на рисунке S8. ( C ) Детали атомного уровня показаны в виде палочек, окрашенных так же, как и в, с областями RSV F, которые изменяют конформацию между конформацией до и после слияния, красным и синим, а те, которые остаются постоянными, — серым.Стабилизирующие атомы углерода для стабилизации мутаций выделены красным. В Cav1 (pH5,5) и в DS-Cav1 (pH5,5) наблюдались новые особенности, включающие взаимодействие C-конца пептида F2 с сульфат-ионом и гибридным пептидом. В структуре DS-Cav1-TriC мутации D486H-E487Q-F488W-D489H взаимодействуют с двумя соседними протомерами (окрашенными в коричневый и розовый цвета) вокруг оси тримера.

Хотя структура варианта DS (левый столбец) выявила, что цистеин-замещенные остатки в 155 и 290 образуют дисульфидную связь, которая предотвращает запуск в состояние после слияния, большая часть дистальной части мембраны тримера RSV F, включая антигенный сайт Ø был либо неупорядочен (остатки 63-72 и 169-216), либо имел другую конформацию.Таким образом, например, остатки 160-168 в структуре DS расширяют α2-спираль вместо того, чтобы формировать виток и инициировать α3-спираль, как в F-структуре, связанной с D25 (, левая панель). Одним из возможных объяснений различий между структурой DS и структурой F RSV, связанной с D25, является то, что антигенный сайт Ø в DS является гибким и кристаллизован в конформации, которая не связывает D25 ( 29 ). В целом, вариант DS сохранил многие особенности состояния до слияния RSV F, включая слитый пептид внутри тримерной полости; однако он не смог зафиксировать антигенный сайт Ø в его конформации, связанной с D25 (рис.S8).

По сравнению с DS, структура Cav1 (вторая и третья колонки) была более упорядоченной на своей дистальной части мембраны, с четко определенными α3-спиралями, β3 / β4 шпильками и α4-спиралями. Остатки 137-202, которые содержат замену S190F, имели среднеквадратичное отклонение Cα 0,6 Å по сравнению со структурой F, связанной с D25. Более высокая степень структурного порядка, вероятно, была связана с мутацией S190F, которая заполнила полость, наблюдаемую в структуре F, связанной с D25, и увеличила контакты Ван-дер-Ваальса с остатками Ile57, Lys176, Val192, Glu256, Ser259 и Leu260.Другая мутация, заполняющая полость в Cav1, V207L, была сдвинута на 5,5 Å по сравнению с F-структурой, связанной с D25, при этом C-концевой участок α4-спирали изгибается около Pro205 и принимает различные конформации в двух условиях кристаллизации (, вторая и третья панели слева), предполагая, что мутация V207L ​​неспособна стабилизировать α4-спираль в конформации, связанной с D25.

Поразительной особенностью структуры Cav1 в тетрагональной кристаллической решетке является C-конец F 2 , который неупорядочен в структуре F, связанной с D25, но в Cav1 туннелирует в тримерную полость вместе с гибридным пептидом.Интересно, что С-конец заканчивается на Ala107, а не на Arg109, как ожидалось после расщепления сайта фурина (Arg106-Ala107-Arg108-Arg109) ( 30 ). В структуре Cav1 положительный заряд Arg106 компенсируется упорядоченным сульфат-ионом (). Биологически внутреннее положение С-конца F 2 может играть роль в запуске конформации F.

Сравнение структур DS-Cav1 двух кубических кристаллических форм (второй и третий столбцы справа) с структурами Cav1 выявило лишь незначительные различия ( 31 ).Наибольшие различия произошли на вершине F RSV, включая антигенный сайт Ø и, в частности, на остатках 64-73 и 203-216. Примечательно, что атомная подвижность ( B -фактор) была самой высокой в ​​этой области верхушки для всех вариантов, стабилизированных по Ø сайта, что, возможно, указывает на внутреннюю гибкость сайта с Ø. Интересно, однако, что сайт Ø имеет низкую атомную подвижность при связывании с D25, что свидетельствует о способности D25 стабилизировать как общие, так и локальные конформации F RSV.

Структура тройной комбинации DS-Cav1-TriC (крайний правый столбец) также очень похожа на другие структуры вариантов F RSV, содержащих Cav1.Одно различие в электронной плотности соответствовало области слабой плотности в проксимальной к мембране области, которая приблизительно соответствовала размерам домена тримеризации Т4-фибритина ( 32 ), но не видна в других кристаллизованных структурах RSV F, содержащих этот домен, включая структуру, связанную с D25 ( 7 ). Небольшие структурные различия в упаковке, вероятно, позволили частично упорядочить этот домен (и, возможно, также объяснить увеличенный дифракционный предел кристаллов DS-Cav1-TriC по сравнению с другими кубическими вариантами), а не различия во взаимодействии между DS -Cav1-TriC стабилизировал RSV F и домен тримеризации.

Критическая замена F488W в изменении TriC остатков 486-489, упакованных непосредственно против замен F488W соседних протомеров тримера RSV F. Боковая цепь индола Trp488 направлена ​​в сторону вершины тримера, а также формирует взаимодействия стэкинга колец с боковой цепью Phe140 гибридного пептида (крайняя правая панель). Это взаимодействие слитого пептида, которое не наблюдается ни в одной из структур, содержащих Phe488, вероятно, ингибирует экстракцию слитого пептида из полости тримера перед слиянием, обеспечивая структурное обоснование способности замены F488W стабилизировать состояние RSV до слияния. F ().

Иммуногенность антигенного сайта Ø-стабилизированного RSV F

Для оценки эффекта стабилизации Ø сайта на выработку гуморальных ответов, защищающих от RSV, мы иммунизировали мышей CB6F1 / J различными формами RSV F, вводя каждой мыши 10 мкг RSV F в сочетании с 50 мкг адъюванта поли I: C на 0-й и 3-й неделях и измеряли способность сыворотки 5-й недели предотвращать инфицирование RSV клеток HEp-2. Каждый из DS, Cav1 и TriC вызывал высокие титры нейтрализующей активности (среднее геометрическое 50% эффективных концентраций (EC 50 s) 1826-2422).Этот уровень был примерно в 4 раза выше, чем уровень, вызванный постфузией F (504 EC 50 ), и примерно в 20 раз выше, чем защитный порог ( 33 ). Для сравнения, DS-Cav1 вызывал нейтрализующую активность 3937 EC 50 , примерно в 8 раз выше, чем постфузионный F, и в 40 раз выше, чем защитный порог ( 33 ) ().

Иммуногенность сконструированных тримеров F RSV

Белки F RSV, сконструированные для стабильного отображения антигенного сайта Ø, вызывают нейтрализующие титры, значительно более высокие, чем титры, вызванные постфузией F.( A ) Титры нейтрализации сывороток мышей, иммунизированных 10 мкг RSV F (слева). Постфузионный F, а также F RSV, связанный с антителами AM22 или D25, вводили в дозе 20 мкг комплекса RSV F-антитело на мышь (справа). Титры от каждой мыши показаны отдельными черными точками, а геометрические средние обозначены красными горизонтальными линиями. ( B ) Нейтрализационные титры сывороток макак-резусов, иммунизированных 50 мкг вариантов белка F RSV. Титры каждой макаки показаны отдельными черными точками, а геометрические значения обозначены красными горизонтальными линиями.Защитный порог (, , 33, , ) обозначен пунктирной линией, а значения p представлены для постфузии по сравнению с DS-Cav1, оцененным с помощью двустороннего Т-теста.

Для количественной оценки ответов антител к различным сайтам на RSV F перед слиянием мы использовали O-окклюзированные формы RSV F. CB6F1 / J мышей, иммунизированных 20 мкг RSV F, связанных антителами, направленными на O антигенных сайтов (содержащих ~ 10 мкг RSV F и ~ 10 мкг антигенсвязывающего фрагмента антитела) развили средние геометрические нейтрализующие титры на 5-й неделе 911 и 1274 EC 50 для комплексов AM22 и D25, соответственно, что примерно вдвое больше, чем после слияния при 10 мкг / мл и сопоставимо. к тем, которые были вызваны постфузией при 20 мкг / мл ().Эти данные свидетельствуют о том, что очень высокие титры, вызванные иммунизацией вариантами F RSV, стабилизированными в состоянии до слияния, особенно DS-Cav1, были результатом антител, нацеленных на антигенный сайт Ø.

Чтобы изучить общность выявления сайта Ø, мы иммунизировали макак-резусов DS-Cav1, DS и постфузионными формами RSV F, вводя каждой макаке 50 мкг RSV F, смешанного с 500 мкг адъюванта поли I: C на 0 и 4 неделях. и измерили способность сывороток 2, 4, 6, 8, 10 и 14 недель ингибировать инфекцию RSV.Сформулированные белки сохраняли свои ожидаемые антигенные профили, измеренные по связыванию D25 с материалом из вводимого вещества (фиг. S9). На 6-й неделе DS и DS-Cav1 вызвали средние геометрические титры 1222 и 2578 EC 50 соответственно, что примерно в 5 и 10 раз выше, чем у F после слияния (287 EC 50 ) (). К 8 неделе средние геометрические титры DS-Cav1 были примерно в 60 раз выше, чем титры, вызванные постфузией F против гомологичного RSV подтипа A (фиг. S10), и более чем в 80 раз выше против RSV подтипа B (таблица S4).В целом, эти результаты демонстрируют сохранение относительной иммуногенности для различных форм иммуногена F RSV между мышами и приматами, при этом DS-Cav1 вызывает RSV-защитные титры, во много раз превышающие защитный порог в иммунной системе приматов против обоих основных подтипов RSV.

Информатика Ø-стабилизированных иммуногенов RSV F

( A ) Физическая стабильность Ø участка по сравнению с иммуногенностью. Физическая стабильность (горизонтальная ось), определенная с помощью среднего из семи измерений активности D25, сохраняемых в, сравнивается с титрами, полученными в результате RSV-защиты (вертикальная ось).( B ) Структурная мимикрия сайта Ø в сравнении с иммуногенностью. Структурная мимикрия (горизонтальная ось) представляет собой среднеквадратичное отклонение расстояний между атомами между различными несвязанными структурами RSV F () и связанной с D25 структурой RSV F для всех атомов в пределах 10 Å от D25. Это сравнивается с титрами, полученными с защитой от RSV (вертикальная ось). ( C ) Антигенный анализ сыворотки иммунизированных макак. Связывание сывороток с иммобилизованным на кончике датчика DS-Cav1 (слева), DS (в центре) или постфузией F (справа) измеряли непосредственно (черные столбцы) или после инкубации с избытком постфузионного F (светло-серые столбцы), DS (серые столбцы). ) или DS-Cav1 (темно-серые полосы).Показаны средние ответы четырех сывороток макак со стандартными отклонениями в виде столбцов ошибок. Дополнительный анализ иммунизированных сывороток показан на рис. S12. ( D ) Вызывали реакции связывания относительно площадей поверхности и общих или уникальных частей иммуногенов. Были рассчитаны площади поверхности (рис. S11 и таблица S3) и сравнивались с реакциями связывания для 36 измерений ответа в (C). ( E ) Корреляция иммуногенности и антигенной специфичности иммунизированных сывороток макака. Средние титры нейтрализации EC 50 (неделя 6) четырех сывороток макака в каждой группе нанесены на график в зависимости от отношения F-специфических реакций связывания до / после слияния в (C) ( 37 ).

Оптимизация защитных ответов RSV F

Взаимодействие между дизайном, физическими и антигенными свойствами, структурой на атомном уровне и иммуногенностью обеспечивает основу для дальнейшей оптимизации кандидатных вакцин против RSV ( 34 ). Например, чтобы получить представление о взаимосвязи между различными антигенными и физическими свойствами сконструированных F RSV и возникновением RSV-защитных ответов, можно соотнести антигенные и физические свойства () с иммуногенностью ().Такие корреляции указывают на то, что увеличение стабильности сайта Ø к физическим крайностям должно увеличивать защитные титры, возникающие при иммунизации () ( 35 ). Точно так же корреляции между различными конформационными состояниями или областями F RSV () и иммуногенностью () обеспечивают понимание конструкции конформации и областей F RSV, которые обеспечивают наиболее защитные ответы. В частности, усиление структурной мимикрии антигенного сайта Ø в его связанной с D25 конформации, по-видимому, является многообещающей стратегией для улучшения защитных ответов антител ().

Мы также должны быть в состоянии оценить степень, в которой может быть получено улучшение по отношению к определенному параметру. Например, как только была установлена ​​корреляция между физической стабильностью или структурной мимикрией и защитными реакциями, физическая стабильность может быть максимизирована (например, до 100% удержания связывания D25) или идеализирована структурная мимикрия (например, для точной имитации связывания D25. конформация), чтобы получить оценку максимального улучшения вызванного защитного ответа по сравнению с этим конкретным параметром.Результаты () предполагают, что усиление структурной мимикрии, вероятно, не будет иметь большого влияния на иммуногенность, но что дополнительная физическая стабилизация антигенного сайта Ø может улучшить защитные титры до 4 раз. Независимые параметры, такие как адъювант, мультимеризация, средство доставки или режим иммунизации, предлагают дополнительные возможности для улучшения вызванного ответа ( 36 ).

Для количественной оценки вызванных реакций связывания мы соединили различные варианты RSV F с наконечником биосенсора Octet и измерили их реактивность с вызванными сыворотками ().«Самореактивные» реакции связывания (с DS-Cav1, DS или постфузионным F на наконечнике биосенсора и сыворотками от животных, иммунизированных DS-Cav1, DS или постфузионным F, соответственно) были сопоставимы для DS-Cav1, DS и постфузионного F. Чтобы получить представление о реакциях связывания относительно поверхностей, которые были либо общими, либо уникальными для DS-Cav1, DS и постфузионного F, мы измерили «перекрестно-реактивные» реакции связывания, например, с DS-Cav1 на наконечнике биосенсора и сыворотки от животных, иммунизированных DS или постфузионным F, а также ответы связывания с «преабсорбированными» сыворотками, к которым были добавлены различные формы F RSV ().Мы рассчитали общие и уникальные площади поверхности, рассчитанные на основе кристаллических структур DS-Cav1, DS и постфузионного F (рис. S11 и таблица S3), и проанализировали их относительно 36 измеренных реакций связывания в. Наблюдалась сильная корреляция между реакциями связывания и рассчитанными площадями поверхности (). Некоторые выбросы включали поверхности, уникальные для DS-Cav1, поверхности, которые, вероятно, содержат антигенный сайт Ø. В совокупности результаты показывают, что количество вызванного связывающего антитела в первом приближении было пропорционально площади поверхности иммуногена, независимо от того, был ли этот иммуноген DS-Cav1, DS или постфузионным F; в пределах этого общего сходства антигенный сайт Ø вызывал примерно в 2 раза более высокий титр связывающего антитела по сравнению с площадью его поверхности.В целом, вызванные титры EC 50 не коррелировали с антигенными ответами, измеренными против форм RSV F до или после слияния, но действительно коррелировали с уровнем специфических ответов до слияния, измеренных либо как разность, либо как отношение ( p = 0,005) между специфическими для префузии и постфузионными F-направленными ответами RSV () ( 37 ). Примечательно, что крутой наклон этой корреляции, вероятно, отражает существенно более высокую эффективность нейтрализации, наблюдаемую для префузионных антител, нацеленных на антигенный сайт Ø ( 7 , 38 ).

Структурная вакцинология

Структурная биология может использоваться при разработке вакцины для определения ключевых участков, с помощью которых можно отключить патоген, для точного определения замен остатков, инактивирующих токсоиды, для стабилизации выбранных конформаций субъединицы антигена и для определения комплексов антитело-антиген. которые служат основой для эпитоп-специфичных стратегий выявления. Важно отметить, что контроль антигенности на атомном уровне все чаще оказывается в пределах досягаемости структурно-ориентированного дизайна ( 16 , 39 , 40 ).В случае сложных патогенов, таких как малярия или менингококк, нейтрализующая активность, опосредованная антителами, может быть направлена ​​против многих потенциальных антигенов, и открытие вакцины было сосредоточено на определении лучшего антигена-мишени с помощью методов, включая геномный анализ или «обратную вакцинологию» ( 41 44 ). Однако для таких патогенов, как ВИЧ-1, грипп или RSV, где нейтрализующие антитела действуют почти исключительно через один или два гликопротеина оболочки, стратегия, специфичная для сайта или суперсайта, может иметь преимущества.В частности, вирусный сайт, уязвимый для нейтрализующего антитела, может быть более податливым для проектирования на основе структуры, чем вирусная субъединица, при сохранении более высокого уровня иммуногенности, чем эпитоп-специфический каркас ( 45 ).

Для сайт-специфичных стратегий вакцинации выбор подходящего целевого сайта имеет решающее значение. Ключевыми факторами являются частота выявления, широта и эффективность. Антигенные сайты, которые содержат несколько перекрывающихся эпитопов часто вызываемых антител, могут быть хорошими мишенями из-за их ожидаемой способности вызывать высокие уровни реактивных антител в общей популяции.По ширине сайт Ø является одним из наиболее дивергентных антигенных сайтов RSV; однако антитела, направленные на сайт Ø, такие как D25, способны нейтрализовать большинство человеческих RSV, вероятно, из-за относительно низкого генетического разнообразия F среди циркулирующих штаммов RSV человека, а нейтрализующая активность подтипа A и B была сильно индуцирована стабилизированными F RSV. сообщается здесь (таблица S4). Эффективность сыграла ключевую роль в нашем выборе Ø сайта в качестве мишени вакцины, и антигенный анализ вызванного ответа () показал, что эффективность вызванных антител имеет решающее значение для успеха нашего подхода, сфокусированного на Ø ( 46 ) .Будет ли примененная здесь стратегия «чувствительного к нейтрализации сайта» успешной в других контекстах, таким образом, зависит от специфичных для вируса факторов, таких как циркулирующее вирусное разнообразие и необходимый уровень нейтрализующей активности для достижения защиты. Тем не менее, многие уроки, извлеченные из наших усилий с RSV, такие как важность изучения естественных иммунных ответов человека и выбора подходящего целевого сайта, в целом применимы.

Благодарности

Мы благодарим Дж.Стаки за помощь с цифрами, И.С. Георгиеву и М. Панчеру за помощь в разработке иммуногена, G.J. Набель, Р.А. Седеру, Л. Шапиро и членам Секции структурной биологии, Основной секции структурной биоинформатики и Лаборатории вирусного патогенеза в Центре исследования вакцин за полезные комментарии, а также Дж. Хрзасу, Дж. Гончи, У. Чинте и сотрудникам SER- CAT (Юго-восточная региональная группа совместного доступа) за помощь в сборе данных дифракции рентгеновских лучей. Данные, представленные в этой рукописи, сведены в таблицу в основной статье и дополнительных материалах.Координаты атомов и структурные факторы описанных кристаллических структур были депонированы в базе данных белков под кодами доступа 4MMQ-4MMV. Поддержка этой работы была оказана Программой внутренних исследований (Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний) и Национальным фондом естественных наук Китая (81161120419). Использование устройства ввода 22 (SER-CAT) в усовершенствованном источнике фотонов было поддержано Министерством энергетики США, Отделом фундаментальных энергетических наук, Управлением науки, в соответствии с контрактом W-31-109-Eng-38.Х.С. и Т.Б. являются авторами международной патентной заявки, описывающей технологию, используемую для выделения D25 и AM22 (средства и способы воздействия на стабильность продуцирующих антитела клеток, WO2007067046A1). A.Q.B и T.B. являются авторами международных патентных заявок на антитело D25 (RSV-специфические связывающие молекулы и средства их получения, WO2008147196A2) и антитело AM22 (RSV-специфические связывающие молекулы, WO2011043643A1). J.S.M., M.G.J, B.Z., B.S.G. и P.D.K являются изобретателями U.S. патентные заявки, описывающие использование гликопротеинов F RSV, стабилизированных предварительным слиянием, в качестве вакцинных антигенов (белки Prefusion RSV F и их использование, 61/798,389 и 61/863,909). J.S.M, M.C., Z.Z., N.X. и B.S.G. являются авторами китайской патентной заявки на антитело 5C4 и его эпитоп (антитело против RSV с высокой нейтрализацией и пептид можно использовать для предотвращения инфекции RSV и родственных заболеваний, 201310082338.1). Реагенты от NIH подпадают под действие неограничительных соглашений о передаче материалов.

Ссылки и примечания

1. Lozano R, et al. Глобальная и региональная смертность от 235 причин смерти для 20 возрастных групп в 1990 и 2010 годах: систематический анализ для исследования глобального бремени болезней 2010. Lancet. 2013; 380: 2095–2128. [PubMed] [Google Scholar] 2. Джонсон С. и др. Разработка гуманизированного моноклонального антитела (MEDI-493) с высокой активностью in vitro и in vivo против респираторно-синцитиального вируса. J. Infect. Дис. 1997. 176: 1215–1224. [PubMed] [Google Scholar] 3. Исследовательская группа IMpact-RSV Palivizumab, гуманизированное моноклональное антитело к респираторно-синцитиальному вирусу, снижает количество госпитализаций в связи с инфекцией респираторно-синцитиального вируса у младенцев из группы высокого риска.Педиатрия. 1998. 102: 531–537. [PubMed] [Google Scholar] 4. Эрп LJ, Delos SE, Park HE, White JM. Многочисленные механизмы слияния белков вирусной мембраны. Curr. Вершина. Microbiol. Иммунол. 2005. 285: 25–66. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 5. Маклеллан Дж.С., Ян Й., Грэм Б.С., Квонг П.Д. Структура гликопротеина слияния респираторно-синцитиального вируса в постфузионной конформации свидетельствует о сохранении нейтрализующих эпитопов. J. Virol. 2011; 85: 7788–7796. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 6.Swanson KA, et al. Структурная основа иммунизации постфузионным гликопротеином F слияния респираторно-синцитиального вируса (RSV F) для получения высоких титров нейтрализующих антител. Proc. Natl. Акад. Sci. США, 2011 г .; 108: 9619–9624. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 7. Маклеллан Дж. С. и др. Структура тримерного гликопротеина слияния RSV, связанного с нейтрализующим антителом, специфичным для предварительного слияния. Наука. 2013; 340: 1113–1117. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 8. Liljeroos L, Krzyzaniak MA, Helenius A, Butcher SJ.Архитектура респираторно-синцитиального вируса, выявленная методом электронной криотомографии. Proc. Natl. Акад. Sci. США 2013; 110: 11133–11138. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 9. Андерсон LJ и др. Стратегические приоритеты разработки вакцины против респираторно-синцитиального вируса (RSV). Вакцина. 2013; 31 (Приложение 2): B209–215. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 10. Магро М. и др. Нейтрализующие антитела против преактивной формы слитого белка респираторно-синцитиального вируса открывают уникальные возможности для клинического вмешательства.Proc. Natl. Акад. Sci. США, 2012 г.; 109: 3089–3094. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 11. Spits H, Beaumont T. RSV-специфические связывающие молекулы и средства для их получения. Патентная заявка №12 / 600,950, 2010 г. [Google Scholar] 12. Бомонт Т., Баккер А.К., Ясуда Э. Специфическая связывающая молекула RSV. Заявка на патент 2012 г. 12/898325. [Google Scholar] 13. Бертон ДР. Антитела, вирусы и вакцины. Nat. Rev. Immunol. 2002; 2: 706–713. [PubMed] [Google Scholar] 15. Офек Г. и др. Выявление структурно-специфических антител эпитопными каркасами.Proc. Natl. Акад. Sci. США, 2010; 107: 17880–17887. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 17. Макгуайр А.Т. и др. Разработка белка оболочки ВИЧ для активации рецепторов В-клеток зародышевой линии широко нейтрализующих антител к сайту связывания CD4. J. Exp. Med. 2013; 210: 655–663. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 18. Маклеллан Дж. С. и др. Структурные основы нейтрализации респираторно-синцитиального вируса мотавизумабом. Nat. Struct. Мол. Биол. 2010; 17: 248–250. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 19.Маклеллан Дж. С. и др. Дизайн и характеристика иммуногенов эпитоп-каркас, которые представляют эпитоп мотавизумаба из респираторно-синцитиального вируса. J. Mol. Биол. 2011; 409: 853–866. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 20. Kong L, et al. Суперсайт иммунной уязвимости на гликозилированной поверхности гликопротеина оболочки ВИЧ-1 gp120. Nat. Struct. Мол. Биол. 2013; 20: 796–803. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 21. Ефимов В.П. и др. Фибритин, кодируемый геном wac бактериофага Т4, имеет параллельную трехцепочечную альфа-спиральную структуру спиральной спирали.J. Mol. Биол. 1994; 242: 470–486. [PubMed] [Google Scholar] 22. Мирошников К.А. и др. Конструирование тримерных волокнистых белков на основе адгезинов бактериофага Т4. Белковая инженерия. 1998. 11: 329–332. [PubMed] [Google Scholar]

23. Информация о материалах и методах доступна в Science Online.

24. Варианты RSV F оценивали по временной экспрессии в 96-луночном формате (рис. S4). Если супернатанты демонстрировали сохраняющуюся реактивность с антителами мотавизумаб и D25 через 1 неделю при 4 ° C, их экспрессировали с помощью временной трансфекции 1 мкл клеток Expi293F, очищали с использованием добавленных His-tag и StreptagII и анализировали с помощью эксклюзионной хроматографии ( инжир.S7)

25. Неспособность экспрессировать потенциальные межцепочечные двойные замены цистеина, несмотря на разумное моделирование в зрелой структуре префузии F 1 F 2 , может указывать на то, что протомеры RSV F 0 до расщепления и удаления пептид 27 принимает существенно различные межпромерные конформации.

26. Полости в структуре RSV F, связанной с D25, были визуализированы с помощью PyMol с использованием опции «Только полости и карманы» для настроек поверхности. Аминокислотные замены, предназначенные для заполнения образовавшихся полостей, были идентифицированы с помощью Мастера мутагенеза.

27. Pancera M, et al. N332-направленные нейтрализующие антитела широкого спектра действия используют различные способы распознавания ВИЧ-1: выводы из функции комплементации тяжелой и легкой цепи. PLoS One. 2013; 8: e55701. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

28. Сконструированные варианты RSV F имели среднеквадратичное отклонение Cα от конформации, связанной с D25, 0,7-1,5 Å и от конформации после слияния приблизительно 30 Å.

29. Кристаллизованный DS сохранил ~ 20% своего распознавания D25 по сравнению с кристаллизованным Cav1 (нормализованным для распознавания мотавизумаба) через 4 месяца при 20 ° C, что указывает на то, что кристаллизованный DS был способен как распознавать D25, так и превращаться в конформация несовместима со связыванием D25.Напротив, растворимые DS утратили распознавание D25 после 2 месяцев инкубации при 4 ° C в PBS. Нам не удалось кристаллизовать DS, который запускался нагреванием при 50 ° C, несмотря на то, что DS, запускаемый нагреванием, сохранял тримерное состояние на эксклюзионной хроматографии.

30. Наблюдение за Ala107, а не за Arg109 на С-конце F2 не является полностью неожиданным: Гартен и Кленк ( 47 ) обнаружили, что аргинин в сайте расщепления гемагглютинина гриппа урезается активностью клеточной карбоксипептидазы.

31. Cα-среднеквадратичное отклонение 0,86 Å для 447 остатков между Cav1 и DS-Cav1, выращенными в условиях сульфата аммония; Cα-среднеквадратичное отклонение 0,47 Å для 447 остатков DS-Cav1 в кубических решетках.

32. Stetefeld J, et al. Стабилизация коллагена на атомном уровне: кристаллическая структура сконструированного (GlyProPro) 10фолдона. Структура. 2003. 11: 339–346. [PubMed] [Google Scholar]

33. Когда паливизумаб (Synagis®) вводится в концентрации 15 мг / кг, уровни сыворотки на дне составляют ~ 40 мкг / мл, что обеспечивает защиту младенцев от тяжелых заболеваний и защиту хлопка. крысы от RSV-инфекции.В нашем анализе нейтрализации ~ 40 мкг / мл паливизумаба дает EC 50 из 100.

34. Nabel GJ. Философия науки. Координаты истины. Наука. 2009. 326: 53–54. [PubMed] [Google Scholar]

35. Напротив, аффинность вариантов F RSV к антителу D25 не коррелировала с получением защитных титров. Выход тримеров RSV F также не коррелировал с защитными титрами.

36. Гибкость антигенного сайта может повысить его иммуногенность, позволяя сайту соответствовать более широкому разнообразию антител.Мы отмечаем в этом контексте, что факторы атомной подвижности антигенного сайта Ø были одними из самых высоких в фектодомене RSV.

37. Для «префузионной» формы RSV F мы использовали стабилизированный DS-Cav1 вариант RSV F.

38. Должна быть возможность деконволюции вызванного ответа с использованием зондов с определенным строением, как показано с D25 и Связанный мотавизумабом RSV F на фиг. S12.39. Дормитцер П.Р., Гранди Дж., Раппуоли Р. Структурная вакцинология начинает приносить плоды. Nat. Rev. Microbiol. 2012; 10: 807–813.[PubMed] [Google Scholar] 40. Азоитей М.Л. и др. Трансплантация прерывистого мотива на белковый каркас под управлением вычислений. Наука. 2011; 334: 373–376. [PubMed] [Google Scholar] 41. Delany I, Rappuoli R, Seib KL. Вакцины, обратная вакцинология и бактериальный патогенез. Харб Холодного источника. Перспектива. Med. 2013; 3: a012476. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 43. Мориэль Д.Г. и др. Идентификация защитных и широко консервативных вакцинных антигенов из генома внекишечных патогенных Escherichia coli.Proc. Natl. Акад. Sci. США 2010; 107: 9072–9077. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 44. Мора М., Донати С., Медини Д., Коваччи А., Раппуоли Р. Микробные геномы и дизайн вакцины: уточнения к классическому подходу обратной вакцинологии. Curr. Opin. Microbiol. 2006; 9: 532–536. [PubMed] [Google Scholar] 45. Хотя стратегия эпитоп-скаффолд может не вызывать таких высоких титров, как стратегия сайта, чувствительного к нейтрализации, для специфических антител, таких как антитело MPE8 ( 48 ), которое способно нейтрализовать не только RSV, но и другие парамиксовирусы, включая человеческие. метапневмовируса, стратегии, специфичной для эпитопа, может быть достаточно.

46. Величина активности антител является решающим фактором, определяющим, насколько хорошо человек будет защищен после вакцинации и как долго будут сохраняться защитные реакции у младенцев, которые пассивно получили антитела от своих матерей.

47. Garten W, Klenk HD. Характеристика карбоксипептидазы, участвующей в протеолитическом расщеплении гемагглютинина гриппа. J. Gen. Virol. 1983; 64: 2127–2137. Ч. 10. [PubMed] [Google Scholar] 48. Corti D, et al. Перекрестная нейтрализация четырех парамиксовирусов человеческим моноклональным антителом.Природа. 2013 [PubMed] [Google Scholar]

Летальный случай, связанный с инфекцией респираторно-синцитиального вируса у маленького ребенка | BMC Infectious Diseases

Пациенткой в ​​этом смертельном случае была 2-летняя девочка, родившаяся доношенным и развивающаяся нормально. В анамнезе не было астмы или пневмонии, а также семейного анамнеза иммунодефицита. У нее не было ни братьев, ни сестер.

Пациент был госпитализирован в связи с повышением температуры тела на 3 дня и остановкой дыхания и сердца на 15 минут.Симптомы начались 10 ноября (за 3 дня до госпитализации) с повышения температуры (до 39,8 ° C), но без озноба, сыпи и судорог. Ибупрофен давали перорально. Температура тела снизилась на 4–5 ч, но затем поднялась до 40,3 ° C. Одышка сопровождала лихорадку, и температура тела после перорального приема ибупрофена явно не снижалась. Возникло свистящее дыхание, вызванное задержкой мокроты в горле, и однократный приступообразный кашель. Пациент иногда откашлялся небольшим количеством желтой мокроты и слегка насморк.У нее не было астмы, затрудненного дыхания или кровохарканья; у нее была летаргия и плохой аппетит, но не было рвоты или диареи. 11 ноября (за 2 дня до госпитализации) у пациентки по-прежнему сохранялась высокая температура, а температура тела колебалась около 40 ° C. Очевидно, что после попеременного перорального приема ибупрофена и ацетаминофена температура тела пациентки не снизилась. С этого момента считалась острой инфекцией. Пациентка получила внутривенное вливание 0,14 г зитромакса и 120 мг рографолида, а также аэрозольную ингаляцию 2 мг будесонида, но лихорадка сохранялась, а температура тела поднялась до пика 40 ° C.12 ноября (за 1 день до госпитализации) у пациентки по-прежнему сохранялась температура и хрипы из-за скопления мокроты в горле. У нее была одышка, легкий кашель и упадок духа, сопровождаемые сыпью на туловище и конечностях. Ее аппетит немного улучшился, рвоты и судорог не было. 13 ноября за 3 часа до госпитализации у пациента произошла внезапная остановка дыхания и сердца. Ей немедленно и непрерывно провели сердечно-легочную реанимацию врачи и внутривенную инъекцию адреналина (4 раза).Ее лечили с помощью канюли трахеи и искусственной вентиляции легких, и ее сердцебиение восстановилось примерно через 15 минут, но пациентка оставалась в глубоком коматозном состоянии без самостоятельного дыхания. Затем пациентку перевели в нашу больницу, где сразу было проведено мониторирование электрокардиограммы (ЭКГ). Кровяная жидкость была видна в постоянной желудочно-кишечной декомпрессионной трубке, а анализ газов крови показал метаболический ацидоз. Пациенту назначили бикарбонат натрия для коррекции ацидоза.Ей поставили диагноз: острая инфекция ЦНС и грыжа головного мозга. После сердечно-легочной реанимации она была госпитализирована в педиатрическое отделение интенсивной терапии (PICU). КТ головы показала обширный отек головного мозга, снижение плотности паренхимы головного мозга, сужение желудочков и цистерн головного мозга. Эти данные позволили поставить диагноз: обширный отек мозга и грыжа. Задне-передняя рентгенограмма грудной клетки показала нечеткие грубые двусторонние отметины на легких, видимые небольшие пятнистые тени в правом нижнем легком и четкие легочные ворота.По этим результатам был поставлен диагноз пневмония. Результаты планового анализа крови позволяют предположить наличие бактериальной инфекции; таким образом, пациенту вводили ванкомицин и меропенем для борьбы с инфекцией. После этого для поддержки иммунитета вводили иммуноглобулин (1 г / кг). Пациент все еще находился в состоянии глубокой комы, световые рефлексы обоих зрачков отсутствовали. Самопроизвольное дыхание пациентки было слабым и нерегулярным, и она не реагировала на болезненную стимуляцию. По сравнению с предыдущим периодом, ее сыпь уменьшилась, а легочные поражения, показанные на задне-передней рентгенограмме грудной клетки, немного рассосались.Иммуноглобулин (1 г / кг) вводился непрерывно для нейтрализации патогенов. 15 ноября (через 3 дня после поступления) транскраниальная допплерография показала, что переднее и заднее мозговое кровообращение пациента соответствовало диагностическим критериям смерти мозга. 17 ноября (через 5 дней после поступления) произошел сбой различных функций органов, пациентка не перенесла тест на самопроизвольное дыхание. Ее опекун решил прекратить лечение, и пациент умер.

Лабораторная диагностика

Обнаружение вирусного антигена, основанное как на иммунофлуоресцентном анализе, так и на респираторном вирусном панельном анализе Luminex xTAG, дало положительный результат на RSV в носоглоточных аспиратах пациента (которые были собраны 14 ноября, на 5-й день начала заболевания и на 2-й день. допуска) и отрицательный для аденовируса, вирусов гриппа A и B, вируса парагриппа 1–4, метапневмовируса человека, энтеровирусов и риновирусов, коронавируса человека HKU1, 229E, NL63 и OC43 и бокавируса человека.Поскольку опекун пациента отказался дать согласие на люмбальную пункцию, спинномозговая жидкость (CSF) не была доступна для выявления инфекции ЦНС.

Результаты биохимии крови приведены в таблице 1. Количество эритроцитов (эритроцитов), гемоглобина и тромбоцитов непрерывно снижалось после появления симптомов. Чрезвычайно высокий уровень С-реактивного белка с третьего дня (36–104 мг / л) свидетельствует о вирусной или бактериальной инфекции; однако бактериальные посевы образцов крови дали отрицательные результаты.

Таблица 1 Параметры крови и результаты обнаружения патогенов пациента

Процент Т-лимфоцитов составил 46,6%, из которых Т-хелперы и Т-супрессоры составили 29,6 и 13,2% соответственно. Соотношение CD4 / CD8 было 2,2. Доля В-лимфоцитов и NK-клеток составляла 45,6 и 3% соответственно. Все эти иммунологические показатели указывали на нарушение функции иммунной системы пациента.

Метагеномный и вирусный молекулярный анализ

Образцы мазка из полости рта, носоглоточного аспирата и образцы сыворотки, собранные 14 ноября (5-й день начала заболевания и 2-й день госпитализации), были подвергнуты множественному метагеномному анализу с использованием платформы NGS.Библиотека нуклеиновых кислот была сконструирована, как описано ранее [6]. Затем амплифицированные библиотеки нуклеиновых кислот анализировали с использованием секвенатора Illumina HiSeq 4000 для однократного считывания 126 п.н. Считанные необработанные последовательности были отфильтрованы с использованием ранее описанных критериев [7] для получения действительных последовательностей.

Когда были исключены бактериофаги, последовательности растительного происхождения, полученные из остатков пищи в полости рта, и загрязнение реагентами, используемыми на этапе обработки образца (например, вирус лейкемии мышей (MLV)), были исключены только RSV человека (на основе База данных таксономии NCBI), по крайней мере, с одной конкретной последовательностью из орального мазка (2137 считываний) и носоглоточного аспирата (146 считываний).В образце сыворотки не было обнаружено связанных с вирусом последовательностей. Между тем, большое количество считываний последовательностей, связанных с бактериями, включая Streptococcus mitis, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus salivarius, Streptococcus infantis , Streptococcus suis, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorocorrhoeus, другие кондиционированные патогенные бактерии также были обнаружены в мазках из полости рта, носоглоточного аспирата и / или сыворотке крови (рис.1). Однако, хотя метагеномный анализ показал считывание последовательностей, присвоенных Kingdom Bacteria, бактериальная культура образцов крови дала отрицательные результаты.

Рис. 1

Тепловая карта основана на считывании количества патогенов, взятых из мазка из полости рта, носоглоточного аспирата и образцов сыворотки. Клинические образцы перечислены в нижнем ряду, а названия патогенов представлены в левом столбце. Прямоугольники, окрашенные от синего к красному, представляют наблюдаемые считывания метагеномного секвенирования (считывания варьировались от 2 0 до 2 15 )

На основе случайного распределения считываний генома вируса RSV была определена полная длина генома. полученные с использованием методов NGS и амплификации разрыва.Этот штамм RSV был подтипом как RSVB; было обнаружено, что он кластеризуется в генотипе BA и имеет характерную дупликацию 60 п.н. в гене G. Вновь идентифицированный вирус был назван RSVB / BCH-Y / 2016, а полная последовательность генома была депонирована в GenBank под номером доступа KY8. Филогенетический анализ был проведен с репрезентативными последовательностями почти всех подгрупп RSVB (BA1–10, GB1–4, SAB1–4, URU1–2) из ​​GenBank; RSVB / BCH-Y / 2016 принадлежал к подгруппе BA9 (рис. 2). Сравнение нуклеотидной гомологии показало, что ген G этого штамма был наиболее близким родственником (доля 98.82% гомологии) к штамму RSVB / GZ / 13-730, который был изолирован от ребенка в Гуанчжоу, Китай, в 2013 году. Для шести наиболее важных антигенных сайтов (Ø, I, II, IV, V, VI) в слитый белок для нацеливания лекарств или вакцин (таких как паливизумаб) [8, 9], мутации в RSVB / BCH-Y / 2016 не обнаружено.

Рис. 2

Филогенетический анализ, основанный на полной последовательности G-гена RSV, обнаруженной у этого пациента, и других репрезентативных последовательностях почти всех подгрупп RSVB (BA1–10, GB1–4, SAB1–4, URU1–2) из GenBank.Филогенетическое дерево нуклеотидов было построено с использованием метода объединения соседей с нуклеотидными p-расстояниями и 1000 загрузочных реплик в программе молекулярно-эволюционного генетического анализа (MEGA, версия 4.0, США)

Вход респираторно-синцитиального вируса и способы его блокирования

  • 1.

    Блаунт Р. Р. Младший, Моррис Дж. А. и Сэвидж Р. Р. Извлечение цитопатогенного агента из шимпанзе с ринитом. Proc. Soc. Exp. Биол. Med. 92 , 544–549 (1956).

    PubMed Статья Google Scholar

  • 2.

    Чанок Р., Ройзман Б. и Майерс Р. Выздоровление младенцев с респираторным заболеванием от вируса, связанного с возбудителем ринита шимпанзе (CCA). I. Изоляция, свойства и характеристика. Am. J. Hyg. 66 , 281–290 (1957). В этом исследовании сообщается о первом выделении RSV у младенцев .

    CAS PubMed Google Scholar

  • 3.

    Чанок Р. и Финберг Л. Выздоровление младенцев с респираторным заболеванием от вируса, связанного с возбудителем ринита шимпанзе (CCA). II. Эпидемиологические аспекты инфекции у детей грудного и раннего возраста. Am. J. Hyg. 66 , 291–300 (1957).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 4.

    Глезен, В. П., Табер, Л. Х., Франк, А. Л., Касел, Дж. А. Риск первичного инфицирования и повторного заражения респираторно-синцитиальным вирусом. Am. J. Dis. Детский 140 , 543–546 (1986).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 5.

    Shi, T. et al. Глобальные, региональные и национальные оценки бремени острых респираторных инфекций нижних дыхательных путей, вызванных респираторно-синцитиальным вирусом, у детей младшего возраста в 2015 г .: систематический обзор и исследование на основе моделирования. Ланцет 390 , 946–958 (2017).

    PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 6.

    Фолси, А. Р., Хеннесси, П. А., Формика, М. А., Кокс, К. и Уолш, Е. E. Инфекция респираторно-синцитиальным вирусом у пожилых людей и взрослых из групп высокого риска. N. Engl. J. Med. 352 , 1749–1759 (2005).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 7.

    van den Hoogen, B.G. et al. Недавно обнаруженный пневмовирус человека, выделенный у детей раннего возраста с заболеваниями дыхательных путей. Нат. Med. 7 , 719–724 (2001). В этой работе описывается первая изоляция метапневмовируса человека от детей .

    PubMed Статья CAS Google Scholar

  • 8.

    Панда, С., Мохакуд, Н. К., Пена, Л. и Кумар, С. Метапневмовирус человека: обзор важного респираторного патогена. Внутр. J. Infect. Дис. 25 , 45–52 (2014).

    PubMed Статья Google Scholar

  • 9.

    Холл, К. Б. Респираторно-синцитиальный вирус: его передача в больничных условиях. Yale J. Biol. Med. 55 , 219–223 (1982).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 10.

    Хаас, Л. Э., Тийсен, С. Ф., ван Элден, Л. и Хемстра, К. А. Метапневмовирус человека у взрослых. Вирусы 5 , 87–110 (2013).

    PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 11.

    Грейсон, С. А., Гриффитс, П. С., Перес, М. К. и Пьедимонте, Г. Обнаружение респираторно-синцитиального вируса, передающегося по воздуху, в педиатрической клинике неотложной помощи. Pediatr. Пульмонол. 52 , 684–688 (2017).

    PubMed Статья Google Scholar

  • 12.

    Коллинз П. Л. и Грэм Б. С. Вирусные факторы и факторы хозяина в патогенезе респираторно-синцитиального вируса человека. J. Virol. 82 , 2040–2055 (2008).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 13.

    Peebles, R. S. Jr & Graham, B. S. Патогенез респираторно-синцитиальной вирусной инфекции на мышиной модели. Proc. Являюсь. Thorac Soc. 2 , 110–115 (2005).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 14.

    Kim, H. W. et al. Респираторно-синцитиальное вирусное заболевание у младенцев, несмотря на предварительное введение антигенной инактивированной вакцины. Am. J. Epidemiol. 89 , 422–434 (1969).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 15.

    Kapikian, AZ, Mitchell, RH, Chanock, RM, Shvedoff, RA & Stewart, CE Эпидемиологическое исследование измененной клинической реактивности к респираторно-синцитиальной (RS) вирусной инфекции у детей, ранее вакцинированных вакциной на основе инактивированного RS-вируса . Am. J. Epidemiol. 89 , 405–421 (1969).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 16.

    Fulginiti, V.A. et al. Иммунизация респираторным вирусом. I. Полевые испытания двух вакцин против инактивированных респираторных вирусов; водная трехвалентная вакцина против вируса парагриппа и вакцина против респираторно-синцитиального вируса, осажденного алюминием. Am. J. Epidemiol. 89 , 435–448 (1969).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 17.

    Чин, Дж., Магоффин, Р. Л., Ширер, Л. А., Шибл, Дж. Х. и Леннетт, Э. Х. Полевая оценка вакцины против респираторно-синцитиального вируса и вакцины от трехвалентного вируса парагриппа в педиатрической популяции. Am. J. Epidemiol. 89 , 449–463 (1969).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 18.

    Принс, Г. А., Кертис, С. Дж., Йим, К. С. и Портер, Д. Д. Усиленное вакциной респираторно-синцитиальное вирусное заболевание у хлопковых крыс после иммунизации партией 100 или недавно приготовленной контрольной вакциной. J. Gen. Virol. 82 , 2881–2888 (2001).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 19.

    Polack, F. P. et al. Роль иммунных комплексов в усилении респираторно-синцитиального вирусного заболевания. J. Exp. Med. 196 , 859–865 (2002). Эта рукопись демонстрирует, что болезнь, усиленная вакциной, опосредуется иммунными комплексами .

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 20.

    Homaira, N., Rawlinson, W., Snelling, T. и Jaffe, A. Эффективность паливизумаба в предотвращении госпитализации RSV у детей высокого риска: реальная перспектива. Внутр. J. Pediatr. 2014 , 571609 (2014).

    PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 21.

    Фирнс Р. и Коллинз П. Л. Роль антитерминационного белка транскрипции M2-1 респираторно-синцитиального вируса в последовательной транскрипции. J. Virol. 73 , 5852–5864 (1999).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 22.

    Коллинз П. Л., Хилл М. Г., Кристина Дж. И Гросфельд H. Фактор элонгации транскрипции респираторно-синцитиального вируса, несегментированного РНК-вируса с отрицательной цепью. Proc. Natl Acad. Sci. США 93 , 81–85 (1996).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 23.

    Bermingham, A. & Collins, P. L. Белок M2-2 респираторно-синцитиального вируса человека является регуляторным фактором, участвующим в балансе между репликацией РНК и транскрипцией. Proc. Natl Acad. Sci. США 96 , 11259–11264 (1999).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 24.

    Bitko, V. et al. Неструктурные белки респираторно-синцитиального вируса подавляют преждевременный апоптоз с помощью NF-κB-зависимого, интерферон-независимого механизма и способствуют росту вируса. J. Virol. 81 , 1786–1795 (2007).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 25.

    Спанн, К. М., Тран, К. С. и Коллинз, П. Л. Влияние неструктурных белков NS1 и NS2 респираторно-синцитиального вируса человека на фактор регуляции интерферона 3, NF-κB и провоспалительные цитокины. J. Virol. 79 , 5353–5362 (2005).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 26.

    Gan, S. W. et al. Небольшой гидрофобный белок респираторно-синцитиального вируса человека образует пентамерные ионные каналы. J. Biol. Chem. 287 , 24671–24689 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 27.

    Fuentes, S., Tran, K. C., Luthra, P., Teng, M. N. & He, B. Функция малого гидрофобного белка респираторно-синцитиального вируса. J. Virol. 81 , 8361–8366 (2007).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 28.

    Baviskar, P. S., Hotard, A. L., Moore, M. L. & Oomens, A. G. Белок слияния респираторно-синцитиального вируса нацеливается на периметр телец включения и способствует образованию филаментов за счет цитоплазматического хвостового механизма. J. Virol. 87 , 10730–10741 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 29.

    Shaikh, F. Y. et al. Важный остаток фенилаланина в цитоплазматическом хвосте слитого белка респираторно-синцитиального вируса опосредует сборку внутренних вирусных белков в вирусные филаменты и частицы. мБио 3 , e00270-11 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 30.

    Oomens, A. G., Bevis, K. P. & Wertz, G. W. Цитоплазматический хвост белка F респираторно-синцитиального вируса человека играет решающую роль в клеточной локализации белка F и продукции инфекционного потомства. J. Virol. 80 , 10465–10477 (2006).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 31.

    Марти, А., Минжер, Дж., Миллс, Дж., Шилдс, Б. и Гилдиал, Р. Ассоциация матричного белка респираторно-синцитиального вируса с клеточной мембраной хозяина инфицированных клеток. Arch. Virol. 149 , 199–210 (2004).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 32.

    Kiss, G. et al. Структурный анализ респираторно-синцитиального вируса показывает положение M2-1 между матриксным белком и рибонуклеопротеидным комплексом. J. Virol. 88 , 7602–7617 (2014).

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 33.

    Tawar, R.G. et al. Кристаллическая структура нуклеокапсидоподобного комплекса нуклеопротеин-РНК респираторно-синцитиального вируса. Наука 326 , 1279–1283 (2009).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 34.

    Rixon, H. W. et al. Небольшой гидрофобный (SH) белок накапливается в структурах липидного рафта комплекса Гольджи во время респираторно-синцитиальной вирусной инфекции. J. Gen. Virol. 85 , 1153–1165 (2004).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 35.

    Букреев А., Whitehead, S. S., Murphy, B. R. и Collins, P. L. Рекомбинантный респираторно-синцитиальный вирус, из которого был удален весь ген SH, эффективно растет в культуре клеток и проявляет сайт-специфическое ослабление в дыхательных путях мыши. J. Virol. 71 , 8973–8982 (1997).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 36.

    Левин, С., Клайбер-Франко, Р. и Парадизо, П.R. Демонстрация того, что гликопротеин G является прикрепляющим белком респираторно-синцитиального вируса. J. Gen. Virol. 68 , 2521–2524 (1987).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 37.

    Хендрикс, Д. А., Барадаран, К., МакИнтош, К. и Паттерсон, Дж. Л. Появление растворимой формы G-белка респираторно-синцитиального вируса в жидкостях инфицированных клеток. J. Gen. Virol. 68 , 1705–1714 (1987).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 38.

    Wertz, G. W. et al. Нуклеотидная последовательность гена G-белка респираторно-синцитиального вируса человека обнаруживает необычный тип вирусного мембранного белка. Proc. Natl Acad. Sci. США 82 , 4075–4079 (1985).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 39.

    Коллинз, П. Л.& Mottet, G. Олигомеризация и посттрансляционный процессинг гликопротеина G респираторно-синцитиального вируса человека: измененное O-гликозилирование в присутствии брефельдина A. J. Gen. Virol. 73 , 849–863 (1992).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 40.

    Сатаке, М., Колиган, Дж. Э., Эланго, Н., Норрби, Э. и Венкатесан, С. Гликопротеин оболочки респираторно-синцитиального вируса (G) имеет новую структуру. Nucleic Acids Res. 13 , 7795–7812 (1985).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 41.

    Garcia-Beato, R. et al. Влияние клетки-хозяина на гликозилирование и антигенность гликопротеина G респираторно-синцитиального вируса человека. Вирусология 221 , 301–309 (1996).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 42.

    Kwilas, S. et al. Респираторно-синцитиальный вирус, выращенный в клетках Vero, содержит усеченный белок прикрепления, который изменяет его инфекционность и зависимость от гликозаминогликанов. J. Virol. 83 , 10710–10718 (2009).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 43.

    Робертс, С. Р., Лихтенштейн, Д., Болл, Л. А. и Вертц, Г. В. Ассоциированные с мембраной и секретируемые формы гликопротеина G прикрепления респираторно-синцитиального вируса синтезируются из альтернативных кодонов инициации. J. Virol. 68 , 4538–4546 (1994).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 44.

    Хендрикс Д. А., Макинтош К. и Паттерсон Дж. Л. Дальнейшая характеристика растворимой формы гликопротеина G респираторно-синцитиального вируса. J. Virol. 62 , 2228–2233 (1988).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 45.

    Букреев А., Янг Л. и Коллинз П. Л. Секретируемый G-белок респираторно-синцитиального вируса человека противодействует опосредованному антителами ограничению репликации с участием макрофагов и комплемента. J. Virol. 86 , 10880–10884 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 46.

    Букреев А. и др. Секретируемая форма гликопротеина G респираторно-синцитиального вируса помогает вирусу избежать опосредованного антителами ограничения репликации, действуя как ловушка для антигена и воздействуя на лейкоциты, несущие рецептор Fc. J. Virol. 82 , 12191–12204 (2008).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 47.

    Gorman, JJ, Ferguson, BL, Speelman, D. & Mills, J. Определение расположения дисульфидных связей в белке прикрепления (G) респираторно-синцитиального вируса человека с помощью лазерной десорбции / ионизации с использованием матрицы. -полетная масс-спектрометрия. Protein Sci. 6 , 1308–1315 (1997).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 48.

    Langedijk, J. P., Schaaper, W. M., Meloen, R.H. & van Oirschot, J. T. Предложена трехмерная модель для белка присоединения G респираторно-синцитиального вируса. J. Gen. Virol. 77 , 1249–1257 (1996).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 49.

    Doreleijers, J. F. et al. Структура раствора иммунодоминантной области белка G респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота. Биохимия 35 , 14684–14688 (1996). Это исследование определяет первую трехмерную структуру цистиновой петли RSV G .

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 50.

    Sugawara, M. et al. Исследования взаимосвязи структура-антигенность центральной консервативной области белка респираторно-синцитиального вируса человека G. J. Pept. Res. 60 , 271–282 (2002).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 51.

    Langedijk, JP, de Groot, BL, Berendsen, HJ & van Oirschot, JT. Структурная гомология центральной консервативной области белка прикрепления G респираторно-синцитиального вируса с четвертым субдоменом 55-кДа фактора некроза опухоли. рецептор. Вирусология 243 , 293–302 (1998).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 52.

    Jones, H.G. et al. Структурная основа распознавания центральной консервативной области G RSV путем нейтрализации человеческих антител. PLOS Pathog. 14 , e1006935 (2018).

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 53.

    Федечкин С.О., Георгий Н.Л., Вольф, Дж. Т., Каувар, Л. М. и Дюбуа, Р. М. Структуры антигена G респираторно-синцитиального вируса, связанного с широко нейтрализующими антителами. Sci. Иммунол. 3 , eaar3534 (2018).

    PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 54.

    Пангести, К. Н., Абд Эль Гани, М., Уолш, М. Г., Кессон, А. М. и Хилл-Коуторн, Г. А. Молекулярная эпидемиология респираторно-синцитиального вируса. Ред.Med. Virol. 28 , e1968 (2018).

    Артикул Google Scholar

  • 55.

    Муфсон М. А., Орвелл К., Рафнар Б. и Норрби Е. Два различных подтипа респираторно-синцитиального вируса человека. J. Gen. Virol. 66 , 2111–2124 (1985).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 56.

    Anderson, L.J. et al. Антигенная характеристика штаммов респираторно-синцитиального вируса с помощью моноклональных антител. J. Infect. Дис. 151 , 626–633 (1985).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 57.

    Hall, C. B. et al. Распространенность респираторно-синцитиального вируса группы A и B в течение 15 лет: связанные эпидемиологические и клинические характеристики у детей, находящихся в стационаре и амбулаторно. J. Infect. Дис. 162 , 1283–1290 (1990).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 58.

    Trento, A. et al. Основные изменения в G-белке изолятов респираторно-синцитиального вируса человека, вызванные дупликацией 60 нуклеотидов. J. Gen. Virol. 84 , 3115–3120 (2003).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 59.

    Trento, A. et al. Естественная история респираторно-синцитиального вируса человека, выведенная из филогенетического анализа прикрепленного (G) гликопротеина с дупликацией 60 нуклеотидов. J. Virol. 80 , 975–984 (2006).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 60.

    Trento, A. et al. Десять лет глобальной эволюции генотипа BA респираторно-синцитиального вируса человека с 60-нуклеотидной дупликацией в гене G-белка. J. Virol. 84 , 7500–7512 (2010).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 61.

    Eshaghi, A. et al. Генетическая изменчивость штаммов респираторно-синцитиального вируса человека А, циркулирующих в Онтарио: новый генотип с дупликацией гена G. PLOS ONE 7 , e32807 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 62.

    Duvvuri, V. R. et al. Генетическое разнообразие и эволюционное понимание генотипа респираторно-синцитиального вируса A ON1: глобальная и локальная динамика передачи. Sci. Отчет 5 , 14268 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 63.

    Hirano, E. et al. Молекулярная эволюция гена гликопротеина (G) прикрепления респираторно-синцитиального вируса человека нового генотипа ON1 и предка NA1. Заражение. Genet. Evol. 28 , 183–191 (2014).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 64.

    Hotard, A. L., Laikhter, E., Brooks, K., Hartert, T. V. и Moore, M. L. Функциональный анализ дупликации 60 нуклеотидов в гликопротеине прикрепления штамма Buenos Aires респираторно-синцитиального вируса. J. Virol. 89 , 8258–8266 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 65.

    Leyrat, C., Paesen, G.C, Charleston, J., Renner, M. & Grimes, J.M. Структурное понимание эктодомена гликопротеина метапневмовируса человека. J. Virol. 88 , 11611–11616 (2014).

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 66.

    Yin, H. S., Wen, X., Paterson, R. G., Lamb, R. A. & Jardetzky, T. S. Структура белка 5 F вируса парагриппа в его метастабильной префузионной конформации. Nature 439 , 38–44 (2006).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 67.

    Yin, H. S., Paterson, R. G., Wen, X., Lamb, R. A., Jardetzky, T. S. Структура нерасщепленного эктодомена слитого белка парамиксовируса (hPIV3). Proc. Natl Acad. Sci. США 102 , 9288–9293 (2005).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 68.

    Collins, P. L., Huang, Y. T. & Wertz, G. W. Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего слитый (F) гликопротеин респираторно-синцитиального вируса человека. Proc. Natl Acad. Sci. США 81 , 7683–7687 (1984).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 69.

    Циммер Г., Будз Л. и Херрлер Г. Протеолитическая активация слитого белка респираторно-синцитиального вируса. Расщепление по двум консенсусным последовательностям фурина. J. Biol. Chem. 276 , 31642–31650 (2001).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 70.

    Gonzalez-Reyes, L. et al. Расщепление слитого белка респираторно-синцитиального вируса человека в двух разных сайтах необходимо для активации слияния мембран. Proc. Natl Acad. Sci. США 98 , 9859–9864 (2001).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 71.

    Bolt, G., Pedersen, L.O. & Birkeslund, H.H. Для его поверхностной экспрессии требуется расщепление слитого белка респираторно-синцитиального вируса: роль фурина. Virus Res. 68 , 25–33 (2000).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 72.

    Коллинз П. Л. и Моттет Г. Посттрансляционный процессинг и олигомеризация слитого гликопротеина респираторно-синцитиального вируса человека. J. Gen. Virol. 72 , 3095–3101 (1991).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 73.

    Day, N. D. et al. Вклад остатков цистеина во внеклеточном домене белка F респираторно-синцитиального вируса человека в его функцию. Virol. J. 3 , 34 (2006).

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 74.

    Gilman, M. S. et al. Характеристика антитела, специфичного для префузии, которое распознает четвертичный, зависимый от расщепления эпитоп на гликопротеине слияния RSV. PLOS Pathog. 11 , e1005035 (2015).

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 75.

    Krarup, A. et al. Высокостабильная вакцина перед слиянием RSV F, полученная в результате структурного анализа механизма слияния. Нат. Commun. 6 , 8143 (2015).

    PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 76.

    McLellan, J. S. et al. Структура тримерного гликопротеина слияния RSV, связанного с нейтрализующим антителом, специфичным для предварительного слияния. Наука 340 , 1113–1117 (2013). Эта работа обеспечивает первую трехмерную структуру конформации RSV F перед слиянием и определяет главный антигенный сайт, распознаваемый специфическими антителами до слияния.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 77.

    Liljeroos, L., Krzyzaniak, M.A., Helenius, A. & Butcher, S.J. Архитектура респираторно-синцитиального вируса, выявленная с помощью электронной криотомографии. Proc. Natl Acad. Sci. США 110 , 11133–11138 (2013). Эта рукопись раскрывает организацию и морфологию вирионов RSV с помощью криоэлектронной томографии .

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 78.

    Килликелли, А. М., Канекиё, М.& Graham, B. S. Pre-fusion F отсутствует на поверхности инактивированного формалином респираторно-синцитиального вируса. Sci. Отчет 6 , 34108 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 79.

    Kim, Y.H. et al. Захват и визуализация промежуточного соединения прешпильчатого слияния парамиксовируса PIV5. Proc. Natl Acad. Sci. США 108 , 20992–20997 (2011).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 80.

    Чжао, X., Сингх, М., Малашкевич, В. Н. и Ким, П. С. Структурная характеристика ядра слитого белка респираторно-синцитиального вируса человека. Proc. Natl Acad. Sci. США 97 , 14172–14177 (2000).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 81.

    McLellan, J. S., Yang, Y., Graham, B. S. & Kwong, P. D. Структура гликопротеина слияния респираторно-синцитиального вируса в постфузионной конформации показывает сохранение нейтрализующих эпитопов. J. Virol. 85 , 7788–7796 (2011).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 82.

    Swanson, K. A. et al. Структурная основа иммунизации постфузионным гликопротеином F слияния респираторно-синцитиального вируса (RSV F) для получения высоких титров нейтрализующих антител. Proc. Natl Acad. Sci. США 108 , 9619–9624 (2011).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 83.

    Джонсон, Дж. Э., Гонсалес, Р. А., Олсон, С. Дж., Райт, П. Ф. и Грэм, Б. С. Гистопатология фатальной нелеченой респираторно-синцитиальной вирусной инфекции человека. Мод. Патол. 20 , 108–119 (2007).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 84.

    Xu, L. et al. Смертельный случай, связанный с инфекцией респираторно-синцитиального вируса у маленького ребенка. BMC Infect. Дис. 18 , 217 (2018).

    PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 85.

    Pitkaranta, A., Virolainen, A., Jero, J., Arruda, E. & Hayden, FG Выявление риновирусов, респираторно-синцитиальных вирусов и коронавирусных инфекций при остром среднем отите с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой . Педиатрия 102 , 291–295 (1998).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 86.

    Rohwedder, A. et al. Обнаружение РНК респираторно-синцитиального вируса в крови новорожденных методом полимеразной цепной реакции. J. Med. Virol. 54 , 320–327 (1998).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 87.

    Эскрибано-Ромеро, Э., Роулинг, Дж., Гарсия-Баррено, Б. и Мелеро, Дж. А. Растворимая форма белка прикрепления респираторно-синцитиального вируса человека отличается от мембраносвязанной формы своим олигомерным состоянием, но все еще способен связываться с протеогликанами клеточной поверхности. J. Virol. 78 , 3524–3532 (2004).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 88.

    Krusat, T. & Streckert, H.J. Гепарин-зависимое прикрепление респираторно-синцитиального вируса (RSV) к клеткам-хозяевам. Arch. Virol. 142 , 1247–1254 (1997).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 89.

    Фельдман С. А., Хендри Р. М. и Билер Дж. А. Идентификация линейного гепарин-связывающего домена для гликопротеина прикрепления респираторно-синцитиального вируса человека G. J. Virol. 73 , 6610–6617 (1999).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 90.

    Халлак, Л. К., Спиллманн, Д., Коллинз, П. Л. и Пиплс, М. Е. Требования сульфатирования гликозаминогликанов при респираторно-синцитиальной вирусной инфекции. J. Virol. 74 , 10508–10513 (2000).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 91.

    Мартинес И. и Мелеро Дж. А. Связывание респираторно-синцитиального вируса человека с клетками: влияние протеогликанов сульфатированной клеточной поверхности. J. Gen. Virol. 81 , 2715–2722 (2000).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 92.

    Халлак, Л. К., Коллинз, П. Л., Кнудсон, В. и Пиплс, М. Е. Гликозаминогликаны, содержащие идуроновую кислоту, на клетках-мишенях необходимы для эффективной респираторно-синцитиальной вирусной инфекции. Вирусология 271 , 264–275 (2000).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 93.

    Чиркова Т. и др. CX3CR1 является важной поверхностной молекулой для респираторно-синцитиальной вирусной инфекции в эпителиальных клетках дыхательных путей человека. J. Gen. Virol. 96 , 2543–2556 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 94.

    Zhang, L. et al. Инфекция реснитчатых клеток вирусом парагриппа человека типа 3 на модели эпителия дыхательных путей человека in vitro. J. Virol. 79 , 1113–1124 (2005).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 95.

    Zhang, L., Peeples, M.E., Boucher, R.C., Collins, P.L. и Pickles, R.J. Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция эпителиальных клеток дыхательных путей человека поляризована, специфична для мерцательных клеток и не имеет явной цитопатологии. J. Virol. 76 , 5654–5666 (2002).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 96.

    Johnson, S. M. et al. Респираторно-синцитиальный вирус использует CX3CR1 в качестве рецептора на первичных культурах эпителия дыхательных путей человека. PLOS Pathog. 11 , e1005318 (2015).

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 97.

    Tripp, R.A. et al. Мимикрия хемокина CX3C гликопротеином G респираторно-синцитиального вируса. Нат. Иммунол. 2 , 732–738 (2001). Это исследование идентифицирует CX 3 мотив C в RSV G и демонстрирует, что CX 3 CR1 облегчает ввод RSV .

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 98.

    Bazan, J. F. et al. Новый класс мембраносвязанных хемокинов с мотивом CX3C. Nature 385 , 640–644 (1997).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar

  • 99.

    Jeong, K. I. et al. CX3CR1 экспрессируется в дифференцированных клетках ресничных дыхательных путей человека и совместно локализуется с респираторно-синцитиальным вирусом на ресничках G-белком. PLOS ONE 10 , e0130517 (2015).

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 100.

    Karron, R.A. et al. Белки SH и G респираторно-синцитиального вируса (RSV) не являются существенными для вирусной репликации in vitro: клиническая оценка и молекулярная характеристика пересаженного холодом аттенуированного мутанта подгруппы B RSV. Proc. Natl Acad. Sci. США 94 , 13961–13966 (1997). Эта работа демонстрирует, что инфекционный RSV требует только белка F на своей поверхности .

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 101.

    Techaarpornkul, S., Barretto, N. & Peeples, M. E. Функциональный анализ рекомбинантных мутантов с делецией респираторно-синцитиального вируса, лишенных небольшого гидрофобного гена и / или гена гликопротеина присоединения. J. Virol. 75 , 6825–6834 (2001).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 102.

    Feldman, S. A., Audet, S. & Beeler, J. A. Слитый гликопротеин респираторно-синцитиального вируса человека облегчает прикрепление вируса и инфекционность посредством взаимодействия с клеточным гепарансульфатом. J. Virol. 74 , 6442–6447 (2000).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 103.

    Behera, A. K. et al. Блокирование молекулы-1 межклеточной адгезии на эпителиальных клетках человека снижает инфекцию респираторно-синцитиального вируса. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 280 , 188–195 (2001).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 104.

    Currier, M. G. et al. EGFR взаимодействует со слитым белком штамма респираторно-синцитиального вируса 2–20 и опосредует инфекцию и экспрессию муцина. PLOS Pathog. 12 , e1005622 (2016).

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 105.

    Tayyari, F. et al. Идентификация нуклеолина как клеточного рецептора респираторно-синцитиального вируса человека. Нат. Med. 17 , 1132–1135 (2011). Эта рукопись идентифицирует нуклеолин как фактор клетки-хозяина, который взаимодействует с белком F и способствует проникновению RSV .

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 106.

    Бозе С., Басу М. и Банерджи А. К. Роль нуклеолина в инфицировании эпителиальных клеток легких человека вирусом парагриппа 3 типа. J. Virol. 78 , 8146–8158 (2004).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 107.

    Su, P. Y. et al. Нуклеолин клеточной поверхности способствует связыванию энтеровируса 71 и инфицированию. J. Virol. 89 , 4527–4538 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 108.

    Xiao, X., Feng, Y., Zhu, Z. & Dimitrov, D. S. Идентификация предполагаемого фактора проникновения вируса крымско-конголезской геморрагической лихорадки. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 411 , 253–258 (2011).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 109.

    Qiu, J. & Brown, K. E. A. Ядерный челночный белок массой 110 кДа, нуклеолин, специфически связывается с капсидом аденоассоциированного вируса типа 2 (AAV-2). Вирусология 257 , 373–382 (1999).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 110.

    Callebaut, C. et al. Идентификация белков, связывающих петлю V3, как потенциальных рецепторов, участвующих в связывании частиц ВИЧ с клетками CD4 + . J. Biol. Chem. 273 , 21988–21997 (1998).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 111.

    Сринивасакумар, Н., Огра, П. Л. и Фланаган, Т. Д. Характеристики слияния респираторно-синцитиального вируса с клетками HEp-2, измеренные с помощью анализа ослабления флуоресценции R18. J. Virol. 65 , 4063–4069 (1991).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 112.

    Kahn, J. S., Schnell, M. J., Buonocore, L. и Rose, J. K. Рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, экспрессирующий гликопротеины респираторно-синцитиального вируса (RSV): слитый белок RSV может опосредовать инфекцию и слияние клеток. Virology 254 , 81–91 (1999).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 113.

    Уайт, Дж. М. и Уиттакер, Г. Р. Слияние оболочечных вирусов в эндосомах. Трафик 17 , 593–614 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 114.

    San-Juan-Vergara, H. et al.Богатые холестерином микродомены как стыковочные платформы для респираторно-синцитиального вируса в нормальных эпителиальных клетках бронхов человека. J. Virol. 86 , 1832–1843 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 115.

    Krzyzaniak, M. A., Zumstein, M. T., Gerez, J. A., Picotti, P. & Helenius, A. Попадание респираторно-синцитиального вируса в клетки-хозяева включает макропиноцитоз с последующей протеолитической активацией белка F. PLOS Pathog. 9 , e1003309 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 116.

    Schlender, J., Zimmer, G., Herrler, G. & Conzelmann, K. K. Субъединица F2 слитого белка респираторно-синцитиального вируса (RSV), а не белок присоединения G, определяет специфичность инфекции RSV. J. Virol. 77 , 4609–4616 (2003).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 117.

    Yuan, P. et al. Структурные исследования тетрамера гемагглютинин-нейраминидазы вируса парагриппа 5 в комплексе с его рецептором сиалиллактозой. Структура 13 , 803–815 (2005).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 118.

    Креннелл, С., Такимото, Т., Портнер, А. и Тейлор, Г. Кристаллическая структура многофункциональной парамиксовирусной гемагглютинин-нейраминидазы. Нат. Struct.Биол. 7 , 1068–1074 (2000).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 119.

    Bose, S., Jardetzky, T. S. & Lamb, R.A. Время решает все: точно настроенные молекулярные машины организуют проникновение парамиксовирусов. Вирусология 479–480 , 518–531 (2015).

    PubMed Статья CAS Google Scholar

  • 120.

    Юнус, А.S. et al. Повышенная температура вызывает образование шестиспирального пучка белка F респираторно-синцитиального вируса человека. Вирусология 396 , 226–237 (2010).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 121.

    Фирнс Р. и Деваль Дж. Новые противовирусные подходы к респираторно-синцитиальному вирусу и другим мононегавирусам: ингибирование РНК-полимеразы. Antiviral Res. 134 , 63–76 (2016).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 122.

    Falsey, A. R. & Walsh, E. E. Связь сывороточных антител с риском респираторно-синцитиальной вирусной инфекции у пожилых людей. J. Infect. Дис. 177 , 463–466 (1998).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 123.

    Холл, К. Б., Уолш, Э. Э., Лонг, К. Э. и Шнабель, К.C. Иммунитет к респираторно-синцитиальному вирусу и частота повторного инфицирования. J. Infect. Дис. 163 , 693–698 (1991).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 124.

    Американская педиатрическая академия. Иммуноглобулин респираторно-синцитиального вируса для внутривенного введения: показания к применению. Комитет по инфекционным болезням, Комитет по плодам и новорожденным. Педиатрия 99 , 645–650 (1997).

    Артикул Google Scholar

  • 125.

    Исследовательская группа IMpact-RSV. Паливизумаб, гуманизированное моноклональное антитело к респираторно-синцитиальному вирусу, снижает количество госпитализаций в связи с инфекцией респираторно-синцитиального вируса у младенцев из группы высокого риска. Педиатрия 102 , 531–537 (1998).

    Артикул Google Scholar

  • 126.

    Beeler, J. A. & Coelingh, K.V. Нейтрализация эпитопов F-гликопротеина респираторно-синцитиального вируса — влияние мутации на функцию слияния. J. Virol. 63 , 2941–2950 (1989).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 127.

    Kwakkenbos, M. J. et al. Создание стабильных моноклональных антител, продуцирующих B-клеточные рецепторы B-клеток памяти человека, путем генетического программирования. Нат. Med. 16 , 123–128 (2010). В этом исследовании сообщается о выделении и характеристике первых F-специфических моноклональных антител перед слиянием, хотя их специфичность в то время не была известна, .

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 128.

    Goodwin, E. et al. Младенцы, инфицированные респираторно-синцитиальным вирусом, вырабатывают мощные нейтрализующие антитела, в которых отсутствует соматическая гипермутация. Иммунитет 48 , 339–349 (2018).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 129.

    Gilman, M. S. et al. Быстрое профилирование репертуаров антител к RSV из В-клеток памяти естественно инфицированных взрослых доноров. Sci. Иммунол . 1 (2016).

  • 130.

    Collarini, E. J. et al. Мощные высокоаффинные антитела для лечения и профилактики респираторно-синцитиального вируса, полученные из В-клеток инфицированных пациентов. J. Immunol. 183 , 6338–6345 (2009).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 131.

    Mousa, J. J., Kose, N., Matta, P., Gilchuk, P. & Crowe, J. E. Jr. Новый нейтрализующий эпитоп, специфичный для конформации перед слиянием, на гибридном белке респираторно-синцитиального вируса. Нат. Microbiol. 2 , 16271 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 132.

    Corti, D. et al. Перекрестная нейтрализация четырех парамиксовирусов человеческим моноклональным антителом. Природа 501 , 439–443 (2013).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 133.

    Zhu, Q. et al. Высокоэффективное антитело с увеличенным периодом полужизни в качестве потенциального заменителя вакцины против RSV для всех младенцев. Sci. Transl Med. 9 , eaaj1928 (2017).

    PubMed Статья Google Scholar

  • 134.

    Национальная медицинская библиотека США. ClinicalTrials.gov https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02878330 (2018).

  • 135.

    Национальная медицинская библиотека США. ClinicalTrials.gov https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02325791 (2018).

  • 136.

    Костелло, Х. М., Рэй, В. К., Чайватпонгсакорн, С. и Пиплс, М. Е. Нацеливание на РСВ с помощью вакцин и низкомолекулярных препаратов. Заражение. Disord. Drug Targets 12 , 110–128 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 137.

    Хейлен, Э., Нейтс, Дж. И Джохманс, Д. Лекарственные препараты-кандидаты и модельные системы в открытии противовирусных препаратов для респираторно-синцитиального вируса. Biochem. Pharmacol. 127 , 1–12 (2017).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 138.

    Cianci, C. et al. Нацеливание на связывающий карман в тримере шпильки: низкомолекулярное ингибирование слияния вирусов. Proc. Natl Acad. Sci. США 101 , 15046–15051 (2004).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 139.

    Roymans, D. et al. Связывание мощного низкомолекулярного ингибитора образования пучка из шести спиралей требует взаимодействия с обоими гептадными повторами слитого белка RSV. Proc. Natl Acad. Sci. США 107 , 308–313 (2010).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 140.

    Yan, D. et al. Механизм перекрестной резистентности респираторно-синцитиального вируса против структурно разнообразных ингибиторов проникновения. Proc. Natl Acad. Sci. США 111 , E3441 – E3449 (2014).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 141.

    Battles, M. B. et al. Молекулярный механизм ингибиторов слияния респираторно-синцитиального вируса. Нат. Chem. Биол. 12 , 87–93 (2016). Эта работа описывает сайт связывания и механизм действия для ингибиторов слияния малых молекул .

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 142.

    Samuel, D. et al. GS-5806 ингибирует пре- и постфузионные конформационные изменения слитого белка респираторно-синцитиального вируса. Антимикробный. Агенты Chemother. 59 , 7109–7112 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 143.

    Де Винченцо, Дж.P. et al. Оральная активность GS-5806 в исследовании заражения респираторно-синцитиальным вирусом. N. Engl. J. Med. 371 , 711–722 (2014).

    PubMed Статья CAS Google Scholar

  • 144.

    Stevens, M. et al. Противовирусная активность перорального JNJ-53718678 у здоровых взрослых добровольцев, зараженных респираторно-синцитиальным вирусом: плацебо-контролируемое исследование. J. Infect. Дис. 218 , 748–756 (2018).

    PubMed Статья Google Scholar

  • 145.

    Mazur, N. I. et al. Пейзаж вакцин против респираторно-синцитиального вируса: уроки с кладбища и многообещающие кандидаты. Lancet Infect. Дис. 18 , e295 – e311 (2018).

    PubMed Статья Google Scholar

  • 146.

    Грэм Б.С. Разработка вакцины против респираторно-синцитиального вируса. Curr. Opin. Virol. 23 , 107–112 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 147.

    Magro, M. et al. Нейтрализующие антитела против преактивной формы слитого белка респираторно-синцитиального вируса открывают уникальные возможности для клинического вмешательства. Proc. Natl Acad. Sci. США 109 , 3089–3094 (2012). Это исследование предоставляет первые доказательства существования F-специфических антител перед слиянием и их доминирующего вклада в нейтрализующую RSV активность сывороток человека .

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 148.

    Ngwuta, J. O. et al. F-специфические антитела перед слиянием определяют степень нейтрализующей активности RSV в сыворотке крови человека. Sci. Transl Med. 7 , 309ra162 (2015).

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 149.

    McLellan, J. S. et al. Конструирование на основе структуры гибридной гликопротеиновой вакцины против респираторно-синцитиального вируса. Наука 342 , 592–598 (2013). В этой рукописи сообщается о первом создании на основе структуры вакцинного антигена F до слияния и демонстрируется его превосходная иммуногенность по сравнению с антигенами F после слияния .

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 150.

    Национальная медицинская библиотека США. ClinicalTrials.gov https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03049488 (2018).

  • 151.

    Национальная медицинская библиотека США. ClinicalTrials.gov https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03529773 (2018).

  • 152.

    Falloon, J. et al. Адъювантная вакцина на основе белка F после слияния не предотвращала респираторно-синцитиальный вирус у пожилых людей. J. Infect. Дис. 216 , 1362–1370 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 153.

    Национальная медицинская библиотека США. ClinicalTrials.gov https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02608502 (2017).

  • 154.

    Национальная медицинская библиотека США. ClinicalTrials.gov https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02508194 (2017).

  • 155.

    Национальная медицинская библиотека США. ClinicalTrials.gov https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02624947 (2018).

  • 156.

    Каррон, Р. А., Бухгольц, У. Дж. И Коллинз, П.L. Живые аттенуированные вакцины против респираторно-синцитиального вируса. Curr. Вершина. Microbiol. Иммунол. 372 , 259–284 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 157.

    Karron, R.A. et al. Делеция гена, которая активирует экспрессию вирусного гена, дает аттенуированную вакцину против RSV с улучшенными реакциями антител у детей. Sci. Transl Med. 7 , 312ра175 (2015).

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 158.

    Liang, B. et al. Улучшенная стабильность перед слиянием, оптимизированное использование кодонов и расширенная упаковка вирионов повышают иммуногенность слитого белка респираторно-синцитиального вируса в кандидате с векторной вакциной. J. Virol. 91 , e00189-17 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 159.

    Stobart, C.C. et al. Несмотря на высокую аттенуацию, живая вакцина против RSV с модифицированной термостабильностью является иммуногенной для хлопковых крыс. Нат. Commun. 7 , 13916 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 160.

    Национальная медицинская библиотека США. ClinicalTrials.gov https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03303625 (2018).

  • 161.

    Национальная медицинская библиотека США. ClinicalTrials.gov https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02

  • 3 (2018).

  • 162.

    Национальная медицинская библиотека США. ClinicalTrials.gov https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02873286 (2018).

  • 163.

    Левин С. Полипептиды респираторно-синцитиального вируса. J. Virol. 21 , 427–431 (1977).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 164.

    Уолш Э. Э. и Хруска Дж. Моноклональные антитела к белкам респираторно-синцитиального вируса: идентификация слитого белка. J. Virol. 47 , 171–177 (1983).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 165.

    Гарсия, Дж., Гарсия-Баррено, Б., Виво, А. и Мелеро, Дж. А. Цитоплазматические включения клеток, инфицированных респираторно-синцитиальным вирусом: образование телец включения в трансфицированных клетках, которые коэкспрессируют нуклеопротеин, фосфопротеин и белок 22К. Вирусология 195 , 243–247 (1993).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 166.

    Гарсия-Баррено, Б., Дельгадо, Т. и Мелеро, Дж. А. Идентификация участков белка, участвующих во взаимодействии фосфопротеина и нуклеопротеина респираторно-синцитиального вируса человека: значение для сборки нуклеокапсида и образования цитоплазматических включений. J. Virol. 70 , 801–808 (1996).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 167.

    Rincheval, V. et al. Функциональная организация цитоплазматических телец включения в клетках, инфицированных респираторно-синцитиальным вирусом. Нат. Commun. 8 , 563 (2017).

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 168.

    Noton, S. L. & Fearns, R. Инициирование и регуляция транскрипции и репликации парамиксовирусов. Вирусология 479–480 , 545–554 (2015).

    PubMed Статья CAS Google Scholar

  • 169.

    Gower, T. L. et al. Передача сигналов RhoA необходима для индуцированного респираторно-синцитиальным вирусом образования синцития и морфологии нитчатого вириона. J. Virol. 79 , 5326–5336 (2005).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 170.

    Ke, Z. et al. Морфология и сборка респираторно-синцитиального вируса, выявленная с помощью криоэлектронной томографии. Вирусы 10 , E446 (2018). Эта работа убедительно демонстрирует, что RSV является нитчатым вирусом после отпочкования из инфицированных клеток .

    PubMed Статья Google Scholar

  • 171.

    Mehedi, M. et al. Связанный с актином белок 2 (ARP2) и индуцированные вирусом филоподии способствуют распространению респираторно-синцитиального вируса человека. PLOS Pathog. 12 , e1006062 (2016).

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 172.

    Vanover, D. et al. Динамика гликопротеина RSV и геномной РНК выявляет сборку филаментов до плазматической мембраны. Нат. Commun. 8 , 667 (2017).

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 173.

    Форстер А., Мартенс Г. Н., Фаррелл П. Дж. И Байорек М. Димеризация матриксного белка необходима для отпочкования респираторно-синцитиального вируса. J. Virol. 89 , 4624–4635 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 174.

    Робертс С. Р., Компанс Р. В. и Верц Г. В. Респираторно-синцитиальный вирус созревает на апикальных поверхностях поляризованных эпителиальных клеток. J. Virol. 69 , 2667–2673 (1995).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 175.

    Ярдецки Т.С. и Лэмб, Р. А. Активация слияния мембран парамиксовируса и проникновение вируса. Curr. Opin. Virol. 5 , 24–33 (2014).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 176.

    Yuan, P. et al. Структура эктодомена гемагглютинин-нейраминидазы (HN) вируса болезни Ньюкасла обнаруживает стебель пучка из четырех спиралей. Proc. Natl Acad. Sci. США 108 , 14920–14925 (2011).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 177.

    Welch, B.D. et al. Структура эктодомена гемагглютинин-нейраминидазы (HN) вируса парагриппа 5 (PIV5). PLOS Pathog. 9 , e1003534 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 178.

    Bose, S. et al. Активация слияния стеблем гемагглютинин-нейраминидазы вируса парагриппа без головы 5 предполагает модульный механизм запуска. Proc. Natl Acad.Sci. США 109 , E2625 – E2634 (2012).

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 179.

    Brindley, M.A. et al. Стабилизированный стебель прикрепляющего белка вируса безголовой кори эффективно запускает слияние мембран. J. Virol. 87 , 11693–11703 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 180.

    Liu, Q. et al. Раскрытие трехступенчатого пространственно-временного механизма запуска индуцированного рецептором слияния вируса Нипах и проникновения в клетки. PLOS Pathog. 9 , e1003770 (2013).

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar

  • 181.

    Иорио Р. М., Мелансон В. Р. и Махон П. Дж. Взаимодействия гликопротеинов при слиянии парамиксовирусов. Future Virol. 4 , 335–351 (2009).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • 182.

    Маклеллан, Дж. С. Нейтрализующие эпитопы на гликопротеине слияния респираторно-синцитиального вируса. Curr. Opin. Virol. 11 , 70–75 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar

  • Генная подпись детей с тяжелой респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией

  • 1.

    Shi, T. et al. Глобальные, региональные и национальные оценки бремени острых респираторных инфекций нижних дыхательных путей, вызванных респираторно-синцитиальным вирусом, у детей младшего возраста в 2015 г .: систематический обзор и исследование на основе моделирования. Ланцет 390 , 946–958 (2017).

    PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 2.

    Nair, H. et al. Глобальное бремя острых респираторных инфекций нижних дыхательных путей, вызванных респираторно-синцитиальным вирусом у детей раннего возраста: систематический обзор и метаанализ. Ланцет 375 , 1545–1555 (2010).

    PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 3.

    Janssen, R. et al. Профили транскрипции хозяина при инфицировании первичным респираторно-синцитиальным вирусом. J. Virol. 81 , 5958–5967 (2007).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 4.

    Martinez, I., Lombardia, L., Garcia-Barreno, B., Dominguez, O. & Melero, J. A. Определенные подмножества генов индуцируются в разные моменты времени после инфицирования клеток A549 респираторно-синцитиальным вирусом человека. J. Gen. Virol. 88 , 570–581 (2007).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 5.

    Hastie, M. L. et al. Неструктурный белок 1 респираторно-синцитиального вируса человека регулирует пути интерферона типа I и типа II. Мол.Cell Proteomics 11 , 108–127 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 6.

    Mejias, A. et al. Профили экспрессии генов в цельной крови для оценки патогенеза и тяжести заболевания у младенцев с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией. PLoS Med. 10 , e1001549 (2013).

    PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 7.

    Brand, H. K. et al. Олфактомедин 4 служит маркером тяжести заболевания у детей, инфицированных респираторно-синцитиальным вирусом (RSV). PLoS ONE 10 , e0131927 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 8.

    Mariani, T. J. et al. Связь динамических изменений транскриптома Т-клеток CD4 с тяжестью заболевания при первичной респираторно-синцитиальной вирусной инфекции у детей раннего возраста. J. Infect. Дис. 216 , 1027–1037 (2017).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 9.

    До, Л. А. Х. и др. Профиль транскрипции хозяина в назальном эпителии и цельной крови госпитализированных детей в возрасте до 2 лет с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией. J. Infect. Дис. 217 , 134–146 (2018).

    CAS Google Scholar

  • 10.

    Моджаррад, К., Гирсинг, Б., Каслоу, округ Колумбия, Смит, П.Г. и Мурти, В.С. Консультация ВОЗ по докладу о разработке вакцины против респираторно-синцитиального вируса на заседании Всемирной организации здравоохранения, состоявшемся 23-24 марта 2015 г. Вакцина 34 , 190–197 (2016).

    PubMed Google Scholar

  • 11.

    Okamoto, M. et al. Молекулярная характеристика респираторно-синцитиального вируса у детей с повторными инфекциями подгруппы B на Филиппинах. J. Infect. Дис. 218 , 1045–1053 (2018).

    PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 12.

    Malasao, R. et al. Молекулярная характеристика респираторно-синцитиального вируса человека на Филиппинах, 2012-2013 гг. PLoS ONE 10 , e0142192 (2015).

    PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 13.

    Беккути, М.и другие. SeqBox: воспроизводимый анализ RNAseq / ChIPseq на пользовательском игровом компьютере. Биоинформатика 34 , 871–872 (2018).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 14.

    Jiang, H., Lei, R., Ding, S. W. & Zhu, S. Skewer: быстрый и точный подстроечный резистор для последовательного считывания парных концов секвенирования нового поколения. BMC Bioinformatics 15 , 182 (2014).

    PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 15.

    Dobin, A. et al. STAR: сверхбыстрый универсальный выравниватель RNA-seq. Биоинформатика 29 , 15–21 (2013).

    CAS Google Scholar

  • 16.

    Li, B. et al. RSEM: точная количественная оценка транскриптов на основе данных RNA-Seq с референсным геномом или без него. BMC Bioinformatcs 12 , 323 (2011).

    CAS Google Scholar

  • 17.

    Marini, F. & Binder, H. PcaExplorer: пакет R / bioconductor для взаимодействия с главными компонентами RNA-seq. BMC Bioinformatics 20 , 331 (2019).

    PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 18.

    Anders, S. & Huber, W. Анализ дифференциальной экспрессии для данных подсчета последовательностей. Genome Biol. 11 , R106 (2010).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 19.

    Лав, М. И., Хубер, В. и Андерс, С. Умеренная оценка кратного изменения и дисперсии данных РНК-seq с помощью DESeq2. Genome Biol. 15 , 550 (2014).

    PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 20.

    Лик, Дж. Т., Джонсон, У. Э., Паркер, Х. С., Джаффе, А. Э. и Стори, Дж. Д. Пакет SVA для удаления пакетных эффектов и других нежелательных изменений в высокопроизводительных экспериментах. Биоинформатика 28 , 882–883 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 21.

    Игнатиадис, Н., Клаус, Б., Заугг, Дж. Б. и Хубер, В. Взвешивание гипотез на основе данных увеличивает мощность обнаружения при множественном тестировании на уровне генома. Нат. Методы 13 , 577–580 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 22.

    Weiner, J. & Domaszewska, T.tmod: пакет R для общего и многомерного анализа обогащения. PeerJ. 4 , 1–9 (2016).

    Google Scholar

  • 23.

    Ashburner, M. et al. Генная онтология: инструмент для объединения биологии. Нат. Genet. 25 , 25–29 (2000).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 24.

    Consoritium, G.О. Ресурсы по генной онтологии: 20 лет и все еще сильны. Nucleic Acids Res. 47 , D330 – D338 (2019).

    Google Scholar

  • 25.

    Канехиса, М. и Гото, С. KEGG: Киотская энциклопедия генов и геномов. Nucleic Acids Res. 28 , 27–30 (2000).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 26.

    Szklarczyk, D. et al. STRING v11: сети белковых ассоциаций с расширенным охватом, поддерживающие функциональные открытия в общегеномных экспериментальных наборах данных. Nucleic Acids Res. 47 , 607–613 (2019).

    Google Scholar

  • 27.

    Shannon, P. et al. Cytoscape: программная среда для интегрированных моделей сетей биомолекулярного взаимодействия. Genome Res. 13 , 2498–2504 (2003).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 28.

    Бадер, Г. Д. и Хог, К. В. В. Автоматический метод поиска молекулярных комплексов в больших сетях взаимодействия белков. BMC Bioinformatics 4 , 2 (2003).

    PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 29.

    Maere, S., Heymans, K. & Kuiper, M. BiNGO: плагин Cytoscape для оценки чрезмерной представленности категорий генной онтологии в биологических сетях. Биоинформатика 21 , 3448–3449 (2005).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 30.

    Wishart, D. S. et al. DrugBank 5.0: крупное обновление базы данных DrugBank за 2018 год. Nucleic Acids Res. 46 , 1074–1082 (2018).

    Google Scholar

  • 31.

    Бенджамини Ю. и Хохберг Ю. Контроль уровня ложных открытий: практичный и эффективный подход к множественному тестированию. J. R. Stat. Soc. B 57 , 289–300 (1995).

    Google Scholar

  • 32.

    R Основная группа. R: Язык и среда для статистических вычислений (Фонд R для статистических вычислений, Вена, Австрия, 2020).

  • 33.

    Everard, M. L. et al. Анализ клеток, полученных при промывании бронхов младенцев с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией. Arch. Дис. Ребенок. 71 , 428–432 (1994).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 34.

    Смит П. К., Ван С. З., Доулинг К. Д. и Форсайт К. Д. Популяции лейкоцитов при бронхиолите, индуцированном респираторно-синцитиальным вирусом. J. Paediatr. Здоровье ребенка 37 , 146–151 (2001).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 35.

    Wang, S. Z. & Forsyth, K. D.Взаимодействие нейтрофилов с клетками респираторного эпителия при вирусной инфекции. Respirology 5 , 1–9 (2000).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 36.

    Fjaerli, H.O. et al. Экспрессия гена в цельной крови у младенцев с респираторно-синцитиальным вирусным бронхиолитом. BMC Infect. Дис. 6 , 1–7 (2006).

    Google Scholar

  • 37.

    Jong, V. L. et al. Транскриптом помогает прогнозировать тяжесть заболевания у младенцев, инфицированных респираторно-синцитиальным вирусом. Sci. Отчет 6 , 1–12 (2016).

    Google Scholar

  • 38.

    Brand, K. H. et al. Использование MMP-8 и MMP-9 для оценки тяжести заболевания у детей с вирусными инфекциями нижних дыхательных путей. J. Med. Virol. 84 , 1471–1480 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 39.

    Mariani, T. J. et al. Связь динамических изменений транскриптома Т-клеток CD4 с тяжестью заболевания при первичной респираторно-синцитиальной вирусной инфекции у детей раннего возраста. J. Infect. Дис. 216 , 1027–1037 (2017).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 40.

    Kuhlicke, J., Frick, J. S., Morote-Garcia, J. C., Rosenberger, P. & Eltzschig, H.K. Фактор, индуцируемый гипоксией (HIF) -1, координирует индукцию толл-подобных рецепторов TLR2 и TLR6 во время гипоксии. PLoS ONE 2 , e1364 (2007).

    PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 41.

    Антониак С. Система свертывания крови в защите организма. Res. Практик. Тромб. Гемост. 2 , 549–557 (2018).

    PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 42.

    Гиббинс, Дж. М. Передача сигналов адгезии тромбоцитов и регуляция образования тромба. J. Cell Sci. 117 , 3415–3425 (2004).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 43.

    Greiller, C. L. et al. Витамин D ослабляет индуцированную риновирусом экспрессию молекулы межклеточной адгезии-1 (ICAM-1) и рецептора фактора активации тромбоцитов (PAFR) в клетках респираторного эпителия. J. Steroid Biochem. Мол. Биол. 187 , 152–159 (2019).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 44.

    Канделл, Д. Р., Джерард, Н. П., Джерард, К., Иданпаан-Хейккила, И. и Туоманен, Е. I. Streptococcus pneumoniae заякоривают активированные клетки человека с помощью рецептора фактора активации тромбоцитов. Nature 377 , 435–438 (1995).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 45.

    De Steenhuijsen Piters, W. A. ​​A. et al. Микробиота носоглотки, транскриптом хозяина и тяжесть заболевания у детей с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией. Am. J. Respir. Крит. Care Med. 194 , 1104–1111 (2016).

    PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 46.

    De Weerd, W., Twilhaar, W. N. & Kimpen, J. L. L. Анализ субпопуляции Т-клеток в периферической крови детей с бронхиолитом, вызванным RSV. Сканд. J. Infect. Дис. 30 , 77–78 (1998).

    PubMed Google Scholar

  • 47.

    Bont, L. et al. Ответы цитокинов периферической крови и тяжесть заболевания при респираторно-синцитиальном вирусном бронхиолите. Eur. Респир. J. 14 , 144–149 (1999).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 48.

    Welliver, T. P. et al. Тяжелое заболевание нижних дыхательных путей человека, вызванное респираторно-синцитиальным вирусом и вирусом гриппа, характеризуется отсутствием реакции легочных цитотоксических лимфоцитов. J. Infect. Дис. 195 , 1126–1136 (2007).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 49.

    Де Винченцо, Дж. П. Факторы, прогнозирующие тяжесть респираторно-синцитиального вируса у детей: что они указывают на патогенез. Pediatr. Заразить. Дис. J. 24 , 177–183 (2005).

    Google Scholar

  • 50.

    Tamura, T. et al. Пути передачи сигнала ранней активации клонов клеток Th2 и Th3, стимулированные анти-Cd3: роль протеинтирозинкиназ в сигнале продукции IL-2 и IL-4. J. Immunol. 155 , 4692–4701 (1995).

  • Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.